http://www.ncbi.nlm.nih.

gov/pmc/articles/PMC3838382/#__abstractid1064046title
La hibridacin basada en la deteccin de Helicobacter pylori en la
temperatura del cuerpo humano, utilizando cido nucleico (LNA)
Sondas Locked avanzadas
Slvia Fontenete ,
1,2,3,4
Nuno Guimares ,
1,2,3
Marina Leite ,
2
Cu Figueiredo ,
2,5
Jesper Wengel ,
3
y Nuno
Filipe Azevedo
1, *

Rakesh N. Veedu, Editor
Informacin Autor notas Artculo de copyright y licencia informacin
Este artculo ha sido citado por otros artculos de PMC.
Resumen
Ir a:
Introduccin
El microbioma humano siempre se ha estudiado para una mejor comprensin de
su influencia sobre el desarrollo humano, la fisiologa, la inmunidad y la
nutricin [ 1 ]. En la mayora de estos estudios, los mtodos de identificacin
microbianos se basan en la recogida de muestras seguido por el aislamiento y
secuenciacin del ADN [ 2 , 3 ]. A pesar de que proporciona informacin
importante sobre las comunidades que habitan en el cuerpo humano, estos
mtodos alteran la estructura espacial de la muestra, lo que significa que la
informacin importante acerca de humano / microorganismo o interacciones
microorganismo / microorganismo podra perderse. Adems, el tiempo necesario
para procesar una muestra es bastante largo, por lo que estos mtodos menos
adecuados como una rutina de diagnstico. Por lo tanto, nuevos mtodos que son
capaces de hacer frente a estas deficiencias, al permitir la visualizacin directa de
los microorganismos y los consorcios microbianos (por ejemplo biofilms) en el
cuerpo humano y en un corto perodo de tiempo, sera muy valiosa.
La hibridacin fluorescente in situ (FISH), utilizando sondas de ADN se ha
utilizado para detectar y localizar rpidamente las clulas microbianas en
muestras clnicas humanas [ 4 , 5 ]. Sin embargo, este mtodo nunca se emple
para detectar microorganismos dentro del cuerpo humano (o de otros animales de
orden superior). La aparicin de una nueva variante de FISH, aqu denominado
como fluorescencia de hibridacin in vivo de microorganismos (FIVH), sobre
todo se ha visto obstaculizado por dos factores. El primero fue la falta de
sistemas adecuados que fueron capaces de detectar seales de fluorescencia
dentro del cuerpo humano. Este problema se ha superado recientemente, con la
llegada de dispositivos mdicos con sistemas avanzados de imgenes
incorporadas, tales como la endomicroscope confocal que permite un anlisis en
profundidad de la mucosa del estmago [ 6 ] o de colon [ 7 ]. Hasta ahora, este
dispositivo ha permitido slo con xito la deteccin de microorganismos en el
tracto gastrointestinal-humano utilizando mtodos de tincin no especfica
[ 8 , 9 ]. El segundo factor es la falta de control sobre el proceso FIVH, ya que
tiene que llevarse a cabo bajo las condiciones impuestas por el microambiente en
el que el microorganismo se encuentra. Para los microorganismos presentes en la
mucosa del estmago humano, por ejemplo, el mtodo tendra que ser llevado a
cabo a 37 C y un pH bajo.Agregando a que, sondas de ADN tendran que
resistir la degradacin por nucleasas [ 10 ].
Las razones antes mencionadas hacen que sea muy poco probable que un mtodo
de ADN FIVH funcione, pero la evolucin de la qumica del cido nucleico
permitieron el desarrollo de variaciones qumicas (de la base nitrogenada, azcar
y / o redes troncales de fosfato) de cidos nucleicos que pueden reemplazar el
ADN como una sonda. De hecho oligonucletidos modificados, tales como los
cidos nucleicos bloqueados (LNA) o ARN 2'-O-metilo (2'OMe), se han
demostrado in vivo para hibridar con cidos nucleicos nativos con efectos txicos
baja [ 11 - 15 ], y estn por lo tanto, buenos candidatos para desarrollar un mtodo
exitoso FIVH.
LNA es un anlogo de cido nucleico con sensibilidad y especificidad de unin
hacia los objetivos de ADN o ARN complementarias [ 16 ]. LNA contiene un
anillo de ribosa bloqueado por un enlace O2'-C4 '-metileno dando como resultado
un tipo N (3-endo) conformacin ( Figura 1 ) [ 17 , 18 ]. LNA se hibrida con una
alta afinidad hacia ARN (y ADN) secuencias complementarias de acuerdo a las
reglas de apareamiento de bases de Watson-Crick, tiene una alta resistencia a la
degradacin por nucleasa (alta estabilidad bio-), es totalmente soluble en agua, y
mostrar una baja toxicidad general de los animales
[ 14 , 16 , 18 ].Oligorribonucletidos 2'-O-metil-ARN base (2'OMe) ( Figura 1 )
constituyen otro anlogo de cido nucleico que se utiliza como una sonda de
diagnstico en las clulas animales [ 19 - 21 ]. El grupo 2'OMe induce afinidad
relativamente alta hacia un objetivo probable debido a la ARN C
3
'endo
conformacin adoptada por 2'OMe azcares ribosa [ 22 ]. El uso de monmeros
2'OMe aumenta bioestabilidad de sonda, mejora la especificidad y la cintica de
hibridacin y permite la orientacin en condiciones en las sondas de ADN
normalmente no hibridar [ 22 ]. La introduccin de los monmeros de LNA en
sondas 2'OMe aumenta la afinidad de destino an ms debido a un efecto aditivo
sobre la temperatura de fusin
(Tm)
que se ha demostrado que mejora el
rendimiento de deteccin general de un experimento [ 19 , 23 ].

Figura 1
Estructuras de LNA y 2 'monmeros O-metil ARN (estructuras de fosfato y fosforotioato)
utilizados.
Otros tipos de modificaciones tambin pueden incorporarse para mejorar la
aplicabilidad del objetivo. Por ejemplo, el uso de fosforotioato (PS)
oligonucletidos present algunos resultados particularmente interesantes en el
caso de los ensayos clnicos humanos como agentes teraputicos para el
tratamiento de infecciones virales y el cncer [ 24 , 25 ]. Los monmeros PS
incluyen la sustitucin de uno de los dos tomos de oxgeno no puente por un
tomo de azufre en cada enlace internucleotdico ( Figura 1 ) [ 26 ]. Estos tipos de
oligonucletidos tienen una mayor resistencia a la exo-y endonucleasas, en
comparacin con oligonucletidos de fosfodister (PO) [ 27 , 28 ], y son
particularmente adecuadas para aplicaciones in vivo debido a su vida media de
eliminacin ms largo [ 29 ].
Aprovechando los avances recientes en mimticos de ADN, el principal objetivo
de este trabajo es el desarrollo de un mtodo FIVH para la deteccin de
microorganismos en la temperatura del cuerpo humano (normotermia) el uso de
estas nuevas molculas de cido nucleico. Como microorganismo objetivo
seleccionamos Helicobacter pylori (H. pylori), una bacteria gram-negativa y
microaerophilic que coloniza el estmago de casi la mitad de la poblacin
humana y es un importante factor de riesgo asociado con el cncer gstrico, el
cncer ms mortfero segunda en todo el mundo [ 30 , 31 ].
Ir a:
Materiales y mtodos
Cepas y condiciones de cultivo bacteriano
Todos los cultivos bacterianos se cultivaron en agar de tripticasa de soja (TSA)
suplementado con 5% (vol / vol) de sangre de oveja (Becton Dickinson GmbH,
Alemania) y se incubaron durante 48 horas a 37 C en condiciones
microaerbicas. Densidad bacteriana se determin mediante la dilucin del
cultivo inicial en agua o en solucin salina y se midi la absorbancia a 600
nm. Optimizacin de protocolos inicial se realiz con H. pylori cepa 26695,
obtenida a partir de la Coleccin Americana de Cultivos Tipo (ATCC 700392,
VA EE.UU.). Para probar la especificidad y sensibilidad de las sondas,
otra H. cepas pylori y Helicobacter spp. fueron utilizados ( Tabla 1 ).

Tabla 1
Cepas de Helicobacter probados en este estudio.
Diseo de la sonda de oligonucletidos
La regin diana de ARNr 16S fue seleccionado basado en un estudio anterior
[ 32 ]. Las secuencias de las sondas se disearon pautas siguientes para los peces
de sondas, a una limitacin del contenido de purinas a 60% y la restriccin de la
auto-complementariedad con 3 pares de bases. Se utilizaron diferentes tipos de
monmeros de nucletidos modificados en las sondas ( Figura 1 ). La posicin y
el nmero de LNA y 2'OMe sustituciones utilizados en cada sonda se basaron en
los informes anteriores [ 33 , 34 ]. Por el momento, un modelo termodinmico
especfico y fiable para predecir la temperatura de hibridacin es todava ausente
por LNA y 2'OMe-ARN. Sin embargo es posible estudiar la temperatura de
fusin terica de cada sonda a travs de un 2'OMeRNA / Calculadora en lnea
( http://rnachemlab.ibch.poznan.pl/calculator1.php ). Como tal, hemos diseado
varias sondas con diferentes tamaos para aumentar las posibilidades de
encontrar uno o ms de la sonda (s) de trabajo en las condiciones del cuerpo
humano (37 C). Una vez seleccionadas las sondas, se realiz una bsqueda en
las bases de datos de 16S rRNA disponibles de Ribosomal Database Project II
(RDP-II), versin 10 (http://rdp.cme.msu.edu/) para confirmar la especificidad
terica y sensibilidad de la sonda frente a otros microorganismos. Para este
anlisis, se seleccionaron slo las secuencias de alta calidad con ms de 1200
pares de bases [ 35 ]. Se encontr que todas las sondas difieren por al menos dos
bases (dos desapareamientos) de H. no especies pylori.
Los oligonucletidos de sntesis y purificacin
Los oligonucletidos fueron sintetizados en condiciones anhidras usando qumica
de fosforamidita estndar en un sintetizador de cidos nucleicos automatizado
(Applied perspectiva Expedite 8909 instrumento). LNA y 2'OMe monmeros
estaban disponibles comercialmente de Exiqon y Ribotask, respectivamente. Las
sntesis se realizaron en 1,0 mol escala utilizando un soporte a base de
poliestireno universal. Las condiciones de sntesis utilizados para la
incorporacin de monmeros de LNA y 2'OMe fueron los siguientes: cido
tricloroactico en CH
2
Cl
2
(3:97) como reactivo de destritilacin; 0,25 M de 4,5-
dicianoimidazol (DCI) en CH
3
CN como activador; anhdrido actico en THF
(9:91, v / v) como tapn de una solucin; -metilimidazol N en THF (1: 9, v / v)
como solucin tapn B. Como una solucin oxidante 0,02 M de yodo en H
2
O /
piridina / THF se utiliz para los oligonucletidos de fosfato. Como tiolacin
solucin 0,0225 M de xantano hidrato en piridina / CH
3
CN (20:90, v / v) se
utiliz para los oligonucletidos de fosforotioato. Tiempo de acoplamiento fue de
4,6 min para ambos monmeros. Fosforamidita de fluorescena, FAM (Glen
Research, VA, EE.UU.) se aadi en acetonitrilo anhidro (0,1 M) y activado por
tetrazol con un tiempo de acoplamiento 20 min. Los rendimientos de
acoplamiento paso a paso (95-99% por paso) se basaron en la absorbancia de los
cationes dimetoxitritilo (DMT
+)
liberados despus de cada etapa de
acoplamiento. La escisin del soporte se llev a cabo mediante el uso de solucin
acuosa 98% de metanol / amoniaco 7 N en metanol (1: 1), 2 h a temperatura
ambiente, seguido de solucin acuosa de amonaco 32%, 12 h a 55 C.
Todos los oligonucletidos se purificaron por HPLC de fase inversa (RP-HPLC)
usando un sistema Waters 600 equipado con un OST XBridge C18 (2,5 m, 19
100 mm) de columna y una Prep C18 XBridge (5 m, 10 10 mm)
precolumna. Despus de la eliminacin del grupo DMT, los oligonucletidos se
caracterizaron por HPLC de intercambio inico (IE-HPLC) en un sistema de
HPLC Dionex (VWR) y por ionizacin por desorcin lser espectrometra de
masas de tiempo de vuelo asistida por matriz (MALDI-TOF) en un Microflex
Maldi (instrumentos Bruker, Leipzig, Alemania) Los oligonucletidos
purificados se precipitaron con acetona y su pureza (> 90%) y las composiciones
se verificaron por anlisis IE-HPLC y MALDI-TOF, respectivamente.
Debido a que las sondas se centrar en el rRNA de H. pylori, la temperatura de
fusin de los oligonucletidos sintticos se evalu usando los oligonucletidos no
modificados que consisten solamente de ARN (HP_RNA_Target), totalmente
complementarias a las sondas diseadas aqu (adquirido de Integrated DNA
Technologies). Una sonda de ADN para servir como una sonda de referencia
(HP_DNA_Ref) con un mayor nmero de bases que el LNA y sondas 2'-OMe se
adquiri de Sigma-Aldrich (MO, EE.UU.).
Melting estudios de temperatura
De cada hebra, se utiliz 1,0 M en los siguientes tampones: un tampn salino
medio con 220 mM de Na
+
(NaCl 200 mM, 20 mM NaH
2
PO
4
y 0,2 mM
EDTA, pH 7,0), un tampn de sal de medio con 30% ( vol / vol) de formamida y
un tampn bajo en sal con 30% (vol / vol) de formamida con 110 mM de
Na
+
(NaCl 110 mM, EDTA 5 mM, Tris-HCl 50 y 30% (v / v) formamida, pH 7,5
). Despus de mezclar cada muestra y desnaturalizar el complejo por
calentamiento hasta 85 C durante 5 min, las muestras se enfriaron a la
temperatura de partida del experimento. Se utilizaron clulas de cuarzo ptimos
con un lengh camino de 1,0 cm. Las temperaturas de fusin (T
m
valores / C) se
midieron en Perkin Elmer Lambda 35 UV VIS equipos / espectrmetro con un
PTP 6 (Peltier programador de temperatura) y se determin como el mximo de
la primera derivada de la curva de desnaturalizacin trmica (A
260
vs.
temperatura de tampn salino medio).Se utiliz un rango de temperatura de 13-
15 C y 80-85 C y una rampa de 1,0 C / min. T
m
valores reportados son el
promedio de las dos mediciones dentro de 1 C.
Optimizacin de las condiciones de hibridacin de la sonda en portaobjetos y en
suspensin
Los procedimientos de hibridacin desarrollado para detectar H. pylori se realiz
por FISH y evaluado por dos tcnicas independientes: por microscopa de
fluorescencia en las diapositivas (para obtener una evaluacin ms rpida pero
cualitativa de la seal de fluorescencia) y por imgenes de la citometra de flujo
clasificacin en suspensiones bacterianas (para obtener una evaluacin
cuantitativa). La deteccin de 16S rRNA en diapositivas por FISH se realiz
como se describe en su mayora Azevedo et al. [ 36 ], con algunas
modificaciones. Para la fijacin en portaobjetos de vidrio, frotis de cada especie /
cepa se sumergieron en 4% (v / v) de paraformaldehdo durante 15 min a
temperatura ambiente, seguido de un tratamiento de 50% (vol / vol) de etanol
durante 10 min y se dej al aire seco. La hibridacin se realiz con 20 l de
tampn de hibridacin con 200 nM de la sonda respectiva, que cubri cada uno
de desprestigio individual. Se ensayaron dos tipos diferentes de tampn de
hibridacin (pH 7,5): uno que contiene 50% (vol / vol) de formamida (Across
Orgnica, Nueva Jersey, EE.UU.) y el otro 4 M de urea (VWR Prolabo BHD,
Haasrode, Blgica). Los siguientes reactivos fueron comunes a ambos buffers:
10% (vol / vol) de sulfato de dextrano (Fisher Scientific, MA, EE.UU.), 0,1%
(vol / vol) de Triton-X (Panreac, Barcelona, Espaa), 5 mM de EDTA disdico
sal de 2-hidrato (Panreac), 50 mM Tris-HCl (Fisher Scientificm Nueva Jersey,
EE.UU.), NaCl 900 mM (Panreac). Las muestras se cubrieron con cubreobjetos y
se incubaron durante 90 min a 37 C.Los portaobjetos se lavaron posteriormente
en una solucin precalentada (pH 10), que contiene 5 mM de Tris Base (Fisher
Scientific), NaCl 15 mM (Panreac) y 1% de Triton X (Panreac), durante 30 min a
37 C y, a continuacin, las diapositivas se dejaron secar al aire. Todos los
experimentos se realizaron por triplicado para cada experimento y un control
negativo (condiciones de hibridacin misma, pero sin una sonda en la solucin de
hibridacin) se incluy. Las diapositivas se almacena en la oscuridad antes de
que el anlisis de microscopa. Para la adquisicin de imgenes se utiliz un
microscopio de epifluorescencia Leica 2000 (Leica Microsystems GmbH,
Wetzlar, Alemania). FAM-etiquetado se excita mediante el uso de un lser de
488 nm; el tiempo de exposicin se fija para todas las preparaciones. La
intensidad de fluorescencia de cada sonda y la muestra se cuantific en las
imgenes de microscopa utilizando el software ImageJ
(http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html).
El mtodo de hibridacin en suspensin se basa en procedimientos descritos por
Almeida et al. [ 37 ], con ligeras modificaciones. Cada tipo de bacteria se recogi
de una placa TSA con 1 ml de solucin salina y se centrifug a 14 000
x g durante 15 min. El sedimento se resuspendi en 400 l de 4% (v / v) de
paraformaldehdo durante 1 hora, seguido por centrifugacin a 14 000
x g durante 5 min. Las clulas fijadas se resuspendieron en 500 l de 50% (vol /
vol) de etanol y se incubaron a -20 C durante al menos 30 min. Para las
bacterias desagregacin las muestras se sometieron a sonicacin por ultrasonidos
(Transsonic 420, Elma, Alemania) durante 12 min, seguido por una filtracin a
travs de un filtro de 10 micras de tamao de poro estril (CellTrics, Gorliz,
Alemania).Despus, 100 l de clulas fijadas se resuspendieron en 100 l de
solucin de hibridacin (como se describi anteriormente) con 400 nM de la
sonda y se incub a 37 C durante 90 min. Despus de la hibridacin, las
muestras se centrifugaron a 14.000 rpm durante 5 min, se resuspendieron en 500
l de solucin de lavado (como se describi anteriormente) y se incub a 37 C
durante 30 min. Las clulas se volvieron a centrifugar a 14 000 x g durante 5 min
y se resuspendieron en 100 l de solucin salina. Para eliminar las muestras de
agregados fueron filtradas por un filtro estril con 10 m de tamao de poro
(CellTrics). Las muestras se usaron directamente para el flujo de anlisis de
citometra de imagen.
La cuantificacin de imagen
Utilizando el programa ImageJ (National Institutes of Health Software), se
analiz cada imagen obtenida por microscopa para la intensidad media de
fluorescencia. Los valores de fondo se obtuvieron mediante la medicin de una
regin en blanco de cada imagen y stos se retiraron de los marcos de
prueba. Los datos se representan como media de unidades de fluorescencia
arbitrarias (AFU) que representaban la intensidad de fluorescencia media menos
intensidades de fondo.
Flujo Imaging citometra y anlisis de datos
H. pylori suspensiones de clulas bacterianas teidas con sondas LNA FAM-
etiquetados, y los respectivos controles negativos sin teir, se analizaron en
un
X
ImageStream (Amnis Corporation, Seattle WA, EE.UU.) el flujo de
imgenes citmetro equipado con dos lseres (488 nm y 785 nm ), un objetivo de
40 aumentos 0,75 NA, y una cmara CDD. Imgenes adquiridas utilizando el
software INSPIRE
TM
incluyen una imagen de campo claro (Canal 1, 430-480
nm), y una imagen de fluorescencia verde (Canal 2, 480-560 nm). Durante la
adquisicin de la muestra, la entidad de rea fue utilizado como clasificador de
clulas, en el canal de campo claro, con un lmite inferior de 2, para excluir los
desechos, y un lmite superior de 20, para excluir los agregados bacterianos y de
este modo minimizar el error en la seal de fluorescencia intensidad que los
agregados bacterianos representaran en el anlisis de datos. Para cada muestra,
se recogieron 50.000 eventos y se realizaron dos experimentos
independientes. Todos los datos de imgenes se analizaron mediante los
algoritmos de software v4.0 (Amnis Corporation) IDEAS
.
Esquemas
jerrquicos de compuerta se utilizan para eliminar an ms los agregados
bacterianos y para determinar el recuento de manchas y la intensidad media de la
seal de fluorescencia de cada muestra bacteriana.
La hibridacin en las biopsias gstricas
Se utilizaron biopsias incluidas en parafina fijadas con formalina de secciones de
tejido gstrico de un paciente infectado con H. pylori. El uso de la biopsia para
fines de investigacin fue aprobado previamente por el comit de tica del
Instituto Portugus de Oncologa (IPO) en Porto, y el consentimiento informado
por escrito se obtuvo de los patient.Sections se redujeron a 3 m de espesor y
montado sobre vidrio microscopio diapositivas y se almacen a 4 C hasta su
uso. Los portaobjetos se sumergieron dos veces en xilol durante 15 min cada vez,
y despus se somete a la rehidratacin por concentraciones decrecientes de etanol
(100%, 95%, 80%, 70% y 50%) durante 5 min cada vez. Por ltimo, los
portaobjetos se lavaron con agua destilada durante 10 min y se dejaron secar al
aire.Posteriormente, se utiliz el procedimiento de hibridacin en portaobjetos
como se ha descrito anteriormente utilizando ambos tampones.
Anlisis estadstico
La significacin estadstica se determin mediante anlisis unidireccional de la
varianza (ANOVA) mediante la aplicacin de la prueba de comparaciones
mltiples de Tukey-, utilizando las estadsticas de SPSS 17.0 (SPSS, paquete
estadstico para las Ciencias Sociales, Chicago, EE.UU.) o Microsoft Office
Excel (Microsoft Corporation, Redmond , CA). Las diferencias en los valores de
los datos se consideraron significativas a valores inferiores a 0,05.
Ir a:
Resultados
Comportamiento de la temperatura de fusin
El propsito inicial de este trabajo fue encontrar un tipo de oligonucletido
sinttico que sera capaz de hibridarse de manera eficiente en una bacteria a la
temperatura corporal humana (37 C). Una primera proyeccin se realiz para
determinar la temperatura de fusin de 18 sondas sintetizadas (datos no
presentados). La temperatura de hibridacin no slo se ve afectado por el tipo de
sonda, tamao y secuencia, pero tambin por la cantidad y tipo de otras
sustancias presentes en la solucin de hibridacin. Por esta razn se llevaron a
cabo estudios de desnaturalizacin trmica UV en soluciones que contienen no
slo las sondas, sino tambin diferentes concentraciones de sal y un compuesto
desnaturalizante (formamida; FA).
Despus de un anlisis comparando la biofsica de fusin y temperaturas de
hibridacin de las sondas LNA (con diferentes longitudes), llegamos a la
conclusin de que la temperatura de hibridacin debe ser de entre 15-30 C ms
baja que la temperatura de fusin medido bajo condiciones similares (es decir, en
presencia de sal y FA) (datos no publicados). Sobre la base de este criterio, se
seleccionaron cuatro sondas candidatos, con temperaturas de fusin que oscilan
entre 60-70 C para estudios posteriores ( Tabla 2 ).

Tabla 2
Resultados de los experimentos de desnaturalizacin trmica en diferentes tipos de tampones
para diferentes tipos de oligorribonucletidos.
Termodinmicamente, se observaron resultados similares para el fosfato
(HP_LNA_PO y HP_LNA / 2OMe_PO) y fosforotioato sondas (HP_LNA_PS y
HP_LNA / 2OMe_PS). Sondas fosforotioato (HP_LNA_PS y HP_LNA /
2OMe_PS) mostraron slo diferencias pequeas (slo C de variacin de 1 en
valores de Tm), en comparacin con las respectivas sondas de fosfato, con la
excepcin de HP_LNA / 2OMe_PS en la sal medio con FA. Aunque el nmero
de LNA es mayor en HP_LNA_PO HP_LNA_PS y sondas (5 monmeros de
LNA) que en HP_LNA / 2OMe_PO y sondas HP_LNA / 2OMe_PS (4
monmeros de LNA) se observaron las nicas diferencias significativas en las
temperaturas de fusin cuando se utiliz tampn de medio con FA. Cabe sealar
que la diferencia de concentracin de sal de los tampones de sal no afect
significativamente la Tm.
Deteccin FISH de H. pylori por microscopa de fluorescencia
La capacidad de las sondas candidatos seleccionados ( Tabla 2 ) para hibridar a la
temperatura corporal humana (37 C) fue entonces probada usando el mtodo
FISH en portaobjetos de vidrio. A pesar de los que se ha diseado para funcionar
a temperaturas de fusin similares, los resultados de microscopa han demostrado
que slo el HP_LNA / 2OMe_PO y HP_LNA / 2OMe_PS sondas fueron capaces
de hibridar a 37 C ( Figura 2A ). Debido HP_LNA_PO y HP_LNA_PS sondas
slo fueron capaces de hibridar a temperaturas superiores a 40 C (datos no
mostrados), que no se consideraron para su posterior evaluacin. Uno de los
componentes de la solucin de hibridacin es FA que acta como un agente
desestabilizador de desnaturalizacin o permitiendo que las hibridaciones que se
llevarn a cabo a temperaturas ms bajas. Sin embargo, no es posible utilizar
FA in vivo debido a su naturaleza txica para las clulas humanas [ 38 ]. Por lo
tanto, hemos probado urea a una concentracin de 4 M como una alternativa no
txico adecuado. La eficiencia de hibridacin de la sonda HP_LNA / 2OMe_PS
fue mayor que el de la sonda HP_LNA / 2OMe_PO en ambos tampones FA y
urea, como se puede observar por la seal de alta fluorescencia ( Figura
2A ). Debido a microscopa de fluorescencia slo proporciona resultados
cualitativos, se determin la intensidad media de fluorescencia de cada muestra
utilizando el software ImageJ ( Figura 2B ).

Figura 2
Deteccin FISH de H. pylori cepa 26695 (ATCC 700392) usando FAM HP_LNA / 2OMe_PO y
HP_LNA / 2OMe_PS sondas.
Los resultados obtenidos por ImageJ confirmaron que la sonda HP_LNA /
2OMe_PS presenta intensidades de fluorescencia ms altas que la sonda
HP_LNA / 2OMe_PO, independientemente del tampn utilizado. La intensidad
de fluorescencia de la sonda HP_LNA / 2OMe_PS es significativamente ms alta
en el tampn de urea que en el tampn de FA (p = 0,006). La diferencia entre
HP_LNA / 2OMe_PS urea y las otras condiciones analizadas es estadsticamente
significativa (p <0,05). No se observaron diferencias estadsticamente
significativas en la intensidad de fluorescencia entre la sonda HP_LNA /
2OMe_PS en FA y la HP_LNA / 2OMe_PO tanto en tampn (p> 0,05). Como
era de esperar, los experimentos de control (sin sonda) mostraron niveles bajos
de fluorescencia;este contexto muy dbil probablemente debido a la presencia de
sustancias autofluorescentes en clulas bacterianas se pudo observar veces
( Figura 2B ).
Sensibilidad y especificidad de las sondas son dos factores importantes para el
xito de un mtodo de FISH. Debido a las bajas temperaturas de hibridacin
pueden influir en estos dos factores, despus de la optimizacin de las
condiciones de hibridacin hemos probado la sensibilidad y especificidad de las
sondas candidatos contra el panel de cepas que se presentan en la Tabla 1 y en la
Figura S1 . Las sondas candidatos fueron capaces de detectar H. cepas de
referenciapylori y H. aislados clnicos pylori, mientras que no se detect seal
fluorescente para las cepas no-Helicobacter pylori probadas. Estos resultados
mostraron que 2 'O metil / sondas modificadas LNA-dos estaban especfica y
sensible para H. cepas pylori, incluso cuando la hibridacin se lleva a cabo a 37
C en presencia de urea como agente desnaturalizante. Un parmetro central para
una futura aplicacin FIVH en el estmago humano es la optimizacin de la
tcnica de FISH a pH bajo. Como se han realizado tales pruebas, preliminares
utilizando HP_LNA / 2OMe_PS analizados en este estudio a pH 4 con resultados
positivos (datos no presentados).
Deteccin FISH de H. pylori por imgenes de citometra de flujo
Despus de la optimizacin del mtodo en las diapositivas, hemos aplicado el
procedimiento de FISH para H. suspensiones pylori para el flujo de imgenes
citometra de anlisis. La intensidad de fluorescencia media de cada muestra se
evalu y los resultados globales fueron similares a los determinados por ImageJ
para la aplicacin en portaobjetos de FISH ( Figura 3 ). La sonda HP_LNA /
2OMe_PS en tampn de urea se hibrid con una eficiencia significativamente
mayor que la de HP_LNA / 2Ome_PS en FA, y la sonda HP_LNA / 2OMe_PO
en ambos tampones (p <0,05), mostrado por la intensidad media de fluorescencia
ms alta. Ambas sondas hibridadas de manera ms eficiente en el tampn de urea
4 M en el tampn de FA en comparacin con el control sin sonda ( Figura 3A y
3B ). Por otro lado, las dos sondas en el bfer de FA no mostraron diferencias
significativas en el control respectivo (p> 0,05) ( Figura 3A y 3B ). En estas
condiciones, el uso de imgenes de citometra de flujo, todos los diferentes tipos
morfolgicos de H. clulas pylori (espiral, cocos y en forma de U) emite una
fluorescencia verde brillante ( Figura 3C ).

Figura 3
Deteccin FISH de H. pylori por imgenes de citometra de flujo.
Anlisis de la biopsia gstrica hibridacin
Teniendo en cuenta la aplicacin de 2'-O-metilo / LNA en entornos clnicos, la
identificacin de H. pylori cepas se realiz en cortes histolgicos de muestras de
biopsias gstricas de pacientes infectados con esta bacteria. En todas las
secciones de parafina, rRNA bacteriano se detect utilizando FAM etiquetados
HP_LNA / 2OMe_PO y sondas HP_LNA / 2OMe_PS. Sin embargo, el anlisis
de las biopsias gstricas utilizando HP_LNA / 2OMe_PS mostr ms intensidad
de fluorescencia de H. pylori que en las mismas condiciones con HP_LNA /
2OMe_PO (datos no mostrados). Los controles negativos confirmaron la falta de
autofluorescencia de H. no marcado clulas pylori ( Figura 4B ). Por lo tanto,
usando condiciones de hibridacin similares a FIVH es posible identificar y
localizar las bacterias en la superficie de la mucosa gstrica.

Figura 4
Deteccin FISH de H. pylori en las secciones incluidas en parafina de biopsias gstricas,
utilizando 2'-O-metil / LNA condiciones de deteccin FISH.
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Discusin
Este trabajo presenta el primer enfoque para obtener un mtodo para la deteccin
de H. pylori in vivo bajo condiciones que imitan. Tomando ventaja de la
evolucin de la qumica de cidos nucleicos, se han sintetizado una serie de LNA
y / o 2'-O-metil ARN sondas usando el fosfodister estndar y las cadenas
principales de fosforotioato sintticos y hemos evaluado su idoneidad para
hibridar a 37 C.
Los ensayos de hibridacin mostraron que slo HP_LNA / 2OMe_PS y HP_LNA
/ 2OMe_PO sondas fueron capaces de emitir fluorescencia a 37 C. Estos
resultados sugieren que la sustitucin de nucletidos de ADN para la 2'-O-metil-
ARN en sondas LNA permite que la hibridacin se produzca a temperaturas ms
bajas, siempre y cuando se utiliza una secuencia ms corta LNA / 2'-OMe-ARN
cuando se compara con la sonda de ADN correspondiente. Se espera, adems,
que la introduccin de monmeros 2'OMe en sondas LNA aumentar de sonda de
bioestabilidad, la especificidad y la cintica de hibridacin y permite la
orientacin en condiciones en las sondas de ADN / LNA no se hibridan, una
observacin que ha sido corroborado por otros [ 19 , 22 , 23 ]. Hemos demostrado
que ambos HP_LNA / 2OMe_PS y sondas HP_LNA / 2OMe_PO son capaces de
hibridar con xito con H. pylori ARN a 37 C. El HP_LNA / 2OMe_PS sonda
producir intensidades de fluorescencia ms altas en las diapositivas y en
suspensiones de H. pylori, as como en las biopsias gstricas, lo que parece
indicar que las sondas de fosforotioato son los mejores candidatos para ser
utilizados como sondas en este tipo de experimentos.
Tomando en cuenta la futura aplicacin de este mtodo a las condiciones in
vivo, y dado que el procedimiento FISH incluye soluciones que son txicos,
hemos sustituido con xito FA por urea. De hecho, FA, que se utiliza como un
agente desestabilizador de dplex de cido nucleico, es uno de los productos
qumicos ms peligrosos presentes en la solucin de hibridacin y el uso de urea
como un sustituto ya ha sido sugerido por otros autores [ 38 ]. La sustitucin de la
comn 50% (v / v) FA por urea 4 M condujo a un aumento del 40% en la
intensidad de la seal, en ambas sondas analizadas ( Figura 3 ), lo que podra
explicarse por el papel permeabilizacin adicional de urea [ 39 ] . Ms importante
an, el uso de un tampn que contiene urea-calentado no afect a la cintica de
renaturalizacin de la reaccin.
Aunque diferentes estudios han llevado a cabo la etapa de hibridacin de un
proceso de FISH a 37 C, estos suelen utilizar un paso previo de
desnaturalizacin y una etapa de lavado realizado a temperaturas ms altas
[ 11 , 40 ] o largos perodos de incubacin [ 41 ]. Adems, algunos de estos
estudios utilizaron sondas de ADN, y como tal, la etapa de hibridacin solo dur
por lo menos durante 8 horas, lo cual es indeseable para el propsito final de
FIVH. Adems, estos experimentos se han realizado slo en las clulas animales,
donde los cidos nucleicos son capaces de difundir ms libremente en la clula
debido a la falta de una pared celular. El presente estudio es el primero en
realizar la deteccin de una bacteria por FISH en la temperatura del cuerpo
humano utilizados para todos los pasos del procedimiento de hibridacin. El
nico estudio que utiliz la designacin de FIVH y que se realiz en las clulas
animales en vivo [ 42 ], se aplica la hibridacin en un ambiente de cultivo ex
vivo y, como tal, no es un verdadero FIVH. A lo mejor de nuestro conocimiento,
los pocos estudios que se han realizado in vivo en las clulas animales utilizados
con fluorescencia etiquetados pptidos pequeos como sondas en lugar de cidos
nucleicos [ 7 ]. Otro problema observado en este estudio fue la autofluorescencia
de los tejidos de la biopsia. Agentes de fluorescencia no especfica, tales como
fluorescena, se han utilizado en varios estudios con anlisis endomicroscopa
[ 43 ]. La sensibilidad de esta tcnica permiti la visualizacin de pequeas
estructuras celulares, tales como los capilares y las clulas inflamatorias
[ 44 ]. Por lo tanto, aunque la autofluorescencia est presente en los tejidos
analizados ( Figura 4 ), los trabajos publicados demostraron que es posible
discriminar las seales de fluorescencia pequeos in vivo [ 45 , 46 ]. Tambin hay
mtodos de anlisis por imgenes que permiten la reduccin de las firmas
autofluorescentes de datos de imagen matemticamente [ 47 , 48 ]. Otro enfoque
posible es el uso de un diferentes fluorforos exgenas con una regin espectral
diferente, donde no se puede observar la autofluorescencia del tejido [ 49 ]. Por lo
tanto, si la presencia de autofluorescencia en imgenes fluorescentes se convierte
en un problema en el anlisis in vivo, todava existen diferentes tipos de
estrategias que podran permitir a superar este problema.
Mientras pasos importantes se han dado en aqu para lograr con xito FIVH en el
futuro, todava hay mucho trabajo por realizar. Por ejemplo, otros componentes
empleados en las soluciones de hibridacin, tales como sulfato de dextrano y
Triton X tendrn que ser sustituidos o tienen sus concentraciones disminuyeron
para la aplicacin FIVH debido a su toxicidad [ 50 , 51 ]. Sulfato de dextrano se
usa como un acelerador de la velocidad de hibridacin [ 52 ], mientras que Triton
X acta como un detergente y evita la unin no especfica. Un equilibrio en la
concentracin de estos reactivos simultneamente con la concentracin de urea
aadida de que se asegurar la cintica razonables y especificidad de la
hibridacin, manteniendo niveles aceptables de toxicidad tendr que ser
logrado. El tiempo de exposicin de la sonda a la diana respectiva es tambin uno
de los factores ms importantes para el xito FIVH. De hecho, la disminucin del
tiempo de curso de cada experimento (30 min) ya se ha hecho en nuestro
laboratorio para sondas de ANP (datos no presentados). Matthiesen y Hansen
tambin trataron de reducir el tiempo de hibridacin se requiere el uso de sondas
de ADN, sin embargo, los mejores resultados se observaron slo con una hora de
hibridacin [ 53]. Por lo tanto, se centraron tambin los estudios futuros en
disminuir el tiempo de exposicin de la sonda HP_LNA / 2OMe_PS.
Un sistema de deteccin adecuado que es capaz de detectar la seal de
fluorescencia en el interior del cuerpo humano para evaluar la eficiencia de la
hibridacin est disponible para FIVH, utilizando un ordenador conectado a un
endomicroscope lser confocal [ 43 ]. Este equipo ha demostrado ser til para el
diagnsticoin vivo de condiciones precancerosas y el cncer gstrico, y tambin
ha permitido dirigir, no especfico en la identificacin in
vivo de H. pylori [ 54 ]. Por lo tanto, podra ser utilizado para detectar la seal de
fluorescencia de la sonda HP_LNA / 2OMe_PS in vivo, posiblemente
permitiendo la adquisicin en tiempo real de imgenes de alta resolucin de esta
bacteria en curso durante la endoscopia. Otra ventaja importante de este mtodo
es que debe ser fcilmente adaptado para detectar la resistencia de H. pylori a la
claritromicina, mediante un simple rediseo de las sondas [ 55 ]. Esto implicara
que para el final de un endomicroscopa, el gastroenterlogo no slo saber acerca
de la presencia de H. pylori, pero tambin tienen informacin sobre la mejor
terapia que debe ser prescrito para el paciente.
En este estudio, la intensidad de fluorescencia se utiliz como un parmetro de la
eficiencia de hibridacin de la sonda en diapositivas y en suspensin. La
cuantificacin de la fluorescencia se realiz tanto por el software ImageJ y por
citometra de flujo. Una de las razones por las cuales la cuantificacin de la
fluorescencia se realiz por dos mtodos fue que cuando se utiliza la citometra
de flujo es posible analizar cada clula como una observacin independiente y
por lo tanto se obtienen los datos estadstica ms fuerte ( Figura 3 ). La otra razn
es que, dentro del cuerpo humano, no todas las clulas microbianas se adhieren a
una superficie. Por ejemplo, cuando se producen infecciones microbianas de la
sangre, los microorganismos tales como Candida spp., Staphylococcus aureus y
muchos otros se pueden encontrar en la corriente sangunea [ 56 , 57 ]. Debido a
que uno de los objetivos de este estudio fue establecer un marco para otros
mtodos FIVH, consideramos relevante para evaluar si las diferencias en el
rendimiento de la hibridacin tambin se pudieron observar entre la hibridacin
en las diapositivas y en suspensin. Como este no era el caso, FIVH tambin
podra ser aplicable en el futuro como un mtodo de diagnstico para detectar el
agente causante de una septicemia, a la espera en el desarrollo de tecnologas
adecuadas para detectar la seal fluorescente de la sonda.
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Conclusiones
Deteccin especfica y sensible por FISH de un microorganismo en condiciones
de normotermia humanos se informa en este documento por primera vez. Ms
importante an, el estudio tambin sienta las bases para otros proyectos que
tienen como objetivo el desarrollo de mtodos para la deteccin in vivo de otros
microorganismos utilizando FIVH. Por ejemplo, las notables propiedades de
LNA en trminos de afinidad y especificidad de hibridacin fueron esenciales
para los resultados obtenidos.Adems, enlaces internucleosdicos fosforotioato,
junto con la introduccin de residuos de 2'OMe demostraron ser las sondas
adecuadas.Como el proceso de FIVH se controla principalmente por la
termodinmica de hibridacin de cidos nucleicos, se sugiere que funciona la
orientacin otros microorganismos deben emplear LNA / 2OMe con PS sondas a
base de ligamiento.
La investigacin futura debe centrarse en tres direcciones principales: 1)
disminucin del tiempo de un procedimiento de FISH estndar; 2) Evaluacin de
la citotoxicidad de todos los compuestos utilizados en este proceso, y 3)
evaluacin de la capacidad de endomicroscopa confocal para detectar la seal
fluorescente emitida por el fluorocromo unido a las clulas a travs in
vivo estudios.
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Informacin de apoyo
Figura S1
Resultados de la intensidad de fluorescencia de las cepas de Helicobacter (no
26695 (ATCC 700392)) probados en este estudio. Los resultados representan la
seal positiva de cada muestra despus de la sustraccin del control respectivo.
(DOCX)
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(177K, docx)

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Agradecimientos
Queremos agradecer a Pedro Madureira del Instituto de Ciencias Biomdicas
Abel Salazar (ICBAS), Universidad de Porto, Porto, Portugal para el anlisis de
citometra de estudios preliminares y Daniel Carvalho de la Facultad de
Ingeniera (FEUP), Universidad de Porto, Porto, Portugal para el anlisis de
imgenes microscpicas utilizando el software ImageJ. Tambin agradecemos a
Mrio Dinis-Ribeiro para proporcionar los cortes histolgicos de las biopsias
gstricas.
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Declaracin de Financiamiento
Esta investigacin fue apoyada por la Fundacin de Cincia e Tecnologia
(mimticos de ADN Proyecto de Investigacin (Ref. PIC / IC / 82815/2007), y
MCTES subvencin PhD SFRH / BD / 72999/2010, y las subvenciones Pos-doc
SFRH / BPD / 33420 / 2008 y SFRH / BPD / 78846/2011 y realizado en el marco
de la Accin COST-TD1004:. Teragnstico para la imagen y la terapia Los
financiadores no tena papel en el diseo del estudio, recogida y anlisis de datos,
decisin a publicar, o la preparacin de la manuscrito.