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Citometra de Flujo:

Introduccin, Aplicaciones, Clnica,


Investigacin y Cncer
T.M. MsSc (c) Juan Luis Castillo N.
Centro de Diagnstico Onco-inmunolgicoLtda.
Laboratorio de Citometra de Flujo
Hospital del Trabajador, Concepcin, Chile.
Concepcin, 16 de Agosto de 2004
Qu es la Citometra de Flujo?
Aplicaciones
Flow Cytometry Publications/year
YEARS
0 0
300 300
600 600
0
13
28
79
113
223
480
611
811
940
2,332
1976 1977 1978 1979 1980 1981 1982 1983 1984 1985 1986 1987 1988 1991 1992 1989 1990 1993 1994
(*) Data taken from Medline search using the keywords: flow Cytometry
(Agost 15
th
: 20:30 hrs)
1995 1996
3,483
3,479
2003: 5.588
2004: 3.205 (*)
1999: 4.256
1998: 3.889
1997: 3.613
2002: 5.323
2001: 5.025
2000: 4.771
3345
2899
2,713
Papers
2,445
2700
2400
2100 2100 1,855
1800 1800
1,494
1500 1500
1,232
1,078
1200 1200
900 900

QUE ES LA
QUE ES LA
CITO / METRIA
CITO / METRIA
DE FLUJO
DE FLUJO
?
?
La Citometra de Flujo es una
tecnologa que permite la
medicin simultnea de
mltiples caractersticas fsicas y
qumicas de clulas en
suspensin
QUE INFORMACION ENTREGA UN
CITOMETRO DE FLUJO SOBRE UNA
CELULA?
1.- Su tamao.
2.- Su granularidad o complejidad
interna.
3.- Evaluacin de caractersticas qumicas:
Fluorocromos
Anticuerpos conjugados con fluorocromos
FACS: Fluorescence activated cell sorter
Relative Sizes of Biologicals
Amoeba
Lymphocyte
S.aureus
5-8 m
1 m
15-30 m
Componentes
Sistema de Fluidos
Sistema Optico:
Fuente de luz
Separacin espectral
Sistema Electrnico:
Control mecnico, de luz y detectores
Coleccin y anlisis de pulsos
Sistema Informtico:
Anlisis y presentacin de datos
Flow Cell
Injector
Tip
Fluorescence
Fluorescence
signals
signals
Focused laser
Focused laser
beam
beam
Sheath
fluid
SISTEMAS DE UN CITOMETRO
SISTEMAS DE UN CITOMETRO
DE FLUJO
DE FLUJO
Sistema Optico:
Consta de uno o varios lseres,
filtros, lentes y fotomultiplicadores.
El lser produce una luz
monocromtica utilizada para la
excitacin de los fluorocromos.
Laser
Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation
PMT
PMT
PMT
PMT
Dichroic
Filters
Bandpass
Filters
Laser
1
2
3
4
Flow Cytometry Optics
Flow Cytometry Optics
Flow cell
Lasers
Argon laser
He-Ne Laser
Optical Collection systems
He-Cd Laser
Argon Laser
He-Ne Laser
2
nd
Argon Laser
Elite Cytometer with 4 Lasers
Water cooled
argon laser
He-Cd laser
Air-cooled argon
laser
Santa clause
ANTICUERPOS
MONOCLONALES
Gran
disponibilidad
comercial
Gran variedad de
fluorocromos
Precios accesibles
Pedidos va Internet
Gran Calidad
FLUOROCROMOS
FLUOROCROMOS
Fluorescein (FITC)
Emisson Excitation
400 nm 500 nm 600 nm 700 nm
Wavelength
300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm
Relative Intensity
Protein
Phycoerytherin (PE)
Excitation Emisson
300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm
Protein
Propidium Iodide
Emisson
Excitation
400 nm 500 nm 600 nm 700 nm
300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm
Relative Intensity
DNA
Allophycocyanin (APC)
Protein 632.5 nm (HeNe)
300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm
Excitation
Emisson
CITOMETRIA DE FLUJO
CITOMETRIA DE FLUJO
PREPARACION
DE LA MUESTRA
OBJETIVO: SUSPENSION CELULAR
CITOMETRIA DE FLUJO CITOMETRIA DE FLUJO
CITOMETRIA DE FLUJO
PREPARACION DE LA MUESTRA
Procedimiento St.:
100 L de sangre total
10 L del Ac. conjugado
Incubar por 10-15 minutos RT
Aade el lisador
Leer en un citmetro de flujo
PROCESO DE ANALISIS DE
UNA MUESTRA
CALIBRACION
ADQUISICION
ANALISIS
FITC Fluorescence
Mo1
CD4
CD8
CD8
CD45
leu11a
CD20
T
u
b
e

I
D
FORMA DE PRESENTACION
DE DATOS
Histograma
Grfico de Puntos (Dot Plot)
Grfico de Contorno (Countour Plot)
Grfico Isomtrico (3D)
Grfico de Densidad (Density Plot)
Citometra de flujo: mediciones
GATE
L
M
G
SCATTER FLUORESCENCIA IMAGEN
Density Dot Plot Contour Plot
Color of dots can give indication Identify subpopulations
of frequency of events with proper contour lines
HISTOGRAMA
(Un Parmetro)
c
o
u
n
t
s
Autofluorescencia
y/o
control isotipo
M1
0
FL1
One parameter frequency histogram
# of events for
particular
parameter
establish regions and calculate coefficient of variation (cv)
cv = stdev/mean of half peak
ESTADISTICA DE
CUADRANTES
(Dos Parmetros)
Autofluorescencia
y/o
control isotipo
F
L
2
0
FL1
ESTADISTICA DE
CUADRANTES
(Dos Parmetros)
+,-
4
+,+
2
-,+
1
F
L
2
-,-
3
0
FL1
CITOMETRIA DE FLUJO:
APLICACIONES
Toxicologa
Microbiologa
Parasitologa
Citogentica
Virologa
. . . . . . . . .
Hematologa
Inmunologa
Patologa
Transplantes
Farmacologa
Biologa
EVOLUCION DE LA
CITOMETRIA DE FLUJO
Inmunologa Celular
Aplicaciones en
Patologa
Anticuerpos
Monoclonales
Citometra de
Flujo
CITOMETRIA CLINICA
CITOMETRIA DE FLUJO:
Aplicaciones Clnicas ms Frecuentes
Determinacin de Subpoblaciones Linfocitarias
Inmunofenotipificacin de Leucemias y Linfomas
Estudio de Ploidia de ADN y Ciclo Celular
Estudio de macrfagos intestinales (EII).
Estudio de Funcin Neutroflica (estallido respiratorio,
fagocitosis, etc.)
Oncogenes (p53, PCNA, Ki67, k-ras, etc.)
Cuantificacin de molculas
Estudio de Clulas Progenitoras (CD34)
Estudios de Funcin Plaquetaria
Estudios de Resistencia a Drogas
Estudio de Citokinas Intracelulares
SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS
Linfocitos T totales :CD3(+)
Linfocitos T Helper :CD3(+)CD4(+)
Linfocitos T Sup/Citot :CD3(+)CD8(+)
Linfocitos B :CD3(-)CD19(+)
Linfocitos Natural Killer (NK) :CD3(-)CD16(+)CD56(+)
Relacin Linfocitos T CD4/CD8
Infeccin VIH-SIDA
File: 111.003
Acquisition Date: 23-Apr-
Gate: G6
Gated Events: 12430
Total Events: 15000
Quad Events % Gated% Total
UL 20 0.16 0.13
UR 1496 12.04 9.97
LL 2028 16.32 13.52
LR 8886 71.49 59.24
RELACION CD4/CD8 = 0.17
File: 111.004
Acquisition Date: 23-Apr-
Gate: G6
Gated Events: 12512
Total Events: 15000
Quad Events % Gated% Total
UL 600 4.80 4.00
UR 8866 70.86 59.11
LL 1499 11.98 9.99
LR 1547 12.36 10.31
EXAM EN R ESU LTAD O R AN G O R EFER EN CIA
LE U C O C ITO S TO TA LE S 8.500 x m m
3
LIN FO C ITO S A B SO LU TO S 2.295 x m m
3
LIN FO C ITO S T (C D 3) 1.916
83.50
x m m
3
% 59.4 - 84.6 %
LIN FO C ITO S B (C D 19) x m m
3
% 6.4 - 22.6 %
LIN FO C ITO S T (C D 4) 12.04
276
%
x m m
3
28.5 - 60.5 %
LIN FO C ITO S T C IT/SU P (C D 8) 70.86
1.626
%
x m m
3
11.1 - 38.3 %
R E LA C IO N T C D 4 / C D 8 0.17 1.2 - 2.1
C E LU LA S LIN FO ID E S N K
(N A TU R A L K ILLE R )
x m m
3
%
INFECCION VIH SIDA
ACTIVACION DE LINFOCITOS T: CD38
El aumento en la expresin de molculas CD38 en LT
CD8 es un fuerte indicador pronstico de progresin
hacia SIDA y muerte.
Superior a:
Rto. LT CD4
Marcadores solubles
Combinacin HLA-DR+ CD38+
J. Acquir Immune Defic Syndr Retrovirol 16:83-92, 1997
Cytometry 26:1-7, 1996
Cytometry 33:115-122, 1998
INFECCION VIH SIDA
GIORGI et al.
Carcaterizaron el nmero de molculas CD38 en LT CD8:
1.- < 2.470 =======> PROGRESOR LENTO
2.- 2.470 - 3.899====> PROGRESOR BAJO
3.- 3.900 - 7.250====> PROGRESOR ALTO
4.- > 7.250 =======> PROGRESOR RAPIDO
Basado en la probabilidad de desarrollar SIDA dentro de 3
aos
Cytometry 33:123-132, 1998
J. Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol 16:83-92, 1997
Copyright Dennis Kunkel
Copyright Dennis Kunkel
CITOMETRIA DE FLUJO:
Aplicaciones Clnicas ms Frecuentes
Determinacin de Subpoblaciones Linfocitarias
Inmunofenotipificacin de Leucemias y Linfomas
Estudio de Ploidia de ADN y Ciclo Celular
Estudio de macrfagos intestinales (EII).
Estudio de Funcin Neutroflica (estallido respiratorio,
fagocitosis, etc.)
Oncogenes (p53, PCNA, Ki67, k-ras, etc.)
Cuantificacin de molculas
Estudio de Clulas Progenitoras (CD34)
Estudios de Funcin Plaquetaria
Estudios de Resistencia a Drogas
Estudio de Citokinas Intracelulares
INMUNOFENOTIPIFICACION
DE LEUCEMIAS
Los distintos tipos de leucemias son un
grupo heterogneo de patologas
resultantes de una proliferacin
descontrolada de una o ms tipos
celulares hematopoyeticos tanto en
mdula sea como sangre perifrica
HEMATOPOYESIS
STEM CELL
CFU-ML
CFU-GEMM
LINFOCITO B
LINFOCITO T
CFU
ERITROIDE
MEGACARIOCITO
CFU
BASOFILO
CFU
EOSINOFILO
CFU-GM
ERITROCITO BASOFILO EOSINOFILONEUTROFILO
CFU-L
PLAQUETAS MONOCITO
RETENCION DE ANTIGENOS
Clulas malignas frecuentemente
conservan antgenos asociados con la
clula normal a partir de la cual fueron
derivados
CD19 CD19
Transformacin
Maligna
CELULA
PRE-B NORMAL
CELULA
LEUCEMICA
CLASIFICACION INMUNOFENOTIPICA (LA)
LLA-B :
-BI-pro B: CD79a y/o CD22 Y/o CD19.
-BII Comn : CD10.
-BIII Pre B: clg.
-BIV Madura : slg
LLA-T :
-TI-proT: CD7
-TII-pre T: CD2 y/o CD5 y/o CD8
-TIII-Cortical: CD1a
-IIV-Madura: CD1a y CD3mb
LMA :
-LMA-M6 : glicoforina A
-LMA-M7 : CD61, CD41, CD42b
-LMA-M3 : HLA-DR(-)
-LMA-M4 : HLA-DR(+)
Caractersticas normales
Paciente sexo masculino
43 aos
Dgto. Leucemia Aguda
Leucemia
Linfoblstica
De Lnea B
(B-II:Comn)
CITOMETRIA DE FLUJO:
Aplicaciones Clnicas ms Frecuentes
Determinacin de Subpoblaciones Linfocitarias
Inmunofenotipificacin de Leucemias y Linfomas
Estudio de Ploidia de ADN y Ciclo Celular
Estudio de macrfagos intestinales (EII).
Estudio de Funcin Neutroflica (estallido respiratorio,
fagocitosis, etc.)
Oncogenes (p53, PCNA, Ki67, k-ras, etc.)
Cuantificacin de molculas
Estudio de Clulas Progenitoras (CD34)
Estudios de Funcin Plaquetaria
Estudios de Resistencia a Drogas
Estudio de Citokinas Intracelulares
Cellular Function
Phagocytosis
Killing index of phagocytes
Intracellular cytokines
Calcium flux
Oxidative burst
Membrane potential
Phagosome
O
2
O
2
-
H
2
O
2
NADPH + H
+
NADP
+
HMP
NADPH
Oxidase
GSSG
GSH
GR
GP
H
2
O
2
SOD
O
2
-
H
+
H
2
O
Catalase
H
2
O + O
2
PCB
SOD
PCB
(Reduced GSH level)
PKC
(PMA)
?
?
+
O
2
-
OH
.
Lipid Peroxidation
Phospolipase A2 activity
Leukotrienes
H
2
O
2
Human Neutrophil
Stimulant
PCB
DCFH-DA DCFH
DCF
DCF
COOH
H
Cl
O
O-C-CH3
O
CH3-C-O
Cl
O
COOH
H
Cl
OH HO
Cl
O
COOH
H
Cl
O HO
Cl
O
Fluorescent
Hydrolysis
Oxidation
2,7-dichlorofluorescin
2,7-dichlorofluorescin diacetate
2,7-dichlorofluorescein
Cellular Esterases
H
2
O
2
DCFH-DA
DCFH DCFH- -DA DA
DCFH DCFH
DCF
H O H O
2 2 2 2
Lymphocytes
Monocytes
Neutrophils
log FITC Fluorescence
.1
1000 100 10 1
0
20
40
60
c
o
u
n
t
s
PMA-stimulated PMN
Control
80
Adulto normal
No estimulado :
Estimulado con PMA :
25.86 %
76.98 %
Estallido respiratorio en Granulocitos
No estimulado
Estimulado
Estallido respiratorio
Caso clnico:
Paciente de sexo femenino
8 aos
Infecciones drmicas recurrentes por S.aureus.
Granulomas fros en cara y piernas
Dficit parcial de IgA.
Evaluacin de estallido respiratorio en
granulocitos y monocitos.
Inicio de terapia antibitica con claritromicina
250 mg/12 hrs por 30 das.
Evaluacin de estallido respiratorio en
granulocitos y monocitos, post terapia.
DCFA DCFA
Despus de terapia antibitica
Estallido respiratorio en Granulocitos
No estimulado:
33.35 %
Estimulado:
42.66 %
No estimulado:
68.97 %
Estimulado:
57.48 %
DCFA DCFA
DCFA DCFA
DCFA
Estallido respiratorio en Monocitos
No estimulado:
25.97 %
Estimulado:
57.06 %
No estimulado:
76.26 %
Estimulado:
76.81 %
Despus de terapia antibitica
DCFA
CITOMETRIA DE FLUJO:
Aplicaciones Clnicas ms Frecuentes
Determinacin de Subpoblaciones Linfocitarias
Inmunofenotipificacin de Leucemias y Linfomas
Estudio de Ploida de ADN y Ciclo Celular
Estudio de macrfagos intestinales (EII).
Estudio de Funcin Neutroflica (estallido respiratorio,
fagocitosis, etc.)
Oncogenes (p53, PCNA, Ki67, k-ras, etc.)
Cuantificacin de molculas
Estudio de Clulas Progenitoras (CD34)
Estudios de Funcin Plaquetaria
Estudios de Resistencia a Drogas
Estudio de Citokinas Intracelulares
Diagnstico Serolgico por Citometra de Flujo.
Bacterias: Uso de Microesferas (beads)
*
*
+
Anti Ig humana
conjugada
*
Ag
+
bead
Suero
paciente
Clin. Microbiol. Rev 2000;13:167-195
J. Clin. Microbiol.. 1998;36:802-806
Cytometry 1994;18:103-108
Aplicaciones en
Microbiologa
Aplicaciones en Microbiologa clnica
Deteccin directa:
Bacterias
Hongos
Parsitos
Virus
Light Scatter of Bacterial Spores
B.anthracis
B.subtilis
irradiated B.anthracis
SS
FS
Light scatter signals from a mixture of live B.anthracis spores,
live B. subtilis spores and gamma irradiated B. anthracis spores.
Microbial Identification Using Antibodies
Enumeration & identification of target organisms in
mixed populations
Examples include:
Legionella spp. in water cooling towers
Cryptosporidium & Giardia in water reservoirs
Listeria monocytogenes in milk
E.coli O157:H7 in contaminated meat
Bacillus anthracis & Yersinia pestis biowarfare agents
Agentes antibacterianos:
Microbiologa tadicional (18-24 horas)
Citometra de flujo (pocas horas)
Evaluacin de parmetros metbolicos:
Potencial de membrana
Tamao celular
Cantidad de ADN
Pruebas de suceptibilidad:
Efecto bacteriosttico
Efecto bactericida
Susceptibilidad bacteriana: FSC/SSC
Universidad de Concepcin, Chile
Hospital del Trabajador Concepcin, Chile
In vitro STUDIES OF pH EFFECT UPON MEMBRANE COMPONENTS, SHAPE AND
SIZE OF Helicobacter pylori: EPIFLUORESCENCE AND FLOW CYTOMETRY STUDIES.
pH 3
pH 7
pH 10
pH 3
pH 7
pH 10
Strain ATCC43504
Strain 747
LO-Skolen, Helsingr, Denmark, July 4-7, 2002
Susceptibilidad bacteriana
Combinacin de:
Tamao (FSC)
Granularidad (SSC)
Fluorescencia:
Fluorocromos para ADN y ARN
Fluorocromos para ensayos metablicos:
Unin a protenas
Potencial de membrana
Clin. Microbiol. Rev 2000;13:167-195
Cytometry 1997;27:169-178
dep.
pol.
dep.
pol.
pol.
dep.
S. aureus
Depolarizacin
en 1 hora.
Potencial
demembrana
permanece
disminuido.
Antimicrob Agents Chemother 2000:44;827-834
CITOMETRIA DE FLUJO:
Gastroenterologa y Cncer
Inmunologa y plipos de colon.
Enfermedad Inflamatoria Intestinal.
Tumores slidos:
Ciclo celular y Ploida de ADN.
Protenas del ciclo celular
Oncogenes
Cncer de Esfago
Linfoma
ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL
Espectro de presentacin.
Enfermedad de Crohn
Colitis ulcerosa
Alteracin de la inmunoregulacin
de mucosa intestinal
Inflamacin persistente y/o recurrente
Granulomatosa
Congestin ulcerativa
Cncer
ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL
Enfermedad de Crohn
Colitis ulcerosa
Estudios celulares de mucosa intestinal (CF):
Clulas epiteliales C.P.A.
Macrfagos Moduladores
Linfocitos: TCD4 Perpetuacin
Induction and Modulation of Gastrointestinal Inflamation
FALK Symposium 104, Amsterdam, 1999.
ENFERMEDAD DE CROHN
COLITIS ULCEROSA
Proceso inflamatorio
difuso continuo, limitado
al colon
Afecta a todo el tracto
digestivo
Inflamacin superficial
de la mucosa
Proceso transmural y
granulomatoso
Presencia de
pseudoplipos
Compromiso de mucosa
discontinuo
Colon normal
Crohn
Crohn
C.U.
Macrfagos intestinales:
Estn localizados en la regin subepitelial de la mucosa.
Constituyen entre 10 a 20% de las clulas mononucleares
de la lamina propia.
Deteccin de su fenotipo:
Inmunohistoqumica
Citometra de Flujo
Existe diferencia entre las poblaciones de macrfagos
encontrados en mucosa de EII y en personas que no la
presentan
Fiocchi C. AmJ Physiol.1997,273:G769-75
Young HE et al. Dev Dyn.1995;202:137-44
Pacientes:
UNIVERSO (n=70)
SOSPECHA CLINICA (+)
ENDOSCOPIA (+) (n = 52)
GRUPO
TESTIGO
(n = 18)
HISTOLOGIA
NO ESPECIFICA
(n = 38)
EII POR BIOPSIA
(n = 14)
Mtodo
Dgto. de EII:
Clnico, endoscpico
e histolgico
Grupo de EII
Controles clnicos
regulares
Grupo testigo
Criterio de
Exclusin
Consentimiento
informado
Endoscopa
HLA-DR
CD33
CD16
CD33
Materiales y Mtodos
Biopsia
2 x 2 mm Disgregacin
mecnica
30` oscuridad
FACSCalibur
Software Cell-Quest
v.3.3
Mnimo de 10000
eventos
Pacientes segn fenotipo HLA-DR en MI y
diagnstico de EII
Fenotipo MI
EII-CH
100 (14)
0 (0)
100 (14)
p<0.001
Testigo
11.11 (2)
88.89 (16)
100 (18)
Total
65.71 (46)
34.29 (24)
100 (70)
HLA-DR(+)
HLA-DR(-)
Total
Sospecha Clnica
HNC
78.94 (30)
21.06 (8)
100 (38)
p<0.001
Subtotal
84.61 (44)
15.39 (8)
100 (52)
p<0.001
HNC: Histologa no concluyente
EII-CH: EII con confirmacin Histolgica
Chi Cuadrado con correccin de Yates p < 0.001
Fenotipo MI
EII-CH
85.71 (12)
14.29 (2)
100 (14)
P>0.05
Testigo
55.55 (10)
44.45 (8)
100 (18)
Total
74.28 (52)
25.72 (18)
100 (70)
CD16 (+)
CD16 (-)
Total
Pacientes segn fenotipo CD16 en MI y
diagnstico de EII
HNC
78.94 (30)
21.06 (8)
100 (38)
p<0.05
Subtotal
80.76 (42)
19.24 (10)
100 (52)
p<0.05
Sospecha Clnica
HNC: Histologa no concluyente
EII-CH: EII con confirmacin Histolgica
Chi Cuadrado con correccin de Yates p < 0.05
Especificidad
88.9
88.9
88.9
VPN
66.7
66.6
100
VG
85.7
82.0
93.7
Sospecha
clnica
HNC
EII-CH
Indices de validacin para HLA-DR en EII
Sensibilidad
84.6
78.9
100
VPP
95.7
93.7
87.5
HNC: Histologa no concluyente
EII-CH: EII con confirmacin Histolgica
VPP: Valor predictivo positivo
VPN: Valor predictivo negativo
VG: Valor Global
Especificidad
44.4
44.4
44.4
VPN
44.4
50.0
80.0
VG
71.4
67.85
62.5
Sospecha
clnica
HNC
EII-CH
Indices de validacin para CD16 en EII
Sensibilidad
80.8
78.9
85.7
VPP
80.8
75.0
54.5
HNC: Histologa no concluyente
EII-CH: EII con confirmacin Histolgica
VPP: Valor predictivo positivo
VPN: Valor predictivo negativo
VG: Valor Global
CITOMETRIA DE FLUJO:
Gastroenterologa y Cncer
Inmunologa y plipos de colon.
Enfermedad Inflamatoria Intestinal.
Tumores slidos:
Ciclo celular y Ploida de ADN.
Protenas del ciclo celular
Oncogenes
Cncer de Esfago
Linfoma
ANALISIS CITOMETRICO DE TUMORES SOLIDOS
Tejido fresco o congelado.
Tejido fijado en formalina -
desparafinado.
Concordancia : 90 %.
ANALISIS CITOMETRICO DE TUMORES SOLIDOS
TEJIDO FRESCO
Ventajas :
- Clulas enteras ( ADN, Ags. de membrana y citoplasma ).
- Menor debris ( mejor resolucin del histograma ).
Desventajas :
- No es posible la localizacin histolgica de reas
de inters.
- Proceso inmediato o congelacin.
Rev. Md. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999
ANALISIS CITOMETRICO DE TUMORES SOLIDOS
TEJIDO FIJADO EN FORMALINA Y DESPARAFINADO
Ventajas :
- Seleccin histolgica de reas de inters.
- Permite estudio retrospectivo en individuos de curso clnico
conocido.
Desventajas :
- Ncleos desnudos.
- Fijacin en formalina o microondas.
- Mayor debris.
Rev. Md. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999
ESTUDIO DE PLOIDIA DE
ADN Y CICLO CELULAR
Se evala el contenido relativo de ADN en el
ncleo de una clula normal o neoplsica.
Se obtiene una estimacin de las fases del
ciclo celular.
Se utilizan sustancias fluorescentes que tiene
afinidad con el ADN (PI, DAPI, BrEt).
Rev. Md. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999
J.L.C.N.
CICLO CELULAR
CICLO DE VIDA DE UNA CELULA (24HRS)
MITOSIS
M
1 hr
G2(4n)
G0 (2n)
9 hr
4 hr
Post Sntesis DNA
10 hrs
Sntesis ADN S G1 (2n) Pre-sntesis ADN
Rev. Md. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999
HISTOGRAMA DE ADN
OBSERVADO
4n 2n
FASES G0G1
N
U
M
E
R
O

D
E

C
E
L
U
L
A
S
FASE S
FASES G2+M
CONTENIDO DE ADN
Rev. Md. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999
Histograma Diploide o Normal
Histograma Aneuploide
Conferencia de Consensos en Citometra del ADN
Octubre de 1992. Cytometry 14:471-7, 1993.
La ploida del ADN se expresa como Indice de ADN ( IA ):
IA = G0G1 poblacin en estudio
G0G1 poblacin de referencia
Poblacin de referencia : tejido normal del cual se
origina el tumor en estudio.
Rev. Md. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999
Conferencia de Consensos en Citometra del ADN
Octubre de 1992. Cytometry 14:471-7, 1993.
IA = 1 ADN diploide.
IA > 1 ADN aneuploide.
Rev. Md. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999
ANALISIS CITOMETRICO DE TUMORES SOLIDOS
ANEUPLOIDIA
Grado de malignidad
Pronstico
Invasin
Metstasis
Evolucin natural
Respuesta a tratamiento
Rev. Md. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999
ANALISIS CITOMETRICO DE TUMORES SOLIDOS
PROLIFERACION CELULAR
Tiempo libre de enfermedad.
Sobrevida.
Conferencia de Consensos en Citometra del ADN
Octubre de 1992. Cytometry 14:471-7, 1993.
Proliferacin Celular :
Fraccin Fase S tiene valor predictivo positivo
S+G2M no debera usarse.
Fraccin Fase S especfica de clulas tumorales
es el parmetro citomtrico ms relevante como
factor pronstico independiente.
Rev. Md. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999
ESTUDIO DE PLOIDIA DE
ADN Y CICLO CELULAR
Estudio del comportamiento biolgico de poblaciones
celulares dentro de un tumor.
Determinacin de Fraccin proliferativa (Fases S +
G2M) de una poblacin celular.
Pronstico y sobrevida de pacientes afectados de
cncer.
Estudios de viabilidad.
Apoptosis.
Aplicaciones:
Rev. Md. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999
MUESTRAS USADAS PARA ANALISIS DE
PLOIDIA DE ADN Y CICLO CELULAR POR
CITOMETRIA DE FLUJO
I Suspensiones Celulares:
Lneas Celulares.
Sangre Perifrica
Mdula Osea
Fludos con alta celularidad (Liq. asctico,
peritoneal, etc.)
II Tumores Slidos:
Tejido slido
Aspirado Celular
III Tejidos Embebidos en Parafina
Rev. Md. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999
Resultados en Cncer Gstrico Avanzado :
PLOIDIA
FASE S
Cuadernos Chilenos de Ciruga N40, 1996: 166-174
Fase S
es un factor pronstico independiente
en Cncer gstrico Avanzado
Cuadernos Chilenos de Ciruga N40, 1996: 166-174
ESOFAGO
Mucina 1
Ciclo celular
Ploida de ADN
p53
Carcinoma
superficial de
clulas escamosas
Marcadores
pronsticos
Endoscopy 2001;33(1):1-7
Int J Cancer 1999;84(3):251-7
Cancer 1999:85(11):2322-8
LINFOMA
Poblaciones Linfoides T
Poblaciones Linfoides B:
Expresin de cadenas livianas tipo kappa
Expresin de cadenas livianas tipo lambda
Ausencia de otros marcadores (CD5, CD10, CD34)
Helicobacter pylori
MALT
Hematology 2001
BMC Gastroenterology 2 (WWW.biomedcentral.com/1471-230x/2/6)
?
Disponible en:
www.oncoinmun.co.cl
Citometra de Flujo:
Introduccin, Aplicaciones, Clnica,
Investigacin y Cncer
T.M. MsSc (c) Juan Luis Castillo N.
Centro de Diagnstico Onco-inmunolgicoLtda.
Laboratorio de Citometra de Flujo
Hospital del Trabajador, Concepcin, Chile.
Concepcin, 16 de Agosto de 2004