DESNATURALIZACIN Y CUANTFICACIN DE PROTENAS

Cindy Lorena Riveros Acevedo

Juan Camilo Velsquez Rodrguez
Grupo 3
Ingeniera Agronmica
Facultad de Ciencias Agrarias

Palabras clave: protena, desnaturalizacin, casena, solventes orgnicos, Biuret, clara de huevo

Objetivo General

Realizar la desnaturalizacin y cuantificacin de una muestra de protena

Objetivos especficos

Utilizar e identificar las diferencias que se presentan en la desnaturalizacin de una
protena con diferentes mtodos
Determinar la concentracin de protena de la muestra de clara de huevo a partir del
mtodo Biuret con respecto a una solucin de concentracin de protena conocida
Introduccin
La desnaturalizacin de una protena es la alteracin de la estructura terciaria de la misma.
Cuando se realiza este proceso se generan cambios en las propiedades fsicas y biolgicas de la
protena, como la disminucin de la solubilidad y la prdida de la actividad cataltica en las
enzimas. Cuando la desnaturalizacin se revierte, se da un proceso llamado renaturalizacin que
en general implica la recuperacin de la actividad biolgica de la protena (McMurry, 2001).

La cuantificacin de protenas, por su parte, es una determinacin que tiene bastante importancia
en los laboratorios de investigacin y tambin para la industria alimenticia, farmacutica y de
biotecnologa. Se basa generalmente en sus propiedades qumicas. (Garca Arellano & Vsquez
Duhalt, 1998)
La tcnica utilizada en el laboratorio fue la que se realiza con el reactivo de Biuret, que es una 20-
40mg de protena para una adecuada deteccin. Presenta adems interferencias ante la presencia
de NH4+ (Badui Dergal, 2006)

Resultados
Desnaturalizacin de protenas
o Desnaturalizacin trmica: En este experimento, cuando se calent la muestra de
clara de huevo por 5 min a 37 C no se observ ningn cambio en sta. Por su
parte, en la muestra que se calent hasta ebullicin se observ la conversin de
un color transparente a un color lechoso.
o Desnaturalizacin por pH extremos: En la muestra a que se le adicion HCl se
observaron partculas en suspensin y un color ms turbio. A su vez, la muestra a
la que se le adicion NaOH no present ningn cambio.
o Desnaturalizacin por solventes orgnicos: En la muestra a la que se agreg etanol
se observ un color lechoso, una sola fase y se percibe ms espeso. En la muestra
con acetona se observa un color lechoso ms oscuro y partculas en suspensin.

Cuantificacin de protenas
Concentracin del patrn de casena: 5mg/ml

Tubo B 1 2 3 4 5
Absorbancia
(540 nm)
0.000 0.013 0.066 0.101 0.149 0.190
Concentracin
(mg/ml)
0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000
Tabla No. 1. Valores de absorbancia con patrn de casena

La concentracin del patrn de casena se calcul utilizando la frmula V1 x V2 = C1 x C2. De esta
manera, se toma como Concentracin 1: 5mg/ml que es la concentracin original del patrn, el
volumen 1 fue 0.2ml para el tubo 1 y el volumen 2 fue 5 ml que fue el volumen al que se llev la
solucin. La frmula para encontrar la Concentracin 2 del tubo 1 quedar as:
C2= (0.2 ml*5ml)/5mg/ml
= 0.2 mg/ml
Se repite el mismo procedimiento para cada uno de los tubos

Muestra
Solucin de clara
de huevo original
Solucin clara de
huevo calentada
37 C
Solucin clara de
huevo calentada
a ebullicin
Tubo 6a 7a 8a 6b 7b 8b 6c 7c 8c
Absorbancia (540 nm) 0.028 0.067 0.164 0.079 0.142 0.188 0.09 0.184 0.32
Tabla No. 2. Valores de absorbancia de soluciones acuosas de clara de huevo

Anlisis de resultados

Para cada uno de los procesos de desnaturalizacin escriba cuidadosamente sus
observaciones. Explicar qu ocurre en cada uno de los procesos de desnaturalizacin.

En la desnaturalizacin trmica, se pudo observar que en la muestra que se calent a 37 C
(temperatura promedio del cuerpo humano) no present ningn cambio, mientras la que se llev
a ebullicin s present un color lechoso, como el cambio que sufre la clara cuando se prepara un
huevo, muestra de su desnaturalizacin. En la primera muestra no ocurri ningn cambio debido a
que no se alcanz su temperatura de transicin, temperatura de melting o temperatura de
desnaturalizacin, que es la temperatura en la cual la mitad de las molculas de la protena se
encuentran desnaturalizadas. (Badui Dergal, 2006).

Un cambio de pH logra desnaturalizar una protena debido a los cambios que pueden presentarse
en la ionizacin de las cadenas laterales cargadas, lo cual afecta el nmero de puentes salinos y
por consiguiente la estabilidad de la estructura nativa. Una desnaturalizacin alcalina implica la
neutralizacin de la carga positiva de cadenas laterales de Lys, His y Arg, una desnaturalizacin
cida implica la protonacin de cargas de Asp, Glu; ambos casos impiden la formacin de una
interaccin electrosttica (Badui Dergal, 2006). En el experimento realizado, se utiliz clara de
huevo que en su conformacin, cuenta con los aminocidos relacionados en la tabla 3.

Aminocido mg/100g
Triptfano -
cido Glutmico 1668
cido Asprtico 1223
Leucina 922
Serina 812
Lisina 739
Alanina 676
Fenilalanina 662
Arginina 635
Isoleucina 571
Valina 536
Treonina 532
Metionina 441
Prolina 406
Glicina 395
Tirosina 390
Cistina 267
Histidina 262
Tabla No. 3. Aminocidos presentes en la clara de huevo. Fuente: FAO.

Se resalt intencionalmente en la tabla los aminocidos que estn involucrados en la
desnaturalizacin por pH. Esto para hacer evidente que los aminocidos que estn involucrados
con la desnaturalizacin cida (resaltados en rojo) se encuentran en mayor cantidad en la clara de
huevo que los involucrados en la desnaturalizacin bsica (resaltados con azul). Debido a esta
diferencia de concentraciones, en el experimento la muestra se desnaturaliz solamente con la
adicin de HCl.

En la desnaturalizacin por la adicin de solventes orgnicos a la protena, este solvente entra a
interactuar con la porcin hidrfoba de la misma y logra un desdoblamiento parcial de su
estructura terciaria (Badui Dergal, 2006). En el experimento se pudo observar la desnaturalizacin
en los dos casos, la adicin de etanol y acetona, aunque fue mucho ms clara y evidente en el caso
de la acetona.
Realizar la curva de calibracin (Absorbancia vs mg/ml de protena) de la cuantificacin,
determinar el coeficiente de correlacin y la ecuacin que describe la recta


Figura No. 1. Valores de absorbancia con patrn de casena

Se hizo el clculo del coeficiente de correlacin con ayuda del programa Microsoft Excel a partir
del comando =COEF.DE.CORREL tomando como matriz 1 los valores de concentracin del patrn
de casena y como matriz 2 los valores de absorbancia. Este coeficiente de correlacin tom un
valor de 0.99 lo cual nos indica que existe una correlacin positiva entre las dos variables.

Para hallar la ecuacin de la recta, se utiliz la ecuacin punto pendiente y la frmula para hallar la
pendiente.

Pendiente de la recta

Se tomaron las siguientes coordenadas para el clculo de la pendiente
(0.000,0.000) (1.000,0.190)
La ecuacin y la pendiente seran entonces
m = (0.190-0.000)/(1.000-0)
0.000, 0.000
0.200, 0.013
0.400, 0.066
0.600, 0.101
0.800, 0.149
1.000, 0.190
0.000
0.020
0.040
0.060
0.080
0.100
0.120
0.140
0.160
0.180
0.200
0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

(
5
4
0

n
m
)

Concentracin (mg/ml)
=0.190
Para hallar la ecuacin que describe la recta de absorbancia VS concentracin se utiliz la ecuacin
punto-pendiente

Y-0 =0.190 (x-0)
y=0.190x
Como nos interesa encontrar los valores de X y no los de Y despejamos X y nos quedar la
ecuacin que se usar para encontrar los valores de la concentracin en la muestra de clara de
huevo
X=y/0.190

Determinar la concentracin de las muestras problema a partir de la curva de calibracin
Utilizando la ecuacin obtenida a partir de la curva de calibracin se encontraron los valores de
concentracin en la muestra de clara de huevo, relacionados en la siguiente tabla

Muestra
Solucin de clara de
huevo original
Solucin clara de
huevo calentada 37 C
Solucin clara de huevo
calentada a ebullicin
Tubo 6a 7a 8a 6b 7b 8b 6c 7c 8c
Absorbancia (540 nm) 0.028 0.067 0.164 0.079 0.142 0.188 0.09 0.184 0.32
Concentracin
(mg/ml)
0.147 0.353 0.863 0.416 0.747 0.989 0.474 0.968 1.684
Tabla No. 4. Valores de concentracin de la muestra de clara de huevo


Bibliografa
Badui Dergal, S. (2006). Qumica de los alimentos (4ta ed.). Pearson Educacin de Mxico, S.A. de
C.V.
Garca Arellano, H., & Vsquez Duhalt, R. (1998). Cuantificacin de protenas: una revisin.
Biotecnologa, 3.
McMurry, J. (2001). Qumica Orgnica (5ta ed.). Ed. International Thomson Editores, S.A. de C.V.