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Laboratorio 2: Inhibicin de la actividad enzimtica en procesos de

transformacin



OBJETIVOS
Medir la velocidad de reaccin del germen de trigo con distintas concentraciones.
Estimar los parmetros cinticos Km y kcat a partir de los datos experimentales.
Identificar factores experimentales que resultan crticos para la estimacin de los parmetros cinticos de la enzima.


INTRODUCCIN
Cintica enzimtica
Las reacciones metablicas conforman un cuerpo de
reacciones qumicas que ocurren en condiciones muy
particulares y que son necesarias para que los seres
vivos cumplan con sus funciones biolgicas. Estas
condiciones particulares en las que las reacciones
metablicas deben darse son caractersticas de los
organismos, rganos, tejidos o clulas, y en ausencia de
un catalizador, no suelen permitir que se generen los
productos a la velocidad requerida. Ciertas protenas han
evolucionado entonces como catalizadores biolgicos
(enzimas) cuya funcin es aumentar la velocidad de las
reacciones qumicas en los seres vivos. Es importante
recordar que este aumento en la velocidad de reaccin
se logra mediante la disminucin de la energa de
activacin de los reactantes y que nada tiene que ver con
el cambio de energa libre que ocurre al convertirse los
reactantes en productos.

Las enzimas son generalmente, molculas proteicas que
tienen la capacidad de catalizar reacciones qumicas.
Debido a la naturaleza proteica, son inestables y pueden
ser desnaturalizadas por cambios en el medio. Como la
desnaturalizacin afecta las propiedades biolgicas de
las protenas, la actividad de las enzimas se afecta por
muchas variables como temperatura, pH, concentracin
de sustrato y de enzima y la presencia de inhibidores.
Las condiciones ptimas varan de una enzima a otra.

En trminos simples, la relacin entre la velocidad de la
reaccin y la concentracin de sustrato (S, reactante) en
una reaccin catalizada por una enzima (E) est dada
por la ecuacin de Michaelis y Menten de acuerdo al
esquema siguiente:

[]

[]


Donde, en condiciones de estado estable




= velocidad de reaccin a una determinada
concentracin de sustrato
[] = concentracin de sustrato

= velocidad mxima alcanzable a la concentracin

de enzima dada

= constante de disociacin aparente de E S = (k 1 +

k2) / k+1

Los valores de Km y Vmx son tiles para caracterizar el
funcionamiento de una enzima con un sustrato
especfico. El Km mantiene un relacin inversa con la
afinidad de la enzima por el sustrato, y si se conoce la
concentracin de la enzima, [E], la Vmax permite el clculo
de la constante de catlisis de sta (kcat = k2 = Vmax/ [E]).
La kcat es equivalente al nmero de reacciones que un
sitio activo de la enzima cataliza por unidad de tiempo. El
cociente kcat/Km toma en cuenta ambos parmetros para
estimar la eficiencia cataltica de la enzima, entendida
sta como la frecuencia en que la enzima transformar el
sustrato en producto cada vez que se encuentre con l (a
mayor kcat [mayor velocidad] y menor Km [mayor afinidad],
mayor eficiencia).

En la prctica, los valores de Km y Vmax pueden estimarse
a partir de grficas de funciones derivadas de la ecuacin
de Michaelis y Menten. Una primera ecuacin derivada
es la de Lineweaver y Burk:

2

[]

Graficando la inversa de las velocidades de reaccin que
se obtienen experimentalmente (eje y) versus la inversa
de las concentraciones de sustrato respectivas (eje x),
se obtiene una recta cuya interseccin con el eje y da la
inversa de Vmax y cuya pendiente es equivalente a
Km/Vmax.

Una ecuacin derivada alternativa es la de Eadie y
Hofstee:

[]

En este caso, graficando las velocidades de reaccin que
se obtienen experimentalmente (eje y) versus el
cociente entre dicha velocidad y la concentracin de
sustrato correspondiente (eje x), se obtiene una recta
cuya interseccin con el eje y es directamente el valor
de Vmax y cuya pendiente es Km.

Hay dos formas generales de seguir el curso de una
reaccin enzimtica: Medir la cantidad de sustrato que
desaparece o determinar la cantidad de producto
formado.

Las fosfatasas cidas y alcalinas son un grupo de
enzimas de amplia distribucin en la naturaleza. Su
especificidad tambin es amplia, aunque se presentan
algunas diferencias de acuerdo con el origen de las
enzimas. Todas actan sobre monosteres de cido
ortofosfrico, tanto alifticos (glicerol1fosfato y
glicerol2fosfato) como aromticos (4fenilofosfato). No
actan sobre disteres o tristeres de fosfato. La
fosfatasa alcalina purificada de diversas fuentes tambin
puede hidrolizar fosfocreatina, fosfato inorgnico y
polifosfatos como el ATP.

Recibe el nombre sistemtico de monoster ortofosfrico
fosfohidrolasa y la reaccin general que cataliza se
presenta as:

Las fosfatasas son especficas para el fosfato de la
molcula, de manera que la ruptura ocurre cerca del
tomo de fsforo.


Entonces el primer requerimiento para estudiar una
enzima es disponer de un mtodo cuantitativo
conveniente para medir su actividad. Para la fosfatasa
cida, objeto de esta prctica, la determinacin de la
actividad se fundamenta en la cuantificacin del fosfato
liberado, lo cual se hace por el mtodo de Fiske-
Subbarow:

BUSCAR REACCION

Este es un mtodo colorimtrico, basado en la reaccin
del fsforo con cido molbdico para obtener cido
fosfomolbdico. Posteriormente, ste reacciona como un
reductor en medio alcalino (cido ascrbico), formando
una mezcla de xidos de molibdeno, de color azul.

La velocidad inicial de una reaccin enzimtica depende
de los siguientes factores:
Concentracin de sustrato
Para una cantidad fija de enzima, la velocidad de
reaccin aumenta cuando se incrementa la
concentracin de sustrato. Hasta alcanzar un valor lmite
cuando la velocidad ya no aumenta ms. En esta
condicin, la enzima se encuentra saturada con el
sustrato y se ha llegado a la velocidad mxima.
Concentracin de enzima
En presencia de un exceso de sustrato, la velocidad de
reaccin es proporcional a la concentracin de enzima.
Algunas enzimas son inhibidas por los productos de la
reaccin.
pH
La concentracin de protones en el medio influye en la
actividad de las enzimas, ya que se afectan los grupos
ionizables en la enzima y en el sustrato (si los hay).
Generalmente las enzimas son activas en un rango
limitado de pH. El valor que permite lograr la mayor
velocidad, se conoce como pH ptimo. Se debe tener en
cuenta que este valor puede variar con la temperatura, el
buffer usado y la presencia de activadores o inhibidores.
Temperatura
Las reacciones enzimticas se afectan por el calor como
se afecta en general cualquier reaccin qumica. Es
decir, un aumento en la temperatura se refleja en
3
aumento en la velocidad de reaccin. No obstante, la
naturaleza proteica de las enzimas hace que stas sufran
desnaturalizacin a altas temperaturas, lo que conlleva
prdida de la actividad y por lo tanto disminucin en la
velocidad de reaccin.
La temperatura ptima es la resultante de estos dos
efectos, y es la temperatura que permite lograr la mxima
velocidad. La temperatura ptima puede variar con el
tiempo de reaccin. Si la incubacin es de unos pocos
segundos, la temperatura ptima puede ser tan alta como
60 o 70C.
Productos de la reaccin
La acumulacin de productos puede retardar la actividad
de algunas enzimas. Esto puede deberse a combinacin
del producto con el sitio activo se la enzima, impidindole
combinarse con el sustrato, o puede deberse a que se
promueve la reaccin inversa, con disminucin en la
velocidad global de reaccin.

Medida de la velocidad de reaccin
Las curvas de progreso de la mayora de las reacciones
enzimticas muestran una cada de velocidad con el
tiempo. Esto puede obedecer a varias causas, por
ejemplo los productos de la reaccin pueden inhibir la
enzima, el grado de saturacin de la enzima con el
sustrato puede disminuir a medida que la reaccin
trascurre, porque disminuye la concentracin de sustrato,
la reaccin inversa puede volverse ms importante a
medida que la concentracin de productos aumenta, la
enzima (o la coenzima) puede sufrir alguna inactivacin
a la temperatura o un pH de reaccin debido a
inestabilidad. Varias de estas causas pueden operar al
mismo tiempo.

Por estas razones, en el estudio de la actividad
enzimtica se emplean medidas de velocidad inicial, ya
que solamente al inicio de la reaccin, cuando las causas
mencionadas anteriormente no han tenido tiempo de
operar, se conocen con exactitud las condiciones. Para
obtener la velocidad de la reaccin y dibujar la tangente
en el origen. Usualmente las curvas son prcticamente
lneas rectas siempre que la cantidad de cambio no
exceda el 20% de total. La cantidad de sustrato
transformado en un perodo de tiempo desde el
comienzo de la reaccin, es una medida de la velocidad
solo si este lmite no se sobrepasa.

Aislamiento de las enzimas
Las enzimas se encuentran en la naturaleza en mezclas
complejas, usualmente en las clulas, que contienen
cientos de enzimas diferentes. Para estudiar
adecuadamente las propiedades y el comportamiento de
una enzima, debe estar pura. Sin embargo, en algunos
casos es posible, mediante el uso de tcnicas muy
especficas, estudiar una enzima aunque est impura.
Elegido el mtodo para medir la actividad, es importante
investigar cules son las fuentes ms abundantes de la
enzima, a menos que haya razones para utilizar una
fuente especfica.

Seleccionado el material de partida, es necesario obtener
la enzima en solucin. Para este propsito usualmente
se debe romper la membrana celular, lo cual se puede
lograr por mtodos qumicos (detergentes, solventes),
enzimticos (lisozima), fsicos (ultrasonido) o mecnicos
(homogenizador o moler con arena). El extracto se puede
preparar con agua, solucin salina o con un buffer. El
extracto crudo contiene la enzima y numerosas otras
sustancias de alto y bajo peso molecular. Las molculas
pequeas se pueden remover por dilisis o por filtracin
por gel, dejando en solucin las molculas grandes que
son predominantemente protenas, aunque tambin
pueden estar presentes en algunos polisacridos.

Los procesos de purificacin consisten en una serie de
fraccionamientos por medio de los cuales la enzima se
separa de las otras protenas presentes. La purificacin
se fundamenta en las diferencias en solubilidad, tamao,
carga y actividad biolgica de las protenas. En esta
prctica se trabajar con un extracto crudo de fosfatasa
alcalina. (El tema de la purificacin de protenas es objeto
de otra prctica de laboratorio).

La actividad de las enzimas se expresa en unidades de
actividad, que se definen como micromoles de sustrato
transformados por minuto (a las condiciones del ensayo).
En los procesos de purificacin es usual emplear como
referencia la actividad especfica, que se define como
unidades de actividad por miligramo de protena. A
medida que aumenta la pureza de la enzima, debe
aumentar la actividad especfica.

MATERIALES Y REACTIVOS
10g Germen de trigo
5 Vasos de precipitados
Pipetas
Centrfuga
11 Tubos de ensayo
Vortex
Colormetro
pH-metro
Gradillas
4

PROCEDIMIENTO
Extraccin de la fosfatasa cida
Pesar 10 gramos de germen de trigo y agregar 50 ml de
agua fra. Luego agitar la mezcla hasta que obtener una
suspensin uniforme. Dejar en reposo por 30 min,
decantar por 15 min y filtrar el sobrenadante a travs de
algodn, los residuos se descartan. Esta solucin
constituye el extracto crudo de fosfatasa cida.
(Mantener en hielo).

Preparacin de curva de calibracin de fosforo
inorgnico
Realizar las siguientes soluciones, de acuerdo a como se
muestra en la tabla 1.

Tabla 1: Volmenes de reactivos utilizados en la preparacin de la
curva de calibracin
Tubo
Patrn de
fsforo 0.04
mg/ml (ml)
Agua
(ml)
cido molbdico
(ml)
B 4.0 0.5
1 0.1 3.9 0.5
2 0.2 3.8 0.5
3 0.3 3.7 0.5
4 0.4 3.6 0.5
5 0.5 3.5 0.5

Agitar bien los tubos y dejar en reposo durante 3 minutos.
Posteriormente adicionar 0.5 ml de la solucin de cido
ascrbico a cada tubo.

Agitar las soluciones de los tubos y dejar en reposo
durante 10 minutos para que se desarrollara el color.
Determinar absorbancia a 660 nm.

A.1 Procedimiento para determinacin de cantidad de
fsforo producido por accin de fosfatasa acida
Nota: En todos los casos la mezcla de reaccin se
prepara como se indica a continuacin, agregando los
reactivos en el orden mostrado:

Tabla 2: Volmenes de sustancias utilizadas en mezcla de reaccin
para determinacin de fsforo
Sobrenadante de la reaccin
enzimtica
0.5 ml
Agua destilada 3.5 ml
cido molbdico 0.5 ml

Agitar bien y dejar en reposo por 3 minutos; despus se
adicionaron 0.5 ml de cido ascrbico. Agitar bien, dejar
en reposo por 10 minutos y leer absorbancia a 660nm.
Dichos valores de absorbancia, se interpolan en la curva
de calibracin preparada con el fin de determinar la
cantidad de fsforo.

A. Determinacin del tiempo ptimo de incubacin
Los extractos enzimticos tienen actividades variables,
algunos pueden resultar muy activos mientras que otros
pueden tener baja actividad. Adicionalmente, las enzimas
en extractos crudos o purificados, pueden perder
actividad durante el almacenamiento. Por tanto es
necesario determinar el tiempo de reaccin conveniente
para obtener una cantidad de fosforo tal que, por
colorimetra, se obtengan valores de %T entre 20 y 80 y
adicionalmente correspondan a la parte recta de la curva
de progreso de la reaccin.

Prepare la siguiente mezcla de reaccin:

Tabla 3: Volmenes de reactivos para prueba de tiempo ptimo
Tubo
Buffer
citrto 0.1
M de pH 5.3
(ml)
-glicero
fosfato de
sodio (ml)
Agua
(ml)
M
e
z
c
l
e

b
i
e
n

l
o
s

t
u
b
o
s

y

a
g
r
e
g
u
e

a

c
o
n
t
i
n
u
a
c
i

n

Extracto
enzimtico
(ml)
Blanco buffer
(BB)

5.6 2.4
Blanco sustrato
(BS)

5.6 1.6 0.8
Blanco enzima
(BE)

5.6 1.6 0.8
Tiempo
reaccin (TR)

5.6 1.6 0.8

Agitar bien e incubar a temperatura ambiente; el blanco
de buffer (BB) y el blanco de sustrato (BS) se dejan
reaccionar 30 minutos. Pasado este tiempo se toman
alcuotas de 1 ml y se reciben sobre cido tricloroactico
al 10%.

Tomar muestras de 1 ml de BE y TR a los 2, 5, 10, 15, 20
y 30 minutos. Dichas alcuotas se reciben en tubos que
contenan 1 ml de cido tricloroactico al 10%. Agitar y
centrifugar a 2500rpm durante 5 minutos.

Determine en el sobrenadante la cantidad de fsforo
producido, ajustando el 100% de T con el tubo BB y
siguiendo el procedimiento A1.

B. Efecto del pH, Determinacin del pH ptimo
Sustrato: Solucin de -glicerofosfato de sodio 0.1 M
Buffer: Soluciones de buffer de citrato 0.1 M, diferentes
pHs
5
Enzima: Extracto enzimtico crudo
Tiempo de reaccin: 10 minutos

Tabla 4: Volmenes de reactivos utilizados en prueba de pH ptimo
Tubo BB BS BE 1 2 3 4 5 6
Sustrato
(ml)
0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
Buffer
(ml)
2.0 1.6 1.8 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4
pH del
buffer
5.3 5.3 5.3 3.0 4.0 5.0 5.3 5.6 6.2

Mezclar bien y enseguida agregar la enzima, a intervalos
de 30 segundos, es decir, pasados 30 segundos de
agregar la enzima al primer tubo, se le agregan al
segundo y as hasta completar los tubos, de la siguiente
forma:

Enzima
(ml)
0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

Mezclar el contenido de cada tubo y dejar incubando a
temperatura ambiente durante 10 minutos. Es importante
que los 10 minutos se le cuenten a cada tubo, es decir,
despus de agregada la enzima al tubo, se empiezan a
contar los 10 minutos y pasado este tiempo, se le
agregan 2 ml de ATA10% a cada tubo. Mezclar y
centrifugar a 2500rpm durante 5 minutos.

El precipitado se descarta y en el sobrenadante de todos
los tubos se determina la concentracin de fsforo
inorgnico, por medio del procedimiento A1.

C. Efecto de la temperatura, Determinacin de la
temperatura ptima

Buffer: Solucin de buffer de citrato, 0.1 M, pH 5.3
Sustrato: Solucin de -glicerofosfato de sodio 0.1 M
Enzima: Extracto enzimtico crudo
Tiempo de reaccin: 10 minutos
Temperatura: Se har la incubacin a diferentes
temperaturas como se muestra a continuacin:

Tabla 5: Temperaturas utilizadas en determinacin de temperatura
ptima
Temperatura, C Medio
0 Agua Hielo
18 Temperatura ambiente
37 Termostato
60 Termostato
98 Agua en ebullicin

Tabla 6: Volmenes de reactivos utilizados en prueba de temperatura
ptima
Tubo BB BS BE 1 2 3 4 5
Buffer (ml) 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4
Sustrato (ml) 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
Agua (ml) 0.6 0.2 0.4
Temperatura
C
18 18 18 0 18 37 60 92

Mezclar bien y enseguida agregar la enzima, a intervalos
de 30 segundos, es decir, pasados 30 segundos de
agregar la enzima al primer tubo, se le agregan al
segundo y as hasta completar los tubos, de la siguiente
forma:

Enzima
(ml)
0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

Agitar y dejar en incubacin durante 10 minutos
exactamente. Al final adicionar a todos los tubos 2 ml de
ATA al 10% y se centrifugar a 2500rpm durante 5
minutos. (Tener en cuenta la misma recomendacin
hecha en el procedimiento de pH para los 10 minutos)

El precipitado se descarta y en el sobrenadante de todos
los tubos se determina la concentracin de fsforo
inorgnico, por medio del procedimiento A1.

D. Efecto de la concentracin de la enzima en la
velocidad de reaccin

Buffer: Solucin de buffer de citrato, 0.1 M, pH 5.3
Sustrato: Solucin de -glicerofosfato de sodio 0.1 M
Enzima: Extracto enzimtico crudo
Tiempo de reaccin: 10 minutos
Temperatura: temperatura ambiente

Tabla 7: Volmenes de reactivos utilizados en la determinacin del
efecto de la concentracin de la enzima
Tubo BB BS BE 1 2 3 4 5
Buffer (ml) 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2
Sustrato
(ml)
0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
Agua (ml) 0.8 0.4 0.4 0.35 0.30 0.25 0.10

Mezclar bien y enseguida agregar la enzima, a intervalos
de 30 segundos, es decir, pasados 30 segundos de
agregar la enzima al primer tubo, se le agregan al
segundo y as hasta completar los tubos, de la siguiente
forma:

Enzima (l) 400 50 100 150 300 400
6

Agitar y dejar en incubacin durante 10 minutos
exactamente. Al final adicionar a todos los tubos 2 ml de
ATA al 10% y se centrifugar a 2500rpm durante 5
minutos. (Tener en cuenta la misma recomendacin
hecha en el procedimiento de pH para los 10 minutos)

El precipitado se descarta y en el sobrenadante de todos
los tubos se determina la concentracin de fsforo
inorgnico, por medio del procedimiento A1.

E. Efecto de la concentracin de sustrato,
determinacin de la constante de Michaelis (Km)

Buffer: Solucin de buffer de citrato, 0.1 M, pH 5.3
Sustrato: Solucin de -glicerofosfato de sodio de
diversas concentraciones en el rango 5 100 mM.
Enzima: Extracto enzimtico crudo
Tiempo de reaccin: 10 minutos
Temperatura: temperatura ambiente

Tabla 8: Volmenes de reactivos para la determinacin del efecto de la
concentracin del sustrato en la velocidad de reaccin
T
u
b
o

BB BS BE 1 2 3 4 5 6 7 8
B
u
f
f
e
r

(
m
l
)

1.4 1.2 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.0
S
u
s
t
r
a
t
o

(
m
l
)

0.8 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.8
{
S
}

m
M

100 5 10 20 40 60 80 100 100
A
g
u
a

(
m
l
)

0.6 0.4

Mezclar bien y enseguida agregar la enzima, a intervalos
de 30 segundos, es decir, pasados 30 segundos de
agregar la enzima al primer tubo, se le agregan al
segundo y as hasta completar los tubos, de la siguiente
forma:

Enzima
(ml)
0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

Agitar y dejar en incubacin durante 10 minutos
exactamente. Al final adicionar a todos los tubos 2 ml de
ATA al 10% y se centrifugar a 2500rpm durante 5
minutos. (Tener en cuenta la misma recomendacin
hecha en el procedimiento de pH para los 10 minutos)
El precipitado se descarta y en el sobrenadante de todos
los tubos se determina la concentracin de fsforo
inorgnico, por medio del procedimiento A1.

F. Efecto de la presencia de un inhibidor en la
velocidad de reaccin

Buffer: Solucin de buffer de citrato, 0.1 M, pH 5.3
Sustrato: Solucin de glicerofosfato de sodio de
diversas concentraciones en el rango 5100 mM.
Enzima: Extracto enzimtico crudo
Tiempo de reaccin: 10 minutos
Temperatura: temperatura ambiente
Inhibidor: HgCl2 5 mg/ml

Tabla 9: Volmenes de reactivos para la determinacin del efecto de la
concentracin del sustrato con inhibidor en la velocidad de reaccin
T
u
b
o

BB BS BE 1 2 3 4 5 6 7 8
B
u
f
f
e
r

(
m
l
)

1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 0.8
S
u
s
t
r
a
t
o

(
m
l
)

0.8 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.8
[

S

]

m
M

100 5 10 20 40 60 80 100 100
A
g
u
a

(
m
l
)

1.0 0.4
I
n
h
i
b
i
d
o
r

(
m
l
)

0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

Mezclar bien y enseguida agregar la enzima, a intervalos
de 30 segundos, es decir, pasados 30 segundos de
agregar la enzima al primer tubo, se le agregan al
segundo y as hasta completar los tubos, de la siguiente
forma:

Enzima
(ml)
0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

Agitar y dejar en incubacin durante 10 minutos
exactamente. Al final adicionar a todos los tubos 2 ml de
ATA al 10% y se centrifugar a 2500rpm durante 5
minutos. (Tener en cuenta la misma recomendacin
hecha en el procedimiento de pH para los 10 minutos)

El precipitado se descarta y en el sobrenadante de todos
los tubos se determina la concentracin de fsforo
inorgnico, por medio del procedimiento A1.
7

CUESTIONARIO
1. Mediante qu cdigo se identifica la fosfatasa cida
y qu indica cada nmero?
2. Cmo podra purificar la fosfatasa cida del germen
de trigo?
3. Cmo se define la unidad de actividad?
4. En qu condiciones se logra la mejor extraccin de
la fosfatasa cida de levadura?
5. Para la fosfatasa cida de levadura en qu
condiciones se logra la mxima estabilidad en
soluciones de etanol?
6. Cul es la constante de sedimentacin de la
enzima de levadura purificada?
7. Cules son las caractersticas de estabilidad
trmica de la fosfatasa cida de levadura y las
caractersticas de inactivacin por agitacin?


BIBLIOGRAFIA

Barman, Thomas E. Springer Verlag. Enzyme
handbook, segunda impresin. 1985

Coodley Eugene L. (editor). Lea & Febiger. Diagnostic
enzymology. 1970

Dixn, Malcom and Edwin C.- Enzymes, Webb.
Academic Press, tercera Edicin, 1979

Joyce B.K Grisolia S: Purification and properties of a
nonspecific acid phosphatise from wheat germ. The
journal of Biological Chemistry 235 : 2278-2281, 1960.

Lehninger, Nelson and cox . principles of biochemistry.
Worth publishers, cuarta edicin, 2005.
Roberts W.A.: The wheat leaf phosphatises III. A survey
on the heat stability of the enzymes active al pH 5.7.
The journal of biological Chemistry 226: 751, 1957

Tsuboi K.K,. Wierner G. and Hudson P.B. acid
phosphatise. VII: Yeast phosphomonoesterase: isolation
procedure and stability characteristics. The journal of
biological chemistry: 224:621-635 1957

ANEXOS
1. Solucin stock de fosfato, 0.2 mg P/ml. Pese 87.9 mg
de KH2PO4 (RA), disuelva en 75 ml de agua,
agregue 1 ml de cido sulfrico 10 N y complete el
volumen a 100 ml con agua.
2. Solucin patrn de fsforo, 0.04 mg P/ml (recin
preparada). Diluya 2 ml de la solucin stock, hasta
10 ml con agua.
3. Solucin de cido molbdico (requerido por prctica
35 ml), Agregue 84 ml de H2SO4 concentrado (grado
analitico, libre de fosfatos y silicatos) sobre 300 ml
de agua, agite y enfre. Aparte disuelva 25 g de
molibdato de amonio en agua, luego mezcle las 2
soluciones y complete a un litro con agua. Es
importante verificar que los reactivos estn libres de
fosfatos.
4. Solucin de cido ascrbico, 1.5 mg/ml (recin
preparada).
5. Solucin de cido tricloroactico (ATA), 10%
6. Solucin de glicerofosfato de sodio, 0.1 M
7. Soluciones de glicerofosfato de sodio, de diversas
concentraciones segn la siguiente Tabla:

Concentracin,
mM

glicerofosfato
0.1 M , ml
Agua, ml
5 0.1 1.9 ml
10 0.2 1.8
20 0.4 1.6
40 0.8 1.2
60 1.2 0.8
80 1.6 0.4
100 2.0

8. Solucin de cido ctrico 0.1 M. Prepare 250 ml.
Pese 4.8 g y disulvalos en agua, complete a 250 ml
en baln aforado
9. Soluciones buffer: La solucin de cido ctrico 0.1 M
tiene un pH inicial 2.25. A partir de ella, mida
volmenes de 20 ml en vasos de precipitados y
ajuste el pH a 3.4, 5.0, 5.6 y 6.2 mediante la adicin
de NaOH. A los 150 ml restantes, ajuste el pH a 5.3
de la misma manera.
10. Solucin de inhibidor HgCl2 20 mM. Prepare 5 ml.
Pese 25 mg y disulvalos en 5 ml de agua.


Corregido por: Diana Ximena Hurtado Varela