Aula 02 Engenharia Bioquimica Prof. Rodrigo Melo PDF

Engenharia Bioqumica- Prof. Dr. Rodrigo de S.
Melo
Catabolismo da Glicose
Rotas Metablicas Especficas: gliclise.
Resumo: Via pela qual a glicose convertida em piruvato atravs da frutose-1-6-
bifosfato, com a produo de 2 mols de ATP por mol de glicose (10 reaes
enzimticas).

VISO GERAL DA VIA GLICOLTICA
- Glicose aparece a partir da quebra de polissacardeos grandes ou pela
sua sntese a partir de precursores no-glicdicos (gliconeognese);
- A glicose entra na clula por um transportador especfico que a leva do
exterior da clula para o citosol;
- As enzimas da gliclise esto localizadas no citosol, onde esto
fracamente associadas, se tanto, com estruturas celulares como as
membranas;
Engenharia Bioqumica- Prof. Dr. Rodrigo de S. Melo
VISO GERAL DA VIA GLICOLTICA
A gliclise converte a glicose em duas unidades de 3C (piruvato), com menor
energia livre, em um processo que atrela a liberao de energia livre para sintetizar
ATP a partir de ADP e Pi.

ESTRATGIA QUMICA DA GLICOSE:
1) Adio de grupos fosforilados glicose;
2) Converso qumica de intermedirios fosforilados em compostos com
alto potencial de transferncia de grupos fosfato;
3) Acoplamento qumico da subsequente hidrlise das substncias
reativas com a sntese de ATP.
+
+
+ +
+ + +
+
+

Hexocinase (HK): a transferncia de um grupo fosforil do ATP para a glicose.
Cinases: enzimas que transferem grupos fosforil
entre um ATP e um metablito.
Est associada a manuteno dos nveis de
glicose srica.
Complexo ATP-Mg
2+
A ausncia do
complexo um
inibidor competitivo
da HK.
A complexao com os tomos de oxignio do fosfato
protege as cargas negativas do ATP, fazendo com que
o tomo do fosfato seja mais acessvel ao ataque
nucleoflico pelo OH do C6 da glicose.
Reao 1 da Gliclise: Transferncia de um Grupo Fosforil do ATP
F6P G6P
1
Ligao do Substrato
Reao 2 da Gliclise: Mecanismo de Reao da Fosfoglicose-isomerase
2
H
+
Abertura do Anel
3
4
5
H
+
Fechamento do
Anel
Fosfoglicose-Isomerase (PGI):
isomerizao de uma aldose
para cetose.
Reao 3 da Gliclise: Fosforilao do F6P para produzir FBP
Reao semelhante reao da hexocinase...a PFK catalisa o ataque nucleoflico
pelo grupo C1-OH da F6P no tomo de fsforo eletroflico do complexo Mg
2+
-ATP.
Reao 4 da Gliclise: Aldolase catalisa a clivagem da FBP em 2 trioses
OH
-
HOH
1
2
+
3
H
2
O
OH
-
1
2
3
4
5
Ligao com
o substrato
Frutose-1,6-
bifosfato
Base de
Schiff
protonada
H
2
O
Clivagem do
aldol
Tautomerizao
+
protonao
H
2
O
Hidrlise da Base de Schiff
Reao 4 da Gliclise: Aldolase catalisa a clivagem da FBP em 2 trioses
Reao 5 da Gliclise: triose-fosfato-isomerase
Somente um dos produtos (GAP) da clivagem aldol segue pela via
glicoltica...entretanto o DHAP e o GAP so ismero cetose aldose...
Reao catalisada pela triose-
fosfato-isomerase (TIM ou TPI)
Reao 5 da Gliclise: triose-fosfato-isomerase
Mecanismo Enzimtico Proposto para a Reao da TIM
Reao 6 da Gliclise: Formao do Primeiro Intermedirio
Envolve a oxidao e a fosforilao do GAP pelo NAD
+
e pelo P
i
catalisada pela
gliceraldedo-3-fosfato-desidrogenase (GAPDH)

Reao 7 da Gliclise: Gerao do Primeiro ATP
Primeira formao de ATP, juntamente com o 3-fosfoglicerato (3PG) em uma
reao catalisada pela fosfoglicerato-cinase (PGK)
Reao 8 da Gliclise: Converso do 3PG em 2-fosfoglicerato (2PG)
A enzima ativa tem um grupo fosfato em seu stio ativo, o qual transferido para o
substrato para formar um intermedirio bifosfato. Esse intermedirio ento refosforila a
enzima para formar o produto e regenerar a fosfoenzima ativa.
1
2
4
3
5
3PG
2PG
2,3-BPG
Reao 9 da Gliclise: Formao do Segundo Intermedirio
Nesta reao o 2PG desidratado a fosfoenolpiruvato (PEP) em uma reao catalisada pela
enolase:
Reao 9 da Gliclise: Formao do Segundo Intermedirio
2-Fosfoglicerato (2PG)
1
rpida
2
lenta
Intermedirio Carbnion Deslocado
Fosfoenolpiruvato (PEP)
H
2
O HOH
troca rpida
Etapa 1: A rpida formao do carbnion no
C2 facilitada por uma base geral na enzima.
O prton abstrado pode facilmente ser
trocado como o solvente, sendo responsvel
pela rpida velocidade de troca observada.
Etapa 2: A eliminao limitada pela
velocidade do grupo OH do C3
consistente com a baixa velocidade de troca
deste grupo hidroxila com o solvente.
Reao 10 da Gliclise: Piruvato-cinase (A Segunda Gerao de ATP)
A piruvato-cinase (PK) acopla a energia livre da hidrlise do PEP sntese de ATP
para formar piruvato:
Ataque nucleoflico de um tomo de
oxignio -fosfrico do ADP sobre o
tomo de fosfrico do PEP para formar
ATP e enolpiruvato.
ATP
1
H
+
2
Tautomerizao do
enolpiruvato em piruvato
Fermentao: o destino anaerbico do piruvato
Na presena de oxignio, os equivalentes redutores do NADH so
transportados para a mitocndria para serem reoxidados (transporte de
eltrons e fosforilao oxidativa).

Sob condies anaerbicas...o NAD
+
reposto pela reduo do piruvato, em
uma continuao da via glicoltica.

Dois processos para a reposio anaerbica do NAD
+
:
1) fermentao homoltica (msculo);
2) fermentao alcolica (leveduras).

Fermentao Homoltica
A reao envolve a transferncia direta de
hidreto do NADH para o tomo de carbono
carbonlico do piruvato, acompanhado pela
doao de prton do grupo imidazlico da
His 195 para o tomo de oxignio
carbonlico do piruvato. O ltimo processo
favorecido pela carga positiva da cadeia
lateral da Arg 109 das proximidades.
Fermentao Homoltica
Processo Geral da Gliclise Anaerbica no Msculo:

+ +
+ +
+
+

Muito do lactato, o produto final da gliclise anaerbica, enviado da
clula muscular atravs do sangue at o fgado, onde reconvertido a glicose.

Ao contrrio do que amplamente aceito, no o aumento de lactato no
msculo que ocasiona a fadiga muscular e a dor...mas sim o acmulo de cido
gerado na gliclise (os msculos podem manter sua carga de trabalho na
presena de altas concentraes de lactato desde que o pH seja mantido
constate).
Fermentao Alcolica
O NAD
+
regenerado de uma forma que tem sido importante para a humanidade h
milhares de anos: a converso do piruvato a etanol e CO
2
.
A piruvato-descarboxilase (PDC) contm a coenzima tiamina pirofosfato (TPP ou
ThDP)...pois a descarboxilao precisa do aumento da carga negativa do tomo de
carbono da carbonila...
Tiamina-pirofosfato
Fermentao Alcolica
H
+
1
CO
2
2
3
H
+
+ H
+
4
Ataque nucleoflico
da TPP sobre o
carbono da carbonila
do piruvato.
Eliminao do CO
2
para
gerar um carbnion,
onde o anel tiazlico da
coenzima atua como
dispersor de eltrons
Protonao do Carbnion
Formar Acetaldedo
e regenerar a enzima
ativa
Controle e Regulao Metablica
Os organismos vivos so sistemas abertos termodinamicamente, que tendem a manter
um estado estacionrio em vez de atingirem o equilbrio (morte para os seres vivos).

O fluxo (taxa de fluxo) de intermedirios em um via metablica constante, isto , as
velocidades de sntese e de degradao de cada intermedirio da via metablica os
mantm em concentraes constantes (mxima eficincia).

A regulao do estado estacionrio (homeostasia) deve ser mantida custa de
variaes no fluxo atravs das vias metablicas em resposta a mudanas nas
demandas.

Regulao metablica: o processo pelo qual mantido o fluxo de metablitos no
estado estacionrio atravs de uma via;

Controle metablico: a influncia exercida pelas enzimas de uma via em resposta a
um sinal externo, visando alterao do fluxo dos metablitos.
Controle e Regulao Metablica
Quais as razes pelas quais o fluxo metablico deve ser controlado?
1. Fornecer cada produto nas velocidades em que so necessrios, isto , para
balancear o fornecimento com a demanda;
2. Manter as concentraes do estado estacionrio dos intermedirios de uma via
metablica dentro de uma estreita faixa de concentrao (homeostasia);

Os organismos mantm a homeostasia por vrias razes:
1. Em um sistema aberto, como o metabolismo, o estado estacionrio o estado de
mxima eficincia termodinmica;
2. Muitos intermedirios participam de mais de uma via, sendo que alteraes nas
suas concentraes podem perturbar um balano delicado;
3. A velocidade da resposta de uma via a uma sinal de controle diminui caso haja
grandes variaes nas concentraes dos intermedirios;
4. Grandes variaes nas concentraes dos intermedirios podem ter efeito
deletrio nas propriedades osmticas da clula.
Metabolismo de outras Hexoses
FRUTOSE: a sacarose um dissacardeo da frutose e da glicose
H duas vias para o metabolismo da frutose: Msculo e Fgado.
Msculo
ATP ADP
hexocinase
Fgado
ATP ADP
frutocinase
1
2
Frutose-1-fosfato-aldolase
3
4
5
6
7
ATP
ADP
lcool-desidrogenase
NADH NAD
+
ATP
ADP
Glicerol-cinase
NADH NAD
+
Glicerol-fosfato-
desidrogenase
Triose-fosfato-isomerase
Gliceraldedo-cinase
Galactose (acar do leite): galactose e glicose so epmeros que diferem
apenas na configurao do C4.

As enzimas da gliclise so especficas e no reconhecem a configurao da
galactose. Com isso uma reao de epimerizao deve ocorrer antes da entrada da
galactose na via glicoltica.
galactocinase
1
ATP ADP
Galactose-
1-fosfato-
uridil-
transferase
2
3
NAD
+
UDP-galactose-4-
epimerase
4
fosfoglicomutase
Manose: um composto comum nas glicoprotenas, sendo epmero da
glicose no C2.
ATP ADP
hexocinase
1 2
Fosfomanose-
isomerase
BIORREATORES E PROCESSOS FERMENTATIVOS
Denominam-se "biorreatores", "reatores bioqumicas", ou ainda "reatores
biolgicos", os reatores qumicos nos quais ocorrem uma srie de reaes
qumicas catalisadas por "biocatalisadores".
Grupo 1: Biorreatores nos quais as reaes ocorrem na ausncia de clulas vivas, ou
seja, so tipicamente os "reatores enzimticos";
Grupo 2: Biorreatores nos quais as reaes se processam na presena de clulas
vivas".
Classificao dos Biorreatores
(I) Reatores em fase aquosa (fermentao submersa):
1.1 Clulas/enzimas livres:
Reatores agitados mecanicamente (STR: "stirred tank reactor");
Reatores agitados pneumaticamente:
Coluna de bolhas ("bubble column");
Reatores "air-lift;
Reatores de fluxo pistonado ("plug-flow").
1.2 Clulas/enzimas imobilizadas em suportes:
Reatores com leito fixo;
Reatores com leito fluidizado;
Outras concepes.
1.3 Clulas/enzimas confinadas entre membranas :
Reatores com membranas planas;
Reatores de fibra oca ("hollow-fiber").
II. Reatores em fase no-aquosa (fermentao semi-slida):
Reatores estticos (reatores com bandejas);
Reatores com agitao (tambor rotativo);
Reatores. com leito, fixo;
Reatores com leito fluidizado gs-slido.
Os mais amplamente empregados so os reatores agitados mecanicamente (STR),
conhecidos tambm como reatores de mistura, constituindo cerca de 90% do total de
reatores utilizados industrialmente.
A capacidade dos biorreatores bastante varivel, conforme o processo em questo,
podendo-se distinguir trs grandes grupos no que se refere escala de produo
industrial.
Reatores da ordem de algumas centenas de litros at 1 a 2 m
3
de capacidade, so
empregados no cultivo de microrganismos patognicos ou para o crescimento de
clulas animais ou vegetais (produtos ligados rea de sade);

Uma escala intermediria, algumas dezenas de metros cbicos at 100 a 200 m
3

especialmente empregada na produo de enzimas, antibiticos e vitaminas.

Processos que exigem poucos ou at mesmo nenhum cuidado de assepsia, como
o caso da fermentao alcolica ou do tratamento biolgico de resduos, pode-se
atingir reatores com alguns milhares de metros cbicos de capacidade.
Formas de Conduo de um Processo Fermentativo
Quando se pensa em executar um processo fermentativo, normalmente se imagina preparar
um certo meio de cultura que seja adequado nutrio e desenvolvimento do microrganismo, bem
como ao acmulo do produto desejado; colocar este meio de cultura em um biorreator (fermentador);
adicionar o microrganismo responsvel pelo processo biolgico (inocular) e aguardar que o processo
ocorra. Aps um determinado tempo de fermentao, imagina-se retirar o caldo fermentado do reator
e executar as operaes unitrias necessrias para a recuperao do produto.
Com essa ideia em mente, pode-se dizer que, de uma forma geral, um reator biolgico pode ser
operado das seguintes formas:
-Descontnuo
com um inculo por tanque
com recirculao de clulas
- Semicontnuo
sem recirculao de clulas
- Descontnuo alimentado
sem recirculao de clulas
-Contnuo
executado em um reator (com ou sem recirculao de clulas)
executado em vrios reatores (com ou sem recirculao de clulas)
FERMENTAO DESCONTNUA
So tambm conhecidas por fermentaes por batelada ou processo descontnuo de
fermentao.
MODO DE OPERAO:
No instante inicial a soluo nutriente esterilizada no fermentador inoculada com microrganismos
e incubada, de modo a permitir que a fermentao ocorra sob condies timas. No decorrer do
processo fermentativo nada adicionado, exceto oxignio, no caso de processos aerbico (na
forma de ar), antiespumante, e cido ou base para controle do pH.

Terminada a fermentao, descarrega-se a dorna, e o meio fermentado segue para os tratamentos
finais. Ento, deve-se lavar adorna, esteriliz-la e recarreg-la com mosto e inculo.

Conclui-se, pela descrio acima, que se no houver adio de solues para controle. do
processo, nem perda de lquido por evaporao, o volume no decorrer da fermentao permanece
constante, o que pode ser considerado mais uma das caractersticas do processo descontnuo de
fermentao.
O volume de inculo introduzido no fermentador de produo est comumente ao redor
de 10% de sua capacidade til. No entanto, pode variar de 0,5 a 50%. A tcnica de preparo
do inculo compreende duas fases: a de laboratrio e a industrial.
Em escala industrial, muitos processos so adaptados com vistas a otimizar a
produo. O processo descontnuo, por sua vez, tambm foi sendo adaptado de modo
a atender ao objetivo de diferentes indstrias.
CLASSIFICAO:
- aqueles em que cada dorna recebe um inculo: inoculao de uma dorna com um
microrganismo que foi propagado a partir de uma cultura pura. Oferece poucos riscos de contaminao se
a propagao do inculo foi feita em boas condies de assepsia. Nas fermentaes em que o meio rico
e o microrganismo altamente suscetvel a contaminao, a utilizao deste processo indicada, a menos
que o substrato adicionado de uma s vez no incio da fermentao leve a resultados insatisfatrios.
- processos com recirculao do microrganismo: reaproveitam como inculo o microrganismo
da batelada anterior. Para tanto, ou se espera que o microrganismo sedimente no fermentador (como o
caso de cervejarias), ou se centrfuga o meio fermentado, separando assim as clulas e reutilizando-as.
Esse procedimento comum em destilarias de lcool. No entanto, como h tendncia de aumentar o
nmero de contaminantes a cada nova batelada, as usinas normalmente empregam uma metodologia com
vistas a elimin-los.
- processo por meio de cortes: inicia-se o trabalho inoculando-se uma dorna (que ser
chamada de dorna A) com p-de-cuba; quando a fermentao atinge um estgio apropriado,
passa-se parte do contedo do fermentador A para um fermentador vazio (que ser chamado
de dorna B) e, em seguida, enchem-se as duas dornas com meio a fermentar. Essa operao
recebe o nome de corte. Diz-se que a dorna A foi cortada para a dorna B ou, ainda, que B
recebeu um corte de A.

A sucesso de cortes pode acarretar srias quedas no rendimento, principalmente quando se
trabalha com meio no esterilizado. Alm disso, o nmero de cortes sucessivos no pode ser.
previsto, sendo que o controle do rendimento poder indicar em que momento deve-se
suspender o trabalho por meio de cortes e se iniciar nova fermentao com inculo novo.
Nmero de Dornas
Consideremos uma instalao de fermentao, funcionando por processo descontnuo, que
deva fornecer, de maneira ininterrupta, lquido fermentado ao setor encarregado dos
tratamentos finais. Suponhamos, ainda, para simplificar, que no esteja sendo utilizado o
processo de cortes.
Sejam dados:
F = vazo mdia de lquido fermentado que deve ser fornecido ininterruptamente ao setor de
tratamentos finais;
t
f
= tempo necessrio para que o contedo de uma dorna fermente completamente;
V= capacidade til de cada dorna;
D =nmero de domas, de capacidade til V, necessrio para garantir a vazo F de lquido
fermentado;
t
d
= tempo necessrio para se descarregar uma dorna;
t
c
= tempo necessrio para se limpar e carregar uma dorna.
=
. .

M = massa do produto;
C = concentrao do produto final no lquido fermentado;
t = tempo para produo do produto;
r = rendimentos dos processo.

O valor de t
c
(tempo necessrio para limpar uma doma descarregada e carreg-la novamente) varia
de caso para caso. Quando se pretende, no dimensionamento de uma instalao, calcular o nmero
de domas, toma-se como ponto de partida: t
c
= t
d
.
Cronograma de
funcionamento de dornas em
um processo descontnuo.
(1) Incio do preparo da
dorna; (2) fim da carga; (3)
fim da fermentao; (4) fim
da descarga.
Conhecendo F, V e t
f
podemos calcular o nmero de dornas:
= 2 +
.

Ao procurarmos dimensionar uma instalao, os valores de F e de t so conhecidos, mas os
de V podem variar em intervalos muitos amplos. Surge, portanto, a necessidade de
escolher um valor de V para podermos dar andamento ao projeto que nos interessa.
Nmero Econmico de Dornas
Esse nmero econmico, indicado por E, pode ser calculado como segue: sendo p
o custo de um fermentador de capacidade til V, vlida a equao emprica:
= .

Sendo k e a dois parmetros que dependem das condies econmicas locais no
momento considerado, e 0 < a< 1. Como os termos k, F, t
1
e a so constantes, pode-se
substitu-los por K, que uma constante fruto das operaes que envolvem as
constantes acima. Portanto, chega-se a:
=
.
( )

Clculo da capacidade til de cada um dos E fermentadores:
=
.
. ( )

Pode-se tambm avaliar o nmero econmico de dornas, sem determinar os parmetros
da correlao emprica, da seguinte maneira: tendo-se uma lista de preos de domas de
diversas capacidades, calcula-se, para cada valor de V desta lista, o correspondente D
pela equao:
= +
.

Tendo se D e o preo unitrio, calcula-se o preo das D dornas; escolhe-se ento, entre os
diversos valores calculados, o valor de V, e consequentemente de D, que tenha conduzido
ao custo total mnimo.

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