CURSO: BIOQUMICA GRUPO - SUBGRUPO: B2 MESA: N5 FECHA DE EJECUCION DE LA PRCTICA: 21 de Marzo del 2014 FECHA DE ENTREGA DE INFORME DE PRCTICAS: 24 de Marzo del 2014
INFORME DE PRCTICA: PRCTICA N: 1 TTULO DE LA PRCTICA: Fotocolorimetra
Integrantes: Rivera Medina, Luis Miguel. Rocha Gomez, Joselyn Sandy. Rodriguez, Ravez Toralva, Anthony
CICLO 2014 I
Introduccin
El estudio de las molculas a un nivel bioqumico requiere de ciertas tcnicas analticas que permitan determinarlas cuantitativa y cualitativamente y as poder caracterizarlas fsico, qumico y biolgicamente. La fotocolorimetra se fundamenta en la medicin de la intensidad de la luz transmitida a travs de una solucin coloreada. Esto se debe a la capacidad de las molculas para absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones del espectro UV. La eficiencia con la que se pueden absorber depende de las condiciones del medio, como la temperatura y el pH, y de la estructura atmica y molecular. La longitud de onda en que las molculas de una sustancia absorben con mayor intensidad la luz, se denomina lambda mximo o longitud de mxima absorcin, concepto que se utiliza en el primer experimento. La ley de LAMBERT y BEER rige los principios de los principios de la colorimetra y tiene como factores la concentracin del soluto y al espesor del recipiente. En los siguientes experimentos se hace uso del mtodo de la curva de calibracin y el mtodo del factor de calibracin y se podr observar las variaciones que existen entre ambos mtodos gracias a diferentes factores.
Experimento 1 Identificacin de la longitud de onda de la mxima absorcin
Procedimiento y resultados A partir del reactivo solucin patrn de cromato de potasio 0,1g/dL medir 3mL a un tubo de ensayo y agregue 2mL de agua destilada, mezclar bien y leer en el espectrofmetro a 500, 480, 460 y 440 mn.
Las lecturas del espectrofmetro fueron las siguientes:
Discusin La absorbancia es un concepto que nos indica la cantidad de luz absorbida por una sustancia, la lectura en el espectrofotmetro se da a partir de una solucin diluida de un compuesto, cuya absorbancia mxima debe estar dentro del rango de medida del espectrofotmetro, se ver as la absorbancia a diferentes longitudes de onda frente a un blanco que contenga el disolvente de la solucin de la muestra a caracterizar. Dicho valor de absorbancia mxima se utilizara para hacer determinaciones cualitativas y cuantitativas del compuesto, este espectro de absorcin depende, principalmente, de la estructura qumica de la molcula, pero existen una gran cantidad de factores que originan la variaciones en los valores, como el pH, la polaridad del solvente o molculas vecinas.
Conclusiones Ya que la lectura fue mayor en la ltima lectura la longitud de onda de mayor absorbancia es la de 440nm, es decir su optimo = 440nm. Probablemente todos los valores de absorbancia mxima variaron por la posibilidad de haber causado cambios en el medio al manipular la solucin.
Experimento 2 - 3 Preparacin de la curva de calibracin - Anlisis de resultados.
Procedimiento y resultados
Disponer de una batera de tubos y proceder a preparar los estndares segn el esquema. TUBO 1 2 3 4 5 6 Solucin patrn (mL)
Agua destilada (mL) 0.3
5.7 0.6
5.4 0.9
5.1 1.5
4.5 2.4
3.6 3.0
3.0
Mezclar y llevar a leer los tubos en la longitud de onda de mayor absorbancia obtenido en el paso 1. TUBO 1 2 3 4 5 6 Solucin patrn (mL)
Agua destilada (mL) 0.3
5.7 0.6
5.4 0.9
5.1 1.5
4.5 2.4
3.6 3.0
3.0 Absorbancia 0.058 0.118 0.221 0.373 0.506
Encuentre la concentracin de cada uno de los tubos estndares en g/dL y en mol/L. a) Concentracin del cromato de potasio: 0.1 g/dl b) Formula a emplear: C 1 x V 1 = C 2 x V 2
TUBO1: 0.1 x 0.3 = C 1 x 6 C 1 = 0.005 TUBO2: 0.1 x 0.6 = C 2 x 6 C 2 = 0.01 TUBO3: 0.1 x 0.9 = C 3 x 6 C 3 = 0.015 TUBO4: 0.1 x 1.5 = C 4 x 6 C 4 = 0.025 TUBO5: 0.1 x 2.4 = C 5 x 6 C 5 = 0.04 TUBO6: 0.1 x 3.0 = C 6 x 6 C 6 = 0.05
Obtenga el factor de calibracin de cada tubo y el factor de calibracin promedio en cada sistema de unidades de concentracin a) El factor de calibracin es un trmino que relaciona la concentracin de una sustancia con su absorbancia. b) La frmula a emplear es la siguiente: [ St ] / DO St ; donde [St] es la concentracin del estndar y DO St la absorbancia del mismo TUBO1: C 1 = 0.005 factor de calibracin: ---------- TUBO2: C 2 = 0.01 0.01/0.058 = 0.172 (eliminado por alejarse demasiado del resto de valores) TUBO3: C 3 = 0.015 0.015/0.118 = 0.127 TUBO4: C 4 = 0.025 0.025/0.221 = 0.113 TUBO5: C 5 = 0.04 0.04/0.373 = 0.107 TUBO6: C 6 = 0.05 0.05/0.506 = 0.09881 FACTOR DE CALIBRACION PROMEDIO: 0.127 + 0.113 + 0.107 + 0.099 = 0.0446 0.0446/4 = 0.1115 Discusin de resultados Si bien es cierto, tericamente en los resultados de la lectura de la batera de tubos ninguna de ellas tendra que haber salido negativa, pero obtuvimos un valor negativo que tuvimos que eliminar junto con el valor de lectura que se alejaba demasiado de los otras lecturas. Esto pudo haber sido por alguna falla al momento de pipetear la solucin patrn o el volumen de agua
Conclusiones Se demuestra la ley de Beer: existe una proporcionalidad entre la absorbancia de una solucin coloreada y la concentracin de sta en un haz de luz monocromtica. Se corrobora la ley de Lambert: existe una proporcionalidad entre el valor de las absorbancias de las soluciones coloreadas y la distancia que recorre el haz de luz monocromtica en ella. Se puede determinar la concentracin de una solucin coloreada por 2 maneras: mtodo de la curva de calibracin (mtodo grfico) y el mtodo del factor de calibracin (mtodo analtico).
Experimento 4 Clculo de la concentracin de una muestra problema
Procedimiento y resultados En la mesa de trabajo encontrar dos muestras de concentracin desconocida A y B, una se puede leer directamente, pero la otra debe ser previamente diluida. Realice la dilucin que estime conveniente (anote los volmenes), lleve a leer al espectrofotmetro y encuentra la concentracin por el mtodo grfico y usando el factor de calibracin y el factor de dilucin. Coloque los resultados en la pizarra, compare y comente respecto a los resultados de otras mesas.
Muestra A: 0.200 (obtenido directamente de la lectura al espectrofotmetro).
Muestra B: Se efectu una dilucin de 1/20 de la siguiente manera:
- 0.5mL de muestra B - Agua c.s.p. 10mL Se procedi a la lectura al espectrofotmetro obtenindose una absorbancia de 0.243. Se presentan nuevamente los datos para hallar la concentracin segn el mtodo grfico y segn el factor de calibracin. TUBO 1 2 3 4 5 6 Concentracin(mg/dL) 0.005 0.010 0.015 0.025 0.040 0.050 absorbancia 0.000 0.058 0.118 0.221 0.373 0.506 Fc 0 0.172 0.127 0.113 0.107 0.099
Se hall el factor de calibracin promedio, considerando los valores resaltados: Fc = 0.111 g/dL Se hall la concentracin por el mtodo de factor de calibracin y factor de dilucin: Abs x Fc x Fd = Concentracin MP 0.243 x 0.111 x 20 = 0.53946 g/dL = 539.46mg/dL En la tabla se resaltan los valores tomados en cuenta para la realizacin de los clculos. Se presentan los grficos (considerando todos los datos y el segundo, considerando desde el tubo n3).
Se procedi a calcular la concentracin segn mtodo grafico intersectando el valor obtenido de absorbancia en el grfico corregido.
La concentracin hallada se multiplica por el factor de dilucin. 0.024 x 20 = 0.480g/dL = 480mg/dL
Se presenta una tabla de resumen de los valores obtenidos por todas las mesas del grupo de prctica: g/dL Absorbancia mg/dL MESA Fc Ampa Ampb db Mpa Mpb 1 0.110 0.191 0.287 1/11 21.00 347.20 2 0.115 0.202 0.345 1/14 23.20 555.00 3 0.107 0.190 0.133 1/20 20.33 284.60 4 0.113 0.200 0.431 1/14 22.60 681.80 5 0.111 0.200 0.243 1/20 22.20 539.40 6 0.090 0.200 0.389 1/14 18.00 490.00 7 0.128 0.195 0.278 1/18 24.00 640.00
Discusin Los resultados obtenidos por el mtodo grfico y del factor de calibracin no fueron los mismos, como se esperan de ser tericamente, pero si fueron similares. Los valores fueron de 480mg/dL Y 539.4mg/dL respectivamente. La seleccin de los valores a usar para el calcula de las dos modalidades se evalu segn la diferencia en el valor del Fc, que indica la pendiente. De no ser por el requisito de que la lnea de regresin inicie en el origen de coordenadas en lnea recta solo podramos haber eliminado el valor del tubo n 6, asumiendo que el grfico en valores bajos no es una recta. Los valores de absorbancia para la muestra A fueron uniformes entre todas las mesas dado que su proceso era mnimo. Las variaciones podran ser atribuidas a que la cubeta de lectura no se enjuago o limpi externamente de modo adecuado entre lecturas. Las concentraciones de esta muestra dependieron de los factores de calibracin que mostraron ligeras variaciones. Las diluciones usadas variaron un poco pero la mayora uso un factor entre 10 y 20. Las absorbancia y concentraciones variaron considerablemente y no se encontr un valor representativo entre las 7 mesas del grupo de prctica. La causa ms probable sera la falta de experiencia de los usuarios en el trabajo homogneo de las mediciones.
Conclusiones Esta primera experiencia evidencia las limitaciones de trabajar con el mtodo grfico, que brinda tan solo una aproximacin y del trabajo con material de laboratorio por usuarios con escaso entrenamiento. Al tratarse de la primera vez que el grupo trabaja con este tipo de material para hacer mediciones precisas de volmenes es comprensible la falta de coherencia. Conforme avancen las prcticas, las experiencias previas ayudaran al establecimiento de un modo de trabajo ms ordenado y sistemtico, que minimice los errores y nos lleve a un resultado ms preciso.
CUESTIONARIO
1. Una sustancia absorbe 530nm el 30% de la luz incidente, cual es su absorbancia.
Solucin:
Si absorbe el 30% Transmite el 70% De la relacin entre absorbancia y transmitancia:
Despejamos: Y adems
Empleando los datos:
5
2. Transforme las absorbancias de la prctica a porcentaje de transmitacia y realice la grfica de la curva de calibracin
3. Si una sustancia tiene una DO de 0.325 en una cubeta de 1 cm. Cul ser su absorbancia cuando la cubeta sea de 0.4 cm. de paso de la luz? Solucin: Como la concentracin de la sustancia no vara emplearemos la ley de Lambert: A 1 / l 1 = A 2 / l 2 , reemplazando tenemos 0.325 / 1 = A 2 / 0.4 A 2 = 1.3
CONCENTRACION [ ] g/dL TRASMITANCIA (%) 0.01 26.3% 0.015 76.2% 0.025 60.11% 0.04 42.36% 0.05 31.18% 4. Una sustancia tiene un coeficiente de extincin molar de 780 cm -1 . mol -1 . L, Cul ser su concentracin sabiendo que una muestra de la misma sustancia tuvo una DO de 0.720 en una cubeta de 2 cm. de paso de luz? Solucin: Como nos dan de dato el coeficiente de extincin molar y nos piden la concentracin, entonces emplearemos laley de Lambert y Beer DO = l. C. e Reemplazando tenemos 0.720 = 2. C. 780 C = 0.0004615
5. Una muestra fue diluida colocando 0.5mL de ella en un tubo y se aadi 7.5mL de agua destilada, la DO obtenida fue 0.572 y el estndar de 25mg/L tubo una DO de 0.386, calcular la concentracin de la MP. Solucin: 0.5ml muestra + 7.5mL agua destilada Dilucin = 0.5mL/0.5mL +7.5m = 1/16 Fd = 16
Estandar: 25mg/L ; DO= 0.386 Fc = 25mg/L/0.386 Fc = 64.767mg/L Concentracin MP = AbsMP x Fd x Fc Concentracin MP = 0.572 x 16 x 64.767mg/L Concentracin MP = 592,7mg/L
6. Una sustancia tiene 180mol/g, una solucin de dicha sustancia a concentracin de 50ug/ml en una cubeta de 0.5cm tiene una transmitancia del 65%, calcular el coeficiente de extincin molar de dicha sustancia. Solucin:
MP = 180mol/g ; Concentracin MP = 50ug/ml Longitud = 0.5cm ; %T = 65 Concentracin en moles = 50mg/L x 180mol/g = 9mol/L A = l.c.e 2 log%T = l.c.e 2 log65 = 0.5cm x 9mol/L x e e = 0.04156 L/mol.cm
7. A 3ml de una muestra de cromato de potasio, se le aande 5ml de agua; de la mezcla se toman 0,5mL y se agrega agua hasta 3mL, se lee al espectrofmetro y se obtiene una lectura de 0,285 DO, usando los resultados de su prctica, calcula la concentracin por mtodo grfico y por clculo. Solucin:
8mL de mezcla 0.5mL de mezcla extrada 3mL de mezcla
Mtodo por clculo:
[MP] = 0.285 x 0.115 x [MP] = 0.524 Mtodo por grfico 3mL de K 2 CrO 4