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Universidad Nacional del Santa 2013
1

I. OBJETIVOS:

1.1. ObjetivosGenerales:
Disear y realizar una experiencia de cultivo celular por lotes en matraces
empleando una cepa de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126, evalundose
el efecto de la razn de S
0
/X
0
en la cintica de crecimiento microbiano.
1.2. ObjetivosEspecficos:
Disear y preparar el medio de cultivo.
Activacin celular y desarrollo del inculo
Determinar la cintica de crecimiento de la biomasa.
Determinar de la cintica de consumo de la fuente de carbono.
Determinar la cintica de produccin de Etanol.
Determinacin del
M
y los rendimientos del nutriente limitante en clulas y
en etanol adems de las respectivas productividades en clulas y en etanol.


2

II. METODOLOGIA EXPERIMENTAL

Para comenzar a trabajar el desarrollo experimental del cultivo del
microorganismo, es importante siempre recalcar, cul ser la metodologa
experimental a utilizar, a fin de evitar problemas y/o errores experimentales,
los mismos que podran darse en: las tcnicas aspticas, en la obtencin de
cultivos puros, en la preparacin de los medio s de cultivo, en las tomas de
muestra, en el crecimiento del microorganismos y entre otros factores.

Es necesario recordar que, cualquier medio de cultivo de levaduras debe
proporcionar los requerimientos nutritivos bsicos, que incluyen los
siguientes: una fuente de carbono, agua, una fuente de nitrgeno, una fuente
de fsforo, una fuente de azufre, y varios minerales, como el hierro y el
magnesio. A este tipo de medio de cultivo se llama definido o sinttico,
porque se conoce exactamente su composicin qumica.

Tener siempre presente que un caldo de cultivo es un medio lquido en el que
los componentes se disuelven simplemente en agua destilada. El agar es un
agente solidificante ideal para los medios microbiolgicos por sus propiedades
reolgicas y porque no posee ningn valor nutritivo para la inmensa mayora
de bacterias y hongos. El agar solido funde a 90 100C, y se solidifica a unos
42C.


3

A. DISEO DE MEDIOS DE CULTIVO
A la hora de disear un medio de cultivo no slo hay que tener en cuenta los
nutrientes sino tambin las condiciones fsicas que permitan el crecimiento de
los microorganismos, asimismo nos interesa cuanto de biomasa se desea
producir.

Estado : Medio lquido
Volumendelmedio : 10 30 % del volumen del matraz
Temperatura: 35C
Ph : 4.2 (ajustar pH con tampn citrato)
Velocidaddeagitacin: 150 rpm en el agitador orbital (shaker)
Metabolismo :autotrfico
Macronutrientes : C, N, Mg, S, K y P
Micronutrientes : Ca, Na, Fe, Cu, Mn, Mo, Co y Zn

*Se utilizar como fuente de carbono y energa: Sacarosa
Fuente de carbono y energa Sacarosa
Fuente de N
Sulfato de amonio
Fuente de Mg
Sulfato de magnesio. 7 H
2
O
Fuente de S
Sulfato de amonio
Fuente de K
Fosfato dicido de potasio
Fuente de P
Fosfato dicido de potasio
Solucin de sales concentrada (100 veces)

Fuente de Ca : CaCl
2
. 2H
2
O
Fuente de Na : NaCl
Fuente de Fe : FeSO
4
.7H
2
O
Fuente de Cu : CuSO
4
.5H
2
O
Fuente de Mn : MnCl
2
.6H
2
O
Fuente de Mo : MoO
3

Fuente de Co : CoCl
2
.6H
2
O
Fuente de Zn : ZnSO
4
.7H
2
O


4

Composicin De Medios De Mantencin, Activacin Y Cultivo Para
Saccharomyces Cerevisiae Atcc 4126 Para La Produccin De Etanol

Medio Slido de Mantencin: Se calcularon los compuestos para el medio

Tabla 01:ConcentracindeNutrientesparaelmediodemantencin(50mL)

Medio de Activacin:

Tabla 02: ConcentracindeNutrientesparaunmediodeactivacin(30mL)

*SedebetenerunT
optima
=35CyN200rpm
NUTRIENTE CONCENTRACIN (G/L)

PESO (G)
PARA 50 ML
Extracto de Levadura 3 0.15
Peptona 5 0.25
Extracto de Malta 3 0.15
Agar 20 1.00
Glucosa 10 0.5
NUTRIENTE CONCENTRACIN (G/L) PESO (G)
Glucosa 10 0.3
Extracto de levadura 3 0.09
Extracto de malta 5 0.15
Soluciones de sales (de la
tabla 04)
5ml/L 0.15ml

5

Medio Fermentacin:

Tabla 03: ConcentracindeNutrientesparaunmediodefermentacin
Paraunvolumendemedio=20%delvolumendelmatrazde500ml
Paraunaconcentracinfinal=7g/l
Tomamoslosmayoresvaloresobtenidosparacadanutriente.
SedebetenerunpH
ptimo
=4.2(sinosedebe
ajustarconTampncitrato)

NUTRIENTE FUENTE CONCENTRACIN (g/L) PESO (G)
PARA 100 mL
C
12
H
22
O
11 C 5.36 0.536
Extracto de
Levadura
- 1.8 0.18
(NH
4
)
2
SO
4
N 0.849 0.0849
MgSO
4
.7H
2
O Mg 0.1215 0.01215
KH
2
PO
4
P y K 0.2615 0.02615
Soluciones de Sales Concentradas 10ml/L 1 ml/L

6

Tabla N 04:Solucindesales
NUTRIENTE CONCENTRACIN (G/L)
CaCl
2
.2H
2
O 1.12
ZnSO
4
.7H
2
O 0.11
FeSO
4
.7H
2
O 0.06
CuSO
4
.5H
2
O 0.05
CoCl
2
.6H
2
O 0.01
MoO
3
0.0005
MnCl
2
6H
2
O 0.027
NaCl 0.28

Condiciones De Cultivo
Temperatura: 35C
Velocidad de Agitacin: 150 rpm en shaker.
pH: 4.2 (ajustar pH con Tampn Citrato)

B. PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

Preparacin de los materiales para el medio de cultivo
1. Lavar y secar todos los materiales de vidrio a utilizar.
2. Luego colocarlos en la estufa en posicin vertical los vasos precipitados,
matraces y tubos de ensayo.
3. Las pipetas a utilizar deber ser puestas en la estufa previamente
recubierta de papel aluminio.
4. Esterilizar a 121 C por 15 minutos.
5. Pesar la sacarosa requerida y los dems fuentes de nutrientes.
6. En un matraz de 125ml diluir las sales con 5 ml de agua destilada.
7. En un matraz de 125 ml diluir la galactosa con 5 ml de agua destilada.

7

8. En un matraz de 125 ml diluir el extracto de levadura con 5 ml de agua
destilada.
9. Colocar los matraces previamente recubierto con papel aluminio en la
estufa.
10. Esterilizar a 121 C por 15 minutos.
11. En un matraz de 1 L agregar las 3 disoluciones antes hechas.
12. Elaborar la curva de calibracin para la determinacin de azucares
reductores por el mtodo del DNS.

Condiciones de Asepsia
Cuando se trabaja con cultivos microbianos, la tcnica asptica se utiliza
para prevenir la introduccin de organismos adicionales al cultivo.
1. Rotular el matraz con el nombre de la cepa, la fecha y el nombre del
alumno o grupo.
2. Encender el mechero Bunsen.
3. Sostener los matraces. Si los matraces tienen un tapn de algodn,
scalo un poco de manera que no est muy apretado.
4. Flamear en el mechero Bunsen, el cual da un rea de desinfeccin de 30
cm a la redonda.

8

5. Retirar una tapa con el meique, mientras sostienes los matraces. Nunca
poner las tapas sobre la mesa.
6. Flamear la boca de ambos matraces para matar cualquier
microorganismo presente en el aire y que pueda contaminar la parte
superior durante las manipulaciones.
7. Los matraces abiertos deben mantenerse en posicin inclinada para que
el riesgo de contaminacin sea mnimo.
8. Sembrar en el matraz estril el inoculo.
9. De nuevo flamea las bocas de los matraces y tpalos de nuevo.
Asegrate de mezclar muy bien el inoculo en los matraces que contienen
el caldo sembrado.
10. Flamea los tapones antes de que los coloques en los matraces.

Confeccin Del Tapn Para Matraces

1. Para confeccionar este tapn se cortar un pedazo de gasa, el cual debe de
ser doble para obtener una buena consistencia del tapn.
2. Luego este pedazo de seda es colocado perpendicularmente en la boca del
matraz.
3. Despus se hundir con algodn hasta que cubra todo el cuello del matraz,
pero este llenado deber ser a presin para que no deje entrar mucho aire,
slo el necesario para el microorganismo
4. Luego de haber culminado se realizarn los nudos respectivos para sujetar el
algodn y as impedir su cada, pero tambin servir para poder manipular
los matraces a travs de estos nudos.

9

CORTAR
Un pedazo de gasa
COLOCAR
RELLENAR
ANUDAR
Tratar que sea un
cuadrado uniforme
Perpendicularmente
en la boca del matraz.

Con pedacitos de
algodn.


10

Esterilizacin De Pipetas

1. Se lavan las pipetas con cuidado y se dejan secar por un lapso de tiempo.
2. Despus se colocar algodn la boquilla de la pipeta, cuidando de no
presionarse mucho ya que cumplir la funcin de un filtro.
3. Luego de haber realizado este procedimiento se agrupan las pipetas y al
mismo tiempo envolverlas con papel aluminio, tratando de cubrir todas las
pipetas y marcando la seccin en donde est colocado el filtro de la pipeta
para que as al manipularlas no se contaminen.
4. Se introducirn las pipetas a la estufa a 120 C
por 2 horas.
5. Pasado este tiempo se sacarn de la estufa, pero
cuidando de no desenvolver las pipetas, para
evitar su contaminacin.

LAVAR
SECAR
COLOCAR
ENVOLVER
A la estufa a 120 C por 2
horas.

Con papel aluminio.

Algodn en la
boquilla de la pipeta
INTRODUCIR

11

Confeccin de los capachos

1. Se corta el papel aluminio en forma cuadrada, de tal manera que pueda ser
suficientemente grande como para cubrir el molde el cual se desea
confeccionar.
2. Luego el papel aluminio que se ha cortado se coloca encima del molde y se
empieza a dar forma de ste.
3. Luego de haberse realizado el moldeado se procede a sacar del molde.
4. Posteriormente de haber realizado el procedimiento anterior, ya no se
puede manipular directamente, sino que debe
hacerse por medio de pinzas.

CORTAR
COLOCAR
SACAR
Tratar que sea un
cuadrado uniforme
Sobre el molde y se le
da la forma de este.

Haciendo el uso de
pinzas y no
directamente.


12

Preparacin del medio de mantencin, segn la tabla N1 para el cultivo de
Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126, para la produccin de etanol.

1. Se inicia teniendo en cuenta la referencia de composicin de medios de
cultivo de mantencin para Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126
2. Luego de acuerdo a la tabla N 1 anterior se pesan las cantidades requeridas
de cada compuesto, con mucho cuidado, con la ayuda de la balanza
analtica.
3. Medir en un vaso de precipitados cierta cantidad de agua destilada para
diluir todos los compuestos pesados anteriormente.
4. Continuar agregando agua destilada hasta llegar a los 50 ml que se requiere.
5. Calentar con el mechero Bunsen la mezcla disuelta en el matraz; agitando
constantemente con la ayuda de una varilla de vidrio, hasta la aparicin de
la primera burbuja, a partir de lo cual se controla de 1 a 2 minutos.
6. Preparar 6 tubos de ensayo con tapa, y en caliente adicionar 7ml de la
mezcla a cada tubo con la ayuda de una pipeta de 10 ml, e inmediatamente
taparlos.
7. Colocar los tubos en un vaso de precipitado, y llevarlos a la olla a presin,
previamente aflojar las tapas, para evitar el rompimiento de tubos.
8. Calentar hasta que la temperatura alcance los 121C (hasta la primera
burbuja) y a partir de ello controlar de 15 a 20 minutos, finalizando la
esterilizacin.
9. Ajustar las tapas de los tubos estando estos aun dentro de la olla, luego
colocarlos en posicin inclinada y dejarlos a temperatura ambiente.


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Preparacin del medio de activacin, segn los la tabla N2 para el cultivo de

1. Pesar los componentes descritos en la tabla N2
2. Se esterilizan por separado el extracto de levadura y extracto de malta en
un tubo de ensayo (hasta 5 ml con agua destilada), la glucosa en un matraz
de 125 ml (con 15ml de agua destilada); esto para evitar la reaccin entre
estos dos componentes; y por ltimo las sales (tabla 04) en otro tubo de
ensayo (hasta 5 ml). Se completa en total un volumen de 25ml.
3. Esterilizar a 121C por 15 minutos
4. Previamente a la esterilizacin utilizar ajustar el pH a 4.2 de la solucin de
que contiene glucosa.
5. Mezclar todo en un matraz el mismo matraz de 125ml, en un ambiente
asptico (segn los pasos indicados).

Preparacin del medio de fermentacin, segn la tabla N3 para el cultivo de

1. Pesar los componentes descritos en la tabla N 3
2. Disolver completamente cada compuesto con agua destilada
3. Regular el pH de la solucin de sacarosa 4.2
4. Esterilizar las diluciones por separado.
5. Terminada la esterilizacin dejar enfriar y guardar en refrigeracin hasta su
posterior uso.

Regulacin de pH en Sustrato
En los medios de cultivo es deseable mantener un pH relativamente constante
durante el crecimiento microbiano, y esto se consigue mejor con el uso de
sustancias reguladoras (sustancias tampn). Estas son sales de cidos o bases
dbiles que toman o liberan iones hidrogeno a medida que cambia la
concentracin de hidrogeniones del medio, y de este modo mantienen
constante la concentracin de hidrogeniones. Existen cientos de sustancias

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tampn en potencia, pero siempre es esencial tener la seguridad de que esta
sustancia no tiene un efecto directo sobre el organismo.
Aunque los microorganismos se encuentran en hbitats de un amplio margen
de pH, el del interior de sus clulas est probablemente cerca de la
neutralidad. En un ambiente cido, el organismo puede un pH prximo al
neutral o bien no permitiendo la entrada de iones H+ o bien expulsndolos de
modo activo tan rpidamente como entran. Probablemente la pared celular
desempea tambin algn papel para mantener fuera los hidrogeniones.
Cada organismo tiene un margen de pH dentro del cual es posible su
crecimiento, y generalmente tiene tambin un pH ptimo bien definido. Los
mismos organismos, a travs de sus actividades, alteran el valor del pH de sus
ambientes.
C. CULTIVO DEL MICROORGANISMO
Inoculacin de m.o.
Su crecimiento del m.o es: Es el incremento ordenado de todos los
componentes de la clula viva, arribando a la duplicacin de todas las
estructuras, orgnulos y componentes
celulares, as como la biognesis de
mitocondrias y cromoplastos cuando
ciertos microorganismos se ven
sbitamente expuestos a las
condiciones en que dichos orgnulos
son esenciales. En la mayora de los organismos unicelulares, la reproduccin es
consecuencia del crecimiento y lleva al incremento en el nmero de individuos
de la poblacin, mientras que en los pluricelulares el crecimiento conduce al
aumento del tamao del organismo.
La figura muestra una curva general del crecimiento de un microorganismo
unicelular.

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Despus de la inoculacin de una porcin de medio con unas pocas clulas,
transcurre un perodo de tiempo (fase de latencia) antes de que se establezca
una velocidad constante de crecimiento, debido a que el microorganismo tiene
una intensa actividad metablica para adaptarse al nuevo medio de cultivo antes
de poder duplicarse. Cuando el cultivo alcanz una velocidad constante de
crecimiento se dice que est en la fase exponencial debido a que el nmero de
clulas se puede expresar como funcin de 2n, donde n es el nmero de ciclos
de duplicacin experimentado por la poblacin.
En condiciones ideales el tiempo de generacin de las bacterias puede ser de 20
minutos, de esta forma una nica clula producir 2.097.152 bacterias al cabo
de 7 horas.
Finalmente el cultivo entra en la fase estacionaria del crecimiento, en la que
permanece constante el nmero de clulas. Esta fase puede durar mucho
tiempo, por ejemplo dcadas en el caso de las bacterias endosporuladas, pero
siempre ser seguida, ms temprano o ms tarde, por la fase de muerte.
RESIEMBRA CELULAR (SOLIDO - SLIDO )

1. Para la resiembra se siguen las tcnicas de asepsia y colocando bajo
mechero con lo que se mantendr un ambiente estril.
2. El asa bacteriolgica se somete al fuego del mechero hasta alcanzar el rojo
vivo.
3. Se debe dejar enfriar por unos segundos, del tubo de ensayo que contiene
las clulas desarrolladas en medio slido, se extrae una azada, se flamea el
tubo para cerrarlo.
4. El procedimiento de resiembra se hace en los tubos de ensayos preparados
con medio slido (con agar).
5. La azada se realiza en el tubo desde adentro hacia fuera.
6. Se llevan a la incubadora a 35 C durante 48 horas. Luego se refrigera para
parar el crecimiento.


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COLOCAR
ENFRIAR
EXTRAER
FLAMEAR
En los tubos de ensayos
preparados con medio
slido (con agar)
Una azada.

Bajo el mechero hasta
alcanzar el color rojo vivo
RESEMBRAR
El asa bacteriolgica

Tubo de ensayo que contiene
las clulas desarrolladas en
medio slido
INCUBAR
A 35 C durante 48
horas

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ACTIVACIN CELULAR Y DESARROLLO DEL INCULO
Se tuvo el lugar bien desinfectado, se colocaron los mecheros se prosigue de la
siguiente manera:

1. Para la inoculacin partimos con la cepa incubada en medio slido
Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126
2. Se toma una azada y se inocula en el matraz con los 25 ml del medio de
activacin
3. Tapamos el tubo con un tapn de gasa y algodn.
4. Llevamos al Shaker a 200 rpm, T = 30 C y un t = 10 hasta alcanzar un
desarrollo celular suficiente, evidenciado por el incremento en la turbidez
del medio.
5. El procedimiento de inoculacin se har por duplicado es decir 2 azadas.

TOMAR
INOCULAR
TAPAR
SHAKER
Con un tampn
Matraz con los 25 ml. De
medio de activacin.

Una azada
Cepa incubada en medio
slido Saccharomyces
cerevisiae ATCC 4126
A 200 rpm, T = 30 C y un t =
10 hasta alcanzar un
desarrollo celular suficiente.

18

INOCULACIN AL MEDIO DE FERMENTACIN

1. Inocular los 25 ml de caldo (medio rico de activacin + biomasa) a un matraz
de 500ml conteniendo el medio definido para fermentacin. A partir de
este paso se determinar la cintica de crecimiento de la biomasa.
2. Inmediatamente despus, se extrae una muestra de 5 ml del caldo y medir
X0 y S0 con D.O.
3. Se toman las medidas de asepsia en la zona de trabajo y el encendido del
mechero.
4. La toma de muestras se inicia desde la dilucin del medio de activacin en el
medio de fermentacin.
5. Estas se realizaran cada hora y media para la primera muestra y
posteriormente cada hora de la siguiente manera:

Se extrae 5 mL del medio de cultivo, 3 mL se le agrega al tubo del
espectrofotmetro y el resto se le agrego al tubo de centrifugado.
Se mide su absorbancia a una determinada log. de onda (640nm)y pH;
luego se devuelve al tubo de centrifugado para completar los 5 ml y se
centrifuga a la mxima velocidad por 20 minutos; el sobrenadante se
vierte a los viales y se guarda en el refrigerador con el fin de despus
determinar el consumo de sustrato.


19

Sobrenadante
FLUJOGRAMA DE PROCESOS:

Inocular 25ml de
(Matraz de 500ml)
Muestra de 5ml del caldo
X
0
y S
o
con D.O
(Con medidas de asepsia y cuidado de
mechero)
Cada 1hr.
5ml de medio cultivo
3ml
2ml
Absorbancia
640nm y pH.
3ml
20 min
(Los viales)
(Refrigerador)
INOCULAR
EXTRAER
MEDIR
REALIZAR
REGISTRAR
EXTRAER
AGREGAR
ESPECTROF
OTEMETRO
MEDIR
VERTIR
CENTRIGUA
GUARDAR
INOCULAR
EXTRAER
MEDIR
REALIZAR


20

CRECIMIENTO CELULAR:
CINETICA CULTIVO CELULAR POR LOTES
Plan de Muestreos y Registro de Datos
Grupo: __________________________________ Da: ___ /___ / ___
Microorganismo: ___________________________
Fuente Carbono: ____________________________

N

HORA

TIEMPO

ABS.(640 NM)

NOMBRE DEL
ALUMNO

OBSERVACIONES


21

DETERMINACIN DE LOS RENDIMIENTOS DEL NUTRIENTE LIMITANTE EN CLULAS

Fuente de carbono y energa: SACAROSA (C
12
H
22
O
11
), M= 342 g

DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES: MTODO DEL DNS (CIDO
DINITROSALICLICO)
La preparacin del reactivo DNS se requiere de lo siguiente:
10 g/l de cido 3,5 dinitrosaliclico (DNS)
200 ml/l de NaOH 2N
300 g/l de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado

Para la preparacin de este reactivo, se disuelve el tartrato en
aproximadamente 500 o 600 ml de agua, paralelamente se disuelve el
cido DNS. Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de 1 litro y
se agita hasta la completa disolucin de todos los componentes, para
posteriormente aforar hasta un litro.
Se precisa realizar los siguientes pasos para el anlisis de la muestra:
1. Se aade un volumen del reactivo DNS a un volumen de muestra a
analizar.
2. Se mantiene la mezcla en un bao de agua a ebullicin durante 5
minutos para luego dejar enfriar.
3. Se aaden 10 volmenes de agua destilada.
4. Se lee la absorbancia a 540 nm, utilizando agua como blanco.

22

5. La concentracin se obtiene interceptando la medida de
absorbancia en la curva de calibrado.
6. La curva de calibrado para el azcar se obtiene a partir de muestras
de concentracin conocida y analizadas segn este procedimiento.

FLUJOGRAMA DEL PROCESO:

Reactivo DNS.
10 Vol. de agua destilada
Reactivo DNS. Tartrato
(Matraz aforado de 1Lt.).
SOMETER
DISOLVER
MEZCLAR
AGITAR
AADIR
DISOLVER
(Muestra a analizar)
(En aprox. 500ml).
(Completa disolucin de componentes).
ANALIZAR
Bao de agua: ebullicin-
ENFRIAR
AADIR
LEER
Absorbancia 540nm
Blanco: agua
REALIZAR
(Curva de calibrado)

23

DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN CELULAR POR D.O
El mtodo se basa en el aumento de la turbidez del medio, al
incrementarse la concentracin de microorganismos, esto puede ser
detectado fcilmente por espectrofotometra a 640 nm. Para sta
determinacin es necesario que previamente se elabore una curva de
calibrado, para lo cual las concentraciones de microorganismos en el medio
son determinadas por peso seco de acuerdo al siguiente procedimiento:
1. Se toman 4 muestras de volumen conocido, y se centrifuga a 1200
rpm. Durante 20 minutos.
2. Se elimina el sobrenadante y se re suspende el centrifugado con
tampn citrato (aprox. 3ml)
3. Se vuelve a centrifugar en las mismas condiciones a fin de eliminar
restos de sustrato que pudieran alterar la determinacin.
4. Se elimina el sobrenadante, se re disolver todo el precipitado y se seca
en la estufa a 80 C hasta peso constante.

FLUJOGRAMA DE PROCESO

CENTRIFUGA
RESUSPEND
(Mismas condiciones)
Volumen conocido
TOMAR
CENTRIFUGA (A 120 rpm por 20 min).
ELIMINAR
El sobrenadante
El centrifugado con agua
destilada
(Sobrenadante) ELIMINAR
La estufa a 80C
DISOLVER
(El precipitado)
SECAR
(Peso Constante)

24

III. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS:
PARA PREPARACIN DE SLIDO DE MANTENCIN:

Materiales y Equipos:
Balanza analtica
Matraz Erlenmeyer de 250 ml
Mechero Bunsen
Gradilla
6 Tubos de ensayo con tapas
Pipeta de 10 ml
Vaso de precipitado
Cocina a gas
Autoclave
Varilla de vidrio
Guantes
Esptula

Reactivos y nutrientes:
Agua destilada.
Extracto de levadura.
Peptona.
Extracto de malta
Agar.

PARA PREPARACIN DE MEDIO DE ACTIVACIN:
Balanza analtica
2 Matraz de 125 ml.
Una probeta de 100ml
Micropipeta

Autoclave y cocina
Balanza analtica
Micropipeta

25

Estufa
Algodn
Gasa
Varilla de vidrio
Esptula

Glucosa
Extracto de levadura
Solucin de sales
Agua destilada
Alcohol

PARA PREPARACIN DE MEDIO DE FERMENTACIN:
Matraz de 1 L
2 Matraces de 125 ml.
Varilla de vidrio
Balanza analtica
Gasa y algodn
Autoclave

Glucosa
(NH4)2SO4
KH2PO4
MgSO4.7H2O
Extracto de Levadura
Agua destilada
Alcohol
Estufa Esptula

26

PARA INOCULACIN AL MEDIO DE ACTIVACIN:
Materiales y equipos
Incubadora
Matraz de 125 ml.
Algodn
Gasa
Agua destilada
Aza bacteriolgica
Shaker
Horno esterilizador
Mechero Bunsen
Trpode y rejilla

PARA CINETICA DE CRECIMIENTO DE BIOMASA
Capachos de papel aluminio
Tubos de ensayo con tapa
Cromatgrafo de gases.
Matraz Erlenmeyer de 500ml

Piseta y agua
Shaker
Esterilizador
Aza bacteriolgica
Bunsen
Trpode y rejilla
Cromatgrafo
Tubos de ensayo
Matraz Erlenmeyer

27

IV. CRONOGRAMAS DE ACTIVIDADES Y/O TAREAS
DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTES DE Saccharomyces
cerevisiae ATCC 4126
DA ACTIVIDAD
24/09/2013 Reconocimiento de materiales
30/09/2013 Presentacin del pre-informe.
01/10/2013 Esterilizacin de material de vidrio.
Preparacin de medio de mantencin, agar
nutriente, esterilizar y refrigerar.
Preparacin Tampn pH 4.2.
Resembrado de clulas en el medio de
mantencin agar slido.
07/10/2013 Preparacin de reactivos DNS.
Obtencin de las curvas de calibrado de
azcares reductores DNS (Glucosa y
Sacarosa).Obtencin de la curva de
calibrado Etanol, cromatgrafo de gases.
10/10/2013 Preparar capachos (6unid.) Secarlos.
11/10/2013 Obtencin de la curva de calibrado de
Biomasa.
14/10/2013 Preparacin y esterilizacin del medio rico
lquido para inoculo y fermentacin.
Preparar material de vidrio estril.
15/10/2013 Inoculacin de medios y seguimiento de la
cintica de crecimiento microbiano.
Anlisis DNS y alcohol.
30/10/2013 Presentacin del informe final y
sustentacin.


28

PROGRAMACION DE CINETICA CULTIVO CELULAR POR LOTES

ACTIVIDAD
DIA Martes 15/10/2013
HORARIO
INICIO TERMINO
Preparacin de materiales para la inoculacin
en medo de activacin y el medio rico para la
cintica de fermentacin.

7:30 a.m.

8:00 a.m.
Inoculacin con aza bacteriolgica desde la
cepa en agar a medio rico de activacin.
8:00 a.m. 8:20 a.m.
Tiempo de referencia para le activacin del
inoculo en el medio de activacin.
8:20 a.m. 11:20 a.m.
Inoculacin de medios para cintica
(fermentacin)
11:20 a.m. 11:40 a.m.
Seguimiento de la cintica por cada hora
( programacin y registro de datos)
11:40 a.m. 7:40 p.m.


29

V. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
http://www.microbiologia.com.ar/bacteriologia/fisiologia.php?Mostrar=qu
imicos
QUINTEROS RAMIREZ Rodolfo, Ingeniera
Bioqumica.http://www.laboratoriosmicrokit.com/docs/..%5Cmanual%5CKit
s-C.pdf.
http://www.monografias.com/trabajos15/lactobacilos/lactobacilos.shtml
THOMAS D. BROCK, Biologa de los Microorganismos
http://es.scribd.com/doc/14173118/4-Esterilizacion-y-Preparacion-de-
Medios-de-Cultivo
http://www.ecologia.unam.mx/laboratorios/evolucionmolecular/images/fil
e/ClaseProcariontes/Alejandra/Pr%C3%A1ctica%201%20T%C3%A9cnica%20as%
C3%A9ptica.pdf


30

ANEXOS
DISEO DEL MEDIO DE ACTIVACIN Y DE FERMENTACIN
Rendimiento:

f
en biomasa %Elemento
te en nutrien %Elemento
S
X
Y
S
X

... (1)
Para fuente de carbono, fermentacin aerbica: f =0.5
Para otra fuente, f =1
Dnde:
f
en biomasa %Elemento
te en nutrien %Elemento
Y
S
X

(2)
S
X
Y
S
X

(3)
De (3):
|

i f
S
X
S S
X
Y

(4)
De (4):
Si 0
f
S . Entonces; n
Y
X
L g S
S
X
i

(5)
Para fuente en exceso, n=1.5
Para fuente limitante, n=1


31

Nota: El nutriente limitante en esta investigacin se considerar a la fuente de
nitrgeno.

Como se puede observar el nutriente MgSO
4
.7H
2
O; sirve para dos elementos Mg y S;
optando por la concentracin del Mg ya que esta concentracin satisface las dos
demandas de Mg y de S, as mismo el KH
2
PO
4
opta por la mayor concentracin del K.

PARA C
12
H
22
O
11
:

Hallamos el porcentaje de carbono contenido en la sacarosa

Pero la concentracin de carbono en la biomasa ser de:

Hallamos el rendimiento de sacarosa.

FUENTE ELEMENTO
%
CELULA
% NUTRIENTE Yx/s S (G/L)
S
(G/L)
C
12
H
22
O
11
C 45 42 0.56 3.573 5.3600
MgSO
4
.7H
2
O S 0.25 13.00 52.00 0.038 0.058
MgSO
4
.7H
2
O Mg 0.4 9.87 24.38 0.081 0.1215
(NH
4
)
2
SO
4
S 0.25 24.24 96.96 0.021 0.031
(NH
4
)
2
SO
4 lim.
N 9 21.21 2.357 0.849 0.849
KH
2
PO
4
K 0.5 28.68 57.36 0.035 0.053
KH
2
PO
4
P 2 22.79 11.4 0.175 0.2625

32

Una vez hallado el rendimiento procedemos a hallar la cantidad de
sacarosa que debemos utilizar para definir el medio de cultivo.

Asumiendo que la produccin de biomasa sea de 2 g/l.

Pero como el medio est definido por el nitrgeno como sustrato
limitante, colocamos un exceso del 50% a las dems fuentes.

PARA KH2PO4:

Para el K

Hallamos el porcentaje de potasio contenido.

Pero la concentracin de potasio en la biomasa ser de:

Hallamos el rendimiento.


33

potasio que debemos utilizar para definir el medio de cultivo.



Para el P

Hallamos el porcentaje de fsforo contenido.

Pero la concentracin de fsforo en la biomasa ser de:


34


fsforo que debemos utilizar para definir el medio de cultivo.



PARA (NH4)2SO4:

Para el N

Hallamos el porcentaje de nitrgeno contenido.

Pero la concentracin de nitrgeno en la biomasa ser de:


35


nitrgeno que debemos utilizar para definir el medio de cultivo.


Para el S

Hallamos el porcentaje de azufre contenido.

Pero la concentracin de azufre en la biomasa ser de:



36

Una vez hallado el rendimiento procedemos a hallar la cantidad de azufre
que debemos utilizar para definir el medio de cultivo.


Pero como el medio est definido por el nitrgeno como sustrato limitante,
colocamos un exceso del 50% a las dems fuentes.

PARA MgSO4.7H2O:

Para el Mg

Hallamos el porcentaje de magnesio contenido.

Pero la concentracin de magnesio en la biomasa ser de:



37

nitrgeno que debemos utilizar para definir el medio de cultivo.



Para el S

Hallamos el porcentaje de azufre contenido.

Pero la concentracin de azufre en la biomasa ser de:



38

azufre que debemos utilizar para definir el medio de cultivo.




39

REFERENCIAS DE COMPOSICION DE MEDIOS DE MANTENCION,
ACTIVACION Y CULTIVO DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE

MEDIO NUTRIENTE CONCENTRACION
(g/L)
Solidos de mantencin
(YM solido)
Peptona
Extracto de malta
Agar
Glucosa
3
5
3
20
10
Activacin Glucosa
Extracto de malta
Solucin de sales

T 35C, 200 rpm
10
3
5
5 ml/L
Fermentacin Sacarosa
(NH
4
)
2
SO
4

kH
2
PO
4

MgSO
4
.7H2O
Solucin de sales

Tampn Citrato pH 4.2
%
5.36
1.8
0.849
0.2625
0.1215
10 ml/L

100 ml/L

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Universidad Nacional del Santa 2013

NUTRIENTE CONCENTRACIN (G/L)

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