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Laboratorio 2: Inhibición transformación de la actividad enzimática en procesos de OBJETIVOS    Medir

Laboratorio

2:

Inhibición

transformación

de

la

actividad

enzimática

en

procesos

de

OBJETIVOS

Medir la velocidad de reacción del germen de trigo con distintas concentraciones. Estimar los parámetros cinéticos K m y k cat a partir de los datos experimentales. Identificar factores experimentales que resultan críticos para la estimación de los parámetros cinéticos de la enzima.

INTRODUCCIÓN Cinética enzimática

Las reacciones metabólicas conforman un cuerpo de reacciones químicas que ocurren en condiciones muy particulares y que son necesarias para que los seres vivos cumplan con sus funciones biológicas. Estas condiciones particulares en las que las reacciones metabólicas deben darse son características de los organismos, órganos, tejidos o células, y en ausencia de un catalizador, no suelen permitir que se generen los productos a la velocidad requerida. Ciertas proteínas han evolucionado entonces como catalizadores biológicos (enzimas) cuya función es aumentar la velocidad de las reacciones químicas en los seres vivos. Es importante recordar que este aumento en la velocidad de reacción se logra mediante la disminución de la energía de activación de los reactantes y que nada tiene que ver con el cambio de energía libre que ocurre al convertirse los reactantes en productos.

Las enzimas son generalmente, moléculas proteicas que tienen la capacidad de catalizar reacciones químicas. Debido a la naturaleza proteica, son inestables y pueden ser desnaturalizadas por cambios en el medio. Como la desnaturalización afecta las propiedades biológicas de las proteínas, la actividad de las enzimas se afecta por muchas variables como temperatura, pH, concentración de sustrato y de enzima y la presencia de inhibidores. Las condiciones óptimas varían de una enzima a otra.

En términos simples, la relación entre la velocidad de la reacción y la concentración de sustrato (S, reactante) en una reacción catalizada por una enzima (E) está dada por la ecuación de Michaelis y Menten de acuerdo al esquema siguiente:

[

]

[

]

Donde, en condiciones de estado estable

=

velocidad

de

reacción

a

una determinada

concentración de sustrato [ ] = concentración de sustrato = velocidad máxima alcanzable a la concentración de enzima dada = constante de disociación aparente de E S = (k 1 + k 2 ) / k +1

Los valores de K m y V máx son útiles para caracterizar el funcionamiento de una enzima con un sustrato específico. El K m mantiene un relación inversa con la afinidad de la enzima por el sustrato, y si se conoce la concentración de la enzima, [E], la V max permite el cálculo de la constante de catálisis de ésta (k cat = k 2 = V max / [E]). La k cat es equivalente al número de reacciones que un sitio activo de la enzima cataliza por unidad de tiempo. El cociente k cat /K m toma en cuenta ambos parámetros para estimar la eficiencia catalítica de la enzima, entendida ésta como la frecuencia en que la enzima transformará el sustrato en producto cada vez que se encuentre con él (a mayor k cat [mayor velocidad] y menor K m [mayor afinidad], mayor eficiencia).

En la práctica, los valores de K m y V max pueden estimarse a partir de gráficas de funciones derivadas de la ecuación de Michaelis y Menten. Una primera ecuación derivada es la de Lineweaver y Burk:

1

[

]

Graficando la inversa de las velocidades de reacción que se obtienen experimentalmente (eje “y”) versus la inversa de las concentraciones de sustrato respectivas (eje “x”), se obtiene una recta cuya intersección con el eje “y” da la inversa de V max y cuya pendiente es equivalente a K m /V max .

Una

ecuación derivada

Hofstee:

alternativa es

la

de

Eadie

y

[

]

En este caso, graficando las velocidades de reacción que se obtienen experimentalmente (eje “y”) versus el cociente entre dicha velocidad y la concentración de sustrato correspondiente (eje “x”), se obtiene una recta cuya intersección con el eje “y” es directamente el valor de V max y cuya pendiente es K m .

Hay dos formas generales de

seguir el curso

de

una

reacción enzimática: Medir la cantidad de sustrato que

“desaparece” o determinar la cantidad de producto

formado.

Las fosfatasas ácidas y alcalinas son un grupo de enzimas de amplia distribución en la naturaleza. Su especificidad también es amplia, aunque se presentan algunas diferencias de acuerdo con el origen de las enzimas. Todas actúan sobre monoésteres de ácido ortofosfórico, tanto alifáticos (glicerol1fosfato y glicerol2fosfato) como aromáticos (4fenilofosfato). No actúan sobre diésteres o triésteres de fosfato. La fosfatasa alcalina purificada de diversas fuentes también puede hidrolizar fosfocreatina, fosfato inorgánico y polifosfatos como el ATP.

Recibe el nombre sistemático de monoéster ortofosfórico fosfohidrolasa y la reacción general que cataliza se presenta así:

Las fosfatasas son específicas para el fosfato de la molécula, de manera que la ruptura ocurre cerca del átomo de fósforo.

2

Entonces

el

primer

requerimiento

para

estudiar

una

enzima es disponer de un método cuantitativo conveniente para medir su actividad. Para la fosfatasa

ácida, objeto

de

esta práctica, la determinación de la

actividad se fundamenta en la cuantificación del fosfato

liberado, lo

cual

se

hace por

el

método de

Fiske-

Subbarow:

BUSCAR REACCION ¡¡¡¡

[ ] Graficando la inversa de las velocidades de reacción que se o btienen experimentalmente (eje

Este es un método colorimétrico, basado en la reacción del fósforo con ácido molíbdico para obtener ácido fosfomolíbdico. Posteriormente, éste reacciona como un reductor en medio alcalino (ácido ascórbico), formando una mezcla de óxidos de molibdeno, de color azul.

La velocidad inicial de una reacción enzimática depende de los siguientes factores:

Concentración de sustrato

Para una cantidad fija de enzima, la velocidad de

reacción aumenta cuando se incrementa la

concentración de sustrato. Hasta alcanzar un valor límite cuando la velocidad ya no aumenta más. En esta condición, la enzima se encuentra saturada con el sustrato y se ha llegado a la velocidad máxima.

Concentración de enzima

En presencia de un exceso de sustrato, la velocidad de reacción es proporcional a la concentración de enzima. Algunas enzimas son inhibidas por los productos de la

reacción.

pH

La concentración de protones en el medio influye en la

actividad de las enzimas, ya que se afectan los grupos ionizables en la enzima y en el sustrato (si los hay). Generalmente las enzimas son activas en un rango limitado de pH. El valor que permite lograr la mayor velocidad, se conoce como pH óptimo. Se debe tener en cuenta que este valor puede variar con la temperatura, el buffer usado y la presencia de activadores o inhibidores.

Temperatura

Las reacciones enzimáticas se afectan por el calor como

se afecta en general cualquier reacción química. Es decir, un aumento en la temperatura se refleja en

aumento en la velocidad de reacción. No obstante, la naturaleza proteica de las enzimas hace que éstas sufran desnaturalización a altas temperaturas, lo que conlleva

adecuadamente las propiedades y el comportamiento de una enzima, debe estar pura. Sin embargo, en algunos casos es posible, mediante el uso de técnicas muy

Seleccionado el material de partida, es necesario obtener

pérdida de la actividad y por lo tanto disminución en la velocidad de reacción. La temperatura óptima es la resultante de estos dos efectos, y es la temperatura que permite lograr la máxima velocidad. La temperatura óptima puede variar con el tiempo de reacción. Si la incubación es de unos pocos segundos, la temperatura óptima puede ser tan alta como 60 o 70°C.

Productos de la reacción

específicas, estudiar una enzima aunque esté impura. Elegido el método para medir la actividad, es importante investigar cuáles son las fuentes más abundantes de la enzima, a menos que haya razones para utilizar una fuente específica.

la enzima en solución. Para este propósito usualmente se debe romper la membrana celular, lo cual se puede

La acumulación de productos puede retardar la actividad de algunas enzimas. Esto puede deberse a combinación del producto con el sitio activo se la enzima, impidiéndole combinarse con el sustrato, o puede deberse a que se promueve la reacción inversa, con disminución en la velocidad global de reacción.

lograr por métodos químicos (detergentes, solventes), enzimáticos (lisozima), físicos (ultrasonido) o mecánicos (homogenizador o moler con arena). El extracto se puede preparar con agua, solución salina o con un buffer. El extracto crudo contiene la enzima y numerosas otras sustancias de alto y bajo peso molecular. Las moléculas

Medida de la velocidad de reacción

pequeñas se pueden remover por diálisis o por filtración por gel, dejando en solución las moléculas grandes que

Las curvas de progreso de la mayoría de las reacciones

enzimáticas muestran una caída de velocidad con el tiempo. Esto puede obedecer a varias causas, por ejemplo los productos de la reacción pueden inhibir la enzima, el grado de saturación de la enzima con el sustrato puede disminuir a medida que la reacción trascurre, porque disminuye la concentración de sustrato, la reacción inversa puede volverse más importante a medida que la concentración de productos aumenta, la enzima (o la coenzima) puede sufrir alguna inactivación a la temperatura o un pH de reacción debido a

son predominantemente proteínas, aunque también pueden estar presentes en algunos polisacáridos.

Los procesos de purificación consisten en una serie de fraccionamientos por medio de los cuales la enzima se separa de las otras proteínas presentes. La purificación se fundamenta en las diferencias en solubilidad, tamaño, carga y actividad biológica de las proteínas. En esta práctica se trabajará con un extracto crudo de fosfatasa alcalina. (El tema de la purificación de proteínas es objeto de otra práctica de laboratorio).

inestabilidad. Varias de estas causas pueden operar al mismo tiempo.

La actividad de las enzimas se expresa en unidades de

actividad, que se definen como micromoles de sustrato

MATERIALES Y REACTIVOS

Por estas razones, en el estudio de

la actividad

transformados por minuto (a las condiciones del ensayo).

enzimática se emplean medidas de velocidad inicial, ya que solamente al inicio de la reacción, cuando las causas mencionadas anteriormente no han tenido tiempo de operar, se conocen con exactitud las condiciones. Para obtener la velocidad de la reacción y dibujar la tangente en el origen. Usualmente las curvas son prácticamente líneas rectas siempre que la cantidad de cambio no

En los procesos de purificación es usual emplear como referencia la actividad específica, que se define como unidades de actividad por miligramo de proteína. A medida que aumenta la pureza de la enzima, debe aumentar la actividad específica.

exceda el 20% de total. La cantidad de sustrato

  • 10g Germen de trigo

transformado en un período de tiempo desde el

  • 5 Vasos de precipitados

comienzo de la reacción, es una medida de la velocidad

  • Pipetas

solo si este límite no se sobrepasa.

  • Centrífuga

  • 11 Tubos de ensayo

Aislamiento de las enzimas

  • Vortex

Las enzimas se encuentran en la naturaleza en mezclas

  • Colorímetro

complejas, usualmente en las células, que contienen

  • pH-metro

cientos de enzimas diferentes. Para estudiar

  • Gradillas

3

PROCEDIMIENTO Extracción de la fosfatasa ácida

Pesar 10 gramos de germen de trigo y agregar 50 ml de agua fría. Luego agitar la mezcla hasta que obtener una suspensión uniforme. Dejar en reposo por 30 min, decantar por 15 min y filtrar el sobrenadante a través de algodón, los residuos se descartan. Esta solución constituye el extracto crudo de fosfatasa ácida. (Mantener en hielo).

Preparación de curva de calibración de fosforo inorgánico

Realizar las siguientes soluciones, de acuerdo a como se muestra en la tabla 1.

Tabla 1: Volúmenes de reactivos utilizados en la preparación de la curva de calibración

 

Patrón de

 

Ácido molíbdico

(ml)

Tubo

fósforo 0.04

mg/ml (ml)

Agua

(ml)

B

4.0

0.5

1

0.1

3.9

0.5

2

0.2

3.8

0.5

3

0.3

3.7

0.5

4

0.4

3.6

0.5

5

0.5

3.5

0.5

Agitar bien los tubos y dejar en reposo durante 3 minutos. Posteriormente adicionar 0.5 ml de la solución de ácido ascórbico a cada tubo.

en reposo por 10 minutos y leer absorbancia a 660nm. Dichos valores de absorbancia, se interpolan en la curva de calibración preparada con el fin de determinar la cantidad de fósforo.

  • A. Determinación del tiempo óptimo de incubación

Los extractos enzimáticos tienen actividades variables, algunos pueden resultar muy activos mientras que otros pueden tener baja actividad. Adicionalmente, las enzimas en extractos crudos o purificados, pueden perder actividad durante el almacenamiento. Por tanto es necesario determinar el tiempo de reacción conveniente para obtener una cantidad de fosforo tal que, por colorimetría, se obtengan valores de %T entre 20 y 80 y adicionalmente correspondan a la parte recta de la curva de progreso de la reacción.

Prepare la siguiente mezcla de reacción:

Tabla 3: Volúmenes de reactivos para prueba de tiempo óptimo

 

Buffer

       

Tubo

citráto 0.1 M de pH 5.3

(ml)

β-glicero

fosfato de

sodio (ml)

Agua

(ml)

   

Extracto

enzimático

(ml)

Blanco buffer

       

(BB)

5.6

 
  • 2.4

Blanco sustrato

       

(BS)

5.6

1.6

Mezcle bien los tubos y agregue

a continuación

  • 0.8

Blanco enzima

       

(BE)

5.6

  • 1.6 0.8

Tiempo

       

reacción (TR)

5.6

1.6

0.8

Agitar las soluciones de los tubos y dejar en reposo durante 10 minutos para que se desarrollara el color. Determinar absorbancia a 660 nm.

A.1 Procedimiento para determinación de cantidad de fósforo producido por acción de fosfatasa acida

Nota: En todos los casos la mezcla de reacción se prepara como se indica a continuación, agregando los reactivos en el orden mostrado:

Tabla 2: Volúmenes de sustancias utilizadas en mezcla de reacción para determinación de fósforo

Sobrenadante

de

la

reacción

 

enzimática

0.5

ml

Agua destilada

3.5

ml

Ácido molíbdico

 

0.5

ml

Agitar bien y dejar en reposo por 3 minutos; después se adicionaron 0.5 ml de ácido ascórbico. Agitar bien, dejar

4

Agitar bien e incubar a temperatura ambiente; el blanco de buffer (BB) y el blanco de sustrato (BS) se dejan reaccionar 30 minutos. Pasado este tiempo se toman alícuotas de 1 ml y se reciben sobre ácido tricloroacético al 10%.

Tomar muestras de 1 ml de BE y TR a los 2, 5, 10, 15, 20 y 30 minutos. Dichas alícuotas se reciben en tubos que contenían 1 ml de ácido tricloroacético al 10%. Agitar y centrifugar a 2500rpm durante 5 minutos.

Determine en el sobrenadante la cantidad de fósforo

producido, ajustando el 100% de T con el tubo BB y siguiendo el procedimiento A1.

  • B. Efecto del pH, Determinación del pH óptimo

Sustrato: Solución de β-glicerofosfato de sodio 0.1 M Buffer: Soluciones de buffer de citrato 0.1 M, diferentes pHs

Enzima: Extracto enzimático crudo Tiempo de reacción: 10 minutos

Tabla 4: Volúmenes de reactivos utilizados en prueba de pH óptimo

Tubo

BB

BS

BE

1

2

3

4

5

6

Sustrato

                 

  • 0.4 0.4

0.4

0.4

0.4

  • 0.4 0.4

(ml)

Buffer

                 

(ml)

  • 2.0 1.8

  • 1.6 1.4

1.4

1.4

1.4

  • 1.4 1.4

pH

del

 
  • 5.3 5.3

  • 5.3 5.6

3.0

4.0

5.0

 
  • 5.3 6.2

 

buffer

Mezclar bien y enseguida agregar la enzima, a intervalos de 30 segundos, es decir, pasados 30 segundos de agregar la enzima al primer tubo, se le agregan al segundo y así hasta completar los tubos, de la siguiente forma:

Enzima

                 

(ml)

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

Mezclar el contenido de cada tubo y dejar incubando a temperatura ambiente durante 10 minutos. Es importante que los 10 minutos se le cuenten a cada tubo, es decir, después de agregada la enzima al tubo, se empiezan a contar los 10 minutos y pasado este tiempo, se le agregan 2 ml de ATA10% a cada tubo. Mezclar y centrifugar a 2500rpm durante 5 minutos.

El precipitado se descarta y en el sobrenadante de todos los tubos se determina la concentración de fósforo inorgánico, por medio del procedimiento A1.

C.

Efecto de la temperatura, Determinación de la temperatura óptima

Buffer: Solución de buffer de citrato, 0.1 M, pH 5.3 Sustrato: Solución de -glicerofosfato de sodio 0.1 M Enzima: Extracto enzimático crudo Tiempo de reacción: 10 minutos Temperatura: Se hará la incubación a diferentes temperaturas como se muestra a continuación:

Tabla 5: Temperaturas utilizadas en determinación de temperatura óptima

Temperatura, °C

Medio

0

Agua Hielo

18

Temperatura ambiente

37

Termostato

60

Termostato

98

Agua en ebullición

Tabla 6: Volúmenes de reactivos utilizados en prueba de temperatura óptima

Tubo

BB

BS

BE

1

2

3

4

5

         

1.4

1.4

1.4

1.4

         

0.4

0.4

0.4

0.4

         

                 

Buffer (ml)

1.4

1.4

1.4

1.4

Sustrato (ml)

0.4

0.4

Agua (ml)

0.6

0.2

0.4

Temperatura

18

18

18

 

0

18

37

 

60

92

 

°C

Mezclar bien y enseguida agregar la enzima, a intervalos de 30 segundos, es decir, pasados 30 segundos de agregar la enzima al primer tubo, se le agregan al segundo y así hasta completar los tubos, de la siguiente forma:

Enzima

               
 

(ml)

0.2

 

0.2

0.2

0.2

 

0.2

0.2

Agitar y

dejar

en

incubación

durante

10

minutos

exactamente. Al final adicionar a todos los tubos 2 ml de

ATA al 10% y se centrifugar a 2500rpm durante 5

minutos. (Tener en

cuenta

la misma

recomendación

hecha en el procedimiento de pH para los 10 minutos)

El precipitado se descarta y en el sobrenadante de todos los tubos se determina la concentración de fósforo inorgánico, por medio del procedimiento A1.

D.

Efecto de la concentración de la enzima en la velocidad de reacción

Buffer: Solución de buffer de citrato, 0.1 M, pH 5.3 Sustrato: Solución de -glicerofosfato de sodio 0.1 M Enzima: Extracto enzimático crudo Tiempo de reacción: 10 minutos Temperatura: temperatura ambiente

Tabla 7: Volúmenes de reactivos utilizados en la determinación del efecto de la concentración de la enzima

 

1

Tubo

BB

BS

BE

 

2

3

4

5

Buffer (ml)

1.2

 

1.2

  • 1.2 1.2

1.2

1.2

1.2

 

1.2

Sustrato

(ml)

 

  • 0.4 0.4

0.4

0.4

0.4

 

0.4

Agua (ml)

0.8

 

0.4

  • 0.4

0.35

0.30

0.25

0.10

 

Mezclar bien y enseguida agregar la enzima, a intervalos de 30 segundos, es decir, pasados 30 segundos de

agregar la enzima al primer tubo, se le agregan al

segundo y así hasta completar los tubos, de la siguiente

forma:

Enzima (µl)

400

50

100

150

300

400

5

Agitar y

dejar en

incubación

durante

10

minutos

exactamente. Al final adicionar a todos los tubos 2 ml de

ATA al 10% y se centrifugar a 2500rpm durante 5

minutos. (Tener en

cuenta

la misma

recomendación

hecha en el procedimiento de pH para los 10 minutos)

El precipitado se descarta y en el sobrenadante de todos los tubos se determina la concentración de fósforo inorgánico, por medio del procedimiento A1.

F.

Efecto de la presencia de un inhibidor en la velocidad de reacción

El precipitado se descarta y en el sobrenadante de todos los tubos se determina la concentración de fósforo inorgánico, por medio del procedimiento A1.

E.

Efecto

de

la

concentración

de

sustrato,

determinación de la constante de Michaelis (Km)

Buffer: Solución de buffer de citrato, 0.1 M, pH 5.3 Sustrato: Solución de -glicerofosfato de sodio de diversas concentraciones en el rango 5 100 mM. Enzima: Extracto enzimático crudo Tiempo de reacción: 10 minutos Temperatura: temperatura ambiente

Tabla 8: Volúmenes de reactivos para la determinación del efecto de la concentración del sustrato en la velocidad de reacción

 

Tubo

BB

BS

BE

1

2

3

4

5

6

7

8

 

Buffer (ml)

1.4

 
  • 1.2 1.4

1.4

 

1.4

1.4

1.4

1.4

1.4

1.4

1.0

(ml)

Sustrato

  • 0.8

 

0.4

0.4

0.4

0.4

0.4

0.4

0.4

0.8

 

{S} mM

100

5

10

20

40

60

80

100

100

(ml)

Agua

0.6

0.4

Mezclar bien y enseguida agregar la enzima, a intervalos de 30 segundos, es decir, pasados 30 segundos de agregar la enzima al primer tubo, se le agregan al segundo y así hasta completar los tubos, de la siguiente forma:

Enzima

                     

(ml)

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

Agitar

y

dejar

en

incubación

durante

10

minutos

exactamente. Al final adicionar a todos los tubos 2 ml de ATA al 10% y se centrifugar a 2500rpm durante 5

minutos.

(Tener en

cuenta

la misma

recomendación

hecha en el procedimiento de pH para los 10 minutos)

Buffer: Solución de buffer de citrato, 0.1 M, pH 5.3 Sustrato: Solución de glicerofosfato de sodio de diversas concentraciones en el rango 5100 mM. Enzima: Extracto enzimático crudo Tiempo de reacción: 10 minutos Temperatura: temperatura ambiente Inhibidor: HgCl 2 5 mg/ml

Tabla 9: Volúmenes de reactivos para la determinación del efecto de la concentración del sustrato con inhibidor en la velocidad de reacción

 

Tubo

BB

BS

BE

1

2

3

4

5

6

7

8

 

Buffer (ml)

1.2

1.2

1.2

   
  • 1.2 1.2

 
  • 1.2 1.2

1.2

1.2

  • 1.2 0.8

 

(ml)

Sustrato

0.8

   
  • 0.4 0.4

 
  • 0.4 0.4

0.4

0.4

  • 0.4 0.8

 
 

[ S ] mM

100

5

10

20

40

60

80

100

100

 

Agua (ml)

1.0

0.4

(ml)

Inhibidor

0.2

   
  • 0.2 0.2

 
  • 0.2 0.2

    • 0.2 0.2

 
  • 0.2 0.2

 

Mezclar bien y enseguida agregar la enzima, a intervalos de 30 segundos, es decir, pasados 30 segundos de agregar la enzima al primer tubo, se le agregan al segundo y así hasta completar los tubos, de la siguiente forma:

0.2

0.2 0.2

0.2 0.2

0.2 0.2

0.2 0.2

Enzima (ml)
Enzima
(ml)

Agitar y

dejar en

incubación

durante

10

minutos

exactamente. Al final adicionar a todos los tubos 2 ml de

ATA al 10% y se centrifugar a 2500rpm durante 5

minutos. (Tener en

cuenta

la misma

recomendación

hecha en el procedimiento de pH para los 10 minutos)

El precipitado se descarta y en el sobrenadante de todos los tubos se determina la concentración de fósforo inorgánico, por medio del procedimiento A1.

6

2.

Solución patrón de fósforo, 0.04 mg P/ml (recién

CUESTIONARIO

  • 1. ¿Mediante qué código se identifica la fosfatasa ácida y qué indica cada número?

  • 2. ¿Cómo podría purificar la fosfatasa ácida del germen de trigo?

  • 3. ¿Cómo se define la unidad de actividad?

  • 4. ¿En qué condiciones se logra la mejor extracción de la fosfatasa ácida de levadura?

  • 5. ¿Para la fosfatasa ácida de levadura en qué condiciones se logra la máxima estabilidad en soluciones de etanol?

  • 6. ¿Cuál es la constante de sedimentación de la enzima de levadura purificada?

  • 7. ¿Cuáles son las características de estabilidad térmica de la fosfatasa ácida de levadura y las características de inactivación por agitación?

BIBLIOGRAFIA

Barman, Thomas E. Springer handbook, segunda impresión. 1985

Verlag.

Enzyme

Coodley Eugene L. (editor). Lea & Febiger. Diagnostic enzymology. 1970

Dixón, Malcom and

Edwin

C.-

Enzymes,

Webb.

Academic Press, tercera Edición, 1979

Joyce B.K Grisolia S: “Purification and properties of a

nonspecific acid phosphatise from wheat

germ.” The

journal of Biological Chemistry 235 : 2278-2281, 1960.

Lehninger, Nelson and cox . principles of biochemistry. Worth publishers, cuarta edición, 2005.

Roberts W.A.: “The wheat leaf phosphatises III. A survey

on the heat stability of the enzymes active al pH 5.7”.

The journal of biological Chemistry 226: 751, 1957

Tsuboi K.K,. Wierner G. and Hudson P.B. acid phosphatise. VII: Yeast phosphomonoesterase: isolation procedure and stability characteristics. The journal of biological chemistry: 224:621-635 1957

ANEXOS

  • 1. Solución stock de fosfato, 0.2 mg P/ml. Pese 87.9 mg de KH 2 PO 4 (RA), disuelva

en

75

ml

de agua,

agregue 1 ml de ácido sulfúrico 10 N y complete el

volumen a 100 ml con agua.

preparada). Diluya 2 ml de la solución stock, hasta

  • 10 ml con agua.

  • 3. Solución de ácido molíbdico (requerido por práctica

    • 35 ml), Agregue 84 ml de H 2 SO 4 concentrado (grado

analitico, libre de fosfatos y silicatos) sobre 300 ml de agua, agite y enfríe. Aparte disuelva 25 g de molibdato de amonio en agua, luego mezcle las 2 soluciones y complete a un litro con agua. Es importante verificar que los reactivos estén libres de fosfatos.

  • 4. Solución de ácido ascórbico, 1.5 mg/ml (recién preparada).

  • 5. Solución de ácido tricloroacético (ATA), 10%

  • 6. Solución de β–glicerofosfato de sodio, 0.1 M

  • 7. Soluciones de βglicerofosfato de sodio, de diversas concentraciones según la siguiente Tabla:

Concentración,

Agua, ml

mM

glicerofosfato 0.1 M , ml

5

0.1

1.9 ml

10

0.2

1.8

20

0.4

1.6

40

0.8

1.2

60

1.2

0.8

80

1.6

0.4

100

2.0

  • 8. Solución de ácido cítrico 0.1 M. Prepare 250 ml. Pese 4.8 g y disuélvalos en agua, complete a 250 ml en balón aforado

  • 9. Soluciones buffer: La solución de ácido cítrico 0.1 M tiene un pH inicial 2.25. A partir de ella, mida volúmenes de 20 ml en vasos de precipitados y ajuste el pH a 3.4, 5.0,

5.6 y 6.2 mediante la adición

de NaOH. A los 150 ml restantes, ajuste el pH a 5.3

de la misma manera. 10. Solución de inhibidor

HgCl 2

20 mM. Prepare 5 ml.

Pese 25 mg y disuélvalos en 5 ml de agua.

Corregido por: Diana Ximena Hurtado Varela

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