Apuntes de Cinetica de Crecimiento Microbiano PDF

Apuntes de cine tica
de crecimiento
microbiano
Ivn Paredes
M. SC. Ingeniera Bioqumica

Cintica de Cultivos Celulares
P
g
i
n
a
1

Crecimiento celular en un cultivo por lotes
El conocimiento de la cintica de crecimiento y produccin de metabolitos es fundamental en el
tratamiento cuantitativo de los procesos de cultivos celulares. El conocimiento de la cintica de
cultivo permite la prediccin del comportamiento del cultivo; la evaluacin de velocidades,
rendimientos y productividades; y entrega informacin til para establecer estrategias de
produccin y optimizacin del proceso.
El comportamiento cintico de una poblacin est determinado por un conjunto de factores
genticos y ambientales (figura 1). Entre estos ltimos destacan las condiciones de operacin,
como la composicin del medio, la temperatura, el pH, agitacin, aireacin, etc.; y la modalidad
del cultivo, entre las que se distinguen el cultivo por lotes, el cultivo por lotes alimentados y el
cultivo continuo.

Figura 1: Aspectos que intervienen en la interaccin entre las clulas y el medio ambiente a lo largo de su
crecimiento.
El cultivo por lotes se define como aquel que se realiza sin intercambio de materia con los
alrededores, salvo en lo que se refiere a gases (aireacin, produccin de CO
2
, y otros gases), los
que se suministran y retiran en forma continua.
La curva caracterstica de crecimiento de un cultivo por lotes (figura 2), se cumple siempre que se
den ciertas condiciones: que todas las clulas que componen la poblacin se reproduzcan a
intervalos regulares, que no existan sustancias inhibidoras del crecimiento y que la composicin
del medio se simple, en especial a las fuentes de carbono y nitrgeno.
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2

Figura 2: Curva caracterstica del crecimiento de un cultivo celular por lotes

La curva presenta varias zonas o fases:
1. Fase de latencia: Se produce inmediatamente despus de la inoculacin. En ella no hay
iniciacin de la replicacin. En esta fase se realiza la adaptacin y aclimatacin del
microorganismo a las condiciones ambientales del cultivo (nutrientes, temperatura,
soporte, pH, etc.), comienza a activar su maquinaria enzimtica para responder en forma
adecuada a las nuevas condiciones. La duracin va a depender de que tan diferentes son
estas condiciones en relacin a las anteriores (antes de la inoculacin). Existe un efecto
significativo si el cambio se realiz desde un medio solido a uno lquido. Esta fase no es
productiva, por lo que se busca que su duracin sea lo ms corta posible, haciendo que el
medio de destino sea lo ms similar al medio de origen, adems es recomendable que en
el momento de realizar la inoculacin, el cultivo este creciendo en forma vigorosa. La
cantidad de biomasa a inocular es aproximadamente el 10% de la biomasa que se busca el
terminar el cultivo. En cultivos industriales la propagacin se realiza en forma escalonada.
2. Fase de crecimiento exponencial: En esta fase el tiempo entre las duplicaciones es el
mismo, producindose un crecimiento vigoroso del cultivo. Las bacterias son las que ms
se ajustan a este modelo, al duplicarse siguiendo una progresin geomtrica. En levaduras
el tiempo de duplicacin va aumentando durante el transcurso del cultivo, debido a un
envejecimiento celular, por lo tanto la fase de crecimiento exponencial es ms corta. En
un medio totalmente controlado, las bacterias detienen su crecimiento solo al sufrir un
agotamiento de nutrientes en el medio de cultivo, en cambio en un cultivo de levaduras,
se observara una fase de desaceleracin ms larga.
3. Fase estacionaria: En la fase estacionaria biomasa permanece constante, sin observar una
prdida de la viabilidad del cultivo. El crecimiento se detiene a causa de un agotamiento
de algn nutriente, falta de oxgeno, acumulacin de un compuesto toxico o inhibitorio,
etc. Dependiendo del nutriente limitante, se presentan diferentes cambios en la fase
estacionaria. En algunos microorganismos es posible la acumulacin de oligosacridos, si
el nutriente limitante no es carbono.
P
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3

4. Fase de muerte del cultivo: Esta fase es una consecuencia del agotamiento de la fuente de
carbono y energa o la acumulacin de compuestos txicos sobre los lmites tolerados por
la clula; por lo que el cultivo no es capaz de mantenerse viable, provocando la lisis
celular. En algunos casos esta lisis celular, da espacio a que este material vertido al medio
de cultivo sea aprovechado por otras clulas, producindose un crecimiento crptico.

Es posible distinguir tambin otras cortas fases de aceleracin y desaceleracin del crecimiento.
La fase estacionaria puede presentar una suave pendiente positiva si el nutriente limitante es la
fuente de nitrgeno. En el caso el metabolismo de la fuente de carbono y energa puede continuar
por algn tiempo, con acumulacin de compuestos de reserva y aumento de la biomasa.

Modelacin de crecimiento celular
Durante el crecimiento celular existe una variacin de la biomasa en el tiempo, la cual puede ser
representada por:
=
Segn la ecuacin de Malhtus se tiene el siguiente comportamiento en una poblacin si se tiene
una progresin geomtrica:
=
Donde k es una constante asociada al crecimiento celular, es una constante asociada a la muerte
celular y X es la concentracin de biomasa. Si suponemos una muerte celular despreciable en
relacin a la duplicacin, la ecuacin se puede expresar de la siguiente manera:
=

De esta forma k pasa a ser la velocidad especfica de crecimiento, que se notara como .
Por lo tanto la ecuacin de velocidad de variacin de biomasa queda como:
=
Aplicando los lmites de integracin desde un tiempo inicial a un tiempo t:
0

Resolviendo:
= (
) O =

P
g
i
n
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4

Al graficar el ln(X) versus el tiempo (figura 3), se puede obtener , por medio de la determinacin
de la pendiente de la ecuacin de la recta.
( ) = (
) +

Figura 3: determinacin grafica de la velocidad especifica de crecimiento.
El parmetro es de especial relevancia en el estudio de la cintica de cultivos celulares. Su
dimensin es tiempo
-1
. Relacionado con , existe otro parmetro cuya interpretacin fsica es ms
directa: el tiempo de duplicacin, t
d
, definido como el tiempo que media entre dos duplicaciones
sucesivas, aplicando esto a la ecuacin anterior
ln
2
0
0
=

Por lo tanto el t
d
, queda finalmente como:
=
()

En forma referencial se pueden tomar los siguientes tiempos de duplicacin:
ln x
tiempo

P
g
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5

Efecto de la concentracin de sustrato en el crecimiento celular
El valor de depende del microorganismo que se trate y de los parmetros ambientales de
cultivo. Entre estos cabe mencionar la composicin del medio de cultivo, la temperatura, pH, Eh, la
presencia de tenso activos y la actividad termodinmica del agua.
El efecto del medio de cultivo es tanto cuantitativo como cualitativo. La naturaleza de los
nutrientes influye en el valor de , en especial en el caso de las fuentes de carbono, energa y
nitrgeno.
El efecto cuantitativo de la fuente de carbono y energa sobre la velocidad especfica de
crecimiento, fue estudiado por Monod en 1949, quien observo experimentalmente la relacin de
con la concentracin de sustrato y propuso la siguiente ecuacin para representarla,
representada grficamente en la figura 4:
=
+

Donde
K
s
: es la constante de afinidad del microorganismo por el sustrato, entre mas afn sea, ms
pequeo ser el valor del K
s
.
m
: valor mximo que puede obtener la velocidad especifica de crecimiento cuando la
concentracin de sustrato es rdenes de magnitud mayor que K
s
.
La velocidad especfica de crecimiento es funcin de la concentracin de sustrato limitante, sin
importar la concentracin de los otros nutrientes.

Tiempos de duplicacin (horas)
Bacterias 0,3 a 2,5
Levaduras 1,0 a 4,0
Mohos 1,5 a 7,0
Microalgas 18 a 35
Clulas animales 20 a 40
P
g
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n
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6

Figura 4: relacin entre la velocidad especfica de crecimiento y la concentracin de sustrato limitante en un
cultivo celular.

De la grafica se puede evaluar las siguientes situaciones:
Ks = S entonces =

S >>> Ks entonces =

S <<< Ks entonces =

La ecuacin de Monod se puede linealizar tomando los recprocos para obtener la expresin:

Una grafica de 1/ frente a 1/S (Figura 5), produce una lnea recta con pendiente Ks/
m
, abscisa al
origen -1/Ks y ordenada al origen

m
.

Figura 5: Grafica de doble reciproca de 1/ frente a 1/S

La aplicacin de la ecuacin planteada por Monod, se ha extendido a las fuentes de otros
nutrientes, adems de la fuente de carbono y energa.
P
g
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7

Los valores de la constante de saturacin Ks (tabla 1), son del orden de las unidades o las decenas
de partes por milln, por lo que cuando la concentracin de sustrato es de gramos o decenas de
gramos por litro, la velocidad especifica de crecimiento se hace prcticamente igual a m. Por este
motivo la pendiente de la figura 3 es una estimacin de m en ausencia de inhibidores.

Tabla 1: valores referenciales de Ks para diferentes gneros de microorganismos.

Durante en largo periodo de del crecimiento S >>> Ks; si es 10 veces mayor se supone un = m, si
es igual o menor a 10 veces se comienza a tener evidencia de la falta de sustrato y comienza la
desaceleracin del crecimiento. En la fase de crecimiento exponencial la velocidad especfica de
crecimiento es constante y se asume como m.
De esta forma la ecuacin para la variacin de biomasa en el tiempo queda como:
+

Cuando Ks es menor que S, al integrar y despejar, la ecuacin queda:

Donde:

=

0
0

=

+
0
+
0

0
+
0

=

+
0
+
0

0
+
0

P
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Efectos de inhibicin sobre la velocidad especifica de crecimiento

El modelo de Monod no siempre logra representar adecuadamente los datos experimentales, en
especial cuando el medio de cultivo es complejo y contiene varias fuentes de carbono y de
nitrgeno. En esos casos pueden resultar ms adecuados otros modelos de crecimiento, entre los
que destaca la ecuacin logstica y sus modificaciones.

= ( )

Donde =
1
siendo Xm el mximo nmero de individuos que soporta el ambiente.

Cuando X es pequea, se hace despreciable frente a 1. Cuando X es igual a 1, el crecimiento se
detiene, con este modelo se logra poner un lmite al crecimiento. Luego de ordenar e integrar la
ecuacin finalmente queda:
=

)

Cuando el tiempo es pequeo, el denominador se hace despreciable.
La relacin de Monod se aplica en el caso de que el crecimiento no sea inhibido, si el cultivo es
afectado por concentraciones altas de producto o sustrato la ecuacin de Monod se modifica.

Si corresponde a una inhibicin por alta concentracin de sustrato se obtiene

=
+) +

Por otro lado, si la inhibicin es por producto la ecuacin queda:

=
+) +

Las altas concentraciones de sustrato provocan un estrs osmtico, por ejemplo Sacaromices
aceptan concentraciones de glucosa del orden de 100 [g/L], pero si se sube a 150 [g/L] causa
problemas a nivel de concentracin osmtica. Otros efectos inhibidores pueden ser: modificacin
del potencial qumico del sustrato, intermediarios o productos; cambio en la permeabilidad
celular; efectos sobre las enzimas a nivel de sntesis o actividad.
Levenspiel y Han propusieron una ecuacin de Monod generalizada, tratando de cubrir la mayor
parte de las situaciones, en particular la inhibicin por sustrato, producto o las mismas clulas:
P
g
i
n
a
9

=

O bien
=

Donde:

Siendo:
Ci: concentracin del inhibidor
Ci
*
: concentracin critica del inhibidor que detiene completamente el proceso (en este
caso el crecimiento celular)
n y m: Son constantes relacionadas con el poder toxico del inhibidor.
Sustituyendo en la ecuacin general Ci por S, P o X; se podr tratar la inhibicin por sustrato,
producto o las propias clulas. Cuando Ci <<< Ci
*
la ecuacin se reduce a la ecuacin de Monod.
Para el caso de la inhibicin por producto (Ci=P) o por las propias clulas (Ci=X), las constantes de
la ecuacin pueden evaluarse a partir de una liberalizacin del tipo Lineweaver-Burk, de 1/ frente
a 1/S.

En la figura 6 se recoge la forma que toma dicha linealizacin para las seis formas ms comunes de
inhibicin:
a) Inhibicin no competitiva, con n>0 y m=0
b) Inhibicin competitiva, con n=0 y m<0
c) Inhibicin generalizada (anticompetitiva), con n>m>0
d) Inhibicin generalizada (anticompetitiva), con m>n>0
e) Inhibicin anticompetitiva, con n=m>0
P
g
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1
0

f) Caso general, con n>0 y m<0

Figura 6: Representacin de Lineweaver-Burke para distintas formas de inhibicin por el producto, de
acuerdo con el modelo de Han y Levenspiel
Efecto de la temperatura sobre la cintica del cultivo celular

Como todas las reacciones qumicas, el crecimiento celular es afectado por la temperatura. La
relacin entre la variacin de biomasa y el efecto de la temperatura puede expresarse de la
siguiente manera.
=
Donde es la velocidad especifica de crecimiento y es la velocidad especfica de muerte, ambas
con dimensin de tiempo
-1
. El crecimiento observado es un balance entre el crecimiento y la
mortalidad, sin embargo, en condiciones generales <<<, por lo que el termino de muerte celular
se desprecia. Cuando se pasan las temperaturas optimas de crecimiento, la relacin entre y
cambia, y la muerte celular pasa a ser significativa. Al graficar el efecto sobre la velocidad
especifica de crecimiento frente a la temperatura (figura 7), se pueden distinguir 2 zonas. En la
zona 1, el aumento de la temperatura tiene un efecto positivo , alcanzando a su punto mximo al
llegar a la temperatura ptima.
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Figura 7: Influencia de la temperatura sobre la velocidad especifica de crecimiento.
De manera aproximada puede decirse que la velocidad especfica de crecimiento se duplica por
cada incremento de 10C en la temperatura, hasta que empieza a producirse la ruptura estructural
de las protenas y lpidos celulares.
Los microorganismos pueden dividirse bsicamente en 3 tipos dependiendo de la temperatura
ptima para su crecimiento (figura 8), estas clases son psicrfilos (<20C), mesfilos (20-37C) y
termfilos (>38C).

Figura 8: Intervalos de temperatura para el crecimiento de: 1 psicrfilos; 2 mesfilos; 3 termfilos.
El efecto de la temperatura sigue un comportamiento del tipo Arrhenius:
Temperatura optima
1 2
P
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1
2

=

Y
=

Dnde:
A y A corresponden a la constante de Arrhenius.
Ea y Ea corresponden a la energa de activacin, con valores de 15-20
para Ea y de
60-70
para Ea.
R es la constante de los gases de 1,98

T corresponde a la temperatura absoluta en grados kelvin.
El aumento de la velocidad de mortalidad (y disminucin de ), a altas temperaturas, se debe
principalmente a la desnaturalizacin termal de las protenas, la cual provoca un aumento
energtico del mantenimiento celular para mecanismos de reparacin (el coeficiente de
mantencin tambin sigue una dependencia del tipo Arrhenius). A bajas temperaturas, los
mecanismos regulatorios de las clulas son afectados, adems de las limitaciones difucionales
como el transporte de sustratos hacia dentro de la clula. Como resultado, la produccin de
biomasa decae a temperaturas extremas.

Efecto del pH, Eh y aw sobre el crecimiento celular

El pH es un parmetro que afecta tanto al crecimiento como a la formacin de producto. La
mayora de los organismos tiene un rango de funcin entre 3 a 4 unidades de pH. El pH para un
crecimiento mximo crecimiento vara frecuentemente entre 1 y 1,5 unidades de pH.
La relacin de con el pH presenta tambin un valor ptimo. Sin embargo la forma de la curva es
ms variada que en el caso de la temperatura y no se dispone de un modelo matemtico simple y
general para representarla. Como regia general, el pH ptimo para bacterias est ubicado en el
rango de 6 a 7.5, el de levaduras entre 3.5 y 5.5 y el de los mohos se extiende de 3 a 7, aunque
existen variadas excepciones a ella (tabla2).
Rangos tpicos
Tipo celular pH
Bacteria 4-8
Levadura 3-6
Hongos 3-7
Clulas eucariotas 6,5-7,5
P
g
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1
3

Tabla 2: rangos tpicos de pH para diferentes microorganismos
Durante el cultivo, el pH tiende a cambiar por diferentes motivos. Cuando la fuente de nitrgeno
es amonio, el pH tiende a bajar. El amonio en solucin se encuentra como NH
4
+
, el microorganismo
lo incorpora a las clulas como R-NH
3
+
, donde R es el esqueleto carbonado, en el proceso un H
+
es
liberado al medio. Si la fuente es nitrato (NO
3
-
), los iones de H son removidos del medio al reducir
NO
3
-
a R- NO
3
+
, por lo que el pH tiende a subir. Cuando de utilizan compuestos amino orgnicos
(como la glutamina), el pH tiende a subir debido a la desaminacin del compuesto.
Otro cambio de pH ocurre cuando se producen compuestos como cido lctico o cido piruvico. Si
se conoce la causa predominante del cambio de pH, es posible obtener informacin del
crecimiento midiendo la adicin v de cido o base para neutralizar el cambio de pH.
El potencial redox. Eh, del cultivo tiene tambin importancia, ya que su valor determina la
posibilidad de ocurrencia de reacciones de oxidacin del sustrato y es especialmente relevante
para organismos quimioauttrofos que utilizan una reaccin inorgnica como fuente de energa.
Finalmente, cabe mencionar la actividad termodinmica de agua, a
w
. Para su desarrollo los
microorganismos requieren niveles mnimos de a
w
que posibiliten que el agua cumpla con su rol
de solvente y reactante. Estos valores son normalmente mayores que 0.90, aunque existen mohos
y levaduras que pueden crecer a a
w
tan bajas como 0.6. Este factor es de especial relevancia en el
deterioro microbiano de alimentos de humedad intermedia y en los procesos de cultivos en
sustrato slido.

Crecimiento Diaxico

El crecimiento diaxico es un tipo crecimiento microbiano en dos etapas, que tiene lugar cuando
hay presentes dos sustratos diferentes que pueden ser utilizados como fuente de carbono. En este
tipo de crecimiento microbiano se observa una curva de crecimiento bifsica debido a la
utilizacin secuencial distintas fuentes de carbono. El metabolismo del organismo es selectivo para
uno de los sustratos (se usa la fuente de carbono que permite un crecimiento ms rpido) y
cuando la agota, comienza a metabolizar el otro. Como se puede ver en la figura 9, la velocidad
especifica de crecimiento, cuando se utiliza el nutriente que es ms afn, es mayor que la que se
desarrolla con el segundo nutriente. En el caso de tener mltiples compuestos, se registrara un
comportamiento similar consecutivo.
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4

Figura 9: Curva de crecimiento celular en presencia de glucosa y lactosa.

Estequiometria del Crecimiento Microbiano

El proceso de reproduccin celular aparece representado esquemticamente en la Figura 10.
Desde una perspectiva cuantitativa, para que la representacin a) sea posible, se deber cumplir
con lo establecido en b), de manera de no violar los principios de conservacin de masa y energa y
hacer posible la construccin de una nueva clula igual a la anterior.
La informacin para la construccin de la nueva clula est contenida en el cromosoma y es
transmitida de generacin en generacin. La materia debe ser suministrada a travs de los
componentes del medio de cultivo. La energa se obtiene del catabolismo de la fuente de carbono
y energa, de reacciones inorgnicas de oxidacin o de la radiacin solar en el caso de organismos
fotosintticos.

Figura 10. Reproduccin celular: a) Formacin de nuevas clulas. b) Requerimientos cuantitativos.
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Desde un punto de vista cuantitativo, las cantidades necesarias de nutrientes pueden
determinarse a partir de la estequiometria del crecimiento y formacin de productos, ya que un
crecimiento microbiano puede expresarse en forma de reaccin qumica.
Ejemplo: Sacharomyces cerevisiae en glucosa en condiciones aerobias:

Para poder calcular los coeficientes estequeomtricos es necesario conocer la composicin
qumica del microorganismo por medio de un anlisis elemental. Esta ecuacin se expresa por
convenio en funcin de un nico tomo de carbono. De esta manera se obtiene que:
.

Estos valores pueden variar segn el sustrato utilizado. La biomasa se representa en base a su
composicin elemental. Composiciones tpicas de bacterias, levaduras y mohos aparecen en la
Tabla 3.
Los elementos cuantitativamente ms importantes son C, H, O y N, l0 que justifica la aproximacin
hecha en la ecuacin del ejemplo. Los siguen un segundo grupo compuesto por Mg, S, P, Ca, Na y
K, mientras que los restantes elementos se encuentran en niveles muy bajos. Estos elementos
deben ser suministrados como compuestos aptos para ser metabolizados. La fuente de carbono
puede ser un carbohidrato u otro compuesto orgnico, o bien CO
2
, carbonato o bicarbonato en el
caso de clulas quimioautotrficas y fotosintticas. La fuente de nitrgeno puede ser amonio,
nitrgeno amino de aminocidos y protenas, urea, nitrato o nitrgeno elemental, siendo las dos
primeras las ms comunes. El resto de los elementos son proporcionados por sales inorgnicas.
Debido a deficiencias genticas, ciertas cepas requieren de factores de crecimiento, tales como
vitaminas, aminocidos y nucletidos.

P
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1
6

Tabla 3: Composicin qumica de clulas microbianas
La expresin en forma de reaccin qumica permite la aplicacin de balances de matera para cada
componente la determinacin de los coeficientes estequeomtricos. Se debe suponer un medio
definido y se aplica principalmente al sustrato limitante. Continuando con el ejemplo anterior se
pueden plantear los siguientes balances:
: 6 = +
: 12 +3 = 1,703 +2
: 6 +2 = 0,459 +2 +
: = 0,171

Se disponen de 4 ecuaciones para determinar 5 incgnitas, por lo tanto se define el coeficiente
respiratorio (CR o RQ), que corresponde a los moles de CO
2
formados por cada mol de O
2

consumido, en este caso queda como:
: 1,033 =

El sistema de 5 ecuaciones con 5 incgnitas puede resolverse para conducir a la siguiente ecuacin
ajustada:
+,
+,
.
,
,
+,
+,

P
g
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1
7

Si el producto principal se produce como consecuencia del metabolismo primario, se puede
plantear una reaccin qumica similar a la ecuacin del ejemplo, introducindose el producto
indicado como CH
v
O
w
; si el producto contiene nitrgeno puede tenerse en cuenta en forma
anloga.

En el caso que el producto se obtenga indirectamente como consecuencia del metabolismo
primario o sea un metabolito secundario, no puede aplicarse la estequiometria simple de la
ecuacin anterior.

Requerimientos nutricionales

Resulta til distinguir dos tipos de medios de cultivo, de acuerdo a su composicin: complejos y
definidos.
Los medios complejos son formulados en base a desechos, subproductos y extractos naturales,
tales como melaza, licor de maceracin de maz, extracto de levadura, y otros. Su composicin
qumica es compleja y variable y contienen varias fuentes de cada elemento. Estos medios pueden
requerir suplementacin con compuestos que proporcionen cantidades adicionales de algunos
elementos, tales como N, Mg y P. Los medios complejos son extensamente utilizados en
microbiologa bsica (taxonoma, fisiologa, gentica), microbiologa analtica, microbiologa de
aguas y alimentos y en fermentaciones industriales.
Los medias definidos se formulan en base a compuestos puros, tales coma glucosa, sulfato de
amonio, metionina, fosfato mono acido de potasio, etc. Debido a ello su composicin qumica es
conocida y reproducible, conteniendo fuentes de cada elemento y los nutrientes esenciales que
pueden ser requeridos. Estos medios son usados preferentemente en investigacin y desarrollo de
procesos de cultivos. En el campo industrial, se percibe una creciente utilizacin de medios
definidos. Una clase especial de medio definido es el medio mnimo, que se puede caracterizar
como aquel formado por solo una fuente de cada elemento. El tpico medio mnimo est
compuesto por glucosa, sulfato de amonio y otras sales minerales.
En la Tabla 4 se entrega un listado parcial de componentes de medios complejos industriales y en
la Tabla 5 se dan ejemplos de medias definidos, donde se puede apreciar que estos pueden llegar
a ser bastante complicados en su formulacin, pero siempre con la caracterstica de ser
qumicamente definidos.
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8

Tabla 4: Medios de cultivos con fines industriales

Los medios complejos son adecuados a nivel industrial por ser ms baratos y porque en ciertos
casos se obtienen con ellos mejores rendimientos y productividades. Ello se debe a que al
contener una variedad de molculas orgnicas, evitan a la clula el trabajo de sintetizarlas a partir
de glucosa y compuestos inorgnicos. Por otro lado, los medios definidos permiten un mejor
control de las condiciones ambientales de crecimiento y produccin, siendo fcil excluir sustancias
txicas o inhibidoras e incluir precursores e inductores en los niveles adecuados. Por esta razn,
ciertos cultivos que requieren un control ambiental estricto resultan ms productivos cuando
utilizan medios definidos. Para optimizar la composicin de un medio complejo, se puede recurrir
a diversas tcnicas experimentales y tericas.

Tabla 5: Ejemplos de medios definidos.

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9

Rendimiento de una reaccin

La extensin en que los reactantes se convierten en productos se denomina rendimiento de la
reaccin. Generalmente, rendimiento es la cantidad de producto formado o acumulado por
cantidad de reactante suministrado o consumido. Desafortunadamente, no existe una definicin
concreta de rendimiento, siendo varios los parmetros utilizados para definirlo en diferentes
situaciones. Los trminos utilizados para expresar rendimiento no son necesariamente aceptados
de manera universal.
Cuando reactantes o productos se ven involucrados en reacciones diferentes, el rendimiento
observado puede ser diferente del rendimiento terico.

Existe un tercer tipo de rendimiento aplicable en determinadas situaciones. Para reacciones con
una conversin incompleta de reactante puede ser interesante especificar la cantidad de producto
formado par cantidad de reactante aadido a la reaccin en vez del realmente consumido. Por
ejemplo, considerando la reaccin de isomerizacin catalizada por glucosa isomerasa:

La reaccin se realiza en un reactor cerrado con enzima pura. En el equilibrio, la mezcla de
azucares contiene 55% en moles de glucosa y el 45% de fructosa. El rendimiento terico de la
fructosa a partir de la glucosa es 1 mol mol-I porque de la estequiometria se deduce que la
formacin de 1 mol de fructosa necesita 1 mol de glucosa. El rendimiento aparente ser tambin 1
mol mol
-1
si la reaccin Se produce en un sistema aislado. Sin embargo, si la reaccin comienza
cuando nicamente existe glucosa, el rendimiento de equilibrio de fructosa par mol de glucosa
aadida al reactor es 0,45 mol mol-I. Este tipo de rendimiento para reacciones incompletas puede
denominarse coma rendimiento bruto.
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2
0

Rendimientos en cultivos celulares

Cuando se consideran procesos como el crecimiento celular se estn agrupando muchos efectos
individuales de conversiones qumicas y enzimticas. A pesar de esta complejidad, los principios
del rendimiento pueden aplicarse al metabolismo celular para relacionar el flujo de sustrato en las
rutas metablicas para la formacin de biomasa y otros productos.
Los rendimientos que se muestran generalmente y aquellos de especial importancia se expresan
mediante coeficientes de rendimiento o factores de rendimiento. Varios coeficientes de
rendimiento son de uso comn, como el rendimiento de biomasa a partir de sustrato, el
rendimiento de biomasa a partir de oxgeno o el rendimiento de producto a partir de sustrato. Los
coeficientes de rendimiento permiten cuantificar la necesidad de nutrientes y las caractersticas de
produccin de un organismo.
La definicin de los coeficientes de rendimiento puede generalizarse de la siguiente manera:

Donde Y
FG
es el factor de rendimiento, F y G son las sustancias involucradas en el metabolismo, F
la masa o moles de F producidos y G la masa o moles de G consumidos. Como G es negativo en
valor para una sustancia consumida, para que el rendimiento se calcule como una cantidad
positiva es necesario aadir un signa negativo a la ecuacin.
En la Tabla 6 se muestra una lista de los coeficientes de rendimiento mas frecuentemente
utilizados. Aunque el trmino rendimiento se refiere generalmente a la cantidad de producto
formado por cantidad de reactante, el rendimiento puede utilizarse tambin para relacionar otras
cantidades. Algunos coeficientes de rendimiento se basan en cantidades tales como el ATP
formado o el calor involucrado en el metabolismo.
Smbolo Definicin
Y
XS
Masa o moles de biomasa producida por unidad de masa o mol de sustrato
consumido.
Y
PS
Masa o moles de producto formado por unidad de masa o mol de sustrato
consumido.
Y
PX
Masa o moles de producto formado por unidad de masa o mol de biomasa formada.
Y
XO
Masa o moles de biomasa formada por unidad de masa o mol de oxgeno consumido.
Y
CS
Masa o moles de dixido de carbono formado por unidad de masa o mol de sustrato
consumido.
RQ Moles de dixido de carbono formados por mol de oxgeno consumido. Este
rendimiento es el denominado cociente respiratorio.
Y
ATP
Masa o moles de biomasa formada por mol de ATP formado.
Y
kcal
Masa o moles de biomasa formada por kilocalora de calor involucrada en la reaccin
Tabla 6: Algunos coeficientes de rendimiento metablicos
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2
1

Un problema en la aplicacin de la ecuacin generalizada de rendimiento, es que los valores de F
y G dependen del periodo de tiempo en el que se miden. En un cultivo discontinuo, F y G
pueden calcularse como la diferencia entre los valores inicial y final, obtenindose un rendimiento
global que representa una especie de valor medio durante el periodo entero de cultivo. Por otro
lado, F y G pueden calcularse entre otros dos puntos cualquiera en el tiempo, lo cual puede
producir un valor diferente de Y
FG
. Los rendimientos pueden variar durante el cultivo y algunas
veces es necesario calcular el rendimiento instantneo en un determinado punto en el tiempo.
Para un reactor cerrado de volumen constante en el que la reaccin entre F y G es la nica
reaccin en la que intervienen estos componentes, si r
F
y r
G
son velocidades volumtricas de
produccin y consumo de F y G respectivamente, el rendimiento instantneo puede calcularse de
la siguiente manera:

Por ejemplo, Y
XS
en un determinado instante se define como:
=

Cuando se expresan rendimientos de cultivo, debe manifestarse el tiempo o perodo de tiempo al
cual se refieren.
Tal como se describi anteriormente, es necesario distinguir entre rendimiento terico y
observado. Este aspecto es particularmente importante en el metabolismo celular porque siempre
existen muchas reacciones producindose de manera simultnea, por lo que ambos rendimientos
pueden ser diferentes. Considerando el ejemplo de rendimiento de biomasa a partir de sustrato,
Y
XS
. Si la masa total de sustrato consumido es S
T
, parte de S
T
igual a S
G
se utilizara para el
crecimiento celular mientras el restante, S
R
, se canalizara hacia otros productos y actividades
metablicas no relacionadas con el crecimiento. Por lo tanto, el rendimiento de biomasa
observado basado en el consumo total de sustrato es:

Donde X es la cantidad de biomasa producida e Y
XS
el rendimiento de biomasa observado a
partir de sustrato. A efecto comparativo, el rendimiento de biomasa terico o verdadero a partir
de sustrato es:

Donde S
G
es la masa de sustrato realmente utilizada en la produccin de biomasa. Debido a la
complejidad del metabolismo, generalmente no se conoce el valor de S
G
y el rendimiento
P
g
i
n
a
2
2

observado es el nico rendimiento disponible. Los rendimientos tericos se refieren normalmente
a un rendimiento mximo posible, ya que ellos representan el rendimiento en ausencia de
reacciones paralelas.

Cintica de consumo de sustrato

El parmetro de rendimiento de un nutriente en clulas, es til para la formulacin de medios de
cultivo y para el estudio cuantitativo de los procesos de cultivos celulares, este se define como la
masa celular obtenida por unidad de nutriente consumido:

=

A travs de este parmetro se puede relacionar las velocidades de variacin de biomasa y de
consumo de sustrato:
Si el rendimiento se defini como:

Reordenando la ecuacin queda:
=
1

Ahora, cuando se evala que ocurre en un intervalo de tiempo muy pequeo; es decir dividiendo
la ecuacin por t y llevando al lmite cuando t0:
1
, lim
0

La ecuacin queda:
=
1

P
g
i
n
a
2
3

Recordando que:
=
La ecuacin puede ser escrita como:
=
1

Siendo esta una expresin que modela el perfil de la concentracin de sustrato durante un cultivo
por lotes, en trminos de velocidad de consumo.
Ahora si se divide por la biomasa, se obtiene:
=

Donde q
S
, corresponde a la velocidad especfica de consumo de sustrato, por lo que la ecuacin
queda:

En la figura 11, se muestra los perfiles caractersticos que se obtienen al graficar la variacin de la
concentracin de sustrato y biomasa, durante el tiempo de cultivo

Figura 11: Variacin de biomasa y sustrato en el tiempo en un cultivo por lotes.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
0 50 100 150
C
o
n
c
e
n
t
r
a
c
i
o
n

(
g
/
l
)

Tiempo en minutos
Cinetica de Sustrato Cinetica Celular
P
g
i
n
a
2
4

Si la velocidad de consumo de sustrato, depende del rendimiento y de , y si se supone un
rendimiento constante durante el cultivo, q
S
, tendr una relacin directamente proporcional con
, y cuando esta obtenga su valor mximo, tambin lo har q
S.
El rendimiento de la fuente de carbono y energa depende de la velocidad especfica de
crecimiento. Para encontrar esta relacin se recurre a un balance de masa de la fuente de carbono
y energa:

La ecuacin expresa que el sustrato consumido se utiliza para crecimiento, mantencin de la
viabilidad celular y produccin de metabolitos extracelulares.
El trmino de crecimiento engloba el sustrato consumido para formar parte de la biomasa y para
generar energa para la biosntesis: esta ltima porcin aparece como CO
2
en la ecuacin
estequeomtrica. El trmino de mantencin se refiere al sustrato utilizado para generar energa
para funciones distintas al crecimiento, como son el transporte de nutrientes, la rotacin de
protenas, el equilibrio osmtico y otras. El trmino de producto puede o no estar presente, segn
el microorganismo considerado las condiciones de cultivo.
Dividiendo la ecuacin por t y llevando al lmite cuando t0:

Reemplazando cada trmino en funcin de parmetros de cultivo se obtiene:

+ +

Donde q
P
, corresponde a la productividad especifica.
Si no hay produccin de metabolito extracelular y se reemplaza cada trmino en funcin de
parmetros del cultivo.

+
El rendimiento mximo, Y
O
XS
se define como la biomasa obtenida por unidad de sustrato
consumido destinado a crecimiento. As definido, Y
O
XS
no puede medirse directamente por anlisis
qumico. Definicin anloga corresponde a Y
PS
. Ambos son lmites tericos.
Si se toma la ecuacin, se simplifica por X y se divide por , queda:

P
g
i
n
a
2
5

Tomando esta ecuacin y realizando un grfico de
1
frente a
1

y si no hay producto
extracelular, Y
O
XS
puede ser determinado por extrapolacin, como se muestra en la Figura 12, la
que tambin permite calcular el valor del coeficiente de mantencin m, el que corresponde a la
pendiente de la recta.

Figura 12: Relacin de Y
xs
con para la fuente de carbono y energa
En los casos de produccin de metabolitos extracelulares, la grfica de recprocos ser recta si la
productividad especfica, q
P
es constante en el rango de considerado. En este caso la pendiente
ser +

, de donde se deber conocer 2 valores para determinar el tercero. Algunos

valores de m se entregan en la Tabla 7

Tabla 7: valores seleccionados de coeficientes de mantencin
P
g
i
n
a
2
6

Cuando no se dispone de datos experimentales, se puede recurrir a un mtodo de clculo o
estimacin de los rendimientos. Un balance de los contenidos de un elemento en la clula y en el
respectivo nutriente conduce a la ecuacin:
=
%
%

Ejemplo:
Fuente de N: (
2
)
2
4

% =
14 2
132
100 = 21%
Dnde:
14 corresponde al peso atmico del nitrgeno
2 corresponde al nmero de tomos de nitrgeno
132 corresponde al peso molecular del compuesto

Si se toma un estimado de 10% de contenido de nitrgeno en la biomasa, tomando en cuenta que
va entre 6 y 14%, el rendimiento ser:

=
21,2
10
= 2,12

Por lo tanto, en forma terica se puede decir que por cada unidad de masa de sulfato de amonio
consumido, se obtiene 2,12 de biomasa. Se supone que el elemento pasa del nutriente a la
biomasa.

En cuanto a la fuente de carbono y energa, no todo el carbono metabolizado aparece en la
biomasa, sino que una porcin forma parte de los productos de oxidacin (C02 y molculas
orgnicas pequeas en metabolismo anaerobio). Para este caso se tiene que:

=
%
%

En metabolismo aerobio f est comprendido entre 0.5 y 0.6, mientras que para el crecimiento
anaerobio f es aproximadamente 0.1.
La ecuacin anterior considera el CO
2
desprendido en la generacin de energa de crecimiento y
mantencin por lo que el Y
XS
calculado es una estimacin del entregado por la ecuacin:

P
g
i
n
a
2
7

+

Diseo de medios de cultivo

Para la formulacin de medios de cultivo se debe conocer la concentracin celular que se desea, la
composicin elemental de la biomasa (normalmente de datos generalizados como los de la Tabla
3) y las fuentes de cada elemento que se utilizaran como nutrientes. Adems de los
requerimientos de factores de crecimiento. Los rangos de concentraciones celulares ms utilizados
aparecen en la Tabla 8.

Tabla 8: Valores tpicos de concentraciones celulares

El clculo se realiza determinando Y
XS
para cada nutriente con ayuda de las ecuaciones:
=
%
%

=
%
%

P
g
i
n
a
2
8

=

Llegando a:
0
=

El valor de S
f
se supone cero en primera instancia. Luego los valores de So obtenidos pueden
multiplicarse por 1,1-1,5, a excepcin del nutriente que se quiere sea el limitante.

Cintica de Formacin de productos

De forma anloga a los rendimientos celulares se puede definir el rendimiento de sustrato en
producto:
=

()
=

El valor de Y
PS
puede ser medido experimentalmente e Y
PS
, puede ser calculado de datos
experimentales graficando la ecuacin:

Pero considerando ahora el trmino de formacin de producto, siempre que q
P
sea conocido y
constante y se conozca el valor de m.
Otra forma de estimar Y
PS
es determinar el rendimiento terico de un metabolito, Y*
PS
. Este
parmetro entrega el valor mximo que se puede alcanzar en la conversin del sustrato a
producto, bajo la condicin ideal que no haya consumo de sustrato para crecimiento ni
mantencin. De acuerdo a la ecuacin de balance de sustrato:

Y
PS
coincide plenamente con Y*
PS
en el caso de metabolitos extracelulares.
P
g
i
n
a
2
9

Los valores de Y*
PS
son tiles como referencia para evaluar el comportamiento de un cultivo y
adoptar decisiones sobre acciones a seguir. Un Y
PS
muy alejado de Y*
PS
implica que el proceso
puede ser mejorado invirtiendo recursos en investigacin y desarrollo. Valores de Y
PS
cercanos a
Y*
PS
aconsejan no invertir en mejorar ms ese proceso.
El clculo de Y*
PS
se basa en la estequiometria de la reaccin de conversin de sustrato a
producto y es sencillo para productos cuyas rotas biosintticas sean simples y conocidas. De no ser
as, el clculo resulta ms elaborado y algo incierto. La Tabla 9 resume algunos valores de Y*
PS

calculados en la forma propuesta.

Tabla 9: Rendimientos tericos de productos
De inters resulta tambin la aplicacin de Y
PS
o Y*
PS
junto a Y
XS
y m, a la determinacin de las
fracciones del sustrato total consumido que se invierten en crecimiento, mantencin y produccin.
Una porcin mayoritaria del sustrato se utiliza en generar biomasa, energa de mantencin; siendo
menor el sustrato destinado a la produccin del metabolito de inters, como se aprecia en la Tabla
10.

P
g
i
n
a
3
0

Tabla 10: Destino del sustrato en produccin de algunos metabolitos
Estas ideas y conceptos en cuanto a las posibilidades de mejoramiento en la produccin de un
determinado metabolito o enzima han llevado al actual concepto de ingeniera metablica, que
busca individualizar las reacciones metablicas cuya alteracin lleve a la sobreproduccin.
El rendimiento de sustrato en producto, es muy sensible a las condiciones ambientales, lo que
dificulta su aplicacin prctica, como parmetro es de mayor utilidad la productividad especfica.
Ordenando la ecuacin de rendimiento:
=
()

Dividiendo la ecuacin por t y llevando al lmite cuando t0:

Si se haba definido previamente:

La ecuacin queda:

Definiendo:

La ecuacin puede ser escrita como:

Lo que significa que la variacin de producto en el tiempo es proporcional a la cantidad de
biomasa y a la velocidad especifica de crecimiento; esto considerando que es un metabolito
asociado al crecimiento.
Dividiendo la ecuacin anterior por la concentracin de biomasa, para obtener la variacin
especfica en el tiempo, se llega a:

P
g
i
n
a
3
1

Para evaluar un proceso industrial, adems de los rendimientos se requiere considerar el aspecto
cintico, ya que no es lo mismo obtener una cierta conversin de sustrato a producto en un corto
tiempo que en un lapso prolongado. Tambin es importante obtener una alta concentracin de
producto que reduzca los costos de recuperacin. Un parmetro que considera lo anterior es la
productividad volumtrica, referida a un metabolito o a biomasa, emplendose las notaciones Q
P
y
Q
X
.
=

Por lo tanto:

Para evaluar globalmente un cultivo, es vlida la aproximacin:

En procesos por lote es necesario calcular la productividad para todo el tiempo del proceso, el cual
incluye no solo el tiempo de cultivo:
=

O
=
1
ln
0
+

Analticamente se puede calcular Q
X
como:

De esta ecuacin es posible determinar el efecto de los cambios del proceso en la productividad.
P
g
i
n
a
3
2

De esta manera se tendr una productividad especfica, que permite establecer parmetros de
escalamiento, ya que corresponde a una propiedad intrnseca de la biomasa asociada a
parmetros cinticos; y una productividad volumtrica, la cual es una caracterstica del sistema, de
cada cultivo en particular, por este motivo se puede evaluar la eficiencia del sistema y realizar
comparaciones sobre la misma base del sistema de cultivo.
La relacin cintica entre el crecimiento y la formacin de producto, depende del rol que tenga
este producto en el metabolismo celular. Las dos cinticas ms comunes son en las que el
producto es sintetizado durante el crecimiento y una vez que este ha terminado. Un patrn menos
comn es el caso en el que el crecimiento comienza sin la formacin de producto, pero luego de
cierto periodo de tiempo, el producto comienza a aparecer mientras en crecimiento continua
(figura 13).

Figura 13: relacin de la sntesis de un producto con el crecimiento: a) asociado al crecimiento; b)
parcialmente asociado al crecimiento; c) no asociado al crecimiento.

Para modelos mixtos Ludeking y Piret (1959), propusieron la siguiente ecuacin:
+
Al dividir por la concentracin de biomasa se llega a:
1
=
1
+
O
= +
P
g
i
n
a
3
3

Dnde:
=0 si el producto no es asociado al crecimiento
=0 si el producto es asociado al crecimiento
y 0 si el modelo es mixto

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