1.- Mtodos de un solo paso sin factor de dilucin Para la realizacin del bosquejo de una curva de calibracin para mtodos de un solo paso sin factor de dilucin (La muestra se trabaja de la misma forma que el STD) se sigue el siguiente esquema general.
Consideraciones generales: Cada vez que nos pidan realizar el bosquejo de una curva de calibracin para un mtodo con Kit (no manual), el STD no sirve para la realizacin de la curva, ya que el STD est previsto para realizar una calibracin de un solo punto (una curva de calibracin es una calibracin multipunto Mltiples concentraciones). Como se ve en el inserto del KIT de Glucose liquicolor de Human para la determinacin de Glucosa, el STD es de 100 mg/dl, el cual no es utilizado para realizar la curva de calibracin (Hay que considerar igual que la curva de calibracin abarcar tanto valores bajos, normales, y altos del mensurando que se est determinando). Es por esto, que frecuentemente la curva de calibracin se realiza con un material de referencia concentrado el cul es diluido a una concentracin ms baja, lo que ser nuestro material de referencia diluido de trabajo (Idealmente).
Realizacin del Bosquejo de la curva 1.- Segn los valores de referencia del mtodo para el cual se quiere realizar la curva, se fijaran las concentraciones que abarcara mi curva de calibracin. Ejemplo: Concentraciones a realizar: 20 - 40 60 90 -110 200 400 600 mg/dl Como 600 mg/dl es mi concentracin ms alta que abarcar la curva, esta debe ser la concentracin del material de referencia de trabajo (Generalmente se prepara a partir de un material de referencia ms concentrado, pero tambin puede venir diluido para trabajarlo directamente). Ejemplo: Material de referencia Concentrado: 1000 mg/dl Material de referencia diluido: 600 mg/dl Material de trabajo que voy a diluir para realizar todas las diluciones (40 60 90- 110 -200 400 600) (Mas adelante se ve como se preapara) 2.- Para saber cunto volumen de cada dilucin debo preparar, se debe mirar el esquema de pipeteo y ver cunto volumen muestra se ocupa. Esto es vlido solo cuando el volumen de muestra es grande. Ejemplo Hipottico: Si en el esquema de pipeteo se utilizara 400 ul de muestra/STD + 1000 ul de reactivo, las diluciones se haran directamente: Concentracin mg/dl Material de trabajo ul Agua destilada ul Volumen Final ul 40 26.8 ul 373.2 ul 400 ul 60 40.2 ul 359.8 ul 400 ul 90 60.3 ul 339.7 ul 400 ul 110 73.7 ul 326.3 ul 400 ul 200 134 ul 266 ul 400 ul 400 268 ul 132 ul 400 ul 600 400ul 0 ul 400 ul *Y a estos 400 ul se le agregaran 1000 ul de reactivo. * Mas adelante se calcula el volumen de material de referencia ocupado para la realizacin de la curva, que para este caso hipottico cambiara. *Los volmenes de cada componente fueron calculados con C1 x V1 = C2 x V2 Ej: 600 mg/dl x V1 = 90 mg/dl x 400 = 60.3 ul
En nuestro caso, como es un volumen muy pequeo (10 ul de muestra/STD), se deben realizar volmenes ms grandes de cada dilucin (por ejemplo 1 ml o ms), y luego de este volumen sacar los 10 ul que yo necesito. Concentracin mg/dl Material de trabajo ul Agua destilada ul Volumen Final ul 40 66.7 933.3 1000 ul 60 100 .0 900.0 1000 ul 90 150.0 850.0 1000 ul 110 183.3 816.7 1000 ul 200 333.3 666.7 1000 ul 400 666.7 333.3 1000 ul 600 1000 ul 0 1000 ul *Los volmenes de cada componente fueron calculados con C1 x V1 = C2 x V2 Ej: 600 mg/dl x V1 = 90 mg/dl x 1000 ul = 150 ul * De cada dilucin (de los 1000 ml de cada dilucin), se toman 10 ul. * Para saber cunto volumen de material de referencia diluido de trabajo se prepara a partir del material de referencia concentrado, se suman los volmenes de material de referencia (66.7 + 100 + 150 + 183.3 + 333.3 + 666.7 + 1000 ul = 2317.6 ul = 2.32 ml = es decir se requieren 2.32 ml de MRD para un replicado de la curva de calibracin. Debido a un tema prctico, y para no preparar lo justo por si algo llegara a suceder con las diluciones, siempre se debe preparar mas, en nuestro caso sern 3 ml de MRD. Este volumen se multiplica por 3, ya que la curva se realiza en triplicado, es decir, necesitaremos 9 ml de MRD. Preparacin del MRD a partir del material de referencia concentrado de 1000 mg/dl C1 x V1 = C2 x V2 = 1000 mg/dl x V1 = 600 mg/dl x 9 ml = 5.4 ml Sacar 5.4 ml del MRC y llevarlo a 9 ml con agua destilada. 3.- Luego se aplica la metdica tal como indica el esquema de pipeteo, es decir, se le agrega a cada dilucin (10 ul), 1000 ul de reactivo (RGT), se incuba por 10 minutos a T ambiente, y luego se lee frente a un blanco de reactivo.
2.- Mtodos de 2 o ms pasos con factor de dilucin (La muestra no se trabaja igual que el STD)
1.- En estos casos, existe un factor de dilucin ya que a la muestra se le aplica un paso de precipitacin, y al STD no, esto quiere decir que la muestra fue diluida. Factor de dilucin: Volumen final/Volumen de muestra = 700/200 = 3.5 F.D Este factor de dilucin servir para la preparacin de nuestro material de referencia. 2.- Como existe dilucin, la concentracin del STD de colesterol de 50 mg/dl (concentracin verdadera), debe ser multiplicada por el factor de dilucin, obtenido en el tem anterior. 50 mg/dl x 3.5 = 175 mg/dl (Concentracin Terica de Trabajo). Como se puede apreciar, para este mtodo el STD si puede ser utilizado para la realizacin de la curva de calibracin, ya que aunque su valor es normal (50 mg/dl), multiplicado por el F.D se obtiene una concentracin alta, que nos sirve para abarcar tanto valores bajos, medios y altos. 175 mg/dl sera la concentracin ms alta que siga la curva. Observacin: Si se quiere trabajar con un material de referencia distinto, el factor de dilucin debe ser considerado. Por ejemplo si se tiene un material de referencia de colesterol de 200 mg/dl, y la concentracin ms alta que quiero que abarque mi curva es 120 mg/dl. El material de referencia debe ser diluido a una concentracin de 34.4 mg/dl aproximadamente, para que multiplicado por mi factor de dilucin me de 120 mg/dl 34.4 mg/dl x 3.5 = 120 mg/dl
Calculo para la preparacin del material de referencia = Concentracin ms alta / F.D 120 mg/dl / 3.5 = 34.4 mg/dl (concentracin real) 34.4 mg/dl x 3.5 = 120 mg/dl (concentracin terica de trabajo) 3.- Ahora, para saber cunto volumen hay que realizar de cada concentracin que abarque mi curva, se debe ver el volumen de sobrenadante/STD utilizado, que en este caso es 100 ul. Entonces, para la realizacin de la curva se utilizar en este caso el STD y como concentracin mxima 175 mg/dl, preparndose 100 ul (volumen de sobrenadante/STD) de diluciones de concentracin ms pequeas.
A cada dilucin (100 ul), se le agregan 1000 ul de reactivo CHOD PAP, se incuba y se lee frente a un blanco de reactivo.
Ejemplo Curva de Calibracin de 2 o ms pasos con F.D En este caso como el STD no se trabaja igual que el suero, existe un F.D 1.0 ml de suero + 3.5 ml de agua destilada + 0.5 ml de tungstato de sodio + 1.0 ml de acido sulfrico = 6 V.F / 1 VM = Factor de dilucin = 6 En la ltima parte dice que se prepara una solucin stock de trabajo que tiene una concentracin de 1.5 mg/dl y como hay un factor de dilucin (4) se multiplican = 1.5 mg/dl x 6 = 9 mg/dl esta ser nuestra concentracin ms alta que abarcar nuestra curva de calibracin. En el punto nmero 3 dice que se agregan 3 ml de SOBRENADANTE, as que este ser el volumen mximo a considerar para realiza nuestras diluciones. Concentraciones a utilizar: Material de referencia stock ml Agua destilada ml Concentracin mg/dl 0.25 2.50 0.75 1.00 2.00 3 1.50 1.50 4.5 3.00 0.00 9
A cada dilucin se le agregan 2 ml de reactivo de color.
METODO DE HENRY, SOBEL Y KIM A. FUNDAMENTO El cido rico es oxidado a alantona y dixido de carbono por el cido fosfotngstico en solucin alcalina. El cido fosfotngstico es reducido a azul de tungsteno, leyndose la reaccin a 660 nm. B. VALORES DE REFERENCIA Suero o Plasma: Hombres 2,5 - 7,0 mg / 100 ml. Mujeres 1,5 - 6,0 mg / 100 ml. Determinacin en Suero: 1) Preparar un filtrado en cido tngstico, excento de protenas, mezclando 1 ml de suero o plasma con 8 ml de agua destilada, 0,5 ml de cido sulfrico 0,66 N y 0,5 ml de tungstato de sodio 10%. Mezclar. Centrifugar a 3000 r.p.m. por 5 min. 2) Se obtiene as un desproteinizado diluido 1/10. 3) Rotular dos tubos X y B. 4) Agregar al tubo X, 3 ml de filtrado (1/10) y al tubo B 3 ml de agua destilada. 5) A ambos tubos agregar 1 ml de carbonato sdico y 1 ml de c. fosfotngstico. Mezclar bien y dejar en reposo por 15 min. 6) Leer a 660 nm calibrando a cero el instrumento con el tubo blanco. Solucin stock de cido rico. Disolver 100 mg de cido rico y 60 mg de carbonato de litio en 50 ml de agua destilada calentando a 60C para que se produzca la disolucin de los reactivos. Dejar enfriar a temperatura ambiente y completar con agua hasta los 100 ml. Guardar congelado. (100 mg/dl) Material de Referencia Diluido. Diluir 1 ml del material concentrado (solucin stock) a 100 ml con agua destilada.(1 mg/dl)
Tubo N Mat. de ref. ml Agua ml Carbonato de sodio ml Ac. fosfotngstico ml Concent. mg / 100 ml 1 ------ 3,00 1 1 blanco 2 0,25 2,75 1 1 0,83 3 0,50 2,50 1 1 1,66 4 1,00 2,00 1 1 3,33 5 1,50 1,50 1 1 5,00 6 2,50 0,50 1 1 8,30 7 3,00 ------ 1 1 10,00
Factor de dilucin 10 Material de referencia diluido = 1 mg/dl x f.d 10 = 10 mg/dl mxima concentracin de la curva. El volumen mximo es 3 ml por ser el volumen que se toma de sobrenadante.
3.- Mtodos de 2 o ms pasos sin factor de dilucin (La muestra se trabaja igual que el STD)
Como se ve arriba, tanto la muestra como el STD se precipitan y se centrifugan, por lo que no existe factor de dilucin.