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DETERMINAO DA ATIVIDADE DA INVERTASE DO LEVEDO

1. OBJETIVOS
a) Objetivo geral
Determinar a atividade da invertase do levedo.
b) Objetivo e!e"#$i"o
- Obter a enzima invertase;
- Realizar a curva-padro de glicose-frutose pelo grfico de absorbncia x
concentrao;
- dentificar a mel!or diluio para a enzima;
- Determinar a cin"tica de ao da enzima invertase;
- #nalisar o efeito da concentrao da enzima e do substrato;
%. MATERIAIS E M&TODOS
a. Obte'()o *a e'+i,a
- $sptula
- %rovetas &'ml
- (entr)fuga
- *alana
- +ral e pistilo
- ,ubos de ensaios
- *"-uer .'m/
- +aleria
- 0)lica
- 1ter et)lico
- 2gua destilada
- ,ablete de levedura 3fermento de po4
(olocou-se .g de levedura 3fermento de po4 em um gral. #crescentou 56.g de s)lica
em p76 previamente pesada6 e depois .m/ de "ter et)lico. ,riturou-se bem e adicionaram-
se por8es de 5m/ de gua destilada at" completar o volume de 9'm/6 sendo a invertase
solubilizada na gua6 seguindo de mais tritura8es. Deixou-se em repouso por uma !ora6
colocou-se o preparado em tubo de ensaio espec)fico para centr)fuga e o colocou para
centrifugar a &'''' rpm6 por &' minutos6 a centrifugao proporcionou a deposio de
massa no fundo do recipiente6 com a enzima no sobrenadante. O sobrenadante obtido foi
divido em pe-uenos tubos e armazenado no congelador.
b. Curva padro de glicose-frutose
- :icropipeta &m/
- *an!o-maria
- ,ubos de ensaio
- +aleria
- 0oluo de glicose e frutose
- 2gua destilada
- Reagente 96.-D;0
- %roveta
- *"-uer
%ipetou-se al)-uotas da soluo de glicose 3.mmol</4 e frutose 3.mmol</46 e
colocou-se em tubos de ensaio. (ompletou-se o volume a &6.m/ com gua destilada. $m
seguida6 acrescentou-se aos tubos anteriores6 &m/ do reagente 96.-D;0 com o aux)lio de
uma micropipeta. (olocaram-se os tubos em ban!o de gua fervente por . minutos para
o desenvolvimento da reao corada. Resfriaram-se os tubos e adicionou-se =6.m/ de
gua destilada para completar o volume6 misturando logo em seguida e realizando a
leitura da absorbncia a .>'nm. Os tubos foram preparados de acordo com a tabela &.
T-bo Sol-()o *e gli"oe $r-toe .,L) /g-a .,L)
1 ' &6.
% '6& &6>
0 '65 &69
1 '69 &65
2 '6> &6&
3 '6. &6'
4 '6? '6@
5 '6= '6A
Tabela 16 7re!ara()o *o t-bo !ara *eter,i'ar a "-rva !a*r)o
". E"ol8a *a ,el8or *il-i()o *a e'+i,a
- ,ubos de ensaio
- :icropipeta &m/
- *an!o-maria
- ,ubo de ensaio contendo a enzima
- +aleria
- 0oluo tampo
- 2gua destilada
- %roveta
- Reagente 96.-D;0
%reparou-se uma s"rie de tubos6 conforme indicado na tabela 5.
T-bo Sa"aroe 9:9%M .,L) Ta,!)o A"etato 9:92M
.,L)
I'vertae Dil-#*a
.,L)
Dil-i()o
1 '6. &6' - -
% '6. '6A '65 3'x4
0 '6. '6A '65 35x4
1 '6. '6A '65 3.x4
Tabela 9%6 !re!ara()o *o t-bo !ara *eter,i'ar a ,el8or *il-i()o e'+i,;ti"a.
#crescentou-se primeiramente '6.m/ de soluo '6'5: da sacarose nos tubos6
seguido do acr"scimo de volumes da soluo tampo acetato '6'.:6 como mostrado na
tabela 5. #p7s isso6 foi adicionados volumes da enzima em trBs dos -uatro tubos6
marcando como zero o tempo em -ue a enzima foi adicionada em cada tubo. #gitou-se
rapidamente e incubou-os C temperatura ambiente por . minutos. nterrompeu-se a
reao pela adio de &m/ de 96.-D;0 com o aux)lio de uma micropipeta de &m/. Os
tubos foram agitados e colocados em ban!o de gua fervente durante . minutos. #p7s
isso6 resfriaram-se os tubos e adicionou-se em seguida =6.m/ de gua destilada para
cada tubo6 misturando em seguida. %or fim6 executou-se a leitura da absorbncia a
.>'nm6 escol!endo C-uela cuDa absorbncia estiver pr7xima de '6.6 valor obtido como
referBncia.
*. <i'=ti"a *a a()o *a i'vertae
- ,ubos de ensaio
- :icropipeta &m/
- %rovetas
- *an!o-maria
- ,ubo de ensaio contendo a enzima
- +aleria
- 2gua destilada
- Reagente 96.-D;0
- 0oluo tampo
%reparou-se uma s"rie de tubos6 conforme indicado na tabela 9.
,ubos ,ampo acetato '6'.m 3ml4 nvertase dilu)da 3ml4 ,empo 3mim4
& &6' - '
5 '6A '65 &
9 '6A '65 5
> '6A '65 9
. '6A '65 >
? '6A '65 .
= '6A '65 ?
A '6A '65 A
@ '6A '65 &.
Tabela 906 !re!ara()o *o t-bo !ara *eter,i'ar a "i'=ti"a *a a()o.
#crescentou-se primeiramente volumes da soluo tampo acetato '6'.:6 como
mostrado na tabela 96 seguido do acr"scimo de '6.m/ de soluo '6'5: da sacarose nos
tubos a temperatura ambiente6 por intervalos de tempo variveis como mostrado na tabela
acima. nterrompeu-se a reao pela adio de &m/ de 96.-D;0 com o aux)lio de uma
micropipeta de &m/6 agitando bem os tubos6 -uem em seguida foram colocados em
ban!o de gua fervente por um per)odo de . minutos. #p7s passado o tempo
determinado6 os tubos foram resfriados e adicionados =6.ml de gua destilada6
misturando logo em seguida e realizando a leitura da absorbncia a .>'nm.
e. E$eito *a "o'"e'tra()o *a e'+i,a
- ,ubos de ensaio
- :icropipeta &m/
- %rovetas
- *an!o-maria
- ,ubo de ensaio contendo a enzima dilu)da
- +aleria
- 2gua destilada
- Reagente 96.-D;0
- 0oluo tampo
Os tubos de ensaio foram preparados como indicado na tabela >. #p7s a preparao
desses tubos6 iniciou-se a reao pela adio de '6.m/ de soluo de sacarose '6'.:. #
reao foi interrompida pela adio de &m/ de 96.-D;0. #gitou-se os tubos e os colocou
em ban!o de gua fervente durante . minutos. #dicionou-se =6.m/ de gua em cada tubo
com uma proveta6 misturando em seguida e executando a leitura da absorbncia a .>'nm
T-bo I'vertae Dil-#*a .,L) Ta,!)o A"etato 9:92M .,L)
1 ' &6'
% '6& '6@
0 '65 '6A
1 '6> '6?
2 '6A '65
Tabela 916 !re!ara()o *o t-bo !ara *eter,i'ar o e$eito *a "o'"e'tra()o *a e'+i,a.
$. E$eito *a "o'"e'tra()o *o -btrato
- ,ubos de ensaio
- :icropipeta &m/
- %rovetas
- *an!o-maria
- ,ubo de ensaio contendo a enzima dilu)da
- +aleria
- 0oluo tampo acetato
- Reagente 96.-D;0
- 2gua destilada
Os tubos de ensaio foram preparados como indicado na tabela .. #p7s a preparao
desses tubos6 adicionou-se '65m/ da invertase dilu)da6 para -ue se inicie a reao.
#gitou-se bem e incubou-os C temperatura ambiente por . minitos. # reao foi
interrompida pela adio de &m/ de 96.-D;0. #gitou-se os tubos e os colocou em ban!o
de gua fervente durante . minutos. #dicionou-se =6.m/ de gua destilada em cada tubo
com uma proveta de &'m/6 misturando em seguida e executando a leitura da absorbncia
a .>'nm.
T-bo Sol-()o *e a"aroe .,olari*a*e) Ta,!)o a"etato .,l)
1 ' &69
% '6'& '6A
0 '6'5 '6A
1 '6'9 '6A
2 '6'> '6A
3 '6'. '6A
4 '6'? '6A
5 '6'= '6A
> '6&' '6A
Tabela 926 !re!ara()o *o t-bo !ara *eter,i'ar o e$eito *a "o'"e'tra()o *o -btrato
0. RES?LTADOS E DIS<?SSO
a. Obte'()o *a e'+i,a
# enzima invertase do levedo 0acc!aromEces cerevisae foi obtida com sucesso por
meio dos m"todos empregados6 sendo devidamente coletada6 reservada e armazenada
em um refrigerador para uso nos experimentos subse-uentes.
b. <-rva !a*r)o *e gli"oe@$r-toe
T-bo Sol-()o *e gli"oe $r-toe .,l) A%o .,l) A .219',) Bli"oe@$r-toe
.C,ol)
1 ' &6. ' '
% '6& &6> '6'AA? &
0 '65 &69 '6&?&. 5
1 '69 &65 '65..& 9
2 '6> &6& '6955. >
3 '6. &6' '69>.@ .
4 '6? '6@ '6.?=& ?
5 '6= '6A '6?5>' =
Tabela 36 re-lta*o "-rva !a*r)o *e gli"oe@$r-toe
#o retirar os tubos de ensaio do ban!o em gua fervente notou-se a variao na
intensidade da cor dos mesmos6 onde o tubo & possu)a uma colorao mais clara em
relao aos tubos seguintes6 at" encontrar a amostra mais escura no tubo A. sso D
permitiu uma deduo visual dos resultados do experimento6 -ue foi elucidado mais
aprofundadamente atrav"s do espectro de absorbncia lido no espectrofotFmetro.
#p7s calcular a concentrao de glicose-frutose em Gmol traou-se a curva padro
de glicose-frutose e calculou-se o coeficiente de inclinao da reta -ue foi de '6'A=@ da
reta.
Dessa forma6 com a construo do grfico6 foi poss)vel determinar a e-uao da
reta6 bem como o valor de R5 no grfico6 -ue -uanto mais pr7ximo de &6 mostra como os
valores tendem a fazer parte da reta. (om um R5 H '6@?@ c!egou-se a concluso de -ue
os valores tendem a fazer parte da reta.
Br;$i"o 16 aborbD'"ia E C,ol *e a(F"are re*-tore.
". E"ol8a *a ,el8or *il-i()o *a e'+i,a
T-bo Sa"aroe
9:9%, .,l)
Ta,!)o a"etato 9:92,
.,l)
I'vertae *il-#*a .,l).'G *e
ve+e)
Dil-i()o A .219',)
1 '6. &6' - '6'&5?
% '6. '6A '65 3'x4 'x 56>?.=
0 '6. '6A '65 35x4 5x &6.99&
1 '6. '6A '65 3.x4 .x '6.9@5
Tabela 46 re-lta*o *a e"ol8a *a ,el8or *il-i()o *a e'+i,a
# diluio escol!ida foi a do tubo >6 pois partiu-se do pressuposto -ue a soluo
escol!ida seria a -ue a absorbncia6 em .>'nm6 mais se aproximasse de '6..
*. <i'=ti"a *a a()o *a i'vertae
T-bo Ta,!)o a"etato
9:92, .,l)
I'vertae
*il-#*a .,l)
Te,!o
.,i'-to)
A .',) A(F"ar@re*-tor
$or,a*o .C,ol)
1 &6' - ' '6'&=@ '69>'?
% '6A '65 & '65@&9 96>.'.
0 '6A '65 5 '6>@?' .6==@5
1 '6A '65 9 '6.>?5 ?69.'>
2 '6A '65 > '6??'9 =6?>A.
3 '6A '65 . '6?.@. =6?9@>
4 '6A '65 ? '6A'?. @69&&=
5 '6A '65 A &65>95 &>65=@@
> '6A '65 &. &6?AA5 &@69>5>
Tabela 56 Re-lta*o "i'=ti"a *a a()o *a i'vertae
%ara o clculo do aIcar redutor formado 3Gmols4 utilizou-se a e-uao da reta do
grfico da curva padro de glicose-frutose6 cuDa e-uao " descritaJ E H '6'A=@x K '6'&5.
#ssim6 substituiu-se o E por cada absorbncia lida6 sendo o x encontrado correspondente
ao aIcar-redutor formado.
Br;$i"o %6 C,ol *e a(F"ar re*-tor $or,a*o E te,!o6
e. E$eito *a "o'"e'tra()o *a e'+i,a
T-bo Ta,!)o a"etato
9:92, .,l)
I'vertae *il-#*a
.,l)
A
.219',)
He'+i,aI e, C,ol .J
K 9:954>E L 9:91%)
V9 e,
C,olM,i'. .vo K
He'+i,aIMNt)
1 &6' ' -6'6''@' - -
% '6@ '6& '659&= 56==5. '6..>.
0 '6A '65 '695.. 96A9@? '6=?=@
1 '6? '6> '6.?5' ?6.9'5 &69'?'
2 '65 '6A &6&>.@ &96&=5@ 56?9>?
Tabela >6 Re-lta*o *o e$eito *a "o'"e'tra()o *a e'+i,a.
Br;$i"o 06 Velo"i*a*e i'i"ial E <o'"e'tra()o *a e'+i,a
$. E$eito *a "o'"e'tra()o *o -btrato
T-bo Sol-()o *e
a"aroe
.,olari*a*e)
Ta,!)o
a"etato
.,l)
A
.219',)
H-btratoI e,
C,ol .J K
9:954>E L 9:91%)
V
.C,olM,i'.)
1Mv 1MHI
1 ' &69 '6''@& '65>'& '6'>A' 5'6A999 >6&?>@
% '6'& '6A '6.@'? ?6A... &69=&& '6=5@9 '6&>.@
0 '6'5 '6A '6=?&5 A6=@?> &6=.@9 '6.?A> '6&&9=
1 '6'9 '6A &6?>?5 &A6A?>? 96==5@ '65?.' '6'.9'
2 '6'> '6A &6=.9> 5'6'A>5 >6'&?A '65>@' '6'>@A
3 '6'. '6A 96'=>A 9.6&==5 =6'59> '6&>5> '6'5A>
4 '6'? '6A 56=??> 9&6?'A? ?695&A '6&.A5 '6'9&?
5 '6'= '6A 56=?== 9&6?59> ?695>= '6&.A& '6'9&?
> '6&' '6A 969'>& 9=6=5.A =6.>.5 '6&95. '6'5?.
Br;$i"o 16 <o'"e'tra()o *e -btrato .S) "o'tra a velo"i*a*e .V)
Rea()o *e Mi"8aeli@Me'te'
$stas pes-uisadoras criaram uma e-uao6 -ue nos permite demonstrar como a
velocidade de uma reao varia com a variao da concentrao do substrato. $sta
e-uao pode ser expressa graficamente6 e representa o efeito da concentrao de
substrato sobre a velocidade de reao enzimtica 3LM0(6 5'&&4.
# reao segue a reao de :ic!aelis-:enten uma vez -ue !ouve variao na
velocidade de reao em funo da concentrao do substrato durante o processo.
Br;$i"o 26 1MV E 1MHSI
<;l"-lo *o O, e V,aE !elo ,=to*o *e Li'ePeaver@B-rQ.
(onsiderando a e-uao E H .6''5&x K '6'''&6 sendo x H ' calcula-se o &<Nmax
como sendo H '6'''&. #ssim6 &<'6'''& H &'.'''6 logo o Nmax corresponde a &'.'''.
(onsiderando a mesma e-uao 3E H >6@@A>x O '6'''?46 tendo E H '6 calcula-se o
&<PmJ
' H .6''5&x K '6'''& tal -ue x H &6@@@5 assim6 &<Qm H &6@@@5 logoJ Qm H '6.''5.
O Pm de um substrato para uma enzima espec)fica " caracter)stico6 e nos fornece
um parmetro de especificidade deste substrato em relao C enzima. Ruanto menor o
Pm6 maior a especificidade6 e vice-versa.
1. <ON<L?SO
O estudo realizado permitiu a visualizao prtica do processo de isolamento de
uma enzima e a realizao de diversos testes -ue permitiram a verificao de sua
atividade em meios controlados em laborat7rio. #ssim6 pode-se referir a utilizao de
enzimas naturais de forma experimental de modo a obter produtos acabados em
laborat7rio.
$sta capacidade " de extrema importncia nas mais diversas indIstrias e6 portanto6
representa uma forma tecnol7gica de se desenvolver6 por exemplo6 frmacos utilizados
pela indIstria farmacButica.
Os ensaios de atividade realizados so necessrios para visualizar a viabilidade de
utilizao das enzimas em escala industrial ou laboratorial e sua produtibilidade no meio
controlado o -ual " capaz de se oferecer C mesma.
RERERSN<IAS
*arliQova6 #.; 0vore6 S. e :iertus6 0. 3&@@&46 AJbri* bioe'or $or *eter,i'atio' o$
-"roe. #nalEtica (!imica #cta6 #msterdan6 v. 5>=6 p. A9-A=.
(!eetam6 %. 0. S. 3&@@&46 A!li"a"io' *e lo e'+i,a e' la i'*Ftria. I'6 Tie,a'6 #.
:anual de *iotecnologia de los $nzima6 $ditora #cribia6 Taragoza6 p. 5?=-9=>.
(!en6 U. (. e /iu6 (. V. 3&@@?46 7ro*-"tio' o$ @$r-"to$-ra'oi*ae bJ Aspergillus
japonicus. $nzEme and :icrobial ,ec!nologE6 v. &A6 n. 56 p. &.9-&?'.
(ostaglioli6 %.; :eil!oc6 M.; Sanatova6 .; Plein6 R. e :asson6 S. 3&@@=46 Se"retio' o$
i'vertae $ro, Schwanniomyces occidentalis. *iotec!nologE /etters6 v. &@6 p. ?59-?5=.
Montana6 #.; +!ommid!6 (.; +uiraud6 S. e ;avarro6 S. 3&@@546 <o'ti'-o- al"o8oli"
$er,e'tatio' o$ -"roe -i'g $lo""-lati'g Jeat @ T8e li,it o$ i'vertae a"tivitJ.
*iotec!nologE /etters6 v. &>6 n.56 p. .'.-.&'.
MLR+O SL;OR6 #. E'+i,a e -a a!li"a(Ue 6 "i'=ti"a e'+i,ati"a. Lniversidade
Mederal de 0anta (atarina. Departamento de engen!aria -uimica e alimentos.
Mlorian7polis6 5''&. disponivel emJ WW
!ttpJ<<XXX.en-.ufsc.br<labs<probio<discYengYbio-<listaYexerc<cineticaYenzimatica.pdfZZ
#cesso em J &? maio 5'&9.
:#D+#;6 :ic!ael ,.; :#R,;PO6 So!n :. *rocQ biologE of microorganisms. &&. ed
Lpper 0addle RiverJ %rentice Vall6 5''?
Rubio6 :. (. e :aldonado6 :. (. 3&@@.46 %urification a'* "8ara"teri+atio' o$ i'vertae
from Aspergillus niger. (urrent :icrobiologE6 v. 9&6 n. 56 p. A'-A9.