Manual de Laboratorio de Qumica Analtica II (QM 228) 2014
Preparado por: Omar Chacn P y Vctor Jimnez Pgina 1
EXPERIMENTO # 4 SEPARACIN DE COMPUESTOS ORGNICOS POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA
I. OBJETIVOS. Estudiar los principios de la cromatografa en capa fina y sus aplicaciones. Aplicar las tcnicas de cromatografa en capa fina para la separacin de e identificacin de compuestos orgnicos.
II. MATERIALES Y REACTIVOS. Tijera, regla en mm, pinzas (saca cejas), cmaras cromatogrficas, vasos qumicos, probetas, capilares, placas de capa fina y lmpara UV. Reactivos: Acetona, etanol, triptfano, cistena, prolina, cido acetil saliclico, aspirina comercial, ibuprofeno, d-limoneno y ninhidrina (0.2%) como solucin reveladora de aminocidos. Eluyentes: a) Hexano: acetato de etilo 1:1, b) NH 4 OH:n-butanol:H 2 O 3:5:2 y c) NH 4 OH: etanol 7:3. Esta ltima es especfica para los aminocidos.
III. MARCO TERICO. La cromatografa es una tcnica que permite separar los componentes de una mezcla. Esta separacin se logra utilizando un sistema bifsico: fase estacionaria donde se retienen los compuestos a separar y fase mvil que desplaza de forma diferencial los compuestos a travs de la fase estacionara. Todas estas sustancias presentan un grado diferente de solubilidad segn su polaridad y peso molecular, lo que permite su separacin cuando una solucin de las mismas asciende por capilaridad a travs de una tira de papel poroso (papel de cromatografa o de filtro) o sobre lmina de silicagel dispuesta verticalmente sobre una pelcula de un disolvente orgnico (que en lo sucesivo llamaremos eluyente) ya que las ms solubles se desplazarn a mayor velocidad, pues acompaarn fcilmente al disolvente a medida que ste asciende. Manual de Laboratorio de Qumica Analtica II (QM 228) 2014 Preparado por: Omar Chacn P y Vctor Jimnez Pgina 2
Aparecern por tanto, varias bandas de diferentes colores o incoloras dependen de la composicin de la muestra. En el caso de manchas incoloras se recurre al uso de reveladores, como la luz UV para compuestos aromticos, FeCl 3 para fenoles, ninhidrina para aminocidos, I 2 para insaturaciones, K 2 CrO 4 /H 2 SO 4 para alcoholes entre otros. El Rf (rate factor) es la relacin entre las distancias recorridas por un compuesto y por el disolvente desde el origen del cromatograma.
La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el centro de la mancha, los clculos se simplifican si el denominador es 10. Para que los Rf sean reproducibles deben ser fijadas una serie de condiciones (Espesor de la placa, fase mvil, fase estacionaria, cantidad de muestra). El mximo valor de Rf que se puede alcanzar es de 1, lo ideal es un Rf entre 0.65 y 0.7. Para averiguar si dos compuestos son iguales, se colocan ambos sobre la misma placa y se desarrolla con varios eluyentes. Una vez desarrollados se calculan los Rf y si son distintos, puede deducirse con toda seguridad que no se trataba del mismo compuesto. Por el contrario si los Rf son iguales los compuestos pueden ser iguales o no serlo. Si se sospecha que dos compuestos son muy parecidos se eluyen sobre la misma placa con el mismo eluyente u otros de menor polaridad, hasta apreciar una separacin mnima. En este caso no se pueden usar reveladores qumicos, ya que alteraran los compuestos, sino indicador ultravioleta. Fase estacionaria: adsorbente. Est constituida por un slido poroso, finamente granulado, con centros activos polares en su superficie donde se adsorben las molculas de los compuestos que se van a cromatografiar. Cuanto menor sea el tamao de partcula de este material mayor ser la capacidad de adsorcin. Manual de Laboratorio de Qumica Analtica II (QM 228) 2014 Preparado por: Omar Chacn P y Vctor Jimnez Pgina 3
La adsorcin se debe a interacciones intermoleculares del tipo dipolo-dipolo, dipolo dipolo inducido o enlaces de hidrgeno entre el adsorbente y el soluto. El adsorbente ms utilizado es el gel de slice donde las interacciones tienen lugar entre los grupos SiOH y SiOSi; tambin se emplea con relativa frecuencia almina. El adsorbente debe ser inerte con las sustancias a cromatografiar. El gel de slice presenta carcter cido y la almina puede adquirirse con carcter neutro, cido o bsico. Fase mvil: eluyente. Es un disolvente en el que los componentes de las mezcla son, al menos, parcialmente solubles. Al aumentar la polaridad del disolvente aumenta la velocidad de elucin de los compuestos de la mezcla. Se puede utilizar un nico disolvente o una mezcla de disolventes e incluso llevar a cabo la elucin con un gradiente de polaridad aumentando progresivamente la proporcin del disolvente ms polar. Orden de polaridad de los compuestos orgnicos: cidos carboxlicos > Fenoles > Alcoholes y Tioles > Aminas > steres > Aldehdos y Cetonas > Hidrocarburos Aromticos > Hidrocarburos Halogenados > teres > Hidrocarburos Insaturados > Alcanos. Para un mismo compuesto, un aumento en la polaridad de la fase mvil hace que se desplace con ms facilidad de la fase estacionaria. Por ejemplo, se eluir ms rpidamente una amina en acetonitrilo que en hexano. Para compuestos poco polares, que se retienen poco en el adsorbente, se utilizan eluyentes apolares o poco polares como, por ejemplo, hexano. Para compuestos muy polares, que quedan muy retenidos en el adsorbente, se emplean eluyentes muy polares como el metanol o mezclas metanol-diclorometano; mientras que para compuestos de polaridad media se emplean eluyentes de polaridad intermedia y son muy aconsejables en estos caso las mezclas en distintas proporciones de hexano-acetato de etilo. Cromatografa de Capa Fina (CCP). La fase estacionaria (adsorbente) se encuentra depositada, formando una capa fina de un espesor uniforme sobre una placa de Manual de Laboratorio de Qumica Analtica II (QM 228) 2014 Preparado por: Omar Chacn P y Vctor Jimnez Pgina 4
vidrio, plstico o una lmina metlica. La mezcla a analizar se deposita con un capilar a una pequea distancia del borde inferior de la placa y se introduce en una cubeta donde est la fase mvil (eluyente), que ascender a lo largo de la capa por capilaridad eluyendo a los componentes de la mezcla a distintas velocidades, lo que provoca su separacin. Cuando el frente del disolvente se encuentra a 0.5 cm del borde superior, se saca la placa de la cubeta, se marca hasta donde ha llegado el eluyente y se deja secar para, a continuacin, proceder a la visualizacin de las manchas correspondientes a los productos cromatografiados. Para la seleccin del adsorbente o fase estacionaria debe considerar los siguientes aspectos: Polaridad, tamao de partcula (Dimetro y rea superficial), homogeneidad (solubilidad) y pureza. Factores que influyen en una separacin por cromatografa de capa fina. a. Temperatura: a menor temperatura las sustancias se adsorben ms en la fase estacionaria. b. La cromatografa debe llevarse a cabo en un rea sin corrientes de aire. c. Limpieza de las placas. Muchas placas estn contaminadas con grasa o agentes plastificantes o adhesivos.
IV. FASE EXPERIMENTAL. 1. Preparar los eluyentes segn las indicaciones descritas en la II parte. Nota: dependiendo de la disponibilidad de disolventes, es posible que el profesor le indique preparar otras mezclas o cambiar la relacin de los eluyentes antes mencionados. 2. Las muestras de frmacos deben disolverlas en acetona y los aminocidos (1%) en solucin al 10% de propanol; estas y las otras muestras se le colocar un nmero, el cual debe ser anotado a lpiz en la parte inferior de la lnea base del cromatograma y su referencia en la libreta. 3. Colocar en las cmaras cromatogrficas las mezclas de los eluyentes (debe ser ligeramente inferior a la altura de la lnea base del cromatograma). A cada cmara Manual de Laboratorio de Qumica Analtica II (QM 228) 2014 Preparado por: Omar Chacn P y Vctor Jimnez Pgina 5
se le colocar una tira delgada de papel filtro para saturarla de los vapores del eluyente. Por qu? 4. Anotar la relacin en la que estn preparados los eluyentes, para cada cmara y a lpiz en la parte superior del cromatograma con letra y abreviaturas pequeas o colocar un nmero a cada cromatograma cuya descripcin sobre los eluyentes y orden de muestra empleadas deber registrar en su libreta. 5. Aplicar con el capilar sobre la placa de capa fina 3 aplicaciones de la muestra. Cada aplicacin se pone siempre en el mismo punto (se puede marcar los puntos con un lpiz previamente). 6. Al terminar de preparar la placa, colocarla dentro de la cmara, cuidando que el borde inferior haga contacto con el eluyente, y observar que este se desplace en forma ascendente. 7. Esperar unos 10 a 30 minutos y observar el recorrido del eluyente hasta la lnea superior. 8. Sacar la placa cuando el eluyente este por llegar a la lnea cercana al borde superior. 9. Colocar la placa en el horno por 2 minutos (este deber estar previamente calentado a 80 C). 10. Sacar la placa y revelar con la lmpara UV y la que contiene los aminocidos con ninhidrina. 11. Marcar las manchas obtenida en el cromatograma con un lpiz, medir y calcular los Rf de cada mancha. 12. Interprete sus resultados. 13. En su discusin indique porqu el eluyente debe estar por debajo de la lnea base del cromatrograma?
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Figura 3. Cromatografa antes y despus del recorrido