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Pablo Tancredi
Tutores: Dr. Eduardo Mnde!
MSc. Leticia Pre!
"acultad de Ciencias# UdelaR
Monte$ideo# Uru%ua&
1
AGRADECIMIENTOS


A PEDECIBA Qumica, ANII y CSIC por el financiamiento otorgado. A los integrantes
del Laboratorio de Biomateriales y del Laboratorio de Interacciones Moleculares de la
Facultad de Ciencias, UdelaR.











































Montevideo, Diciembre 2011
2
RESUMEN


Uno de los motivos del creciente inters en el desarrollo de sensores qumicos radica en
la capacidad que poseen estos duspositivos para descentralizar el proceso analtico. En
particular, los sensores colorimtricos se adaptan muy bien a este tipo de funciones.

La necesidad de generar estrategias que permitan descentralizar los mecanismos de
ensayo resulta especialmente atractivo en el diagnstico de la contaminacin con Plomo.
La exposicin al Plomo ambiental en las zonas altamente urbanizadas afecta la salud de
una enorme cantidad de personas en todo el mundo, y Uruguay no escapa a esta realidad.
En este sentido, la posibilidad de desarrollar un sensor colorimtrico que permita realizar
un primer diagnstico cualitativo sobre la poblacin de riesgo tendra un impacto
potencial sumamente positivo.

En los ltimos aos la investigacin vinculada a diferentes disciplinas dentro de la
Nanotecnologa ha presentado posibles soluciones a varios problemas concretos de
diversas reas, por ejemplo la construccin de sensores para especies qumicas
especficas. En particular, la combinacin de nanopartculas con propiedades pticas
dependientes de la distancia con DNAzymas con alta selectividad por iones metlicos ha
presentado grandes oportunidades para el desarrollo de sensores colorimtricos.

La construccin de un sensor colorimtrico especfico para Plomo que se detalla en este
trabajo se realiza a partir de la DNAzyma 17E y de nanopartculas de Oro, responsables
de la deteccin del analito y del cambio de color del medio respectivamente. De la
interaccin de estos dos elementos se obtiene un complejo sistema de color violeta, que
cambia de color a rojo cuando se le adiciona una solucin que contiene Plomo.

Hasta ahora, se ha demostrado que este sistema funciona de forma efectiva como ensayo
tipo positivo/negativo sobre soportes inertes y ofrece resultados inmediatos y a simple
vista para soluciones acuosas de Plomo de concentraciones por encima de 4ppm.
A pesar de que el elevado lmite de deteccin obtenido en este primer diseo impedira la
aplicacin del sensor para determinaciones de Plomo en sangre, el sistema ofrece
perspectivas positivas, que permitirn continuar el trabajo y la bsqueda de soluciones
con el fin de optimizar los diferentes parmetros del instrumento.





3
NDICE

PARTE 1: DESARROLLO TERICO
SENSORES QUMICOS 6
INTRODUCCIN 6
BIOSENSORES 7
PROPIEDADES DE LOS SENSORES 7
SENSORES COMO INTRUMENTOS PARA ANLISIS DESCENTRALIZADOS 8
PLOMO 9
PROPIEDADES GENERALES, APLICACIONES Y EXPOSICIN AL PLOMO 10
CONTAMINACIN POR PLOMO 11
IDENTIFICACIN DE PLOMO 14
SENSORES COMO PRODUCTOS DE INVESTIGACIN INTERDISCIPLINARIA 16
NANOTECNOLOGA Y NANOPARTCULAS 17
INTRODUCCIN 17
HISTORIA 17
NANOPARTCULAS METLICAS 18
NANOPARTCULAS DE ORO 20
QUMICA SUPRAMOLECULAR DE LAS NANOPARTCULAS DE ORO 24
ADN FUNCIONAL y DNAzymas 27
ADN COMO NANOMATERIAL 27
ENDONCLUEASAS Y DNAzymas 8-17 32
DNAzymas COMO SENSORES DE IONES METLICOS 35
DESARROLLO DE UN BIOSENSOR COLORIMTRICO PARA LA
DETECCIN DE PLOMO 37
2 GENERACIN DEL BIOSENSOR DE Pb(II) 38
3 GENERACIN DEL BIOSENSOR DE Pb(II) 40
4 GENERACIN DEL BIOSENSOR DE Pb(II) 41
PARTE 2: DESARROLLO EXPERIMENTAL
OBJETIVOS 43
MATERIALES 44
MTODOS 45
RESULTADOS Y DISCUSIN 48
4
CARACTERIZACIN DE LAS NANOPARTCULAS DE ORO 48
ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD DE LA DNAZYMA 17E 54
DERIVATIZACIN DE LAS NANOPARTCULAS DE ORO CON LAS
MOLCULAS DE ADN TIOLADAS. 59
ENSAMBLADO DEL SENSOR 61
PUESTA A PUNTO DEL SENSOR Y CURVA DE CALIBRACIN 65
PERSPECTIVAS DEL SENSOR PARA ANLISIS DE Pb(II) EN SANGRE 69
CONCLUSIONES 71
BIBLIOGRAFA 72











5


PARTE 1:

DESARROLLO
TERICO













6
SENSORES QUMICOS


INTRODUCCIN

Los sensores qumicos nacen de la necesidad de extender la percepcin y aumentar la
sensibilidad que tenemos sobre los diferentes componentes del mundo que nos rodea.
Segn la definicin IUPAC, un sensor qumico es un dispositivo integrado capaz de
proporcionar informacin qumica especfica cuantitativa o semicuantitativa, formado
por un elemento de reconocimiento que est en contacto directo con un elemento de
transduccin.[1] La informacin qumica obtenida del sensor se convierte en una seal
analtica til y eso permite diagnosticar y determinar la presencia de diferentes agentes
en un sistema puntual. La capacidad de analizar qumicamente un sistema que integra
nuestro entorno directo resulta de vital importancia debido a que su composicin qumica
est fuertemente relacionada y determina varios aspectos vinculados con nuestra calidad
de vida. Por ejemplo, la presencia de toxinas o metales pesados en el ambiente puede
afectar severamente a la salud humana.[2] De la misma forma, determinados agentes que
a bajas concentraciones pueden ser tolerables, dejan de serlo cuando aumenta su
presencia en el sistema. Por este motivo, el desarrollo de sensores qumicos ha sido un
importante objeto de investigacin de varias areas del conocimiento analtico, entre
ellas el monitoreo ambiental, el diagnostico mdico o el control de calidad en la
industria.[2]
Los sensores qumicos pueden clasificarse de diferentes maneras. Una de las
clasificaciones ms comunes se realiza segn la naturaleza de la seal que se obtiene de
la interaccin sensor-analito. As, los sensores qumicos pueden agruparse en sensores
electroqumicos (incluyendo sensores conductimtricos, amperomtricos y
potenciomtricos), sensores de masa, sensores calorimtricos y sensores pticos.[3] Este
ltimo grupo, los sensores pticos, incluye a todos los sistemas que aprovechan la
interaccin materia/radiacin electromagntica y utilizan como seal de deteccin a una
onda de este tipo. En estos casos, la evaluacin del cambio en el parmetro ptico puede
relacionarse con la concentracin del analito. Los principios analticos aplicables a los
sensores pticos estn anclados en la espectroscopa clsica, aunque difieren en el
arreglo y en algunos elementos experimentales. En un sensor ptico, la radiacin
electromagntica es guiada desde un espectrofotmetro, interacta con la materia, y
luego se reintroduce en el instrumento para un procesamiento electrnico. Del
procesamiento de esta seal, se obtiene el resultado del anlisis realizado.[4] La
ubicacin de la onda dentro del espectro electromagntico permite realizar una nueva
clasificacin de los elementos de este grupo. De esta nueva clasificacin surgen los
sensores colorimtricos o sensores basados en absorcin de luz visible, cuya principal
caracterstica de medicin consiste en el cambio de las propiedades pticas del sistema
dentro del rango visible del espectro. Esto quiere decir que la seal transmitida por el
sensor como consecuencia de la interaccin con el analito es en un cambio de color del
sistema detectable por el ojo humano, que puede ser tanto en la intensidad del tono
original como en el pasaje de un color a otro. La principal ventaja de este tipo de
sensores es que permite eliminar el instrumental analtico, ya que no precisa de ningn
procesamiento electrnico de la seal.[2]
De todas modos, el procesamiento de la seal lumnica mediante un equipo
espectrofotomtrico en el rango UV-Visible puede resultar til para obtener datos ms
precisos y fiables. A partir del estudio del espectro y su variacin en presencia del analito
7
se puede resolver de mejor manera el cambio de color del sistema, y as obtener un
sensor que no depende de la subjetividad del operario.[2]
Como ya se vena mencionando, un sensor qumico debe contener, al menos, dos
componentes: uno que permite el reconocimiento del objetivo y otro que traduce esta
relacin en una seal detectable.
El elemento de reconocimiento o receptor debe ser capaz de interactuar con las
molculas del analito, catalizar una reaccin selectivamente o participar de un equilibrio
qumico.[3] Idealmente, esta interaccin debe ser de alta afinidad, alta especificidad,
buen rango dinmico, rpida respuesta en el tiempo y relativa estabilidad. Los elementos
de reconocimiento pueden ser cualquier entidad qumica o biolgica capaz de establecer
la interaccin con el analito, como por ejemplo, pequeas molculas orgnicas, pptidos,
protenas (anticuerpos), ADN o incluso clulas completas.[2]
Por otro lado, el elemento responsable de la seal o transductor es el encargado de
convertir el evento de reconocimiento del receptor en una seal fsicamente
detectable.[2] Para la mayora de los sensores, el transductor transforma esta interaccin
en una seal elctrica a ser procesada por un circuito electrnico de medicin. Sin
embargo, en los sensores colorimtricos la propia seal del transductor es el cambio de
color, y puede ser interpretada visualmente por el analista sin la necesidad del
procesamiento electrnico.


BIOSENSORES

Las caractersticas del sistema de reconocimiento tambin permite crear una nueva
definicin para un grupo especfico de sensores: los biosensores. Los biosensores son
todos aquellos sensores qumicos que, a travs de reacciones bioqumicas especficas,
aprovechan las propiedades de los mecanismos biolgicos y los utilizan como sistema de
reconocimiento para la deteccin de compuestos qumicos.[5-6] Por ejemplo, los
anticuerpos (protenas de unin de alta afinidad y especificidad) han sido largamente
utilizados en el desarrollo de sensores qumicos y biolgicos. Tambin, el apareamiento
de bases de Watson-Crick y la hibridacin de hebras asociada al ADN han sido
aprovechadas en estos sistemas. Ms recientemente, el descubrimiento de nuevas
aplicaciones y posibilidades vinculadas a esta biomolcula, como su capacidad de
catalizar ciertas reacciones qumicas, tambin ha permitido el desarrollo de toda una
nueva gama de biosensores.[2,7] La utilizacin de mecanismos biolgicos como sistemas
de reconocimiento ofrece varias ventajas sobre los mecanismos qumicos; las ms
importantes estn asociadas a la alta especificidad y sensibilidad del reconocimiento.


PROPIEDADES DE LOS SENSORES

La idoneidad de un sensor para cualquier aplicacin particular depende de su
performance en diferentes sistemas y condiciones. Existen varias propiedades que
permiten definir esta performance, y a partir de ellas es posible determinar la perspectiva
y las posibilidades reales de aplicacin prctica:
Sensibilidad y lmite de deteccin: La sensibilidad de un sensor es la magnitud en la
seal de salida (respuesta) producida por el cambio de una unidad en la seal de
entrada.[8] Por otro lado, la sensibilidad analtica es el mnimo cambio detectable en la
seal de entrada.[8] En un sensor qumico, la seal de entrada est definida por la
8
capacidad para transferir informacin entre en el sistema de reconocimiento y el
transductor. De estas dos propiedades depende el lmite de deteccin o resolucin, que
representa la mnima concentracin de analito detectable por el sensor en el ensayo.[8]
La sensibilidad del sensor vara frente a diferentes concentraciones de analito. Por
definicin, en el rango de respuesta lineal del sensor el valor de esta propiedad se
mantiene constante; esto quiere decir que cambios iguales en la concentracin del analito
producen cambios cuantitativos iguales en la seal de entrada.[4] El rango dinmico es
otro parmetro relacionado con la sensibilidad del sensor. Representa la zona de
medicin activa y est delimitada por la sensibilidad analtica como lmite inferior y por
la mxima concentracin de analito detectable como lmite superior.[4] A partir de este
ltimo punto, el lmite superior de deteccin, comienza la zona de saturacin y es en ella
donde la sensibilidad del sensor se vuelve nula; esto significa que la seal de entrada no
se modifica a pesar del aumento de analito en el medio.[3] De la futura aplicacin
prctica del instrumento va a depender cul de estos parmetros es ms importante
priorizar.

Facilidad de uso y costo: Aunque no depende directamente de la tecnologa de medicin,
la facilidad de uso y el bajo costo siempre son propiedades deseables en cualquier tipo de
instrumento. Los sensores colorimtricos son particularmente sencillos de utilizar debido
a que evitan los dispositivos de procesamiento electrnico. De todas formas, en el diseo
de nuevos sensores de este tipo se busca, entre otros aspectos, la posibilidad de reducir al
mnimo las operaciones previo a la medida o mejorar la interfaz de reaccin de manera
de hacer lo ms cmodo posible la visualizacin del cambio de color.[8] Para los
sensores que funcionan de manera discreta y en anlisis no recuperables, es importante
evaluar el costo que implica cada ensayo particular. El precio por anlisis va a estar
determinado por el valor de cada uno de los componentes del sensor y por el volumen
utilizado en la medida.[8]

Rendimiento y Robustez: Tanto el rendimiento (cantidad de ensayos que se pueden
realizar por unidad de tiempo) como la robustez (adaptabilidad del sensor para analizar
diferentes matrices) determinan las posibilidades reales de aplicacin de un sensor para,
por ejemplo, ensayos tipo barrido.[8] En los sensores colorimtricos, es ideal que la
respuesta frente al agregado de la muestra sea inmediata y que no existan demasiados
elementos de la matriz que puedan interferir en el resultado del ensayo.


SENSORES COMO INTRUMENTOS PARA ANLISIS DESCENTRALIZADOS

Uno de los aspectos ms interesantes que presenta el desarrollo de sensores qumicos es
la posibilidad de descentralizar fsicamente el proceso analtico. Durante mucho tiempo,
el anlisis qumico estaba centralizado en grandes laboratorios, lejos de los sitios de
muestreo, y solo poda ser llevado a cabo por personal especializado. La evolucin de
esta forma de trabajo se vea muchas veces limitada por las caractersticas fsicas y de
tamao del instrumental necesario para las medidas y por la compleja operativa que
implicaba el anlisis. Sin embargo, el rpido avance cientfico de las ltimas dcadas ha
permitido reemplazar a los grandes y altamente concentrados centros de procesamiento
por instrumentos mviles y automatizados que permiten realizar el anlisis en el mismo
sitio de muestreo.[3] Ests tcnicas de anlisis que utilizan sensores pequeos y
transportables cada vez atraen ms el inters de parte de los desarrolladores y de los
analistas. En especial, los sensores colorimtricos se adaptan muy bien a este tipo de
9
aplicaciones debido a que no precisan de ningn tipo de instrumental analtico que
procese la informacin del transductor.[2] Otros ejemplos de sensores automticos y
transportables son los sensores electroqumicos, como los electrodos selectivos para
iones o el electrodo de vidrio para pH.
El carcter de la seal de transduccin de los sensores colorimtricos muchas veces hace
imposible su utilizacin como instrumentos cuantitativos, especialmente si el diseo no
incorpora dispositivos informticos que procesen el cambio de color. En determinados
sistemas, resulta demasiado complejo interpretar las diferentes transiciones cromticas
dentro del rango dinmico y por eso no es fcil asociar a cada concentracin de analito
un tono de color en particular. Incluso, puede que el rango dinmico del sensor sea
demasiado estrecho o directamente inexistente como consecuencia del modo en que
funciona la seal de entrada. As, para facilitar el diseo, muchos sensores colorimtricos
reconocen nicamente dos estados del analito en la matriz: ausencia / presencia, o mejor,
concentracin por debajo de X / concentracin por encima de X, siendo X el valor
umbral de concentracin de analito que activa el sensor y permite el cambio de color.
Este modo de funcionamiento convierte a los sensores colorimtricos en instrumentos
ideales para ensayos tipo positivo / negativo. La informacin que se obtiene de estos
ensayos se reduce a si la concentracin del analito en la muestra est por debajo o por
encima de este valor umbral.
Las aplicaciones prcticas de los sensores tipo positivo / negativo muchas veces estn
asociadas a procedimientos de preseleccin, que funcionan como anlisis tipo barrido o
screening. Esta forma de ensayo sirve como filtro primario ya que permite analizar un
grupo relativamente grande de muestras y seleccionar aquellas de concentracin superior
al valor umbral del test para su posterior anlisis por metodologas aprobadas
internacionalmente. La preseleccin evita el anlisis cuantitativo de la totalidad de las
muestras y se vuelve sumamente ventajosa en casos donde la ejecucin de este ltimo es
costosa en tiempo y dinero.
Adems del resultado del ensayo en la forma positivo/negativo, los sensores
colorimtricos renen otras propiedades (facilidad de uso, resultado del ensayo
instantneo, etc.) que los convierte en instrumentos ideales para esta aplicacin.

















10
PLOMO


PROPIEDADES GENERALES, APLICACIONES Y EXPOSICIN AL PLOMO

El Plomo (Z = 82, masa atmica = 207,2 uma) es un metal pesado que ha venido siendo
empleado por el hombre significativa y constantemente desde pocas pre-industriales. Su
amplia distribucin y fcil extraccin y manejo han favorecido su explotacin a lo largo
de la historia y han permitido su uso en una gran cantidad de aplicaciones social e
industrialmente relevantes.[9]
Desde pocas del imperio romano (500 A.C.) y hasta no hace muchas dcadas atrs el
Plomo metlico era el material ms comnmente utilizado en la construccin de caeras
para la distribucin de agua. Ms recientemente (principios del s. XX), diferentes
propiedades qumicas asociadas a este metal permitieron su incorporacin,
principalmente como aditivo, en varios productos relacionados a la industria
petroqumica, como la gasolina, las pinturas o las bateras.[9]



Smbolo qumico Pb Grupo, perodo, bloque 14, 6, p
Nmero atmico 82 P. de Fusin 327.4 C
Peso atmico 207.2 Densidad 11.34 g/cm
3

Configuracin electrnica [Xe] 4f
14
5d
10
6s
2
6p
2
Electronegatividad 2.33
Radio atmico 175 pm Estados de Oxidacin 2, 4
Aspecto Metal gris-azulado, tono opaco y apagado. Flexible e inelstico
Abundancia isotpica
204
Pb (1,4%),
206
Pb (24.1%),
207
Pb (22.1%),
208
Pb (52.4%)


El extendido uso industrial ha convertido al Plomo en un elemento habitual en el entorno
urbano y su presencia puede rastrearse en el suelo, el aire y el agua de las zonas
altamente industrializadas. Sin embargo, el contacto directo y la exposicin constante
con este metal resulta por dems problemtica y es una causa comn asociada a varias
patologas mdicas. La contaminacin por Plomo es uno de los problemas de salud ms
comunes en varias regiones del mundo; se cree que afecta a 1 de cada 5 personas que
vive en reas urbanizadas. En especial, la poblacin que ms sufre las consecuencias de
este problema son los nios menores de 5 aos.[10]
La contaminacin ambiental y el origen de las fuentes de exposicin estn directamente
relacionadas al uso industrial del Plomo en diferentes productos:
La gasolina con Plomo ha sido utilizada durante gran parte del s. XX y en Uruguay su
comercializacin recin se prohibi en 2003. En la gasolina, el Plomo forma parte del
compuesto orgnico tetraetilo de Plomo que acta como antidetonante.[10] La liberacin
de los gases posterior a la quema del combustible en los motores de combustin re-
introduca al metal en la atmsfera, resultando una de las fuentes de contaminacin ms
importantes en el ambiente urbano. Estudios recientes tambin han demostrado que la
principal causa de contaminacin con Plomo en suelos se debe a la deposicin de estos
gases liberados por los automviles.
La presencia de Plomo en pinturas, en especial aquellas empleadas en juguetes para
nios y pinturas para exteriores, tambin ha sido reportada como una importante fuente
Tabla 1: Propiedades generales del Plomo
11
de exposicin. En Estados Unidos, el uso de pinturas con Plomo fue prohibido en 1978
luego de que se registraran varios casos de intoxicacin en nios asociada a esta fuente.
Uruguay todava no cuenta con una legislacin que regule la fabricacin de este tipo de
pinturas, pero las industrias del rea ya han comenzado a reducir el contenido de Plomo
en sus productos.[10]
Muchos de los desechos originados en fbricas vinculadas a la industria pesada
(fundiciones, combustibles, etc.) tienen alto contenido de Plomo, y se ha reportado que la
contaminacin de los suelos aumenta significativamente en las reas que bordean estos
establecimientos.[11] La situacin se vuelve especialmente comprometida cuando
existen zonas pobladas en las cercanas de las fbricas que, como consecuencia de su
ubicacin, resultan fuertemente afectadas por las emisiones industriales. La utilizacin
de desechos con Plomo (bateras, residuos industriales, etc.) como relleno sanitario
tambin favorece al aumento de la concentracin del metal en el suelo.[9, 12]
Otras fuentes de exposicin ambiental reportadas por varios autores son: agua para beber
que circula por caeras de Plomo, cosmticos de fabricacin casera, lozas vidriadas y
latas con soldadura de Plomo utilizadas para almacenar alimentos.[12]
Aparte de las fuentes ambientales, el Plomo tambin es un gran contaminante qumico de
los lugares de trabajo, y la exposicin y contaminacin ocupacional afecta a una gran
cantidad de trabajadores de diferentes industrias, como los recuperadores de Plomo de
fuentes secundarias (fundiciones), los plomeros que trabajan con caeras antiguas o los
fabricantes de pinturas y bateras.[13]


CONTAMINACIN POR PLOMO

El Plomo ambiental de las diferentes fuentes puede ser inhalado y absorbido a travs del
sistema respiratorio o ingerido y absorbido por el tracto gastrointestinal. La intoxicacin
o envenenamiento se conoce como Plombemia, y en su estado ms avanzado, cuando la
intoxicacin es crnica, se denomina Saturnismo. El Plomo absorbido circula por el
torrente sanguneo y se distribuya a los diferentes sistemas del organismo. En especial,
los sistemas que resultan ms afectados son el nervioso, gastrointestinal, renal y
hematopoytico.[9]

A nivel bioqumico, la toxicidad del Plomo es consecuencia de varias interacciones:
El Plomo tiene especial afinidad por el grupo sulfihidrilo (SH) de las protenas, y se une
a ellos a travs de enlaces covalentes (346 1.7 kJ mol
-1
). La unin del Plomo a este
tomo modifica la geometra de la protena y altera completamente la funcin
enzimtica.[14] Estudios ms recientes tambin han revelado que se une fuertemente a
los sitios del zinc y el calcio en diferentes protenas, aprovechndose de cierta similitud
qumica con estos dos elementos (en la carga, por ejemplo); el intercambio de tomos de
Plomo por zinc o calcio tambin altera la estructura proteica y la actividad de la
enzima.[15] En el sistema hematopoytico, la biosntesis del grupo hemo se ve
especialmente afectada, incluso por cantidades traza del metal en la sangre. El Plomo
sustituye a los tomos de zinc en la enzima cido-aminolevulnico deshidratasa (ALAD),
responsable de la sntesis de precursores de porfirina a travs de la conversin de cido
aminolevulnico (ALA) a porfobilingeno (PBG). La sustitucin en el centro cataltico
inhibe la actividad de la protena y desencadena la acumulacin del precursor ALA,
potente neurotxico que puede depositarse en los tejidos si no excreta con suficiente
rapidez.[16] Niveles de ALA por encima del promedio metablico se utilizan como
indicadores indirectos de intoxicacin por Plomo. Los casos de anemia reportados y
12
vinculados de forma directa con la contaminacin con Plomo son resultado de la
deficiencia de grupos hemo, como consecuencia del bloqueo en la ruta de sntesis de
porfirinas.[17]
La contaminacin con Plomo se diagnostica directamente a travs del anlisis de sangre.
*

Debido que este metal no cumple ningn rol biolgico en el organismo, no existen
niveles de contaminacin recomendables ni 100% seguros. Sin embargo, el cuerpo
humano ofrece cierto margen de tolerancia con este elemento y eso permite que los
organismos internacionales pueden fijar diferentes lmites de intoxicacin.[10]





Para el Center of Disease Control (CDC) de Estados Unidos y el World Health
Organization (WHO), cantidades de Plomo en sangre por encima de 100 g/L (100 ppb,
o aproximadamente 0.5 M) son suficientes para comenzar a tomar medidas de
intervencin y combate activo. Adems, el CDC tambin tiene elaborado una
clasificacin con los diferentes niveles de contaminacin y las recomendaciones mdicas
y tratamientos para cada situacin (Tabla 2).[10] Por otro lado, la Organizacin Mundial
de la Salud (OMS) fija el lmite de tolerancia biolgica en 100 g/L en nios y 250 g/L
en adultos.[18]

*
De acuerdo a la referencia bibliogrfica el !"rmino plombemia es u!ili#ado indis!in!amen!e para
referirse a la pa!olog$a m"dica asociada a la in!o%icaci&n o al parme!ro 'ue indica el con!enido real de
Plomo 'ue circula en sangre incluso en personas no con!aminadas ( 'ue no manifies!an ning)n s$n!oma*
la unidad de medida de es!e parme!ro es masa de Plomo sobre +olumen de sangre, -n es!e !e%!o se
u!ili#a la segunda acepci&n,
Clase Plombemia (g/L) Recomendaciones y Tratamiento
I 0 90 Sin peligro inmediato
IIA 100 - 140
Buscar fuente/s de exposicin y eliminarla/s; educacin
acerca de la exposicin y prevencin de la contaminacin
con Plomo. Realizar controles peridicos
IIB 150 - 190
Buscar fuente/s de exposicin y eliminarla/s; educacin
acerca de la exposicin y prevencin de la contaminacin
con Plomo. Realizar controles peridicos. Si se mantienen
los niveles de Plomo, re-investigar el medio y realizar
intervencin eficaz sobre la/s fuente/s.
II 200 - 440
Retirada inmediata de la/s fuente/s de exposicin. El
paciente debe recibir tratamiento mdico.
IV 450 - 690
Retirada inmediata de la/s fuente/s de exposicin. El
paciente debe recibir atencin mdica para tratamiento con
quelantes.
V > 700
Nivel de emergencia mdica. El paciente debe ser
hospitalizado de inmediato y recibir tratamiento con
quelantes.
Tabla 2: .lasificaci&n ( recomendaciones de la .en!ral of Disease .on!rol /.D.0 para los
diferen!es ni+eles de Plomo en sangre
13
En Uruguay, la problemtica de la contaminacin con Plomo se ignor completamente
durante varias dcadas y recin adquiri notoriedad en 1996, despus del aparicin del
trabajo publicado por el Departamento de Toxicologa e Higiene Ambiental de la
Facultad de Qumica de la Universidad de la Repblica.[12] En el artculo, se reportaba
que el 36% de los nios analizados (ms de 1 de cada 3) tenan niveles de plombemia por
encima del lmite de intervencin de la CDC y WHO (100 g/L) (Figura 1). Este
porcentaje, aclaran, es sensiblemente mayor a los obtenidos en estudios similares
realizados en pases europeos. Tambin se reportaba que haba una marcada correlacin
entre el nivel de intoxicacin y la edad de los nios; los valores de plombemia ms altos
se registraban en nios de menor edad. Esta relacin resulta por dems preocupante, ya
que la intoxicacin a edades muy tempranas compromete las etapas ms importantes del
desarrollo biolgico.
Desde la publicacin de este trabajo se han tomado algunas medidas (la eliminacin del
Plomo en las naftas, por ejemplo) que han permitido mitigar o directamente eliminar
diferentes fuentes de exposicin. Sin embargo, los casos de contaminacin todava no
han desaparecido y el problema central est lejos de solucionarse. Por estos motivos
resulta necesario tomar las medidas adecuadas de prevencin y accin para erradicar al
problema completamente.








Para disear un sistema de contencin que permita eliminar o mitigar la contaminacin
con Plomo es necesario, ante todo, delimitar a la poblacin de riesgo. Despus, el
diagnostico clnico de todas estas personas permitir determinar quines estn
contaminadas y precisan del tratamiento mdico correspondiente.
En Uruguay, el anlisis de Plomo en sangre slo se realiza en la Facultad de Qumica
(mtodo de espectrometra de absorcin atmica con horno de grafito) y en el Hospital
Filtro (mtodo voltamperomtrico). Sin embargo, la capacidad analtica de estos dos
establecimientos es insuficiente para diagnosticar a toda la poblacin de riesgo. En este
Figura 1: 1esul!ados del es!udio de con!aminaci&n por Plomo reali#ado por la 2acul!ad de 3u$mica de la
4ni+ersidad de la 1ep)blica /4rugua(0, 5e mues!ran los ni+eles de Plomo en sangre en ni6os de diferen!es
edades /c$rculos7 +arones* cruces7 ni6as0, 8a l$nea a 100 9g:8 corresponde con el l$mi!e de in!er+enci&n de
la ;<=, >dap!ado de 1ef, ?12@
14
contexto, el desarrollo de un sensor sencillo y barato para la deteccin de Plomo en
sangre como el propuesto en este trabajo, permitira aumentar esta capacidad de medida,
de forma de poder estudiar a toda la poblacin de riesgo y detectar a las personas
intoxicadas para incorporarlas al sistema primario de salud. Un sensor colorimtrico
positivo/negativo puede ser utilizado en ensayos tipo barrido y permitir analizar
mltiples muestras (toda la poblacin de riesgo), de manera de seleccionar aquellas
potencialmente contaminadas para su posterior anlisis por las metodologas aprobadas
internacionalmente.
Adicionalmente, el sensor tambin facilitara el anlisis obligatorio de plombemia de los
trabajadores expuestos a este contaminante, segn estipula la Ley No. 17.774
promulgada por el Poder Ejecutivo en el ao 2004.[13]


IDENTIFICACIN DE PLOMO

Existen varios mtodos, clsicos e instrumentales, que permiten la deteccin y la
cuantificacin de Plomo. En una solucin acuosa tpica la determinacin cualitativa del
in Pb(II) est incorporada en las marchas analticas clsicas. Dentro de estos mtodos,
la verificacin se realiza mediante el agregado de cido clorhdrico para lograr la
precipitacin de cloruro de Plomo (PbCl
2
) y otras sales de cloro (AgCl o Hg
2
Cl
2
, por
ejemplo), la filtracin y redisolucin del precipitado en agua caliente (el cloruro de
Plomo es el nico que se disuelve en este caso), y la formacin de un nuevo precipitado
amarillo frente al agregado de cromato de potasio a la solucin en caliente.[19]
La cuantificacin analtica clsica, el Mtodo de la Ditizona, es un procedimiento
colorimtrico que tiene como principio la extraccin del Pb(II) de una solucin acuosa
acidulada con ditizona en cloroformo para formar ditiozionato de Plomo, de color rojo
cereza caracterstico; la absorbancia del extracto orgnico a 460nm sirve como indicador
de la concentracin de Pb(II) en la solucin original. Sin embargo, este procedimiento
ha cado en desuso frente a los mtodos instrumentales ms recientes debido a su
costosa operativa, poca precisin y relativamente alto lmite de deteccin.[19-20]
Los mtodos instrumentales comnmente empleados y recomendados para la
determinacin de Plomo son: Espectrometra de Absorcin Atmica a la Llama (FAAS)
y en Horno de Grafito (GFAAS), Espectrometra de Emisin Atmica por Plasma
Acoplado Inductivamente (ICP/AES), Espectrometra de masa por Plasma Acoplado
Inductivamente (ICP/MS), y Voltamperometra de redisolucin andica (ASV).[21] Los
lmites de deteccin de cada tcnica pueden variar de acuerdo a la matriz y el tratamiento
realizado a la muestra (Tabla 3). En general, la mayora de estos equipos precisan de
muestras previamente digeridas y con pocas especies ajenas al analito que puedan
interferir en la medida.[19, 21]
El anlisis tpico por FAAS puede detectar niveles de Plomo en el entorno de 0.1 ppm,
mientras que la incorporacin del horno de grafito en GFAAS puede llevar al lmite de
deteccin a casi 1 ppb. Este ltimo procedimiento es el recomendado por los diferentes
organismos de referencia (EPA, OMS) para realizar el anlisis de Pb(II) en sangre.[21]
Los mtodos inductivos tambin tienen lmites de deteccin en el entorno de partes por
billn (10 ppb para ICP/AAS y 0.1 ppb para ICP/MS), pero requieren de tratamientos
previos ms complejos e instrumental ms sofisticado y costoso. El procedimiento
voltamperomtrico puede medir concentraciones de hasta 5 ppb.[21]



15























*
1esul!ados e%perimen!ales ob!enidos en el 8abora!orio de Aioma!eriales 2acul!ad de .iencias,
Mtodo Analtico Tratamiento de la Muestra
Lmite de
Deteccin
(ppb)
Referencia
FAAS Digestin con HNO
3
500 [22]
FAAS
Digestin con HNO
3
, quelacin con
APDC y extraccin con metil-
isobutil-cetona
50 [23]
GFAAS
Digestin y dilucin con Triton X-
100

, HNO
3
y fosfato de amonio
2 [24]
GFAAS Incineracin en mufla y redisolucin 4 [25]
ICP/MS Incineracin en mufla y redisolucin 0.1 [25]
ICP/AES Digestin con HNO
3
-HClO
4
-H
2
SO
4
10 [26]
ASV
Digestin en HClO
4
o extraccin con
Metexchange

5
*

Tabla 3: B"!odos u!ili#ados en anlisis de Plomo en sangre !ra!amien!o sobre la mues!ra (
l$mi!e de de!ecci&n de cada uno de ellos
16
SENSORES COMO PRODUCTOS DE INVESTIGACIN
INTERDISCIPLINARIA


De acuerdo a las caractersticas y exigencias de los diferentes componentes de un sensor
qumico, existe la posibilidad de incorporar y combinar en un mismo dispositivo
materiales que, en principio, tienen muy pocos elementos en comn. Cada uno de los
componentes que forma parte del sensor puede provenir de reas del conocimiento
cientfico completamente dismiles, pero que sin embargo son capaces de proveer los
elementos que mejor se ajustan a una de las funciones especficas del instrumento. La
integracin de estos elementos en un nico sistema y la capacidad de transferir y vincular
la informacin entre ellos permite construir dispositivos sumamente novedosos y
efectivos.
En los ltimos aos, la utilizacin e integracin de diferentes materiales, especialmente
aquellos productos asociados a la investigacin en Nanotecnologa, ha permitido el
desarrollo de una enorme cantidad de instrumentos de medicin. En especial, el
desarrollo de sensores qumicos a partir de nanopartculas metlicas y ADN funcional se
ha transformado en un rea de investigacin con excelentes resultados.[2] Las
nanopartculas metlicas pueden actuar como sistema responsable de la seal de
deteccin, debido a que sus propiedades fsicas (color, campo magntico asociado,
conductividad, etc.) cambian con el estado de agregacin del sistema. Por otro lado, el
ADN funcional puede actuar como sistema de reconocimiento de diferentes especies
qumicas.[2, 7]
Los sensores construidos a partir de estos dos elementos tienen las caractersticas tpicas
de los instrumentos de medicin para anlisis descentralizados. En especial, los sensores
colorimtricos diseados con nanopartculas de Oro presentan un enorme potencial en
este tipo de aplicaciones analticas.
En los ltimos aos (sobre todo en la segunda mitad de la pasada dcada) varios equipos
de investigacin han desarrollado dispositivos capaces de censar e identificar la
presencia de diferentes analitos.[2] Sin embargo, muy pocos de los sensores
desarrollados han sido utilizados en aplicaciones reales, a pesar de las varias ventajas y
facilidades que, en principio, puede presentar su empleo en estos casos. Probablemente,
uno de los objetivos a futuro consista en encontrar diferentes campos de aplicacin que
puedan verse beneficiados con el empleo de este tipo de sensores. En este sentido, el
desarrollo de un sensor colorimtrico para la deteccin de Plomo y su potencial uso en
anlisis de sangre implicara una primera aproximacin a una aplicacin prctica real de
un diseo que, hasta ahora, solo ha sido ensayado en el laboratorio en muestras sintticas
sin inters analtico.
El sensor colorimtrico para la deteccin de Plomo funciona a travs de la integracin de
dos componentes, responsables por separado de la transduccin de la seal y el
reconocimiento del metal.[27] Estos dos materiales son el resultado de reas del
conocimiento completamente diferentes; por tanto, sus principios pueden ser estudiados
y entendidos por separado. Una vez detalladas las propiedades de cada uno de ellos, va a
ser posible comprender cmo se integran y permiten que funcionen como instrumento de
medicin.




17
NANOTECNOLOGA Y NANOPARTCULAS


INTRODUCCIN

La Nanotecnologa es un rea de investigacin interdisciplinaria que trata sobre las
diferentes estructuras de la materia a escala nanomtrica. El prefijo nano hace referencia
a la milmillonsima parte de una unidad, en este caso, la milmillonsima parte de un
metro. A esta escala, se logra manipular la materia directamente a nivel atmico y
molecular.[28]
La United States Science Foundation define a la Nanociencia/Nanotecnologa como el
estudio de materiales y sistemas que poseen las siguientes propiedades clave:
1- Dimensin: al menos una de las dimensiones del sistema debe ser menor de 100nm
2- Proceso: diseadas con metodologas que permiten controlar los atributos fsicos y
qumicos de estructuras a escala molecular.
3- Propiedades de construccin-en-bloque: los sistemas nanoestructurados pueden ser
combinadas para formar estructuras ms grandes, pero que conservan las propiedades
de sus bloques constituyentes.[29]
La Nanotecnologa se nutre de varias disciplinas cientficas clsicas, como la fsica, la
qumica o la informtica, y sus avances, la creacin de nuevas estructuras, afecta y tiene
aplicaciones en reas tan diversas como la medicina, la agroindustria o las
telecomunicaciones.[28-29]
Hay varias razones que explican por qu la Nanotecnologa se ha vuelto un rea de
investigacin tan relevante en los ltimos tiempos:
- Las propiedades cunticas de los electrones se ven influenciadas por variaciones en su
entorno ms cercano, definido por un radio de unos pocos nanmetros de distancia. En
los elementos nanoestructurados, con una distribucin definida y controlada a escala
atmica durante la sntesis, el entorno diferencial en estos electrones permite que algunas
propiedades micro y macroscpicas del sistema (propiedades pticas o magnticas,
conductividad, etc.) pueden variar sin que cambie la composicin qumica del material
original.
- Las nanomateriales poseen una relacin superficie/tamao muy alta, y pueden tener una
densidad y conductividad mayor a las estructuras normales. Estas propiedades posibilitan
su uso en una enorme cantidad de aplicaciones, que van desde el almacenamiento de
energa y el transporte de frmacos al desarrollo de dispositivos elctricos y
semiconductores.
- La combinacin de procesos biolgicos, organizados de forma sistemtica a escala
atmica y molecular, y la investigacin y desarrollo de nanomateriales capaces de
interactuar con estos sistemas tambin resulta un campo de investigacin muy
prometedor. Los trabajos en esta rea permitirn construir nanoestructuras artificiales, y
vincularlas con sistemas vivos para potenciar funciones especficas en clulas y
tejidos.[30]


HISTORIA

Se puede decir que la Nanotecnologa como disciplina cientfica tuvo un nacimiento
terico varios aos antes de consolidarse como campo de investigacin real. En 1959,
el fsico Richard Feynman en la famosa conferencia titulada There's Plenty of Room at
18
the Bottom, planteaba cmo la posibilidad de manipular la materia tomo por tomo no
viola ninguna ley de la naturaleza y que s todava no se haba alcanzado ese nivel de
control sobre los elementos se deba solo a limitaciones puramente tecnolgicas.[31] A
partir de este razonamiento, tambin planteaba como el cambio en la escala de
manipulacin poda alterar las magnitudes de varios fenmenos fsicos y conjeturaba
sobre el potencial de las estructuras creadas con este tipo de tecnologa.[31] Sin
embargo, no fue hasta la dcada de los 80s que la Nanotecnologa abandon su status de
hiptesis como resultado de la convergencia de varios avances tcnicos y cientficos
realizados en esos aos. La invencin del microscopio de efecto tnel (STM) en 1981, el
desarrollo de la microscopa de fuerza atmica (AFM) en 1984 y el descubrimiento de
los fulerenos en 1985, son los tres grandes acontecimientos que suelen definir el
nacimiento de esta ciencia.[29] As, una vez consolidada como disciplina cientfica, la
Nanotecnologa tambin incorpor y fue asociada a otras reas de investigacin ya
existentes, como por ejemplo, el estudio de interfaces y sistemas coloidales.[32] El
trabajo en Nanotecnologa continu creciendo en las siguientes dcadas, y a principios de
este nuevo siglo logr consolidarse como una de las disciplinas con mayor proyeccin y
potencial en todo el mbito cientfico. Actualmente, las investigaciones en
Nanotecnologa constituyen un espectro de actividades que abarca casi todas las
disciplinas cientficas clsicas, y que prometen ser la plataforma de la prxima gran
revolucin industrial. Sin embargo, el rpido desarrollo de estas tecnologas y las
caractersticas de los avances logrados hasta ahora plantean una enorme cantidad de
debates sobre las implicancias, regulaciones y posibles aplicaciones de los resultados, y
los productos y beneficios sociales que podemos obtener de ellos. En este sentido, los
organismos internacionales y estatales, con una participacin activa de toda la
comunidad cientfica, tienen la necesidad de evaluar el impacto en todas sus aristas,
social, tica, ambiental y poltica, con el objetivo de que la investigacin en este campo
reporte los mayores beneficios a la sociedad en su conjunto.[28-29]


NANOPARTCULAS METLICAS

Como ya se mencion anteriormente, las aplicaciones y el estudio de los sistemas
coloidales metlicos es anterior a la consolidacin de la Nanotecnologa como disciplina
cientfica. Las nanopartculas de oro, plata y hierro (o coloides metlicos, como se
llamaban en ese entonces) se han utilizado como pigmentos en vidrios y telas desde hace
varios siglos debido a sus propiedades pticas y colores nicos. La sntesis de este tipo
de estructuras no se aleja demasiado de los procedimientos qumicos clsicos, y por eso
fue posibles desarrollar varias tcnicas de sntesis incluso antes de conocer los
fenmenos fsicos detrs de estos sistemas.[28]

En la dcada de 1850, Michael Faraday comenz con el estudio cientfico de los sistemas
coloidales metlicos, y en particular, de los coloides con oro. El trabajo en esta rea le
permiti desarrollar un mtodo de sntesis de nanopartculas de Oro puras por medio de
la reduccin con fsforo. Ms tarde, las bases fsicas de los fenmenos pticos
observados en las nanopartculas fueron descritas en 1861 en las ecuaciones de Maxwell.
En 1904, Gustav Mie present soluciones algebraicas exactas a estas ecuaciones que
permitan describir la dispersin de las ondas electromagnticas por cuerpos
esfricos.[28, 33] A travs de estas soluciones, es posible calcular los coeficientes de
extincin molar y las propiedades pticas de, por ejemplo, las nanopartculas esfricas de
oro, de acuerdo a la ecuacin:
19
(1)

donde V es el volumen de la partcula, c la velocidad de la luz, la frecuencia angular de
la onda electromagntica incidente,
m
la constante dielctrica del medio externo, y
1
y

2
describen las componentes real e imaginaria respectivamente de la funcin dielctrica
del material de la partcula.[34]

El coeficiente de extincin,
ext
,

se vuelve significativo a medida que el denominador
adquiere dimensiones cada vez menores; esto se logra cuando
2
() = -2
m
.[34]
La ec. 1 tambin permite calcular la frecuencia del pico de mxima absorcin para
partculas esfricas de volumen y medio externo fijo; al analizar
ext
en funcin de se
puede obtener una aproximacin terica del espectro de absorcin para cualquier sistema
compuesto por figuras geomtricas de este tipo.

Los conceptos plasmn y resonancia del plasmn estn directamente relacionados con
las propiedades pticas de las nanopartculas. Cuando una partcula metlica esfrica es
irradiada con una onda electromagntica, la oscilacin del campo elctrico de la onda
genera una oscilacin coherente de los electrones del metal (Figura 2).[33] Este
fenmeno se denomina resonancia del plasmn, por analoga al movimiento de los iones
en un plasma.[28, 35] La frecuencia de vibracin de esta nube electrnica, el plasmn
(
p
), se relaciona con la energa de acuerdo a la ecuacin de Planck:

(2)

donde E
p
es la energa del plasmn y h es la constante de Planck.[28]








En un cuerpo metlico cualquiera, el alcance de la resonancia del plasmn depende
directamente de la relacin rea/volumen, la forma geomtrica y el tamao de la/s
partcula/s. Para objetos de dimensiones macroscpicas, la gran mayora de los
electrones se encuentran confinados dentro del volumen interno del metal, formando
parte del enlace metlico del bloque. Como consecuencia, la energa y el momento de los
fotones que pueden incidir sobre la sustancia, y la cantidad de electrones inmediatos a la
interfase metal/ambiente no son suficientes para establecer una resonancia del plasmn
significativa. En cambio, en algunos objetos nanoestructurados de geometras especficas
y que poseen una relacin rea/volumen mucho ms importante, la incidencia de las
Figura 2: -s'uema ilus!ra!i+o de la resonancia del plasm&n, 5e represen!a la oscilaci&n de la nube
elec!r&nica del me!al /en +erde0 cuando una onda elec!romagn"!ica a!ra+iesa la par!$cula /en gris0,
>dap!ado de 1ef, ?35@
20
ondas electromagnticas sobre la extensa superficie metlica origina una resonancia
apreciable de los electrones inmediatos a la interfase. La vibracin de este grupo de
electrones se denomina resonancia del plasmn superficial (SRP, por sus siglas en
ingls), y se vuelve significativa cuando el nmero de electrones en la superficie es de
rdenes similares al nmero de electrones internos responsables del enlace metlico
intra-partcula.[28]
En estos sistemas, la frecuencia de la onda electromagntica absorbida y responsable de
la resonancia depende tambin del entorno ms inmediato del elemento. En algunas
nanopartculas metlicas, la frecuencia de este pico mximo de absorcin cae dentro del
rango visible del espectro y eso genera los colores caractersticos de los coloides
metlicos.[28, 35]


NANOPARTCULAS DE ORO

Dentro de los elementos que pueden formar nanoestructuras, las nanopartculas de Oro
(Z = 79, masa atmica = 197.0 uma) han sido uno de los sistemas ms estudiados y uno
de los que ha encontrado ms aplicaciones prcticas hasta ahora. Las inusuales
propiedades pticas de las nanopartculas de Oro (AuNPs a partir de ahora), su
electroqumica dependiente del tamao, y su alta estabilidad qumica las han convertido
en un excelente modelo para la investigacin de varios fenmenos, como el auto-
ensamblaje, biomarcado, catlisis, teoras de transferencia de electrones, transferencia de
fase o crecimiento de cristales. Estas mismas propiedades tambin han permitido su
aplicacin e incorporacin en dispositivos e instrumentos de una amplia variedad de
disciplinas vinculadas con alta tecnologa, como la microscopa electrnica, la
electrnica, la ciencia de los materiales y el desarrollo de sensores para metales,
molculas orgnicas y biomolculas.[32, 36]

Hasta el momento se han desarrollado varios mtodos que permiten sintetizar AuNPs.
Sin embargo, la mayora de ellos comparte el mismo principio de sntesis y la misma
reaccin electroqumica: la nanoestructuras de Au metlico se forman por la reduccin
controlada de iones Au(III) o Au(I) disueltos en un medio lquido. Las caractersticas del
medio de reaccin y la naturaleza y concentracin del agente reductor determinan las
propiedades, el tamao y la forma de las AuNPs obtenidas en el proceso. Los distintos
mecanismos de sntesis requieren, adems, la presencia de un agente estabilizador que
recubra a las nanopartculas formadas y mantenga el sistema coloidal estable.[28]

El mtodo de sntesis de AuNPs ms simple y difundido fue desarrollado por J.
Turkevich en 1951, refinado por G. Frens en la dcada del setenta, y es universalmente
conocido por el apellido de estos dos cientficos (Mtodo de Turkevich o Mtodo de
Frens segn la referencia bibliogrfica). El procedimiento, que permite obtener partculas
esfricas monodispersas en solucin acuosa, es una normalizacin de los procesos de
sntesis utilizados histricamente.[37-38]
La reaccin de los iones Au(III) (derivados del cido tetraclorourico, HAuCl
4
) se realiza
en un medio acuoso calentado a 100, y utiliza citrato de sodio como agente reductor.
Este ltimo compuesto tambin recubre y acta como agente estabilizador de las AuNPs
formadas en la reaccin.[37] El proceso de sntesis en el mtodo de Turkevich est
gobernado por un mecanismo termodinmico; esto quiere decir que la alta energa del
sistema (en este caso, consecuencia de la temperatura del solvente), el exceso de agente
21
reductor y el extenso tiempo de reaccin determinan la formacin de AuNPs esfricas,
la forma geomtrica ms estable termodinmicamente.
La formacin de las AuNPs en el proceso se evidencia por un rpido cambio del color
del sistema de reaccin: despus de la adicin de citrato de sodio, la solucin de HAuCl
4

pierde el color amarillo plido caracterstico de las soluciones de Au(III) y se torna rojo
intenso. Entremedio, durante el proceso de nucleacin, la solucin adquiere una
coloracin azul oscuro, casi negro. El pico de absorcin del plasmn superficial de la
solucin de AuNPs obtenidas por este mtodo se ubica entre 515-530nm y depende del
tamao promedio de las partculas sintetizadas.[34]

El mtodo de Turkevich permite sintetizar AuNPs con dimetros de entre 8-150nm y una
dispersin del 95% menor de alrededor de 10% en reacciones bien controladas.[34] El
dimetro promedio del producto de la sntesis depende de la proporcin HAuCl
4
/citrato
en el medio de reaccin. G. Frens estudi por primera vez esta relacin en 1973 y
demostr que el dimetro de las AuNPs aumenta a medida que se aade menos cantidad
de agente reductor (Figura 2).[38] En ese mismo estudio y en otros ms recientes
tambin se detalla que la sntesis de AuNPs mayores a 100nm utilizando este
procedimiento requiere de tiempos de reaccin ms extensos, y que, adems, no se
logran distribuciones homogneas de las partculas.[34, 38]
La influencia del citrato en el tamao de las AuNPs se cree se debe ms a su rol como
mediador del pH que como agente reductor. Al variar el pH del sistema, el propio citrato
de sodio y los complejos de Au(III) presentes en el medio de reaccin cambian
marcadamente su reactividad. Estas variaciones generan cambios estructurales que
influyen en las rutas de reaccin y en la naturaleza de los productos de la sntesis.[39]

=C1=5 BDC=D=5 D- 5EFC-5G5 D- >uFPs7

-l m"!odo de Arus! fue desarrollado por Arus! ( 5cHiffrin a principios de los no+en!a
( permi!e sin!e!i#ar >uFPs en sol+en!es orgnicos apolares, -l procedimien!o se
reali#a en un sis!ema compues!o por dos fases e in+olucra la reacci&n de >u/GGG0
presen!e en la fase acuosa con bromuro de !e!raoc!ilamonio /C=>A0 ( boroHidruro
de sodio 'ue ac!)an como an!icoagulan!e ( agen!e reduc!or respec!i+amen!e, -l
C=>A es un ca!ali#ador de !ransferencia de fase ( permi!e el pasaIe de las >uFPs del
agua al sol+en!e orgnico* adems !ambi"n ac!)a como agen!e es!abili#an!e en la
fase orgnica, =!ros m"!odos de s$n!esis 'ue emplean boroHidruro de sodio en
medio acuoso permi!en sin!e!i#ar >uFPs de dime!ros cercanos a 1nm, 5in embargo
los sis!emas coloidales 'ue se ob!ienen en es!as s$n!esis no suelen ser demasiado
es!ables,
-l m"!odo de Perraul! desarrollado en 2009 es una +arian!e del m"!odo de 2rens,
4!ili#a 'uinidrona como agen!e reduc!or e incorpora >uFPs 'ue ac!)an como origen
de siembra para la nue+a s$n!esis, -s!e procedimien!o permi!e ob!ener >uFPs de
en!re 30J250nm con una menor dispersi&n de !ama6os 'ue el m"!odo de CurKe+icH,
Cambi"n se Han desarrollado m"!odos de s$n!esis 'ue u!ili#an agen!es reduc!ores
!ales como aminocidos Hidrogeno gaseoso o incluso elec!rones libres direc!amen!e
in(ec!ados al sis!ema,
22
Figura 3: 1esul!ados de las diferen!es s$n!esis reali#adas por L, 2rens con can!idades +ariables de ci!ra!o de
sodio, 8a concen!raci&n de la M5olu!ion GGN es de 10 g de ci!ra!o de sodio : 8i!ro, t
blue
( t
red
indican el !iempo
'ue demor& a la soluci&n en !ornarse a#ul ( roIa respec!i+amen!e >dap!ado de 1ef, ?38@


El empleo de diferentes agentes reductores tambin puede variar el tamao de las AuNPs
sintetizadas. En especial, la rapidez en la descomposicin y/o el potencial redox de estos
reactivos tienen una marcada influencia en los productos de la reaccin. Una reduccin
rpida a travs de un agente reductor fuerte aumenta el ritmo de nucleacin, disminuye la
disponibilidad de tomos para el crecimiento del ncleo, e induce la formacin de
AuNPs ms pequeas. Este argumento explica por qu se obtienen nanopartculas ms
pequeas cuando se utiliza un agente reductor fuerte (borohidruro de sodio) en lugar de
uno dbil (citrato de sodio).

Las propiedades pticas de las AuNPs dependen de varios factores. Para nanopartculas
esfricas aisladas, el espectro de absorcin del sistema coloidal est fuertemente
determinado por el dimetro promedio de las especies en suspensin. El anlisis de las
soluciones de Mie y los resultados experimentales de diferentes estudios prueban que el
pico mximo de absorcin del plasmn superficial se corre a longitudes de onda mayores
a medida que aumenta el tamao de las AuNPs (Figura 4).[34, 40-41]
A nivel macroscpico, esto se traduce en una transicin de color que va del rojo-
anaranjado hacia el violeta-azulado (Figura 5).[42]




Figura 4: Posici&n del pico del plasm&n superficial en funci&n del !ama6o de las >uFPs, 5e grafican c$rculos
/resul!ados del clculo !e&rico0 ( !riangulos /resul!ados de medidas e%perimen!ales0 ( se reali#a un aIus!e
e%ponencial con !oda la serie de da!os, >dap!ado de 1ef, ?41@
23




Aparte, la forma general del espectro puede verse afectada por la presencia de
nanopartculas no esfricas, con la aparicin de nuevos picos o pisos de absorcin de
fondo ms significativos.[34]

El proceso de nucleacin y crecimiento durante la sntesis tambin ha sido ampliamente
estudiado. Las primeras hiptesis planteadas por Turkevich y Frens proponan dos etapas
diferenciadas en la formacin de AuNPs: primero, la rpida creacin de ncleos por la
reduccin de Au(III), y segundo, el crecimiento controlado por difusin de los
cristales originales.[37-38] El tamao y la distribucin de los cristales formados en el
proceso seguan los principios del Modelo de LaMer (Figura 6).[43] Sin embargo, este
modelo de desarrollo no se ajusta de forma exacta a las observaciones realizadas sobre la
evolucin temporal de las nanopartculas.






Un nuevo mecanismo descrito a principios de la dcada pasada propone una etapa
novedosa posterior a la nucleacin de los cristales: las nanopartculas de
aproximadamente 5nm de dimetro originadas en la primera nucleacin se auto-
ensamblan para formar una extensa red agregados, en forma de nanotubos. El dimetro
Figura 5: Fanopar!$culas esf"ricas de oro de diferen!es !ama6os sin!e!i#adas por el B"!odo de CurKe+icH,
5e obser+a la !ransici&n del color a medida 'ue aumen!a el dime!ro de la par!$cula, >dap!ado de 1ef, ?42@
Figura 6: -!apas de nucleaci&n ( crecimien!o para cris!ales ( nanopar!$culas seg)n el Bodelo de 8aBer,
>dap!ado de 1ef, ?43@
24
de estos nanotubos aumenta progresivamente a medida que se reduce el Au(III); despus
de alcanzar un espesor determinado, la red se fragmenta en pequeos segmentos que se
re-dispersan para formar las nanopartculas esfricas (Figura 7).[44-45] La red de
nanotubos sera responsable del color azul oscuro que adquiere el medio de reaccin al
momento de agregar el citrato de sodio.














QUMICA SUPRAMOLECULAR DE LAS NANOPARTCULAS DE ORO

Hasta ahora, solo se han descrito las propiedades pticas de los sistemas coloidales
estables, es decir, suspensiones de nanopartculas aisladas y recubiertas por un agente
estabilizante. En estos sistemas, la separacin existente entre las partculas suspendidas
evita posibles variaciones en las frecuencias de absorcin del plasmn superficial
asociado. En otras palabras, el entorno cercano de cada nanopartcula (responsable en
parte de la naturaleza del plasmn superficial) no se ve perturbado por la presencia
cercana de otro elemento (otra nanopartcula).
En gran medida, el responsable de mantener este aislamiento es el agente estabilizante: el
ion citrato, por ejemplo, recubre a las AuNPs y aprovecha la repulsin electrosttica
entre las diferentes molculas; as, cada nanopartcula se encuentra rodeada por una
esfera de carga negativa, que la mantiene aislada del resto de los elementos del coloide.
Sin embargo, la propia teora de Mie prev que las propiedades pticas de los sistemas
coloidales dependen de la distancia que separa a las nanopartculas en la suspensin. A
medida que dos nanopartculas se acercan en el espacio, la naturaleza y el perfil de
absorcin del plasmn superficial de cada una de ellas se ven afectados y cambian por el
nuevo entorno. En particular, la presencia de otra nanopartcula altera las constantes
dielctricas del medio externo, que, como se ve en la ec. 1, tiene una relacin directa con
los coeficientes de extincin del plasmn.[34]
El nuevo perfil de absorcin del plasmn superficial como consecuencia del cambio en la
distancia que separa a las nanopartculas se traduce en una transicin de color del sistema
Figura 7: -!apas de formaci&n de >uFPs, /a0 8os !omos de >u/GGG0 se adsorben sobre los n)cleos (
promue+en la formaci&n de agregados lineales, 8os nue+os !omos de >u reducidos se deposi!an
irregularmen!e en las ca+idades en!re los n)cleos, /b0 .uando las ca+idades es!n llenas los !omos se
deposi!an preferencialmen!e sobre los cris!ales ( crean cons!ricciones en el nano!ubo, /c0 5e eliminan las
regiones no cris!alinas de las ca+idades /proceso anlogo a la maduraci&n de =s!Oald, /d0 8os iones ci!ra!o
se +uel+en los agen!es de recubrimien!o dominan!es ( repelen a los !omos de >u/GGG0 ad(acen!es al
nano!ubo, 8a fuer#a de repulsi&n en!re los n)cleos originales separa a las par!$culas del !ubo ( se forman
las >uFPs esf"ricas recubier!as de ci!ra!o /e0, >dap!ado de 1ef, ?44@

25
coloidal. Para AuNPs, el pico bien definido en 515-530 nm pierde intensidad, y aumenta
de forma pareja, sin ningn pico especfico, la absorcin para longitudes de onda entre
550nm-750 nm. Como resultado, a nivel macroscpico el color del sistema cambia desde
rojo intenso, caracterstico de las AuNPs aisladas, y se vuelve violeta-azulado de acuerdo
al grado de agregacin (ms agregado, ms azul).

En el sistema coloidal, la aproximacin espacial de las nanopartculas se puede lograr
por diferentes vas:
La adicin de un electrolito fuerte permite remover al agente estabilizante del entorno
cercano de la nanopartcula y favorece la formacin de estructuras compuestas por varios
elementos. En particular, se ha estudiado que la agregacin de AuNPs inducida por
cloruro de sodio (NaCl) altera completamente la naturaleza de la suspensin. La
remocin de los iones citrato inmediatos a las nanopartculas producida por la sal,
conduce al colapso del sistema coloidal y a la formacin de una nica gran estructura en
forma de red por la condensacin de los partculas originales.
Otras formas de agregacin se pueden lograr a travs de especies unidas covalentemente
a las nanopartculas.[46] En los agregados formados por esta va, las AuNPs no se
colapsan en una nica estructura y mantienen su identidad a pesar de la modificacin de
la separacin espacial. Este estado diferencial del sistema permite que algunas
referencias discriminen entre agregados (las nanopartculas se condensan y pierden su
identidad original) y aglomerados (las nanopartculas se acercan espacialmente, pero no
hay contacto directo entre ellas y mantienen su identidad).[47]

Una de las propiedades ms interesantes que presentan las AuNPs es la posibilidad de
establecer enlaces covalentes entre los tomos de la superficie y determinadas especies
qumicas. Este proceso, conocido como derivatizacin, permite la creacin de nuevas
estructuras, con propiedades nicas y novedosas surgidas de la asociacin de la
nanopartcula y la molcula unida a ella. A travs de la derivatizacin, es posible
funcionalizar a la nanopartcula y lograr sistemas adaptables a varias funciones, como el
reconocimiento molecular o la promocin de la formacin de aglomerados.[46]
Las AuNPs pueden derivatizarse fcilmente con grupos tiol a travs de la formacin de
enlaces covalentes entre los tomos de Oro de la superficie de la nanopartcula y el
tomo de Azufre del grupo funcional. La presencia del grupo tiol en determinadas
molculas orgnicas y biomolculas permite construir las estructuras mencionadas y
funcionalizar a la nanopartcula con una especie de inters (Figura 8a).[46]
Si las biomolculas unidas a la nanopartcula tienen afinidad por otras especies qumicas
o biolgicas es posible promover la formacin de agregados de AuNPs a travs del
reconocimiento y la unin de estos elementos. El acoplamiento entre las biomolculas
derivatizadas produce el acercamiento espacial de las AuNPs, y como consecuencia, el
cambio de color del sistema coloidal (Figura 8b). Este fenmeno de acoplamiento y
cambio de color a nivel macroscpico es el principio en el que se basan la mayora de los
sensores colorimtricos que emplean AuNPs. En 1997, Storhoff et al. disearon un
sistema colorimtrico que permite diferenciar oligonucletidos con imperfecciones de
una nica base a travs de la derivatizacin de AuNPs con molculas de ADN.[48]
Desde entonces, se han reportado varios sistemas de este tipo que permiten detectar y
diferenciar una gran cantidad de especies qumicas y biolgicas, desde protenas hasta
iones metlicos.[2, 32]



26
Figura 8: >0 Deri+a!i#aci&n de una >uFP a !ra+"s del grupo !iol de una biomol"cula, -l ele+ado P< de
formaci&n del enlace >uJ5 /418 Q:J 25 KR:mol0 Hace 'ue la uni&n Mnanopar!$culaJbiomol"culaN sea
sumamen!e es!able ( fuer!e ( permi!e 'ue el enlace se forme de manera espon!nea al en!rar en
con!ac!o las dos especies,
A0 2ormaci&n de agregados de >uFPs deri+a!i#adas con biomol"culas capaces de reconocerse ( unirse
en!re s$, 8a formaci&n del agregado al!era el color del sis!ema coloidal como consecuencia del cambio ( la
fiIaci&n de la separaci&n espacial e%is!en!e en!re las >uFPs, > ni+el macrosc&pico el sis!ema coloidal
cambia de color desde roIo in!enso a +iole!aJa#ulado,




































A)
5is!ema .oloidal 5is!ema .oloidal
B)
>uFPs aisladas deri+a!i#adas
con biomol"culas 'ue se recoJ
nocen ( acoplan en!re s$,
>gregado +iole!a formado por la uni&n de
+arias >uFPs a !ra+"s de la biomol"cula
<5
AG=B=8D.48> >uFP
5
>uFP D-1GS>CGT>D>
27
ADN FUNCIONAL y DNAzym!

ADN COMO NANOMATERIAL

Hasta no hace muchos aos atrs, dentro del mbito cientfico se entenda y convena que
el ADN solo funcionaba como la biomolcula encargada de contener la informacin
gentica y asegurar la transmisin de la misma de una generacin a otra. En todos los
seres vivos, el rol del ADN se reduce a estas dos nicas funciones. En cambio, otras
biomolculas como las protenas (o incluso el ARN) tienen un abanico de roles mucho
ms amplio. Es esta versatilidad de funciones lo que ha permitido adoptar y utilizar a las
protenas ya desde mediados de la dcada de 1980 en varios sistemas vinculados con la
Nanotecnologa, como sensores, dispositivos de reconocimiento o bloques de
construccin molecular. En contrapartida, prcticamente no se haban realizado estudios
y trabajos que incorporaran ADN con estos fines.

Como sistema molecular optimizado a travs de millones de aos de evolucin, la
biomolcula del ADN tiene varias propiedades que le permiten cumplir con su rol
biolgico de forma sumamente eficaz. A diferencia de las protenas, el ADN es una
molcula lineal que est compuesta nicamente por 4 monmeros, y tiene una estabilidad
trmica y qumica mucho ms significativa que las primeras. Adems, su mecanismo de
sntesis y ensamblado es rpido y sencillo, y puede enlazarse especficamente a travs de
enlaces de hidrgeno a otra molcula de ADN de secuencia complementaria para formar
la doble hebra.[49]
Ya en tiempos ms recientes, han sido estas mismas propiedades asociadas a la molcula
de ADN las que han despertado el inters de varios grupos cientficos de disciplinas
relacionadas con la nanoingeniera y los biomateriales. La idea de aprovechar las
propiedades qumicas de la molcula de ADN e incorporarla en el diseo de diferentes
estructuras y dispositivos se ha convertido en un campo de investigacin sumamente
frtil.[49-50]
El ADN presenta varias ventajas para su empleo como nanomaterial: En comparacin
con el ARN y las protenas, las molculas de ADN son ms estables y menos
susceptibles a la hidrlisis. Adems, las vas artificiales de sntesis y amplificacin
permiten crear secuencias de ADN bien definidas de forma sencilla, rpida y controlada.
El ADN tambin puede modificarse con diferentes grupos funcionales y fluorforos que
le permiten conjugarse con nanopartculas y otras estructuras artificiales. Por ejemplo, la
conjugacin de los terminales 3 o 5 de una hebra de ADN con tioles permite
funcionalizar AuNPs segn se detalla en el captulo anterior.[48, 51] Es as que la
incorporacin de ADN en las investigaciones en Nanotecnologa ha promovido el
desarrollo de varias nanoestructuras, como cables, sistemas de procesamiento de la
informacin, biocatalizadores, y mquinas y dispositivos moleculares.[7]
Los primeras aplicaciones del ADN como nanomaterial aprovechaban su estructura
lineal, y a partir de ella, la posibilidad de reconocer y enlazarse con otras hebras de
secuencias complementarias. La formacin de la doble hebra a travs del apareamiento
de bases de Watson-Crick y las oportunidades que presenta este tipo de interaccin
especfica ha sido la base para la creacin de, por ejemplo, semiconductores,
nanobloques de construccin o sensores colorimtricos de oligonucletidos (Figura 9).[7,
48, 52-53]

28


























ADN FUNCIONAL: APTMEROS Y DNAzymas

Figura 9: -Iemplos de diferen!es nanoes!ruc!uras 'ue incorporan >DF apro+ecHando el empareIamien!o
de bases de ;a!sonJ.ricK,
>0 >DF u!ili#ado como blo'ue de cons!rucci&n en Mnanoar'ui!ec!urasN, 8as 4 Hebras complemen!arias en
!ramos espec$ficos de sus secuencias permi!en formar una red de >DF o Mcris!al 2DN con espacios de
!ama6o bien definido en!re las doble Hebras /a0, -s!a red de >DF puede ser u!ili#ada como molde para la
uni&n a espacios con!rolados de nanopar!$culas /b0 o pro!e$nas /c0, >dap!ado de 1efs, ?7 52@
A0 MFanocablesN semiconduc!ores preparados a par!ir de >DF, AaIo de!erminadas condiciones la mol"cula
de >DF puede conducir la corrien!e en!re dos polos, -l pasaIe de corrien!e el"c!rica se logra cuando dos
microelec!rodos se conec!an en!re s$ debido a su funcionali#aci&n con dos oligonucle&!idos de >DF de
secuencias complemen!arias, -l >DF puede ser el )nico ma!erial conec!ando es!os elec!rodos /a0 o puede
es!ar asociado a conduc!ores me!licos /b0, >dap!ado de 1efs, ?7 53@
.0 5ensor colorim"!rico 'ue permi!e iden!ificar secuencias de bases en oligonucle&!idos,
Despu"s de es!ablecer la secuencia de >DF blanco 'ue es necesario reconocer se reali#a la
funcionali#aci&n de dos grupos de >uFPs7 el primer grupo se deri+a!i#a a !ra+"s del !omo de a#ufre de un
oligonucle&!ido modificado con un !iol en su e%!remo 5U* es!e primer oligo es complemen!ario a la
secuencia de bases sobre el e%!remo 3U del >DF blanco* el segundo grupo se deri+a!i#a a !ra+"s del !omo
de a#ufre de o!ro oligonucle&!ido modificado con un !iol en su e%!remo 3U* es!e segundo oligo es
complemen!ario a la secuencia de bases sobre el e%!remo 5U del >DF blanco,
-l >DF de las dos deri+a!i#aciones se une a cada uno de los e%!remos del >DF blanco a !ra+"s del
empareIamien!o de bases de ;a!sonJ.ricK para formar la doble Hebra, -s!a uni&n acerca a las >uFPs ( fiIa
la separaci&n espacial en!re los dos elemen!os funcionali#ados, -n!onces si la me#cla de las dos >uFPs
deri+a!i#adas se encuen!ra con el oligonucle&!ido blanco se produce la agregaci&n !odas las par!$culas del
sis!ema ( como consecuencia el cambio de color del medio, 8a formaci&n del agregado es espec$fica (
depende de la presencia del oligonucle&!ido blanco,
.on es!a !"cnica es posible ob!ener un sensor colorim"!rico 'ue permi!e iden!ificar secuencias bien
definidas de >DF de forma inmedia!a ( a simple +is!a, -laborado a par!ir de resul!ados de 1ef, ?48@

C)
A)
B)
TGCTCGATAGCTAATC AGTCTCTAGCTCTGTTG
NO HAY FROMACIN
DE AGREGADO
AuNP
3derivatizada
AuNP
5derivatizada
Oligon. blanco
Oligon. no
complementario
-S-5ACGTGCTA3
AuNP 5derivatizada
5TCGATTAG3-S-
AuNP 3derivatizada
3-TGCTCGAT-----AGCTAATC-5
Oligonucletido Blanco

-S-5ACGTGCTA3 5CTGATTAG3-S-
3TGCTCGAT------------GACTAATC5
4ni&n de las dos >uFPs por el oligon, blanco
29
En paralelo al desarrollo de la Nanotecnologa con base en el ADN, la continua y
progresiva caracterizacin de este sistema y los resultados de diferentes investigaciones
han permitido expandir, desde los roles y propiedades clsicas, las funciones qumicas de
esta biomolcula. A principios de la dcada de 1990, diferentes grupos de investigacin
crearon las bases del ADN funcional, o sea, molculas construidas con nucletidos que
tienen propiedades qumicas ms all de las clsicas e histricas asociadas a la molcula
de ADN.[49]
Los primeros sistemas de ADN funcional nacen en 1991, cuando, por primera vez, se
logran sintetizar por distintos procesos de seleccin molculas de ADN aisladas y de
secuencias bien definidas que son capaces de reconocer y unirse con alta afinidad y
especificidad a un amplio rango de estructuras qumicas y/o biolgicas. Los aptmeros,
como se denominaron a esta nueva clase de molculas funcionales de ADN, pueden
entenderse, en cierta medida, como anlogos basados en ADN de los anticuerpos
proteicos.[54]

Los aptmeros son oligonucletidos de cadena sencilla con tamaos entre 70 y 100
nucletidos. Por lo general tienen una regin central de tamao variable con una
secuencia aleatoria, y dos regiones flanqueantes de secuencia conocida. La longitud de la
regin central suele estar comprendida entre los 30 y 60 nucletidos. La secuencia fija en
los extremos permite la unin de primers y la amplificacin por PCR.
Los aptmeros son capaces de adoptar estructuras globulares, que les confieren unas
complejas y sofisticadas propiedades de reconocimiento molecular. El plegado del
oligonucletido le permite reconocer y unirse de una manera estable y muy especfica a
sus sistemas diana. Las dianas de los aptmeros pueden ser pequeas molculas como
cofactores enzimticas, aminocidos o cidos nucleicos, protenas, o incluso complejas
estructuras multimricas.[54]

Las novedosas propiedades de los aptmeros han despertado el inters de diferentes
grupos de investigacin y han permitido su incorporacin en diferentes aplicaciones
tecnolgicas. En comparacin a los sistemas nanotecnolgicos de ADN basados en el
apareamiento de bases de Watson-Crick, el empleo de ADN funcional puede resultar en
estructuras mucho ms verstiles y dinmicas. Los aptmeros pueden ser sumamente
tiles en sistemas vinculados con la biotecnologa y Nanotecnologa debido a sus
propiedades de reconocimiento molecular que rivalizan con los anticuerpos, las
biomolculas comnmente utilizadas en este tipo de aplicaciones. Sobre todo, la
incorporacin de estas biomolculas en el diseo de sensores qumicos y biolgicos
puede ofrecer excelentes resultados (Figura 10).
Para este tipo de aplicaciones, los aptmeros ofrecen algunas ventajas particulares sobre
los anticuerpos: pueden ser sintetizados completamente y de forma rpida y masiva por
vas artificiales; pueden almacenarse fcilmente y por tiempos prolongados debido a su
elevada estabilidad qumica; provocan muy pequea o nula respuesta del sistema inmune
en aplicaciones teraputicas.[49-50]








30























Pero los aptmeros no son la nica clase de ADN funcional. En 1994 Breaker y Joyce
descubrieron que molculas de ADN aisladas mediante un procedimiento de seleccin in
vitro eran capaces de desarrollar actividades catalticas.[55] Desde entonces, muchas
molculas de ADN cataltico, o DNAzymas, han sido reportadas por diferentes equipos
de investigacin y se ha demostrado su capacidad para actuar sobre una amplia variedad
de reacciones, como el clivaje, ligacin y fosforilacin de ARN/ADN, metilacin de
porfirinas o clivaje de enlaces fosfatilamida.[56] Adems, varias de estas biomolculas
han mostrado eficiencias catalticas comparables a las enzimas proteicas o las ribozimas.
Las DNAzymas an no se han encontrado en la naturaleza y la seleccin in vitro
permanece como la nica va que permite aislar e identificar nuevas biomolculas con
actividades desconocidas.

Mientras que las enzimas proteicas disponen de 20 diferentes monmeros para su
construccin, la variedad de estructuras disponibles de las DNAzymas se reduce a los 4
nucletidos comnmente conocidos. Adems, la ausencia del grupo funcional 2-OH en
el ADN en comparacin al ARN reduce an ms la diversidad de conformaciones que
puede tomar la DNAzyma para el reconocimiento efectivo de la diana.[56]
La solucin natural para corregir este tipo de problemas es el empleo de cofactores. En
este sentido, para competir con las otras clases de biomolculas catalticas, el
requerimiento de cofactores se vuelve crtico para el funcionamiento de las DNAzymas.
Para la gran mayora de las DNAzymas, el empleo de iones metlicos como cofactores
permite desencadenar la actividad cataltica en condiciones fisiolgicas. Sin embargo, y a
diferencia de las protenas, los iones metlicos utilizados por las DNAzymas
comnmente se limitan a un pequeo grupo de elementos como, Mg(II), Ca(II) o Mn(II).
A pesar de ello, algunas DNAzymas han mostrado cierta selectividad de unin con
algunos metales menos comunes, aunque la afinidad encontrada hasta ahora es menor
que las asociadas a metaloprotenas.
A)
B)
C)
D)
Figura 10: -Iemplos de sensores nanoes!ruc!urados 'ue incorporan ap!meros,
>0 >gregado de >uFPs funcionali#adas con el ap!mero de !rombina por la presencia de !rombina,
.ada mol"cula de !rombina puede unirse a dos ap!meros ( eso permi!e la formaci&n del agregado,
A0 >gregados de >uFPs funcionali#adas con ap!meros sensibles a especies 'u$micas espec$ficas
/adenosina en es!e caso0, 8a presencia de la diana desagrega el sis!ema,
.0 -misi&n de fluorescencia con!rolada por un ap!mero, 8a adici&n de !rombina ( la uni&n con su
ap!mero libera al >DF con el quencher ( desenmascara la fluorescencia del emisor,
D0 5ensor no coopera!i+o 'ue incorpora ap!meros de adenosina ( coca$na ( permi!e iden!ificar la
presencia de es!as dos especies, >dap!ado de 1ef, ?49@
31
Figura 11: A) 1epresen!aci&n es'uem!ica del proceso de selecci&n in vitro, A0 Diagrama de la selecci&n en
paralelo de una DF>#(ma dependien!e de .o/GG0 con ( sin selecci&n nega!i+a, >dap!ado de 1ef, ?56@
La fuerza de la unin DNAzyma-in metlico puede ser modificada utilizando el mismo
proceso que permite crearlas artificialmente, la seleccin in vitro.[56]

La clave para generar nuevas DNAzymas y/u optimizar a las descritas anteriormente (ya
sea en la afinidad y selectividad o en la diversificacin de los iones metlicos que
emplean como cofactores) reside en el proceso de seleccin (Figura 11).
La seleccin de molculas con actividad cataltica comienza con un pool de entre 10
14
y
10
15
secuencias aleatorias de ADN. Bajo condiciones puntuales, las secuencias que
pueden presentar las funciones catalticas deseadas son separadas del resto del pool.
Estas secuencias activas son amplificadas por PCR para la prxima ronda de reaccin y
seleccin (al igual que los aptremos, las DNAzymas tienen en sus extremos secuencias
que pueden ser reconocidas por primers). El rigor de la seleccin puede ser aumentado al
reducir el tiempo de reaccin o la concentracin del cofactor. Las rondas de seleccin se
repiten hasta que sea posible identificar y aislar secuencias de ADN con elevada
actividad y especificidad. Tericamente este proceso de seleccin puede llevarse a cabo
con cualquier ion metlico con el objetivo de identificar DNAzymas con actividades
especficas que dependan de la presencia elemento deseado. En este sentido, se han
logrado aislar molculas de ADN con actividad dependiente de iones metlicos menos
comunes que los mencionados anteriormente, como Cu(II), Zn(II), Co(II), UO
+2
o
Pb(II).[56]
Uno de los problemas inherentes a esta estrategia de seleccin in vitro es que, a pesar de
que las DNAzymas se obtienen bajo condiciones controladas, no se excluye la
posibilidad que los productos aislados puedan funcionar en diferentes circunstancias o
con diferentes cofactores. Este problema se puede resolver mediante estrategias de
seleccin negativa. La seleccin negativa implica la incubacin del pool de secuencias
activas con los iones metlicos sobre los que no se desea que exista actividad. En este
caso, se aslan las molculas que no reaccionan con el cofactor presente.[56]


















A)
B)
32
Figura 12: -Iemplos de DF>#(mas con ac!i+idad endonucleasa, -n cada eIemplo se indica la Hebra sus!ra!o
/negro0 la Hebra en#ima /+erde0 ( el si!io de cor!e /roIo0, MFNV cual'uier nucle&!ido 'ue permi!a el
apareamien!o con la Hebra complemen!aria, M1N V Purina, MWN V Pirimidina, >0 DF>#(ma 39- espec$fica
para iones 4=
Q2
, A0 DF>#(ma espec$fica para .u/GG0, .0 DF>#(ma espec$fica para Tn/GG0, >dap!ado de 1ef,
?2@
ENDONCLUEASAS Y DNAzym! "#$%&'

Muchas de las DNAzymas aisladas por la seleccin in vitro han demostrado gran
actividad en reacciones de clivaje de ADN y ARN. En particular, se han obtenido varias
endonucleasas con reactividad especfica para algunos metales de transicin.
Las endonucleasas estn compuestas por dos hebras de ADN (o ARN): La hebra enzima,
con afinidad por el cofactor metlico y responsable de la actividad del sistema, y la hebra
sustrato, que posee el sitio de clivaje que permite la reaccin enzimtica (Figura 12).[2,
56]









En una reaccin tpica catalizada por DNAzymas, primero se produce la hibridacin de
las hebras sustrato y enzima. Luego, la presencia del in metlico diana y el
reconocimiento de ste por el ncleo cataltico de la DNAzyma, producen el clivaje del
sustrato en dos nuevas molculas, que inmediatamente pierden la unin y se apartan de la
hebra enzima.[2]
Dentro del grupo de DNAzymas con actividad endonucleasa, las biomolculas de la
familia 8-17 han sido uno de los sistemas mejor caracterizados hasta el momento.
Las DNAzymas 8-17 son las endonucleasas de ARN de menor tamao aisladas hasta
ahora. Son capaces de clivar sustratos formados completamente por ARN, o tambin
sustratos de ADN con un nucletido de ARN embebido en el sitio de corte.[56]
Diferentes variantes de esta DNAzyma han sido seleccionadas de forma independiente
por el proceso de seleccin in vitro al menos en tres oportunidades. En 1997, Santoro &
Joyce aislaron la secuencia cataltica original en presencia de MgCl
2
(Figura 13).[57] A
esta primer secuencia se la denomin 8-17 y se obtuvo a partir de un sustrato
compuesto ntegramente por ARN. En paralelo, se han logrado aislar secuencias
anlogas en presencia de Mg(II) e histidina (DNAzyma Mg5), y Zn(II) (DNAzyma 17E)
(Figura 14). Posteriormente, Lu et al. demostraron que el cofactor ms efectivo para
todas las variantes de este sistema es el in Pb(II), un metal no ensayado en ninguna de
las selecciones realizadas previamente. La k
obs
en presencia de Pb(II) para cada una de
las tres variantes es de 0.5 min
-1
(8-17), 2 min
-1
(Mg5) y 1 min
-1
(17E) a pH = 5.0 y
concentracin de Pb(II) de 20M.[58]
El proceso de seleccin de la secuencia original evit las rondas de seleccin negativa, lo
que permite que varios iones metlicos activen el clivaje del sustrato.[59] Para la
variante 17E las constantes de la reaccin siguen el orden Pb(II) >> Zn(II) >> Mn(II)
Co(II).[58] La notoria diferencia de reactividad a favor del in Pb(II) se debe a que este
cofactor obliga a la DNAzyma a emplear un mecanismo de reaccin diferencial. El
>0
A0
.0
33
Figura 13: Becanismo de aislado de secuencias con ac!i+idad endonucleasa 'ue u!ili#an cofac!ores
me!licos, >0 Pool de arran'ue de secuencias alea!orias de >DF dise6adas para con!ener dos dominios de
uni&n al sus!ra!o, .ada mol"cula del pool con!iene una bio!ina en el e%!remo 5U un nucle&!ido de >1F /r>0
'ue define el si!io de cor!e ( la secuencia alea!oria de 40pb en el dominio cen!ral, A0 -s'uema de la
amplificaci&n ( el aislado selec!i+o de mol"culas de >DF 'ue ca!ali#an el cli+aIe en presencia del cofac!or
me!lico, >dap!ado de 1ef, ?58@
Figura 14: DF>#(mas de la familia M8J17N, >0 DF>#(ma M8J17N /)nica del grupo de sus!ra!o $n!egro de
>1F0, A0 DF>#(ma Bg5 .0 DF>#(ma 17-, D0 5ecuencia conser+ada de la DF>#(ma 17-* solo se re+elan los
nucle&!idos cla+es para lograr la ac!i+idad ca!al$!ica, >dap!ado de 1ef, ?56@
clivaje empleando cofactores como Zn(II) o Mg(II) transita por dos etapas: la primera de
ellas involucra un cambio conformacional del sistema enzima-sustrato. El plegado de las
dos hebras es necesario para que se produzca el clivaje en la segunda etapa. En cambio,
la reaccin con Pb(II) saltea la primer etapa y el corte en la hebra sustrato se logra de
forma directa sin la necesidad del plegado del sistema (Figura 15).[60]

La zona conservada de la DNAzyma 17E ha sido definida en varias publicaciones. La
regin desapareada en el bucle hacia el extremo 3 posee la secuencia 5-ACGAA-3 y
es una de los motivos claves para la actividad cataltica. Aparte de este motivo, se ha
demostrado que la secuencia 5-AGC-3 que forma el codo de la hebra enzima y el
wobble T-G previo al sitio de corte tambin son indispensables para el funcionamiento
del sistema.[61]

















La cintica del clivaje est fuertemente determinada por el medio de reaccin. Para pH
7.0 y concentraciones de buffer de 50 mM la actividad enzimtica comienza a notarse
>0 A0
.0 D0
34
Figura 15: Becanismo de reacci&n propues!o para las DF>#(mas M8J17N en presencia de Pb/GG0 o Bg/GG0 (
Tn/GG0, >dap!ado de 1ef, ?60@
Figura 16: -s!udios cin"!icos de la ca!lisis del cli+aIe por la DF>#(ma 17- en presencia de Pb/GG0, >0
Lrfica de la cons!an!e de +elocidad obser+ada /k
obs
0 en funci&n de la concen!raci&n de Pb/GG0 en buffer de
reacci&n 50 mB FaJ<epes p< 7,0, A0 Bisma grfica 'ue >0 en buffer de reacci&n 10 mB FaJ<epes p< 7,0,
.0 .ambio de la +elocidad de reacci&n al +ariar el p< del medio, 8a concen!raci&n de Pb/GG0 para cada
medida es de 100 XB, >dap!ado de 1efs, ?56@ ( ?61@
con concentraciones de Pb(II) cercanas a 2.5 M. Valores de k
obs
de alrededor de 1 min
-1

se alcanzan en 3.5 M y a partir de 4.5 M la velocidad se despega y no es posible medir
la constante de la reaccin (Figura 16a).[61] La velocidad de reaccin baja notoriamente
al disminuir la fuerza inica del medio. Al pasar a concentraciones de buffer de 10 mM
los valores de k
obs
caen cerca de dos rdenes (Figura 16b). Sin embargo, para estas
condiciones, el perfil de la reaccin se acerca ms al modelo clsico de Michaelis-
Menten que se aplica en enzimas proteicas. Se cree que esta diferencia de velocidades es
reflejo de dos conformaciones diferenciadas del sitio activo, y como consecuencia, dos
mecanismos de reaccin divergentes.[61]





























El pH tambin tiene una marcada influencia en la velocidad de reaccin. Brown et al.
estudiaron esta relacin y demostraron que, para concentraciones fijas de Pb(II), la k
obs

de la reaccin aumenta a medida que aumenta el pH (Figura 16c).[58]
A0 >
0
.0
35

En el mecanismo de clivaje que emplea Pb(II) se forma un producto intermediario que
contiene un 23-ciclofosfato. Esta especie es consistente con un mecanismo de
transesterificacin interna, en el que el grupo 2-OH en el sitio de corte ataca el enlace
fosfodister para formar un fosfato pentacoordinado, seguido de la prdida del oxgeno
en el extremo 5. Al final de la reaccin el 23-ciclofosfato se hidroliza y la hebra
sustrato original queda dividida en las dos nuevas molculas.[58]


DNAzym! COMO SENSORES DE IONES METLICOS

El clivaje de hebras de ARN/ADN como consecuencia de la actividad de las DNAzymas,
y la dependencia que tienen estas reacciones de la presencia de iones metlicos ha
permitido la creacin de toda una nueva clase de biosensores altamente sensibles y
selectivos.
Estos sistemas de deteccin aprovechan el empleo de cofactores metlicos por parte de
las DNAzymas. Los productos de la reaccin pueden ser monitoreados de diferentes
maneras, lo que permite identificar y/o cuantificar la presencia del in metlico
involucrado en la reaccin.

Las DNAzymas tienen varias ventajas a la hora de emplearse en sensores para iones
metlicos en comparacin a los sistemas de deteccin convencionales. En primer lugar,
las DNAzymas pueden reducir los requerimientos de instrumental complejo y
voluminoso, y pueden incorporarse en dispositivos portables para anlisis in situ.
Segundo, el mecanismo de aislado y accin de las DNAzymas permite obtener nuevos
sistemas y/o modificar a los ya creados con el objetivo de generar y amplificar las
seales de deteccin para anlisis ms sensibles. Los biosensores basados en DNAzymas
tambin son amigables con el medio ambiente debido a que sus componentes, molculas
de ADN, son biocompatibles y biodegradables; adems, sus efectos toxicolgicos en el
cuerpo humano seran mnimos. En comparacin a los sensores basados en protenas o
RNA, las DNAzymas son ms resistentes a la hidrlisis y permiten su almacenamiento y
aplicacin por perodos de tiempo ms largos. Por ltimo y quiz ms importante, las
DNAzymas proveen una plataforma comn para el desarrollo de sensores para iones
metlicos nuevos o incluso otras dianas ms all de estos elementos. Una vez establecida
una estrategia de transduccin que permita convertir la actividad cataltica en una seal
medible analticamente, el mismo diseo puede ser aplicado a otras dianas tan pronto se
aslen DNAzymas especficas para estas especies. Esta plataforma de mejora flexible se
espera reduzca el costo de desarrollo de diferentes sistemas de deteccin, y permita
convertir a los biosensores basados en DNAzymas en instrumentos efectivos e idneos
para la deteccin mltiple y en paralelo en muestras complejas en ensayos tipo
barrido.[56]

Hasta ahora se han encontrado varias soluciones que permiten transducir el evento de
reconocimiento de la DNAzyma (el clivaje de la hebra sustrato por la presencia del
cofactor metlico) y convertirlo en una seal analtica y operativamente til. El primer
biosensor para iones metlicos desarrollado con DNAzymas utilizaba mediciones de
fluorescencia como seal de deteccin. En este primer sistema, a la DNAzyma 17E para
Pb(II) se le incorpora un fluorforo (TAMRA) en el extremo 5 de la hebra sustrato y un
quencher (Dabcyl) en el extremo 3 de la hebra enzima. De esta forma, la seal de
fluorescencia a 580nm no puede ser detectada debido al quencheado del fluorforo. En
36
Figura 17: 5ensor de Pb/GG0 basado en fluorescencia 'ue incorpora la DF>#(ma 17-, >0 -s'uema de la
generaci&n de la se6al por el cli+aIe de la Hebra sus!ra!o en presencia del i&n me!lico, M2N represen!a al
2luor&foro ( M3N al Quencher, A0 5elec!i+idad del sensor, -l i&n Pb/GG0 /?Pb/GG0@ V 2 XB0 es el )nico me!al 'ue
produce una se6al de fluorescencia apreciable, >dap!ado de 1ef, ?2@
presencia de Pb(II) la emisin de fluorescencia aumenta hasta 400 veces como
consecuencia del clivaje de la hebra sustrato y la liberacin del producto de reaccin
unido al fluorforo. Este sensor es altamente sensible y selectivo, y permite medidas
semi-cuantitativas de concentraciones de Pb(II) entre 10 nM y 4 M (Figura 17).[2, 62]













Otros diseos realizados hasta el momento incorporan soluciones nanotecnolgicas para
la transduccin de la seal al aprovechar las propiedades de los sistemas
nanoestructurados como los descritos en el captulo anterior. En este sentido, se han
construido biosensores con DNAzymas que incorporan nanopartculas metlicas de
Fe
2
O
3
(la seal de transduccin se relaciona con el cambio del campo magntico del
sistema), sistemas de deteccin electroqumica (el clivaje del sustrato modifica la
conductividad de una lamina nanoestructurada de Au), o nanopartculas de Oro en
sistemas de deteccin colorimtricos.[2] Este ltimo grupo est integrado por un
conjunto de instrumentos con caractersticas, algunas ya demostradas y otras an por
demostrar, sumamente interesantes y valiosas. Los sensores colorimtricos de AuNPs-
DNAzymas renen casi todas las propiedades deseadas en instrumentos de medicin
descentralizados descritas en el primer captulo. Sin embargo, el desarrollo de esta clase
biosensores es un rea de investigacin muy reciente, que recin se encuentra en la
bsqueda de sistemas reales que puedan verse beneficiados a travs del diagnstico con
alguno de los instrumentos ya diseados.









A) B)
37
DESARROLLO DE UN BIOSENSOR COLORIM(TRICO PARA
LA DETECCIN DE PLOMO


Por un lado, hemos comentado y descrito las caractersticas de las nanopartculas de oro,
y detallado sus propiedades pticas dependientes de la distancia y su capacidad para
interaccionar con otras especies en agregados supramoleculares. Por otro lado, tambin
hemos presentado al ADN funcional, y en particular a la DNAzyma 17E y su capacidad
de utilizar al in metlico Pb(II) como cofactor en una reaccin de clivaje de ARN.
Aparte, tambin hemos discutido como cada uno de estos dos sistemas rene algunas
propiedades especficas que pueden ser aprovechadas en el diseo de sensores qumicos.

En el ao 2003, Liu & Lu de la Universidad de Illinois en Urbana-Champaign se
inspiraron en el sistema desarrollado por Santoro & Joyce para detectar molculas de
ADN (Figura 9c), y crearon un biosensor colorimtrico para la deteccin especfica de
iones Pb(II) a partir de la combinacin de AuNPs y la DNAzyma 17E. En este sistema,
la DNAzyma 17E acta como elemento de reconocimiento del objetivo (el in Pb(II)) y
las AuNPs traducen este evento en una seal detectable (el cambio de color del
medio).[27]
El sensor diseado por Liu & Lu est compuesto por: la hebra enzima de la DNAzyma
17E; la hebra sustrato, extendida 12 pb en cada uno de los extremos 5 y 3; y AuNPs de
13 nm de dimetro, derivatizadas a travs del tomo de Azufre con una molcula de
ADN de 12 pb de secuencia definida y modificada con un tiol en su extremo 5 (Figura
18a). Las extensiones en la hebra sustrato se realizan de forma que pueda formar la doble
hebra con las secuencias de ADN unidas a la nanopartculas. Este apareamiento de bases,
sin embargo, mantiene libre la porcin de la hebra sustrato que reconoce y se une a la
hebra enzima. Cada molcula de sustrato tiene dos secuencias, una en cada extremo, que
pueden formar la doble hebra con el ADN de las AuNPs. Con este diseo, la mezcla de
los tres componentes del sensor en el medio de reaccin produce la agregacin de las
nanopartculas y el cambio de color de rojo a azul-violeta despus de un proceso de
incubacin-enfriamiento (Figura 18b). Este complejo sistema formado por las AuNPs
funcionalizadas y la DNAzyma 17E puede funcionar como sensor colorimtrico para la
identificacin de Pb(II). En presencia de Pb(II), la hebra enzima podra catalizar el
clivaje de la hebra sustrato y promover el desensamblado del sistema y el cambio de
color de azul-violeta a rojo, como consecuencia de la desagregacin y el cambio de
distancia entre las AuNPs en el medio de reaccin.[63]
Para una anlisis semi-cuantitativo, Liu y Lu utilizan el cociente entre la absorbancia a
522 nm y a 700 nm. Estas dos longitudes de onda fueron seleccionadas por que
representan la cantidad relativa de AuNPs aisladas y agregadas, respectivamente. El
empleo del cociente en los diferentes ensayos permite distinguir concentraciones de
Pb(II) entre 0.1 M y 4 M. Sin embargo, a simple vista, la diferencia recin se hace
notoria a partir de 1 M.[27, 63]

De todas formas, esta primera versin an no optimizada del sensor presenta algunos
puntos a mejorar: En principio, no se ha podido demostrar que la adicin de Pb(II) sobre
el sistema agregado genere el clivaje de la hebra sustrato de forma efectiva. Como
consecuencia, el sistema formado por las AuNPs funcionalizadas y la DNAzyma no
logra desarmarse inmediatamente, y no se produce el cambio de color que permite
revelar la presencia del metal en el medio de reaccin. En este diseo, la reaccin
38
Figura 18: Sensor colorim!rico "light-down# $ara la %e!ecci&n %e 'b()))* >0 .omponen!es del sensor, A0
-s'uema de la formaci&n del agregado de >uFPs por la acci&n de la DF>#(ma, -l acercamien!o ( la
fiIaci&n de la dis!ancia en!re las >uFPs produce el cambio de color del sis!ema coloidal, .0 -s'uema del
mecanismo de de!ecci&n del sensor, 8a presencia de Pb/GG0 impide 'ue se +uel+a a formar el agregado
despu"s de la incubaci&n, >dap!ado de 1efs, ?27@ ( ?63@
catalizada por la DNAzyma y la deteccin de Pb(II) recin se logra despus de incubar el
sistema a 50, desaparear a la doble hebra de ADN y producir la desagregacin de las
AuNPs como consecuencia del aumento de la temperatura. En presencia de Pb(II), el
sensor mantiene el color rojo de las AuNPs aisladas durante la incubacin; el clivaje de
la hebra sustrato catalizado por la DNAzyma ocurrido previamente no permite que el
sistema se agregue de nuevo. En contrapartida, en ausencia de Pb(II) no hay clivaje del
sustrato, y el agregado de AuNPs y la DNAzyma vuelve a formarse a medida que
desciende la temperatura del medio (Figura 18c). Este mecanismo de deteccin resulta
sumamente incmodo ya que la necesidad de una etapa intermedia de incubacin-
enfriamiento y la espera para que los componentes del sistema vuelvan (o no) a formar el
agregado alargan demasiado el tiempo necesario para obtener el resultado del ensayo.
Adems, el mecanismo de deteccin utilizado es del tipo light-down; el cambio de
color del sistema, el pasaje de rojo a azul-violeta en este caso, se produce en ausencia del
analito. Por lo general, no se recomienda el empleo de este tipo de sensores debido a que
aumentan significativamente el riesgo de obtener resultados falsos positivos.[27]
Por este motivo, Liu y Lu continuaron trabajando sobre este sistema. Su objetivo:
optimizar el mecanismo de funcionamiento y lograr un sensor colorimtrico ms cmodo
y mejor adaptado a las necesidades reales.


























)* GENERACIN DEL BIOSENSOR DE P+,II-
Formacin del
agregado
no Pb(II)
Pb(II)
Incubacin a 50C
Re-hibridacin
(2 hs.)
Hebra enzima DNAzyma 17E
Hebra sustrato extendida
AuNP derivatizada con ADN
5-CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT-3
A)
B)
+)
39
Figura 19: Segun%o %ise,o %el sensor* >0 Deri+a!i#aci&n de >uFPs ( Hebra sus!ra!o modificada para
lograr la alineaci&n McolaJcolaN en el agregado, A0 >lineaci&n Mcabe#aJcolaN ( alineaci&n McolaJcolaN, 5e
cree 'ue la formaci&n del agregado se +e fa+orecida con el segundo dise6o debido 'ue e%is!e ma(or
liber!ad ( menor impedimen!o es!"rico en!re los componen!es del sensor, .0 -s'uema del mecanismo
de de!ecci&n del sensor, > diferencia del primer dise6o es!e sensor no precisa la e!apa de incubaci&nJ
enfriamien!o, >dop!ado de 1ef, ?64@

El segundo diseo desarrollado por Liu & Lu incorporaba algunos cambios puntuales
con el fin de optimizar el mecanismo de deteccin del sensor. En primer lugar, se
propuso cambiar el modelo de derivatizacin de las nanopartculas, adoptando un
sistema ms similar al presentado por Santoro & Joyce en el sensor original de ADN. En
lugar de trabajar con una nica molcula de ADN, la nueva propuesta realiza dos
derivatizaciones sobre dos grupos diferentes de AuNPs. Un grupo de AuNPs se
funcionaliza a travs de la modificacin en el extremo 5 del oligonucletido; el otro
grupo, se funcionaliza a travs del extremo 3 (Figura 19a). Este modelo de
derivatizacin permite obtener un alineamiento en el agregado del tipo cola-cola, a
diferencia del alineamiento cabeza-cola que se lograba anteriormente (Figura 19b). El
nuevo alineamiento permite que el agregado de AuNPs-DNAzyma se logre de forma
espontnea, sin cambio de temperatura, en un tiempo que no excede los 20min (Figura
19c). Adems, con este diseo la adicin de Pb(II) sobre el sistema agregado s consigue
catalizar el clivaje del sustrato a pesar de la presencia de las AuNPs; de todas formas, la
reaccin sobre el ADN no logra por s sola la desagregacin del sistema, y de esta forma
revelar de manera inmediata la presencia del metal. Para el nuevo sensor, tambin se
determina que el largo ideal de estos los oligonucletidos de ADN de la derivatizacin es
de 9 pb.[63-64]






















Aparte, se identificaron otros factores que afectan el cambio de color del sensor y el
tiempo requerido de ensayo, como el dimetro de las nanopartculas, la relacin de
Sustrato modificado
p/ailnea cola-cola
no Pb(II)
Pb(II)
T. ambiente
< 20 min.
Alineacin cabeza-cola
Alineacin cola-cola
B) A)
+)
40
Figura 20: Sensores "light-up#* Tercer - cuar!o %ise,o* >0 -s'uema del mecanismo de de!ecci&n del sensor
'ue incorpora >DF Min+asi+oN, 8a presencia de es!a mol"cula permi!e la desagregaci&n del sis!ema despu"s
del cli+aIe de la Hebra sus!ra!o, A0 -s'uema del mecanismo de de!ecci&n del sensor con la DF>#(ma
asim"!rica, -l bra#o cor!o de la DF>#(ma no logra man!enerse apareado con el su!ra!o despu"s del cli+aIe
lo 'ue permi!e la desagregaci&n del sis!ema en presencia de Pb/GG0, >dap!ado de 1efs, ?65@ ( ?66@,
concentraciones entre los tres componentes, o la temperatura, el pH y la concentracin de
NaCl ptimos del medio de reaccin.[64]
Tras la optimizacin de todos estos factores, el nuevo diseo del sensor no necesita la
etapa de incubacin-enfriamiento posterior a la adicin de Pb(II) y se logra reducir
considerablemente el tiempo de las determinaciones a cerca de 20 min. Sin embargo, el
mecanismo de deteccin sigue siendo del tipo light-down.


























.* GENERACIN DEL BIOSENSOR DE P+,II-

Finalmente, en el tercer sistema desarrollado por Liu y Lu se logr transformar el
mecanismo de deteccin del sensor de light-down a light-up. Manteniendo la base
del segundo diseo, el nuevo sensor consigue que la adicin de Pb(II) en el medio de
reaccin sea la responsable de la separacin del agregado de AuNPs-DNAzyma. A
diferencia de los sistemas anteriores, con este diseo se obtiene un sensor que cambia de
color (de azul-violeta a rojo en este caso) en presencia y al momento de interaccionar con
la diana.
Sin embargo, para que se produzca esta desagregacin del sistema se requiere la adicin
de un nuevo componente: una molcula invasiva de ADN. Este oligonucletido tiene
Pb(II)
brazo corto
brazo largo
Pb(II)
ADN invasivo
B) A)
41
una secuencia complementaria a los productos de clivaje de la hebra sustrato. Despus de
producirse la reaccin catalizada por la DNAzyma sobre el sistema agregado, el ADN
invasivo forma la doble hebra con los productos de reaccin y favorece la
desagregacin y el cambio de color del sistema (Figura 20a). En ausencia de Pb(II), por
ms adicin de ADN invasivo que se realice, no se logra promover la desagregacin de
las nanopartculas.[65]


/* GENERACIN DEL BIOSENSOR DE P+,II-

El ltimo sistema descrito hasta ahora mantiene el mecanismo de deteccin light-up
pero prescinde del ADN invasivo utilizado para favorecer y permitir la desagregacin
del sistema y la liberacin de las AuNPs. En este nuevo diseo, la desagregacin se
puede acelerar e independizar del ADN invasivo si se vara la simetra de los brazos de
la DNAzyma.
La DNAzyma original tiene una extensin idntica de 10 pb desde el centro cataltico
hacia los extremos 5 y 3. Al acortar el brazo 3 a 5 pb y alargar el 5 a 15 pb, la
actividad cataltica no se ve alterada, pero se facilita la etapa de desagregacin del
sistema en presencia de Pb(II) (Figura 20b). En esta nueva optimizacin tambin se
estudio el efecto de la fuerza inica del medio, y se demostr que el mejor desempeo
del sistema se logra a concentraciones de NaCl de 200 mM.[66]

Hasta ahora, el diseo que incorpora la variante asimtrica de la DNAzyma 17E es el
sistema que posee las mejores cualidades para ensayos tipo barrido y una eventual
aplicacin sobre muestras reales. Sin embargo, el artculo donde se reporta este diseo no
aclara el lmite de deteccin del sistema ni la respuesta frente a diferentes
concentraciones de Pb(II). Esta informacin, en cambio, s se reporta para los primeros
diseos.
Para el primer sistema con alineamiento cola-cola, el sensor prcticamente carece de
un rango de deteccin lineal, o por lo menos, de un intervalo de concentraciones en los
que la seal cambia de forma ms progresiva. El pasaje del estado agregado al estado
desagregado se da de forma abrupta, frente a concentraciones de Pb(II) de alrededor de
0,6 M (120 ppb). El mismo lmite de deteccin se ha reportado para el primer diseo
con alineamiento cabeza-cola y el sistema que incorpora el ADN invasivo.
Esta naturaleza de la seal de deteccin, definida por el cambio abrupto de color y la
ausencia de rango lineal, puede ser til para ensayos tipo positivo/negativo como los
descritos en el primer captulo. Adems, el cambio de la seal se produce a
concentraciones similares a los lmites de intervencin de Pb(II) en sangre establecidos
por los diferentes organismos de referencia, lo que en principio podra permitir adaptar el
instrumento para anlisis de este tipo.







42


PARTE 2:

DESARROLLO
EXPERIMENTAL

























43
OB0ETIVOS


De acuerdo a los antecedentes presentados en el Desarrollo Terico, la combinacin e
interaccin de nanopartculas de Oro (AuNPs) con la DNAzyma 17E permite crear un
sensor colorimtrico especfico para Plomo. Por otro lado, en Uruguay la contaminacin
con Plomo es una problemtica actual de importancia, y los sistemas y centros de
diagnstico existentes son insuficientes para analizar a toda la poblacin de riesgo. En
este contexto, es deseable encontrar alternativas reales que permitan descentralizar el
anlisis de plombemia en el pas, y el sensor desarrollado por Liu & Lu es una opcin
potencialmente vlida.

Por lo tanto, los objetivos generales propuestos en el presente trabajo son:

Construir el sensor colorimtrico especfico para Pb(II), poner a punto las
condiciones del ensayo, y determinar el modo de deteccin ptimo y los
diferentes parmetros del sistema.

A partir de los resultados de los ensayos con soluciones de referencia, evaluar la
viabilidad del sensor y la posibilidad de adaptar el sistema para anlisis de
plombemia.

Como objetivos particulares, se plantean:

Sintetizar nanopartculas de Oro de tamao y forma definidas, y caracterizarlas
por TEM y espectroscopa UV-Visible.

Evaluar la actividad de la variante de la DNAzyma 17E empleada en la
construccin del sensor mediante el anlisis electrofortico en geles de
poliacrilamida.
















44
MATERIALES

Reactivos y disoluciones: Todos los reactivos empleados fueron de calidad analtica o
superior y fueron utilizados sin posterior purificacin: cido tetraclorourico tri-
hidratado (AuHCl
4
3 H
2
O, 99,9%, Sigma-Aldrich); citrato de sodio di-hidratado
(Na
3
C
6
H
5
O
7
2 H
2
O, Carlo Ebra, 99%); cloruro de sodio (NaCl, 99%, Anedra); tris-
hidroximetil-aminometano, Tris ((HOCH
2
)
3
CNH
2
); cido actico (CH
3
COOH, 99%,
Fluka); cido sulfrico (H
2
SO
4
, 99.5%, Biopack); cido ntrico (HNO
3
, 70%, Biopack),
Solucin estndar de Plomo para AAS, (Pb(II) 1.000g/L como Pb(NO
3
)
2
, Fluka).
Todas las soluciones fueron preparadas en agua ultrapura (MilliQ, resistividad >
18.2Mcm).
Los oligmeros de ADN fueron adquiridos de Biomers (Ulm, Alemania) y purificadas
por HPLC por la propia empresa (Tabla 1). Previo al uso, los reactivos de ADN
liofilizado se disolvieron en agua ultrapura para obtener soluciones stock de
concentraciones de 100M para la hebra enzima y la hebra sustrato, y 1mM para las
molculas modificadas con el tiol. Las soluciones empleadas en el estudio electrofortico
y su composicin se detallan en la Tabla 2.



Nombre del oligonucletido Secuencia (5 a 3)
Oligonucletido 5 tiolado GCACACGAGTTGACA - (CH
2
)
6
S
Oligonucletido 3 tiolado S - (CH
2
)
3
- CGCTGAGTAGACACT
Hebra enzima ACAGACATCTCTTCTCCGAGCCGGACGAAATAGT
Hebra sustrato
GCGACTCATCTGTGAACTATrAGGAAGAGATGTCTCTTC
TCAACTCGTGTGC


Solucin Composicin
Buffer de corrida TBE 0.5X 0.045 M Trisborato de Sodio + 0.001 M EDTA, pH = 8
Buffer de carga
0.25% (m/v) Azul de bromofenol + 0.25% (m/v) Xilene cianol +
30% (v/v) Glicerol
Solucin fijadora 10% (v/v) Etanol + 0.5% (v/v) cido Actico
Solucin de tincin 0.2% (m/v) Nitrato de Plata
Solucin de revelado 3% (m/v) NaOH + 0.5% (v/v) Formaldehdo

Equipos: Las medidas espectrofotomtricas se realizaron en un espectrofotmetro UV-
Visible-NIR UV-1603 (Shimadzu, Japn). Se emplearon celdas de cuarzo de 1 cm de
paso ptico. Aparte, un grupo de medidas espectrofotomtricas de la curva de calibracin
del sensor se realiz en el espectrofotmetro de microvolmenes ACTGene ASP-3700.
Las imgenes de Microscopa de Transmisin Electrnica (TEM) fueron tomadas con el
Microscopio JEOL, modelo JEM 1010 (Japn). El tratamiento informtico de los datos
(espectros de absorcin UV-Vis, distribucin de tamaos de AuNPs, etc.) se realiz con
el programa Microcal Origin 7.0. Para medir el tamao de las AuNPs se emple el
software de edicin de imgenes ImageJ.[67]
Tabla 1: .ligonucle&!i%os em$lea%os en el !raba/o
Tabla 2: Soluciones em$lea%as en el es!u%io elec!ro0or!ico
45
M(TODOS


Preparacin del material: El material de vidrio empleado en la sntesis de AuNPs fue
sumergido en mezcla sulfontrica, H
2
SO
4
/HNO
3
(1:1 v/v) por al menos 1 h, y luego
enjuagado con abundante agua ultrapura. Para el estudio de la actividad de la DNAzyma
y la construccin del sensor se trabaj casi nicamente con material de plstico
descartable.


Sntesis de Nanopartculas de Oro: Se emplea una variante de la tcnica reportada por
Santoro et al. para la sntesis de AuNPs esfricas de aproximadamente 13nm de
dimetro.[48] La tcnica empleada est basada en el mtodo de sntesis de
Turkevich.[37]
En un baln de dos bocas se agregan 0.0195g de HAuCl
4
3 H
2
O (45moles de Au) y
50mL de agua ultrapura y se calienta hasta ebullicin en un sistema a reflujo. Sobre el
sistema a 100C se agregan 5mL de una disolucin fresca de citrato de sodio 38.8mM
preparados previamente y se contina calentando. En esta etapa se observa un rpido
cambio de color del sistema desde el amarillo plido original al rojo intenso, pasando por
una etapa intermedia de color negro-azulado. Despus del cambio final de color, se
mantiene el reflujo durante 15 min ms y luego se deja reposar la mezcla de reaccin
hasta alcanzar temperatura ambiente. Las AuNPs sintetizadas se centrifugan a 10.000
rpm durante 25 min y se resuspenden en agua ultrapura.


Caracterizacin de las nanopartculas de Oro: Se registra el espectro electrnico entre
400-800nm de las AuNPs obtenidas en la sntesis, y se determina la longitud de onda del
mximo del espectro. Tambin se estudia la aditividad de dos propiedades (absorbancia e
ndice de refraccin) para los productos de la sntesis.
A partir de las AuNPs resuspendidas, se mide la absorbancia en el pico de mxima
absorcin de las siguientes disoluciones en agua ultrapura de la suspensin madre de
AuNPs: 100%; 80%; 60%; 40%; 20%; 15%; 10% y 5% (todas v/v).


Actividad de la DNAzyma 17E: La evaluacin de la actividad cataltica de la
DNAzyma en presencia de Pb(II) se realiza mediante la deteccin de los productos de
clivaje de la hebra sustrato en geles de poliacrilamida en condiciones nativas.
Para evaluar la actividad de la DNAzyma se preparan 2 tubos eppendorf (Reaccin y
Control) para cargar en el gel. En cada eppendorf se agrega 2L de la hebra sustrato
50M, 6L de la hebra enzima 50M y 7L de buffer Tris-acetato 25mM pH =
8.0/NaCl 200mM. Se incuban a 80C durante 1 min y se dejan enfriar hasta temperatura
ambiente. Al tubo Reaccin se agregan 5L de solucin acuosa de Pb(II) 500M, y al
tubo Control, 5L de agua MilliQ. Se dejan reaccionar durante 18 hs y se cargan, en
un carril por tubo, 10L de la reaccin ms 2L de buffer de carga en un gel nativo de
poliacrilamida 20%. En dos carriles aparte, se cargan nicamente 2L de hebra enzima
50M y 2 L de hebra sustrato 50M respectivamente. Se dejan correr durante 45 min
a 100 V en buffer TBE 0.5X.
Adems, se verifica la formacin del complejo hebra enzima hebra sustrato
mediante la deteccin del sistema bi-molecular empleando las mismas condiciones
46
electroforticas. Para ello, en un tubo eppendorf se agrega 5L de buffer Tris-acetato
25mM pH = 8.0/NaCl 200mM, 4L de la hebra sustrato 50M, y 2L de la hebra
enzima 50M. Se incuba a 80C durante 1 min y se dejan enfriar hasta temperatura
ambiente. Se cargan 10L de la solucin ms 2L de buffer de carga en un gel de
poliacrilamida 20%. En dos carriles aparte, se cargan nicamente 2L de hebra enzima
50M y 2 L de hebra sustrato 50M respectivamente. Se dejan correr durante 45 min
a 100 V en buffer TBE 0.5X.
Para el revelado de las bandas se realiza la tincin de plata. Primero, el gel de
poliacrilamida se sumerge en la solucin fijadora y se calienta 30 s en horno de
microondas. Luego, se sumerge en la solucin de tincin, y se calienta nuevamente 30 s.
Por ltimo se enjuaga con agua ultrapura y se sumerge en la solucin de revelado hasta
aparicin de las bandas de la corrida. La reaccin se detiene sumergiendo el gel
nuevamente en solucin fijadora.


Derivatizacin de las nanopartculas de Oro: A 12mL de una dispersin de AuNPs de
absorbancia 1.5 se agregan 60L de ADN 3-tiolado 1 mM. Despus de incubar durante
24 hs se adicionan, gota a gota, 1.2mL de buffer Tris-acetato 0.1 M pH = 8.2/NaCl 1M.
Despus de una segunda incubacin de 48 hs, la solucin se centrifuga a 12.000 rpm
durante 30 min y se resuspende en buffer Tris-acetato 25mM pH = 8.2/NaCl 0.1 M. La
centrifugacin/resuspensin se repitie 3 veces ms para reducir la cantidad de ADN-
libre. El mismo procedimiento anterior se repite para el ADN 5-tiolado. Por ltimo, se
registra el espectro electrnico UV-Vis de los dos dispersiones de AuNPs
funcionalizadas.


Ensamblado de los componentes del sensor: En un eppendorf de 1.5mL que contiene
230L de buffer Tris-acetato 25mM pH = 8.2/NaCl 0.5 M, se mezclan 100L de la
dispersin de AuNPs derivatizadas con ADN 3 de absorbancia 2.0, 100L de la
dispersin de AuNPs derivatizadas con ADN 5 de abosrbancia 2.0, 120 L de hebra
enzima 100M y 50L de hebra sustrato100 M. La mezcla se calienta por 2 min a
80C y se deja reposar 24 hs. Luego, se centrifuga por 1 min a 1000 rpm. En esta etapa,
se observa la rpida precipitacin de los agregados de AuNPs de color violeta. El
agregado violeta se resuspende en 230L de buffer Tris-acetato 25mM pH = 8.2/NaCl
0.5M. Despus, se vuelve a centrifugar/resuspender 3 veces ms. La ltima resuspensin
se realiza en un mnimo volumen del buffer original. Por ltimo, se registra el espectro
electrnico UV-Visible de los agregados resuspendidos.


Ensayo del sensor y curva de calibracin con Plomo: Con el sensor ensamblado y
preparado para el anlisis de Pb(II) a travs de un mecanismo de deteccin light-up, se
procede a ensayar diferentes concentraciones del metal para obtener una curva de
calibracin y el lmite de deteccin del sensor.
Se colocan sobre un nylon de Parafilm 10L de AuNPs agregadas y resuspendidas
(sensor ensamblado). Espontneamente, las AuNPs precipitan sobre el soporte y es
posible eliminar el buffer sobrenadante. Despus de eliminar la mayor cantidad de
solvente, sobre los agregados slidos se adicionan 10L de solucin acuosa de Pb(II) de
forma de lograr resuspender los agregados. Para la curva de calibracin se ensayaron las
siguientes concentraciones de Pb(II): 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 y 20 ppm (1ppm Pb(II) = 5M
47
Pb(II)). La desagregacin del sistema a causa del Pb(II) se analiza visualmente y a travs
del espectro electrnico UV-visible


Obtencin de micrografas por Microscopa Electrnica de Transmisin (TEM): Se
tomaron y analizaron imgenes microscpicas de 3 muestras: 1) AuNPs aisladas sin
modificar; 2) AuNPs agregadas por NaCl; 3) AuNPs agregadas por la DNAzyma (sensor
ensamblado).
Para las muestras 2) y 3) se agregan 100L de la suspensin sobre una rejilla de cobre de
200 mesh con film de formivar y carbono y se deja reposar y decantar el agregado sobre
la grilla durante 1 h. Luego, se elimina el excedente de solvente secando la rejilla con
papel absorbente y se coloca la grilla en el equipo de medicin. Para la muestra 1) se
agregan 10L de muestra de absorbancia 0.5 sobre otra rejilla y se deja reposar hasta
lograr evaporar la mayor parte del solvente (aproximadamente 24 hs). Por ltimo, se
elimina el agua restante y se coloca la nueva grilla en el equipo de medicin. Para las
medidas se fija la aceleracin de electrones en 100kV.






























48
RESULTADOS Y DISCUSIN

CARACTERIZACIN DE LAS NANOPARTCULAS DE ORO

El mtodo de sntesis desarrollado por Turkevich en la dcada de 1950 y refinado por
Frens en la dcada de 1970 permite sintetizar AuNPs cuasiesfricas de dimetro
homogneo.[37-38] El dimetro de los productos va a estar definido por la relacin
molar agente reductor / Au(III) empleada en la reaccin.[38] En particular, la tcnica
empleada en este trabajo fue elaborada para obtener AuNPs de 13nm de dimetro.
El artculo de donde se extrajo el procedimiento no se detiene demasiado en los
resultados de la sntesis; solo especifica el tamao de las AuNPs, (aproximadamente
13nm), pero no realiza ningn estudio de la distribucin de formas y tamaos.[48]

En el sistema a ebullicin, la adicin de citrato de sodio reduce a los iones Au(III) de
acuerdo a la siguiente reaccin:

2 HAuCl
4
+ 3 Na
3
C
6
H
5
O
7
2 Au + 3 Na
2
C
5
H
4
O
5
+ 3 NaCl + 5 HCl + 3 CO
2

(citrato de sodio) (cetoglutarato de sodio)

Los tomos de Oro reducidos por el citrato se asocian para formar las nanopartculas tal
como se describe en el Desarrollo Terico.

El sistema coloidal obtenido de la sntesis es traslcido y de color rojo intenso, tal como
se esperaba de acuerdo a las diferentes referencias consultadas. El espectro electrnico
de este sistema tiene un nico mximo de absorcin bien definido en 520nm, igual al
reportado en el artculo de la tcnica; la absorcin para la dilucin empleada es de
0.5244ua (Figura 1). Hacia la derecha de este pico el espectro cae abruptamente, y
prcticamente no hay absorcin lumnica a longitudes de onda comprendidas entre 650-
800nm. Hacia la izquierda existe un mnimo relativo a 431nm (0.3234ua) de
aproximadamente 2/3 de altura con respecto al mximo de absorcin.
El espectro electrnico obtenido coincide con la forma general planteada para AuNPs
esfricas.[48]
400 500 600 700 800
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
Longitud de onda (nm)
520 nm

Figura 1: -spec!ro elec!r&nico en el rango +isible ( fo!ograf$a macrosc&pica de la suspensi&n de >uFPs
sin!e!i#ada, 5e indica la longi!ud de onda del m%imo del espec!ro 520nm,

49
El nico mximo presente en la grfica se debe al modo de vibracin bipolar, el nico
modo de vibracin del plasmn superficial significativo dentro de la regin visible del
espectro en nanopartculas esfricas de dimetros tan pequeos.[35]

Una vez definido el mximo de absorcin, es posible estudiar la aditividad de esta
propiedad al variar la concentracin del sistema. Los resultados de este estudio muestran
que la absorcin a 520nm es una propiedad aditiva para valores por debajo de 1.48ua
(30% de AuNPs) (Figura 2). A partir de este de punto las limitaciones propias de los
fenmenos de absorcin en el rango UV-Visible y del espectrofotmetro empleado en el
estudio no permiten mantener la aditividad de la propiedad. Como era de esperar, la
aditividad en el rango 0-1.48ua sugiere que la concentracin de las AuNPs en el solvente
no afecta ni tiene relacin con el alcance y la forma de los modos de vibracin
electrnica presentes en las esferas, y responsables de la absorbancia del sistema
coloidal.

















El dimetro de las AuNPs se determina a travs de las micrografas obtenidas por TEM.
Las imgenes de las AuNPs aisladas y sin modificar no son tan ntidas y reveladoras
como se hubiera deseado, y no permiten realizar las medidas de forma simple pero
precisa (Figura 3). La superposicin de las AuNPs que se observa en las imgenes se
debe ms a la forma en que las diferentes partculas fueron depositndose sobre la grilla
que a la propia naturaleza del sistema coloidal. Por ejemplo, las micrografas
provenientes de una sntesis realizada previamente en otras condiciones a modo de
prueba permiten observar mucho ms claro a cada una de las nanopartculas aisladas y la
ausencia de un patrn que las mantenga formando una nica estructura (Figura 4). Por
este motivo, para medir el dimetro de las AuNPs utilizadas en la construccin del sensor
fue mucho ms sencillo trabajar con las imgenes del sensor ensamblado (AuNPs
agregadas por la DNAzyma).
El rango de dimetros de las AuNPs de la sntesis va desde 12.5nm a 22nm. La
distribucin de tamaos se ajusta de manera bastante precisa a una distribucin normal
centrada en 17.7nm (Figura 5). Sin embargo las poblaciones ms numerosas se
encuentran entre 17.0-17.5nm y 18.0-18.5nm.
1Sus$* Au2's3 Abs
520nm

100Y 2,940
80Y 2,940
60Y 2,547
40Y 1,825
30Y 1,489
20Y 1,001
15Y 0,751
10Y 0,498
05Y 0,246
0 20 40 60 80 100
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
% Suspensin AuNPs
>bs
520nm
para cada diluci&n
de la suspensi&n de >uFP5
Figura 2: -s!udio de la adi!i+idad de la absorbancia a 520nm, -n la grfica de la i#'uierda se mues!ra (
diferencian claramen!e las dos regiones de concen!raci&n7 el rango lineal ( adi!i+o en!re 0Y ( 30Y* ( el
rango no adi!i+o a par!ir de 40Y,
50









































La varianza del ajuste normal es de 1.3nm, lo que determina que el dimetro del 95% de
las AuNPs est comprendido entre 15.1nm y 20.3nm (dos varianzas en torno a la media).
De este resultado se desprende que el dimetro del 95% de las AuNPs vara menos de
17,9nm
20nm
500nm
Figura 3: Bicrograf$as de C-B de las >uFPs sin!e!i#adas, 8as diferen!es imgenes permi!en obser+ar la
dis!ribuci&n a dis!in!as escalas, -n las dos imgenes grupales se ad+ier!e una fuer!e superposici&n
espacial de las par!$culas ( como es!o dificul!a la de!erminaci&n de la dis!ribuci&n de !ama6os, De !odos
modos la superposici&n no debe asociarse a las carac!er$s!icas del sis!ema coloidal sino 'ue es
resul!ado de la forma de deposici&n de las >uFPs en la reIilla del microscopio, >baIo a la i#'uierda se
marca el dime!ro de una )nica nanopar!$culas esf"rica,
500nm 200nm
Figura 4: Bicrograf$as de C-B de >uFPs pro+enien!es de una s$n!esis reali#ada pre+iamen!e a modo de
prueba, -n es!as dos imgenes no Ha( superposici&n de las par!$culas ( se puede obser+ar meIor la
dis!ribuci&n de !ama6os ( la ausencia de pa!rones de uni&n en!re ellas, 8a ausencia de pa!rones de
uni&n ( el aislamien!o de las >uFPs en el sis!ema coloidal son responsables del color roIo in!enso de las
suspensiones,
51
15% alrededor del valor medio de 17.7nm. El valor medio de 17.7nm se aleja un par de
nanmetros del dimetro esperado segn detalla el procedimiento empleado (13nm). Una
de las hiptesis para explicar esta diferencia de tamaos est en el diseo del sistema de
reaccin. El equipo utilizado en nuestra sntesis no permita la agitacin vigorosa y
constante del medio de reaccin, por ejemplo con una pastilla magntica. Como
consecuencia, al momento de agregar el citrato de sodio a la solucin de Au(III) la
reduccin del metal pudo no haberse dado con la misma intensidad ni a la misma
velocidad que en la sntesis original. Se ha demostrado que la agitacin del medio tiene
una fuerte influencia en el tamao de las AuNPs que se forman durante la sntesis. Por
ejemplo, en un estudio realizado por Tabrizi et al., la agitacin a diferentes velocidades
del medio de reaccin permite obtener AuNPs de dimetros que van desde 42nm a 4nm
sin variar la relacin de concentraciones de citrato y Au(III).[68]
Por otro lado, la dispersin de tamaos tambin es un poco mayor a la esperada y
reportada para este tipo de reacciones. Esta diferencia tambin se puede atribuir a la
ausencia de agitacin del medio de reaccin.

12 14 16 18 20 22
0
2
4
6
8
10
12
14
16
P
o
r
c
e
n
t
a
j
e
Diametro AuNPs (nm)




La ausencia casi total de partculas no-esfricas tambin es otro aspecto a destacar. En
las micrografas TEM de la sntesis de AuNPs a emplear en la construccin del sensor, la
gran mayora de las nanopartculas observadas son esferas o formas fcilmente
asimilables a esferas.
1
Otro pequeo grupo est compuesto por ovoides y nanopartculas
irregulares. Pero quiz lo ms destacable de la distribucin obtenida es que no se
distinguen nanopartculas con formas geomtricas no-esfricas bien definidas, como

1
8as nanopar!$culas obser+adas en realidad son formas poligonales con mucHas caras ( por eso en las
imgenes !erminan asimilndose a esferas, 8a presencia de caras cris!alinas planas en la superficie no
permi!e definir es!as es!ruc!uras como esferas perfec!as,

Figura 5: Proporci&n de !ama6os de las >uFPs de la s$n!esis ( aIus!e normal de la dis!ribuci&n, -n el
grfico las nanopar!$culas se agrupan en in!er+alos de 0,5nm,
8a media ( la +arian#a del aIus!e normal son 17,74nm ( 1,33nm respec!i+amen!e,
52
tringulos, hexgonos, etc. Esta distribucin de formas es consecuencia del fuerte control
termodinmico que acta sobre el proceso de sntesis. En este tipo de procesos,
prevalecen las formas geomtricas termodinmicamente ms estables, como las esferas.

Con los datos de la absorbancia en el mximo del espectro electrnico y el dimetro de
las AuNPs obtenidas es posible calcular la concentracin de nanopartculas en la
dispersin y el coeficiente de extincin de los productos obtenidos en la sntesis. Sin
embargo, para poder determinar estos parmetros es necesario asumir un par de
condiciones: todo el Oro presente en el medio de reaccin fue reducido y forma parte de
las AuNPs sintetizadas; la AuNPs tienen un dimetro homogneo de 17.7nm; y la
densidad de las AuNPs es igual a la de un bloque de Oro metlico. Bajo estas
condiciones se calcul que los 50mL de dispersin producidos tienen una concentracin
de AuNPs de 5.8 x 10
-9
M y un coeficiente de extincin de 7.2 x 10
8
M
-1
cm
-1
(Cuadro 1).
Este coeficiente de extincin resulta muy similar al reportado por Haiss et al.; para
AuNPs de 18nm de dimetro el clculo terico empleado en el artculo determina un
coeficiente de extincin de 3.87 x 10
8
M
-1
cm
-1
en el valle del espectro a 450nm.[41]
Asumiendo que la absorbancia a esta longitud de onda es de 2/3 de la del pico del
espectro, el coeficiente de extincin terico en el mximo de absorcin es de
aproximadamente 5.8 x 10
8
M
-1
cm
-1
.
























Con estos resultados se pueden retomar los datos y la grfica del estudio de aditividad y
cambiar los porcentajes arbitrarios empleados por la concentracin molar de AuNPs. La
nueva grfica, la grfica de Beer-Lambert, es independiente de la sntesis realizada en
.4>D1= 17 D-C-1BGF>.GZF D- 8> .=F.-FC1>.GZF W -8 .=-2G.G-FC- D- -[CGF.GZF D-
8>5 >uFPs -F 8> 5EFC-5G5 -F5>W>D>7

masa 4Au+l
4
5 3 4
2
. 6 0*0195 g P2 <>u.l
4
\ 3 <
2
= V 390,8 g:mol
B> >u V 197,0 g:mol

masa >u V 0,0195 g % 197,0 g:mol : 390,8 g:mol V 9,83%10
J3
g
dim, >uFP V 17,7 nm V 1,77%10
J6
cm
+ol, >uFP V 4 : 3 % ] % /dim, : 20
3
V 4:3 % ] % /1,77 % 10
J6
cm : 20
3
V 2*90710
818
cm
3

dens, >u V 19,3 g:cm
3

masa >uFP V dens, % +ol, V 19,3 g:cm
3
% 2,90%10
J18
cm
3
V 5*60 10
817
g
.an!, >uFPs V masa >u : masa >uFP V 9,83%10
J3
g : 5,60%10
J17
g V 1*76710
14
Au2's
.onc, >uFPs V .an!, : +ol, <
2
= V 1,76%10
14
>uFPs : 50 m8 V 3*52710
12
Au2's9m:
3,52%10
12
>uFPs:m8 % 1000 m8:8 : 6,02 % 10
23
>uFPs:mol V 5*84710
89
;
:a concen!raci&n %e Au2's en la sus$ensi&n es %e 5*84710
89
; (65*84n;)

>bs, >uFPs V 0,5244 ua
/la mues!ra medida es una diluci&n 1:8 de la dispersi&n original0
5,84%10
J9
B : 8 V 0,73%10
J9
B
8e( de Aeer >bs, V >,b,.
0,5244 ua V ^ % 1cm % 0,73%10
J9
B ^ V 7,18%10
8
B
J1
cm
J1
<l coe0icien!e %e e7!inci&n e7$erimen!al %e las Au2's %e 17*7nm es %e 7*18710
8
;
81
cm
81

53
este trabajo, y permite calcular el coeficiente de extincin en la zona donde se cumple la
aditividad (Figura 6).
0 1 2 3 4 5 6
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
Concentracin AuNPs (nM)





La relacin entre el tamao de las AuNPs y el mximo de absorcin en el espectro
tambin coincide de forma bastante precisa con los resultados de la bibliografa
consultada. En particular, estos dos parmetros pueden relacionarse a travs de la
ecuacin emprica planteada por Khlebstov, y generada a partir de la recopilacin de
resultados de sntesis de nanopartculas realizadas por diferentes equipos de
investigacin. A partir de la frecuencia del mximo del plasmn superficial es posible
calcular el tamao promedio de las AuNPs responsables de este resultado. En este caso,
al espectro con el mximo ubicado a 520nm le corresponde una suspensin de AuNPs de
16nm de dimetro.[69]
















0,76 nB
J1
cm
J1
V 7,6 % 10
8
B
J1
cm
J1

Figura 6: Lrfico de AeerJ8amber! para la dispersi&n de >uFPs de 17,7nm, 8a pendien!e de la rec!a en el
in!er+alo donde se cumple 'ue la absorbancia es una propiedad adi!i+a para las >uFPs /0 nB a 2 nB0
de!ermina el coeficien!e de e%!inci&n ( +ale 7,6 % 10
8
B
J1
cm
J1
,
54
ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD DE LA DNAZYMA %&E

Como resultado de las numerosas rondas de seleccin ensayadas, la variante clsica o
simtrica de la DNAzyma 17E est altamente optimizada y presenta gran reactividad en
presencia de sus cofactores especficos. El clivaje de la hebra sustrato de la variante
clsica puede darse de forma casi inmediata si las concentraciones de los reactivos y las
condiciones del medio son las adecuadas.[56] Pero, al momento de construir el sensor de
Pb(II), esta versin de la DNAzyma no permite disear un instrumento con deteccin
light-up, cosa que s sucede con la variante de brazos asimtricos.
Al haber arribado a una variante de la DNAzyma sumamente optimizada, la variacin de
diferentes aspectos del sistema, como la simetra de los brazos de las hebras, puede
alterar la funcionalidad y la actividad cataltica. Los brazos de la hebra enzima son los
responsables de mantener la unin entre la hebra enzima y sustrato a travs del
apareamiento de bases de Watson-Crick (Figura 7). En particular, el cambio en la
extensin de estas secuencias modifica la energa de unin del sistema y la velocidad de
disociacin despus del clivaje. Cuanto ms largo los brazos de la hebra enzima,
mayor ser el nmero de bases apareadas, y ms difcil de desaparear el complejo entre
las dos molculas. Al emplear la variante asimtrica de la DNAzyma, el cambio del
factor energtico permite la desagregacin del sensor sin la necesidad de incubar a 50C
y, como resultado, se genera el sistema de deteccin light-up. Sin embargo es deseable
y necesario evaluar esta modificacin en el largo de los brazos y ver como altera, adems
de la energa de unin, la actividad de la DNAzyma.

En principio, la extensin/compresin de los brazos de la hebra enzima no modifica el
sitio cataltico ni los nucletidos esenciales para la actividad. Liu & Lu estudiaron
diferentes variantes de la DNAzyma asimtrica y demostraron que la actividad se inhibe
recin al eliminar al menos 7 nucletidos del brazo derecho de la DNAzyma.[66] El
sensor construido en este trabajo incorpora una variante con 4 nucletidos menos en el
brazo derecho y 4 nucletidos ms en el brazo izquierdo (Figura 7).















Sobre este sistema, en primer lugar se verific mediante un estudio electrofortico la
formacin del complejo entre la hebra enzima y la hebra sustrato en ausencia del
A)
B)
Figura 7: 5ecuencias ( es!ruc!ura secundaria de los componen!es de >07 la +arian!e clsica de la
DF>#(ma 17- ( A07 la +arian!e asim"!rica empleada en el es!udio elec!rofor"!ico, 8as e%!ensiones en la
Hebra Msus!ra!oN en los dos e%!remos de la +arian!e es!udiada permi!en enla#ar a la DF>#(ma con las
>uFPs deri+a!i#adas, -l empleo de es!e dise6o es lo 'ue posibili!a la cons!rucci&n del sensor de con
de!ecci&n light-up,
55
cofactor de la reaccin. La formacin de este complejo es indispensable para que se
produzca la actividad y el clivaje una vez agregado el in Pb(II).
En el carril 1 del gel de poliacrilamiada en condiciones nativas se carg la mezcla de
hebra enzima y hebra sustrato; la presencia de la banda por debajo del marcador de
peso de 100pb corresponde al complejo entre las dos molculas (Figura 8). En los
carrilles adyacentes se observa la banda que corresponde a la hebra enzima de 30 bases
(carril 2) y a la hebra sustrato de 50 bases (carril 3). En el carril del complejo tambin
se revela la banda de la hebra sustrato debido a que se encontraba en exceso en
relacin a la hebra enzima.
Un vistazo rpido a las secuencias de las dos molculas del sistema estudiado indicaba
que no deba haber mayores problemas para el apareamiento y la formacin de la doble
hebra en algunos tramos puntuales de las molculas. La formacin del complejo es el
primer paso para lograr el sistema con actividad cataltica. Sin embargo, con el anterior
experimento es imposible saber si el complejo formado respeta la estructura secundaria
de la DNAzyma (en particular, el loop en el centro de unin a los iones Pb(II)) y presenta
la actividad endonucleasa reportada para este sistema.






















Una vez demostrada la formacin del complejo, se procedi a evaluar la actividad de la
DNAzyma.
En vista de que se ha reportado que el clivaje de la hebra sustrato se da de forma
prcticamente instantnea en presencia de Pb(II) en el entorno de 5M y fuerza inica
(200mM) y pH (8.0) fcilmente ensayables, los primeros experimentos realizados
dejaban reaccionar el sistema por alrededor de solo 20 min en estas condiciones de
reaccin. Con el complejo de la DNAzyma ya formado se adicionaba un pequeo
volumen de Pb(II), y despus de 20 min se detena la reaccin mediante la quelacin del
metal con EDTA. En estos ensayos no se logr observar los productos de clivaje en los
5us!ra!o
-n#ima
.ompleIo - Q 5
100p
200p
1 2 3
4
Figura 8: Lel de elec!roforesis en poliacrilamida 20Y en condiciones na!i+as ( re+elado con !inci&n de
pla!a 'ue demues!ra la formaci&n del compleIo en!re la Hebra Msus!ra!oN ( la Hebra Men#imaN, .arril 17
Hebra Men#imaN Q Hebra Msus!ra!oN .arril 27 Hebra Men#imaN .arril 37 Hebra Msus!ra!oN .arril 47
marcadores de peso molecular, 8a banda ma(ori!aria en el carril 1 corresponde al compleIo en!re las dos
secuencias 'ue migra como una mol"cula de apro%, 80pb, >baIo !ambi"n se obser+a la banda de la
Hebra Msus!ra!oN debido a 'ue se encon!raba en e%ceso en relaci&n a la Hebra Men#imaN, -n los carriles 2
( 3 se obser+an las bandas de la Hebra Men#imaN ( la Hebra Msus!ra!oN respec!i+amen!e,
56
geles de poliacrilamida; en el gel solo se distingua una banda que corresponde al
sustrato sin clivar, pero ningn producto del corte. De estos resultados se desprende que
en estas condiciones de ensayo (fuerza inica, pH, tiempo de reaccin, etc.) no es posible
verificar la actividad enzimtica.
Manteniendo el tiempo de reaccin se procedi a cambiar la concentracin de Pb(II), la
concentracin de la DNAzyma, la fuerza inica y/o el pH sin resultados positivos.
Finalmente, recin al dejar reaccionar el sistema durante 18 hs se logr observar los
productos de clivaje en el gel de electroforesis (Figura 9).
La hebra sustrato de 50 bases puede clivarse en presencia de Pb(II) en dos molculas,
de 30 y 20 bases. En el carril 1 del gel de poliacrilamida en condiciones nativas (tubo
Reaccin en el procedimiento) se observa una banda tenue hacia el final de la corrida,
que correspondera al producto de clivaje de 20 bases. El producto de 30 bases no puede
observarse individualmente debido a que se superpone con la banda de la hebra
enzima, tambin de 30 bases. En este mismo carril, la marcada presencia de la banda
de la hebra sustrato a 50 bases indica que el clivaje no fue completo. La banda del
producto de clivaje a 20 bases, en cambio, no se observa en el carril 2 (tubo Control en
el procedimiento). La ausencia de la banda en este carril se puede asociar con la ausencia
del cofactor Pb(II) en el medio de reaccin. Por lo tanto, sin el cofactor metlico no es
posible que se produzca el clivaje de la hebra sustrato. Aparte, en los carriles 3 y 4 se
observan las bandas que corresponden a la hebra enzima y sustrato respectivamente.
Estas bandas sirven como patrn para identificar las molculas en los carriles de la
reaccin.























Con estas condiciones de reaccin, se pudo demostrar que la adicin de Pb(II) sobre el
complejo de la DNAzyma 17E genera el clivaje de un pequeo porcentaje de la hebra
-n#ima
5us!ra!o
.ompleIo - Q 5
Produc!o de .li+aIe
_30 pb
_50 pb
_20 pb
100 pb
1 2 3 4
5
Figura 9: Lel de poliacrilamida al 20Y en condiciones na!i+as re+elado con !inci&n de pla!a 'ue
demues!ra la ac!i+idad de la DF>#(ma ( el cli+aIe de la Hebra Msus!ra!oN en presencia de Pb/GG0, -l carril 1
corresponde al sis!ema de reacci&n 'ue con!en$a la DF>#(ma ( Pb/GG0 el cofac!or 'ue posibili!a el cli+aIe,
5e obser+an 4 bandas7 de ma(or a menor !ama6o la banda del compleIo Men#imaNJMsus!ra!oN la banda
de la Hebra Msus!ra!oN la banda de la Hebra Men#imaN ( la banda de uno de los produc!os de cli+aIe, -l
o!ro produc!o de cli+aIe coincide en !ama6o con la Hebra Men#imaN, -l carril 2 corresponde a la soluci&n
de DF>#(ma pero sin Pb/GG0 adicionado, 5e obser+an las mismas bandas 'ue en el carril 1 sal+o por la
banda del produc!o de cli+aIe, 8a ausencia de es!a mol"cula de >DF en el carril demues!ra 'ue la
ausencia del cofac!or impide 'ue se produ#ca la ac!i+idad en#im!ica ( el cli+aIe, -n los carriles 3 ( 4 se
obser+an las bandas de la Hebra Men#imaN ( la Hebra Msus!ra!oN respec!i+amen!e,
57
sustrato. Sin embargo, el tiempo de reaccin necesario (18 hs) y el bajo porcentaje de
avance revelado se alejan de los resultados esperados y reportados sobre la actividad de
esta variante de la DNAzyma 17E. En este sentido, puede resultar atractivo realizar un
estudio terico de la estructura secundaria y las propiedades termodinmicas de la
DNAzyma para ver si ayudan a aclarar el por qu de los problemas observados en la
reaccin.

El software mfold permite visualizar las conformaciones ms estables de una molcula
de ADN y obtener los parmetros termodinmicos asociadas al proceso de formacin de
esa estructura secundaria.[70] Con los resultados otorgados por el programa, se puede
evaluar cmo es esta estructura terica en relacin al planteo previo o qu tan estable son
las uniones de las bases de la secuencia.
El programa mfold nicamente genera estructuras secundarias de una molcula simple de
ADN. El sistema estudiado, la DNAzyma 17E, sin embargo est compuesto por las dos
molculas mencionadas con anterioridad. Para adaptar el complejo de estudio al
programa, la hebra sustrato y la hebra enzima pueden unirse para formar una nica
molcula, agregando un par de nucletidos que permitan el giro de la secuencia en uno
de los extremos. Como estos nucletidos no pueden formar la doble hebra, no afectan de
forma significativa los parmetros termodinmicos del sistema.
El anlisis de la estructura secundaria se realiz para dos casos: la variante clsica de la
DNAzyma 17E y el sistema sobre el que se ensay la reaccin en este trabajo (variante
asimtrica con la hebra sustrato extendida).
Fijando la concentracin de Na
+
en 200mM y la temperatura en 20C, el programa
genera dos conformaciones (uno por cada caso) de estructura secundaria bien definida
(Figura 10). Al estudiar las alineaciones calculadas, se puede ver que el loop que se
forma espontneamente corresponde de forma exacta al sitio de reconocimiento y unin
del cofactor reportado en la bibliografa. En los dos casos, la estructura secundaria ms
estable del sistema determina la conformacin que permite la actividad cataltica.
*
Este
resultado, en principio revela que la conformacin ms estable en la variante asimtrica
no presenta problemas estructurales al momento de unirse al cofactor metlico y
provocar la actividad cataltica.
La energa total de Gibbs para la formacin de la estructura secundaria y la temperatura
de fusin de las dos conformaciones tambin son bastante similares entre s.
En principio, estos valores indicaran que el cambio del largo y la simetra de los brazos
de la DNAzyma no afectan a las propiedades termodinmicas globales del proceso
estudiado. Entonces, la diferencia significativa entre las dos variantes debe encontrarse
en el G local de cada uno de los brazos. En la DNAzyma clsica, cada una de las dos
uniones entre la hebra enzima y la sustrato tiene un G de estabilizacin local de
alrededor de -11 kcal/mol. En cambio, en la variante asimtrica el G local vara entre
los dos brazos del sistema; en el brazo largo vale -19.25 kcal/mol y en el brazo corto vale
-4.93 kcal/mol. En funcin del bajo valor relativo del G local, el brazo corto de la
variante asimtrica puede gobernar y determinar los procesos de ensamblado, catlisis y
desensamblado tanto en la DNAzyma libre como en el sensor.[66]
Por un lado, la menor rigidez e intensidad del enlace permite liberar al producto de
clivaje generado despus de la reaccin de manera ms sencilla y eficiente. Esta

*
-l programa !ambi"n generaba una segunda es!ruc!ura de PL similar, -n ella se man!en$a el pliegue
global pero el si!io ca!al$!ico se +e$a ligeramen!e modificado por el apareamien!o de la adenina 10 con la
!imina 20 en la +arian!e clsica /en la o!ra DF>#(ma el apareamien!o era en!re >15 ( C250
58
caracterstica del sistema es aprovechada para construir el sensor de deteccin light-
up. Pero por otro lado, es esta misma naturaleza de la unin la que quiz afecte la
formacin del loop de reconocimiento previo a la reaccin debido a que el apareamiento
de las hebras puede romperse fcilmente sin la necesidad de cambios energticos
significativos. En particular, este problema resulta ms determinante en la DNAzyma
libre que en el sensor, ya que la mayor libertad del sistema en solucin dificulta an ms
la formacin de la doble hebra en este tramo de las secuencias. En el sensor, en cambio,
la mayor rigidez del complejo y la presencia de nuevas interacciones (entre la hebra
sustrato y el ADN de las derivatizaciones, por ejemplo) quiz colabore para formar
estos enlaces. La dificultad para establecer un apareamiento estable puede ser la causa de
avance de la reaccin llamativamente bajo observado en el gel de poliacrilamida. De
todas maneras, en el sensor de Pb(II) existe la posibilidad de que la DNAzyma se
comporte de manera diferente debido a la presencia de los nuevos componentes que
integran el complejo.































Figura 10: -s!ruc!uras secundarias ms es!ables generadas por el sof!Oare mfold para >07 la +arian!e
clsica de la DF>#(ma 17- ( A07 la +arian!e asim"!rica empleada en el es!udio elec!rofor"!ico, -n los dos
casos el resul!ado del programa ( en especial el loop en la mi!ad de las secuencias coinciden con la
es!ruc!ura repor!ada ( 'ue posibili!a la ac!i+idad del sis!ema, Para el anlisis de la +arian!e clsica se
agregaron 5 adeninas en!re el e%!remo 3U de la Hebra Men#imaN ( el e%!remo 5U de la Hebra Msus!ra!oN
para permi!ir el giro de la secuencia de >DF,
-n el recuadro inferior se indican las propiedades !ermodinmicas calculadas por el software para cada
una de las es!ruc!uras generadas,
'ro$ie%a% Termo%*
Pun!o de 2usi&n /`.0
A)
B)
59
DERIVATIZACIN DE LAS NANOPARTCULAS DE ORO CON LAS MOL(CULAS DE
ADN TIOLADAS1

La derivatizacin de las AuNPs con las molculas de ADN modificadas se logra a travs
de las formacin del enlace covalente entre los tomos de Oro de la superficie de la
nanopartcula y el tomo de Azufre del extremo de las secuencias. La formacin de este
enlace se da de manera prcticamente instantnea al entrar en contacto las dos especies,
incluso si los grupos tiol se encuentran en un estado de oxidacin ms elevado formando
puentes disulfuro. Una vez establecida la derivatizacin, la unin de los tomos es
sumamente estable y difcil de romper como consecuencia de la elevada energa del
enlace entre Oro y Azufre.
La reaccin de derivatizacin tal cual se describe en los Mtodos es relativamente
sencilla. La mezcla de los dos componentes, AuNPs aisladas y ADN modificado, y el
cambio de las condiciones salinas del medio de reaccin logran generar fcilmente la
unin entre los tomos.
El propio procedimiento, adems, permite verificar si se produjo la modificacin de las
AuNPs de forma efectiva. En el Desarrollo Terico, se detall como el cambio de la
fuerza inica por la adicin de un electrolito induce la formacin de estructuras
compuestas por varias nanopartculas. Macroscpicamente, esto se asocia a un cambio de
color de la suspensin. En una de las etapas del procedimiento empleado se adiciona
NaCl 1M al sistema de reaccin. Si las AuNPs no lograron modificarse, el aumento de la
fuerza inica rpidamente inducira la formacin de agregados y el cambio de color de la
suspensin. Pero en el procedimiento, y tal como se pudo observar en la prctica, el
cambio de color no se produce, debido a que la funcionalizacin de las AuNPs con las
molculas de ADN impide la formacin de los agregados por el aumento de la fuerza
inica.
La comparacin del espectro electrnico de las AuNPs sin modificar y las modificadas
tambin permite evaluar la unin del ADN. De nuevo, en el Desarrollo Terico se
explic cmo el patrn de absorcin del plasmn superficial de las AuNPs est
fuertemente determinado por el entorno cercano de las nanopartculas. En este caso, la
modificacin covalente podra cambiar, aunque sea de forma mnima, algunos rasgos del
espectro electrnico.[48]
505 510 515 520 525 530 535
0,54
0,56
0,58
0,60
0,62
0,64
0,66
0,68
AuNPs 5derivatizadas
AuNPs 3derivatizadas
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
longitud de onda (nm)
AuNPs aisladas


Figura 11: Toom del espec!ro elec!r&nico en la #ona del m%imo de absorci&n 'ue permi!e obser+ar el
corrimien!o del pico Hacia la derecHa para las >uFPs funcionali#adas en comparaci&n a las >uFPs
aisladas sin funcionali#ar, -l corrimien!o obser+ado es de apro%, 5nm ( sir+e como e+idencia de la
modificaci&n del en!orno cercano de las nanopar!$culas,
60
En el espectro de las AuNPs modificadas, tanto para el ADN tiolado en 5 como para el
3, se observa un corrimiento hacia la derecha del mximo de absorcin, que revela un
cambio del entorno de las nanopartculas del sistema (Figura 11).

El mximo del espectro tambin se relaciona con la concentracin de las AuNPs
funcionalizadas como resultado de la purificacin por centrifugacin y determina los
volmenes de suspensin a utilizar en la construccin del sensor. De todos modos, la
tolerancia a la agregacin de la suspensin frente a cambios de la fuerza inica, y la
variacin del mximo del espectro no necesariamente deben asociarse a la unin
covalente entre el Azufre del ADN y la nanopartcula. Se ha reportado que las molculas
de ADN simple hebra sin modificar tambin son atradas por las AuNPs, se unen a ellas
por atracciones electrostticas no covalentes e impiden la formacin de agregados por
fuerza inica.[71]
































61
ENSAMBLADO DEL SENSOR

La funcionalizacin de los dos grupos de AuNPs fue el ltimo paso necesario para
comenzar la construccin del sensor. Completada esta etapa, ya disponemos de los
cuatro componentes en condiciones de iniciar el ensamblado.
El ADN de las derivatizaciones puede formar la doble hebra con las extensiones en los
dos extremos de la secuencia de la hebra sustrato. De esta forma, la hebra sustrato
acta como puente entre las AuNPs derivatizadas, las acerca espacialmente y fija la
distancia de separacin entre ellas. El nuevo entorno de las AuNPs genera cambios en el
perfil del pasmn superficial, que se asocian al cambio de color de la suspensin.
Tambin, como consecuencia del gran tamao, el agregado de AuNPs-DNAzyma pierde
la estabilidad coloidal propia de las AuNPs aisladas y puede precipitar y centrifugarse
ms fcilmente.
Despus de completada la formacin del agregado y las diferentes etapas de purificacin
por centrifugacin, se obtiene una suspensin violeta-azulada, que rpidamente precipita
en el fondo del tubo si se deja estabilizar por un par de minutos. El espectro del agregado
de AuNPs-DNAzyma cambia de forma notoria en comparacin al espectro de las AuNPs
aisladas (Figura 12). El mximo a 520nm se corre hacia la izquierda y pierde intensidad
en relacin al piso de absorcin del espectro. Tambin, la absorbancia aumenta de forma
pareja, sin ningn mximo puntual para longitudes de onda comprendidas entre 650-
800nm. El perfil del espectro en esta ltima zona es consecuencia de la componente de
absorcin vinculada a las AuNPs agregadas. En particular, se puede tomar el valor de
Abs
700nm
como indicador relativo del monto de AuNPs agregadas, y a travs de la
relacin Abs
520nm
/Abs
700nm
determinar el grado de agregacin del sistema. Como era de
esperar, este cociente resulta mucho mayor para las AuNPs aisladas que para el agregado
de AuNPs-DNAzyma.
El cambio de color y de perfil del plasmn superficial y la precipitacin de estructuras
macroscpicas demuestran la existencia de un acercamiento espacial de las AuNPs y la
formacin de agregados compuestos por varias partculas.

400 500 600 700 800
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
Longitud de Onda (nm)



Figura 12: -spec!ro elec!r&nico en el rango +isible ( fo!ograf$a macrosc&pica del agregado de >uFPsJ
DF>#(ma /+iole!a0, 8a grfica roIa pun!eada corresponde al espec!ro de las >uFPs aisladas,

62









Las micrografas de TEM tambin permiten observar y demostrar la formacin de los
agregados de AuNPs-DNAzyma. En estas micrografas, se observa que las AuNPs
forman estructuras compuestas por varias nanopartculas, con un patrn de separacin
que se mantiene fijo en casi todas las uniones (Figura 13). Hacia el extremo de los
agregados, prcticamente no hay superposicin ni AuNPs aisladas; todas se ven en un
mismo plano, respetando una separacin espacial que se repite de forma casi constante.
Volviendo al principio de esta seccin, en las micrografas de las AuNPs aisladas
tambin se vea uniones entre las partculas (Figura 3), pero no haba el patrn de
separacin estable que se observa en estas imgenes
40nm 40nm
500nm 500nm
Figura 13: Bicrograf$as de C-B de los agregados >uFPsJDF>#(ma, 8as diferen!es imgenes permi!en
obser+ar el sis!ema a dis!in!as escalas, 8a imagen superior i#'uierda corresponde a un pe'ue6o
agregado de apenas un par de decenas de >uFPs, -n es!a imagen prc!icamen!e no Ha( superposici&n
de nanopar!$culas ( se puede +er como la dis!ancia de uni&n en!re cada una de ellas se man!iene
bas!an!e es!able, 8a imagen superior derecHa corresponde un e%!remo de un agregado de ma(ores
proporciones, -n las dos imgenes inferiores el aumen!o de la escala permi!e obser+ar el e%!remo
agrupaciones de >uFPs mucHo ms impor!an!es,
-n las cua!ro micrograf$as !ambi"n se +e como las nanopar!$culas man!ienen su iden!idad esf"rica a
pesar de formar par!e de agregados supramoleculares,
63
Sabiendo que el largo de cada nucletido de ADN es de 0.34nm y que la hebra
sustrato tiene 51 nucletidos, la distancia de separacin terica entre las AuNPs, de no
existir ningn pliegue adicional, debera ser de alrededor de 17nm. En las imgenes sin
embargo, esta distancia es claramente menor. Probablemente, en el puente de unin
entre las AuNPs la hebra sustrato no se encuentra completamente extendida, de forma
que la separacin entre las nanopartculas se reduce notoriamente.

Otro punto a destacar de las micrografas es que, a pesar del nuevo aspecto observado en
el sistema, las AuNPs de los agregados mantienen la identidad geomtrica. La
agregacin por fenmenos de este tipo produce la aproximacin en el espacio de las
nanopartculas funcionalizadas, pero evita la fusin de estas estructuras en un nico
cuerpo de mayores dimensiones. En este sentido, resulta interesante comparar las
suspensiones y las imgenes obtenidas de estos agregados por ADN con los agregados
inducidos por NaCl.
Sobre una suspensin de AuNPs aisladas, la adicin de una solucin concentrada de
NaCl genera cambios macroscpicos inmediatos en el sistema coloidal. La suspensin de
AuNPs, antes roja intensa, se vuelve azul en cuestin de segundos. El perfil del espectro
electrnico acompaa este cambio de color del sistema (Figura 14).


400 500 600 700 800
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
Longitud de onda (nm)




Las micrografas de TEM de los agregados inducidos por NaCl revelan que las AuNPs
aisladas y esfricas han perdido completamente su identidad y se encuentran fusionadas
en una especie de gran red metlica (Figura 15). En este caso, ya no se puede hablar de
separacin espacial entre las nanopartculas debido al colapso y la fusin de las esferas
originales. Al comparar los dos sistemas, AuNPs agregadas por ADN y AuNPs
agregadas por NaCl, las diferencias microscpicas entre los dos sistemas son notorias. El
estado de agregacin se vincula directamente con el color macroscpico de la
suspensin. La suspensin de AuNPs aisladas, de color rojo intenso, va volvindose
ms azul a medida que las esferas se aproximan en el espacio. Las AuNPs
funcionalizadas en el complejo con ADN presentan un estado de agregacin
Figura 14: -spec!ro elec!r&nico en el rango +isible ( fo!ograf$a macrosc&pica del agregado de >uFPs
inducido por Fa.l /a#ul0, 8a grfica roIa pun!eada corresponde al espec!ro de las >uFPs aisladas,

64
intermedio y por eso su color violeta. Finalmente, el color azul bien definido en las
AuNPs agregadas por NaCl se debe a que ya no hay separacin entre las esferas.










































200nm 400nm
Figura 15: Bicrograf$as de C-B de los agregados >uFPs inducidos por Fa.l, -n las dos imgenes se
obser+a una es!recHa red de nanopar!$culas sobre la 'ue resul!a imposible dis!inguir elemen!os
aislados, 8a adici&n de Fa.l pro+oca la p"rdida de la iden!idad esf"rica de las >uFPs ( el colapso en una
)nica gran es!ruc!ura en forma de red,

65
PUESTA A PUNTO DEL SENSOR Y CURVA DE CALIBRACIN

La mezcla de los cuatro componentes del sensor dio lugar a una suspensin violeta, y
dentro de ella, un agregado de aspecto slido que precipita si el sistema se mantiene
esttico. En principio, esta suspensin puede actuar como un sensor colorimtrico para
Pb(II), de acuerdo al mecanismo de deteccin ligh-up planteado en el Desarrollo
Terico.
Es as que se ensayaron distintas soluciones acuosas de Pb(II) de varias concentraciones
para evaluar la respuesta del sensor y verificar si realmente permite revelar la presencia
del in metlico.

La precipitacin espontnea de los agregados AuNPs-DNAzyma result sumamente
beneficiosa a la hora de elaborar el protocolo de uso del sensor. Esta propiedad del
sistema permite realizar los ensayos sobre un soporte inerte (Parafilm

, en este caso). El
ensayo realizado de forma directa sobre el agregado AuNPs-DNAzyma resulta mucho
ms ventajoso que trabajar directamente en solucin, por ejemplo. La forma de trabajo
descrita en los Mtodos permite conservar la alta intensidad del color del sensor, ya que,
entre el volumen de sobrenadante que se quita y el volumen adicionado de Pb(II), no se
realiza una dilucin excesiva y se logra mantener el volumen de la solucin original.

En una primera serie de medidas se evala la respuesta del sensor frente a soluciones de
Pb(II) de 0ppm, 1ppm, 3ppm, 6ppm y 10ppm. Aplicando la metodologa descrita
anteriormente, la adicin de la solucin sobre el agregado produce un cambio de color
inmediato del sistema de deteccin nicamente en los ensayos de 6ppm y 10ppm.
Despus de la re-suspensin en la solucin del ensayo, el sensor, originalmente violeta-
oscuro, se torna rojo intenso indicando la presencia de AuNPs aisladas. (Figura 16) En
cambio, esta variacin del color no se produce para la solucin blanco y las soluciones
de Pb(II) de 1ppm y 3pmm. En este caso, al resuspender en el solvente, el agregado
mantiene el color violeta original.
La experiencia se repiti varios meses ms tarde con reactivos nuevos y un nuevo sensor
construido desde cero en iguales condiciones, empleando ahora soluciones de Pb(II) de
0pmm, 2ppm, 4ppm, 8ppm y 20ppm. En este caso, se observan cambios colorimtricos
significativos nicamente para las soluciones de 4ppm y 8ppm. En contrapartida, el
ensayo con la solucin 20ppm produce una reaccin inesperada en el sensor, que no se
vincula con el mecanismo de deteccin asociado al instrumento. La adicin de la
solucin de Pb(II) produce la precipitacin total del agregado y la formacin de un slido
negro imposible de caracterizar en el espectro Uv-Vis. Por lo tanto, resulta imposible
aplicar este sistema para concentraciones de Pb(II) de esta magnitud.
A partir de estos resultados, se puede proyectar un primer lmite de deteccin para
ensayos colorimtricos a ojo-desnudo. De las diferentes soluciones ensayadas, 4ppm
es la menor concentracin de Pb(II) que logra activar a la DNAzyma y producir la
desagregacin y el cambio de color visible del sensor. Los ensayos realizados con
soluciones de menor concentracin no logran desensamblar los agregados, y el color del
sensor se mantiene idntico al ensayo sin Plomo.
Para las evaluaciones a ojo-desnudo tambin resulta difcil establecer un rango de
deteccin semi-cuantitativo. El cambio de color observado en los diferentes ensayos con
resultados positivos es prcticamente el mismo, y no es posible distinguir de manera
sencilla tonos de rojo diferentes en cada una de estas medidas. En este sentido, el sensor
diseado y la metodologa aplicada resultan adecuados para un instrumento de deteccin
de resultados positivo/negativo.
66
El lmite de deteccin estara fijado en 4ppm de Pb(II), la menor concentracin que logra
producir el cambio de color del sistema (Figura 16). Adems de las caractersticas de la
seal de transduccin, la posibilidad de trabajar sobre soportes inertes y el resultado
instantneo del anlisis tambin son cualidades positivas en vistas de posibles
aplicaciones prcticas.













El resultado y el color de cada uno de los ensayos tambin puede evaluarse a travs del
espectro electrnico (Figura 17).
En los resultados de la primera serie de medidas se observa claramente como el espectro
de los ensayos de 6ppm y 10ppm resultan muy similares al espectro de las AuNPs
aisladas (Figura 17a). En comparacin al espectro del sensor ensamblado, la adicin de
Pb(II) corre el mximo de la grfica hacia la izquierda y gana en intensidad en relacin al
piso de absorcin a longitudes de onda mayores, comprendidas entre 650-800nm. En
cambio, el espectro de los ensayos no positivos de 3ppm y 1ppm prcticamente no vara
respecto a la medida con la solucin blanco.

Aparte, tambin puede observarse como los espectros de los dos resultados positivos
presentan diferencias entre s. Para el ensayo de 6ppm, la componente del espectro a
700nm (consecuencia de las AuNPs agregadas) es mucho ms apreciable que para el
ensayo de 10ppm, e indicara que la desagregacin del complejo AuNPs-DNAzyma
todava no se dio de forma completa. Esta diferencia se vuelve evidente al calcular el
cociente de Abs
520nm
/Abs
700nm
, el parmetro utilizado para intuir el grado de agregacin
del sistema.
El mismo estudio se realiza para la segunda serie de medidas. En este caso, el perfil del
espectro de los dos resultados positivos tambin resulta similar al espectro de las AuNPs
aisladas (Figura 17b). Adems, en estos dos ensayos se puede ver de nuevo como la
Abs
700
es mayor para el anlisis de la solucin con menos Pb(II).

A partir de estos resultados, es posible trabajar con el parmetro Abs
520nm
/Abs
700nm

utilizado por Liu & Lu para evaluar el grado de desagregacin del complejo AuNPs-
DNAzyma.[27, 63-65] Como se mencion anteriormente, estas dos longitudes de onda
se asocian directamente con las componentes de absorcin de las AuNPs aisladas
(Abs
520nm
) y de las AuNPs agregadas (Abs
700nm
); cuanto ms grande la diferencia entre
las dos mediciones, caso esperado para un sistema de AuNPs aisladas, ms grande
tambin el valor del parmetro de ensayo.

>uFPs agregadas por la DF>#(ma
/5ensor ensamblado0
5ensor reJdispersado en Pb/GG0 de
diferen!es concen!raciones
10 6 4 1 0 ppm Pb/GG0
Figura 16: 5ensor an!es ( despu"s de ensa(ar las soluciones de Pb/GG0 de la primera serie de medidas, 5e
obser+a como el cambio de color de +iole!a oscuro a roIo se produce solamen!e en los ensa(os de
6ppm ( 10ppm,

67



































La grfica Abs
520nm
/Abs
700nm
vs. Concentracin de Plomo tiene dos zonas bien
diferenciadas (Figura 18). La primera zona va hasta 3ppm, y en ella el parmetro
desagregacin es prcticamente el mismo para las 4 medidas realizadas, incluida la
solucin blanco. Estos ensayos eran los resultados no positivos observados en la
evaluacin a ojo-desnudo. La segunda zona comienza con la medida de 4ppm, el lmite
de deteccin fijado en la primera etapa. En esta rea se produce un aumento sostenido
del cociente de absorbancias, que puede asociarse directamente con mayores niveles de
desagregacin del complejo AuNPs-DNAzyma como consecuencia del aumento de la
concentracin de Pb(II), el cofactor que permite el clivaje. En particular, el valor del
Figura 17: -spec!ro elec!r&nico de los resul!ados de >07 la primera serie de medidas ( A07 la segunda
serie de medidas /reali#adas en el e'uipo >.CLene >5PJ37000, Para la primera serie los resul!ados
nega!i+os de 1ppm ( 3ppm !ienen el mismo perfil 'ue el espec!ro elec!r&nico de la soluci&n blanco, -n
cambio en los ensa(os con 6ppm ( 10ppm el Pb/GG0 adicionado logra desagregar el compleIo >uFPsJ
DF>#(ma ( el espec!ro elec!r&nico ob!enido se asemeIa al de las >uFPs aisladas, 8o mismo sucede con
la segunda serie, -l ensa(o de 2ppm presen!a el mismo perfil 'ue la soluci&n blanco mien!ras 'ue los
ensa(os de 4ppm ( 8ppm !ienen un compor!amien!o similar al de los resul!ados posi!i+os an!eriores,
8os +alores de absorbancia absolu!os son no!oriamen!e diferen!es en!re las dos series como puede
no!arse en .0, 5in embargo como la absorbancia es una propiedad adi!i+a para el sis!ema en es!udio
/2igura 20 el empleo el cocien!e >bs
520nm
:>bs
700nm
como indicador

del es!ado de agregaci&n en!re los
diferen!es ensa(os no precisa de medidas del mismo orden de magni!ud,
400 500 600 700 800
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
Longitud de Onda (nm)
0 ppm
1 ppm
3 ppm
6 ppm
10 ppm
400 450 500 550 600 650 700 750 800
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
Longitud de onda (nm)
8 ppm
4 ppm
2 ppm
0 ppm
400 500 600 700 800
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
Longitud de onda (nm)
1 ppm
3 ..
6 ..
10 ..
8 ..
4 ..
2 ..
A) B)
C)
68
parmetro para el ensayo de 10ppm se encuentra muy cerca del lmite de
Abs
520nm
/Abs
700nm
terico, que surge del cociente calculado para las AuNPs aisladas
previo a la construccin del sensor (el lmite terico surge de asumir que las AuNPs del
sensor no pueden desagregarse an ms que las AuNPs aisladas).

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Ecuacion:
y = A2 + (A1-A2)/(1 + exp((x-x0)/dx))
Chi^2/DoF = 0.11286
R^2 = 0.97203

A1 1.45387 0.19578
A2 8 0
x0 8.27521 0.27965
dx 1.70155 0.29993
A
b
s
5
2
0
n
m
/
A
b
s
7
0
0
n
m
Concentracin Pb(II) (ppm)
1a serie de medidas
2a serie de medidas





Las dos zonas bien diferenciadas y el lmite terico establecido sirven para realizar un
ajuste sigmoideo con los resultados obtenidos en los ensayos. Este tipo de ajuste es el
mismo que realizan Liu & Lu en los artculos originales.[27, 63] La zona de transicin de
la curva se ubica entre 4ppm y 12pmm, y podra utilizarse como indicador de la
concentracin de Pb(II) para anlisis semi-cuantitativos. La estabilizacin del cociente de
absorbancias en este ajuste se lograra para valores por encima de 12ppm. De todas
formas, se recuerda que el ensayo de 20ppm no arroja resultados positivos ya que se
produce una reaccin inesperada entre el complejo AuNPs-DNAzyma y el in metlico.

En resumen, el empleo de AuNPs de 17.7nm de dimetro funcionalizadas con
oligmeros de ADN y de una variante asimtrica de la DNAzyma 17E permiti construir
un sensor colorimtrico para detectar Pb(II) en soluciones acuosas. El sensor funciona
sobre un soporte inerte y ofrece resultados inmediatos, cambia de color de violeta oscuro
a rojo intenso, para concentraciones de Pb(II) por encima de 4ppm. Para medidas a ojo-
desnudo el sensor solamente funciona como instrumento en ensayos cualitativos, ya que
resulta muy complicado distinguir diferentes tonos de rojo entre los resultados positivos
obtenidos. En cambio, empleando el cociente Abs
520nm
/Abs
700nm
es posible establecer un
rango de deteccin semi-cualitativo entre 4ppm y 12ppm. Valores de Pb(II) por debajo
de 4ppm producen la misma seal que la solucin blanco.

Figura 18: Lrfica .oncen!raci&n de Pb/GG0 +s, >bs
520nm
:>bs
700nm
( aIus!e sigmoideo a los resul!ados
e%perimen!ales, 5e dis!inguen las medidas pro+enien!es de las dos series reali#adas ( se obser+a c&mo
se aIus!an a una )nica !endencia a pesar de 'ue sus +alores de absorbancia absolu!os /2igura 170 son
comple!amen!e diferen!es,
69
PERSPECTIVAS DEL SENSOR PARA ANLISIS DE P+,II- EN SANGRE

Es posible adaptar el sistema diseado para realizar estudios de Plombemia? En
principio, el primer gran problema surge al evaluar el lmite de deteccin instrumental.
El sensor solo puede detectar concentraciones de Pb(II) por encima de 4ppm, mientras
que el lmite de intervencin de Pb(II) en sangre definido por los organismos
internacionales es de 0.1ppm, cifra poco ms de un orden por debajo del lmite de
deteccin del instrumento. Con el sensor tal como fue diseado en este trabajo, la
diferencia entre los dos lmites resulta infranqueable y no sera posible determinar casos
de contaminacin por Plomo analizando directamente una muestra de sangre cruda.
En la construccin del sensor se esperaba llegar a un lmite de deteccin ms bajo,
similar a los que obtienen Liu & Lu en las diferentes versiones de sus instrumentos.[27,
63]

Diferentes alternativas se presentan para solucionar este problema del lmite de
deteccin. Empleando el mismo sistema construido en este trabajo, se podra trabajar
sobre muestras de sangre digeridas y concentradas. Al evaporar todos los componentes
voltiles y digerir la materia orgnica, las cenizas resultantes de este proceso contienen
todo el Pb(II) de la muestra original y pueden resuspenderse en un volumen de solvente
menor, cuestin de aumentar la concentracin y alcanzar el lmite de deteccin. Sin
embargo, realizar este proceso de digestin aumenta significativamente el tiempo y la
complejidad del anlisis y adems implica desaprovechar varias de las caractersticas
principales y deseables de los sensores colorimtricos.
Otra alternativa pasa por buscar soluciones que permitan bajar el lmite de deteccin a
travs de cambios en el diseo del sensor. Por ejemplo, asumiendo que el problema se
encuentra en la etapa de desagregacin posterior a la adicin de Pb(II), se pueden
modificar algunos aspectos del sistema, como la relacin de enlaces AT sobre CG en la
DNAzyma o el largo de los oligonucletidos de las derivatizaciones. Estas
modificaciones permiten lograr uniones ms lbiles que pueden romperse frente a
variaciones de energa menores o quiz menores concentraciones de Pb(II). Adems,
tambin se ha estudiado que el aumento del tamao de las AuNPs puede favorecer
algunos aspectos de esta etapa, como la velocidad de desagregacin del sistema.[64]
Tambin se desconoce cmo pueden interferir en el ensayo los otros componentes
presentes en la sangre. El Pb(II) puede encontrarse de varias formas dentro del torrente
sanguneo (libre en solucin, ocupando los sitios de Zn en la enzima ALAD de los
eritrocitos, entre otros), y la disponibilidad de cada una de ellas para la reaccin de la
DNAzyma no est estudiada. El color de la sangre para anlisis de muestras crudas sin
diluir tambin puede resultar un problema.

Las dos alternativas planteadas conservan el diseo y el mecanismo de deteccin
empleado en este trabajo, pero tambin puede resultar atractivo investigar sobre otros
sistemas de caractersticas similares.
Un artculo publicado en 2009 describe un nuevo sensor colorimtrico para detectar
Pb(II), tambin elaborado a partir de AuNPs y la DNAzyma 17E.[72] Este nuevo sistema
aprovecha las propiedades de unin diferencial entre el ADN simple hebra y doble hebra
con las AuNPs, y permite crear un diseo y mecanismo de deteccin ms simple, ya que
prescinde de la funcionalizacin a travs del ADN tiolado (Figura 19).


70







Otro aspecto a evaluar es el costo de cada ensayo. En este sentido, para tener cierta
ventaja en futuras aplicaciones reales la alternativa de medicin planteada no debe ser
ms costosa que los mtodos de referencia. A partir de los precios de cada uno de los
reactivos y de la cantidad que se emplea en cada medida se calcula que el precio de
ensayo es de alrededor de 0.8 (Cuadro 2). Este valor puede compararse con los US$ 55
que cuesta realizar el anlisis actualmente empleando la tcnica AAS.





















Figura 19: Becanismo de de!ecci&n del nue+o sensor, Despu"s del cli+aIe inducido por el Pb/GG0 se
produce la liberaci&n de una mol"cula simple Hebra de >DF 'ue se adsorbe en la superficie de las
>uFPs, 8a adici&n de Fa.l al compleIo no afec!a a las >uFPs adsorbidas con >DF pero produce la
agregaci&n de las >uFPs no !ra!adas con Pb/GG0, >dap!ado de 1ef, ?72@,
.4>D1= 27 D-C-1BGF>.GZF D-8 .=5C= D- -F5>W=

'recio %e los com$onen!es %el sensor:
<>u.l
4
\ 3 <
2
= _ 100 a por 0,5g
<ebra Men#imaN _ 30 a por 0,2Xmoles
<ebra Msus!ra!oN _ 70 a por 0,2Xmoles
>DF 5Umodificado _ 70 a por 0,2Xmoles
>DF 3Umodificado _ 70 a por 0,2Xmoles

<>u.l
4
\ 3 <
2
= en s$n!esis 0,0195g 3,9a sir+e para reali#ar apro%, 5 deri+a!i#aciones
>DF 5Umodificado en deri+a!i#aci&n 0,06Xmoles 21a sir+e para reali#ar apro%, 10 ensamblados
>DF 3Umodificado en deri+a!i#aci&n 0,06Xmoles 21a sir+e para reali#ar apro%, 10 ensamblados
<ebra Men#imaN en ensamblado 0,012Xmoles 1,8a sir+e para 10 ensa(os de Pb/GG0
<ebra Msus!ra!oN en ensamblado 0,005Xmoles 1,75a sir+e para 10 ensa(os de Pb/GG0

1 5$n!esis de >uFPs permi!e reali#ar 10 deri+a!i#aciones, 1 deri+a!i#aci&n permi!e reali#ar 10
ensamblados, 1 ensamblado permi!e anali#ar 10 soluciones de Pb/GG0

.os!o por ensa(o V .os!o >uFPs Q .os!o >DF 5U ( 3U Q .os!o <, Msu!ra!oN Q .os!o <, Men#imaN
.os!o por ensa(o _ 2 % /3,9a : /5 % 10 % 1000 Q 2 % /21a : /10 % 1000 Q /1,75a : 100 Q /1,8a : 100
+os!o $or ensa-o = 0*8>
71
CONCLUSIONES


Se logr construir un sensor colorimtrico positivo/negativo que funciona sobre
soportes inertes y que permite detectar, a simple vista y de forma inmediata, soluciones
de Pb(II) con concentraciones iguales o mayores a 4ppm. Para concentraciones de Pb(II)
entre 4ppm y 12ppm, el cociente de Abs
520nm
/Abs
700nm
podra llegar a ser til para
establecer un rango de anlisis semi-cuantitativo.

Para poder adaptar el sensor de Pb(II) para anlisis de Plombemia es necesario optimizar
varios aspectos del sistema. El principal problema en el sensor diseado surge por la
diferencia entre el lmite de deteccin del instrumento y el lmite de intervencin de
Pb(II) en sangre establecido por los organismos de referencia. Sin embargo, las
caractersticas del ensayo, como la seal colorimtrica o el resultado instantneo, y el
bajo costo relativo por medida son algunas de las ventajas que presenta este sistema y
que motivan a continuar el trabajo en este sentido.




























72
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