METODOS DE DETERMI NACI ON DE NI TROGENO TOTAL

1. Mtodo de Kjeldahl
Fundamento
Se caracteriza por el uso de ebullicin, cido sulfrico concentrado que efecta la
destruccin oxidativa de la materia orgnica de la muestra y la reduccin del nitrgeno
orgnico a amonaco el amonio es retenido como bisulfato de amonio y puede ser
determinado in situ o por destilacin alcalina y titulacin.
Dificultades qumicas y prcticas
Digestin prolongada.
Conversin cuantitativa de nitrgeno a amonaco.
Espumosidad excesiva.
Accin corrosiva de cido sulfrico sobre el sistema de extraccin de humos.
Consideraciones ambientales respecto a descarga de humos y contaminacin de
aguas con catalizadores metlicos.
Soluciones
Aumentar relacin sulfato de potasio/cido sulfrico (1 g.1 m1) t 370-410C.
Uso de catalizadores metlicos.
Uso de H
2
O
2
.
Catalizadores metlicos utilizados
a) Oxido de mercurio
Ventaja
Oprima recuperacin de nitrgeno
Desventajas
Txico.
Alto costo.
Contaminacin de aguas.
Formacin de compuesto estable con amonaco el que debe ser descompuesto con
adicin de tiosulfato de sodio.
b) Selenio o mezcla de sulfato de cobre y selenio
Desventaja
El selenio puede producir prdida de nitrgeno.
c) Mezcla de sulfato de cobre y dixido de titanio
Ventajas
til en anlisis de cereales.
Uso a gran escala como rutina.
Desventaja
Menos efectiva en recuperar nitrgeno.
Determinacin de amonio
El amonio en el digestor puede ser determinado por diversos mtodos:
a. Adicin de exceso de lcali al digestor, destilacin del amonio y titulacin.
b. Mezcla alcalina de fenol con hipoclorito de sodio que da una coloracin azul
con amonio.
c. Mezcla alcalina de salicilato de sodio, nitroprusiato de sodio e hipoclorito de
sodio que da una coloracin verde esmeralda brillante con amonio.
d. Determinacin electromtrica usando un electrodo de ion especfico y una
solucin de hidrxido de sodio al 1 % .
Ventajas del mtodo de Kjeldhal
Apropiado para varios tipos de productos.
Alta fiabilidad.
Usado como mtodo de referencia.
Desventajas del mtodo de Kjeldhal
Interfieren compuestos nitrogenados no proteicos.
Uso de catalizadores txicos o caros.
Eleccin del factor de conversin.
2. Mtodo de Dumas
Fundamento
Se caracteriza por pirlisis completa de la muestra y medicin del contenido de
nitrgeno de los gases de combustin.
El nitrgeno puede ser medido con manmetro despus de absorber el dixido de
carbono en una solucin alcalina o por conductividad trmica en mtodos
automatizados.
Ventaja
Muestra equivalencias satisfactorias al compararlo con el mtodo de Kjeldahl en
anlisis de forrajes y alimentos infantiles, aunque con valores levemente mayores.
Desventajas
Incluye nitrgeno inorgnico.
Requiere pequeas cantidades de muestra 5-50 mg, finamente dividida y homognea
para minimizar el error de muestreo.
Este mtodo no puede aplicarse a material hmedo por lo que debe efectuarse un
secado previo.
3. Mtodos radioqumicos
Se han descrito dos mtodos:
a) Activacin neutrnica
Fundamento
Se irradia una cantidad pesada de muestra con neutrones lo que produce el paso
de
l4
N a
13
N. Este positrn tiene una vida media de 10 minutos y emite radiaciones
gamma las que se registran en un contador de centelleo . Las cuentas se relacionan
con el contenido de nitrgeno de la muestra.
Ventajas
Simple; rpido.
Sin problemas de contaminacin.
Los valores encontrados presentan
buena correlacin con el mtodo de
Kjeldahl.
Desventaja
El costo de infraestructura es muy elevado.
b) Activacin protnica
Fundamento
Similar al anterior con la variante de que la muestra se irradia con protones y se
efecta la conversin de
14
N a
14
O, un istopo que decae con la emisin de un protn y
de radiaciones gamma las que son registradas y relacionadas con el contenido de
nitrgeno de la muestra.
METODOS DE DETERMI NACI ON DE PROTEI NAS
Existen diversos mtodos alternativos para determinar protenas:
1. Utilizacin del factor de conversin
a) Determinar el contenido de nitrgeno total y multiplicar por un factor de conversin
de nitrgeno a protena. Este factor se calcul considerando el porcentaje de
nitrgeno que contiene la protena en los alimentos.
Desventajas del uso del factor de conversin:
Para efectos de clculo se considera el contenido de nitrgeno de la protena principal
y no de toda la mezcla.
La fraccin analizada no necesariamente es protena pura.
No se realizan correcciones de nitrgeno no proteico.
Se ha sugerido determinar el factor de conversin de nitrgeno a protena utilizando la
composicin de aminocidos del alimento a analizar, lo que se complica al combinar
los alimentos, por lo cual se prefiere continuar con el uso de los factores tradicionales
informando a su vez el factor utilizado.
b) Determinar el contenido de nitrgeno proteico y multiplicar por un factor de
conversin de nitrgeno a protena.
Se han utilizado diversos mtodos para separar la protena de compuestos
nitrogenados no proteicos entre los que se sealan:
- dilisis y ultrafiltracin por membrana;
- coagulacin por calor (no es efectivo para casena y gelatina);
- uso de agentes precipitantes como: cido tngstico, cido
tricloroactico, hidrxido de cobre, xido frrico, acetato de plomo,
cido fosfotngstico, cido metafosfrico, cido tnico, cido
sulfosaliclico, etanol, mezcla cloroformo y octanol (8:1), mezcla fenol,
cido actico y agua (1:1:1).
Desventajas
Diferencias en las fracciones proteicas obtenidas por los diversos mtodos. Debe
considerarse posibles retenciones sobre la protena precipitada de pequeas
molculas no proteicas por adsorcin o intercambio inico. Problemas relacionados
con el uso del factor de conversin de nitrgeno a protena.
2. Mtodos qumicos
Fundamento
Las protenas presentan un amplio rango de comportamiento qumico debido a la
propiedad de los aminocidos de tener diferentes tipos de grupos funcionales, a las
reacciones qumicas de estos grupos y a los enlaces peptdicos.
Consideraciones en la aplicacin de los mtodos qumicos:
- Los alimentos son una matriz compleja por lo que se sugiere que estos mtodos empricos e
indirectos sean calibrados con el mtodo de Kjeldahl;
- se espera una buena correlacin entre estos dos tipos de determinacin de protena cuando la
relacin N no proteico/N proteico es baja y constante; y
- son satisfactorios para leche y cereales e insatisfactorios para la mayora de los vegetales y
mezclas de alimentos.
a) Mtodo de Biuret
Principio qumico
La reaccin se caracteriza por una coloracin prpura cuando los iones cpricos son
complejados por los enlaces peptdicos a pH alcalino. El matiz del color depende del
tipo de protena y su intensidad depende del contenido de protena presente.
Reactivo utilizado
Solucin alcalina conteniendo iones cpricos complejados con tartrato de sodio y
potasio.
Lectura
550 nm, a 263 nm se aumenta la sensibilidad en 10 veces.
Desventaja
Se ha encontrado poca aplicacin en anlisis de alimentos debido a la presencia de
interferentes como azcares reductores que reducen el ion cprico en medio alcalino
produciendo resultados insatisfactorios. Ejemplo: leche.
b) Mtodo "dye-binding"
Principio qumico
Se caracteriza por la formacin de un cogulo de protena, coloreado e insoluble
producto de la reaccin de la protena con una solucin coloreada de cido sulfnico a
pH 2. El anincoloreado se une por asociaciones electrostticas a los sitios bsicos de
la protena, por ejemplo a los grupos M-amino de lisina, guanidina de arginina,
imidazol de histidina y aminos terminales. Adems se producen atracciones
intermoleculares por interacciones hidrofbicas entre la protena y la mitad no inica
del anin y entre el anin unido a protena y la mitad no inica del anin en solucin.
El cogulo se separa por filtracin y se mide colorimtricamente el exceso de tintura
en el sobrenadante. Esta medida se relaciona con el contenido de protena.
Lectura
A595nm
Consideraciones
El mtodo es emprico por lo que se debe buscar la concentracin de tintura ideal que
sature la protena y forme el cogulo pero que no pierda sensibilidad.
Ventajas
Util en anlisis de rutina de muestras similares.
Econmico y rpido.
Preciso como el mtodo de Kjeldhal.
Usado como mtodo de referencia.
Desventajas
Dificultad en encontrar tinturas puras.
Desuniformidad en la calidad de las tinturas de un lote de fabricacin a otro, por lo que
se require la calibracin del mtodo con cada lote.
No es aplicable a alimentos que varen su contenido en grupos aminos (protelisis,
pardeamiento).
c) Mtodo de destilacin alcalina
Fundamento
La hidrlisis de las amidas en medio alcalino fuerte da origen a amonaco el cual es
destilado y su valor es relacionado con el contenido de protena.
Se ha encontrado que el rendimiento de amonio es altamente reproducible para una
protena dada.
d) Mtodo de Lowry
Reactivo
Acido fosfomolbdico-fosfotngstico
Fundamento
Cuando se agrega reactivo de Folin a una protena, sta se reduce a un complejo azul
de molibdeno por la oxidacin de los aminocidos tirosina, triptfano, cistina, cisterna
e histidina.
Lectura
A750 nm
Ventajas
Alta sensibilidad y simple de operar.
Desventajas
La respuesta del color vara de acuerdo al tipo de protena.
La intensidad del color no es estrictamente proporcional a la concentracin de
protena.
Los iones potasio, magnesio, EDTA e hidratos de carbono interfieren en la reaccin.
e) Mtodo de titulacin con formol
Fundamento
A la muestra neutralizada con lcali se le agrega formaldehido en exceso el cual
reacciona con cada grupo bsico de lisina y arginina. El exceso de formaldehido se
neutraliza con un exceso de lcali estndar el cual se titula, y se relaciona con el
contenido de protena.
Desventaja
Su reproducibilidad es menor a la de otros mtodos alternativos.
3. Mtodos fsicos
Consideraciones
Son ms simples, rpidos y el costo por anlisis es menor aunque el costo de los
equipos es elevado. La exactitud de estos mtodos se relaciona con las
caractersticas del material a analizar. La concordancia con nitrgeno total depende
de que el material no vare de muestra en muestra.
a) Espectroscopa infrarroja
Fundamento
Se aprovecha la absorcin del grupo amida del enlace peptdico a 6,46 Tm.
Ventajas
Rpido, anlisis de multicomponentes No destructivo.
Desventajas
Interferido por agua.
Proceso de calibracin complejo.
b) Espectroscopa infrarroja reflectante
Fundamento
La muestra se ilumina con seis longitudes de onda cercanas a la radiacin infrarroja
(0,75-2,5 Tm) y se detecta la luz reflejada.
Consideracin
Es necesaria la calibracin contra un conjunto de muestras estadsticamente
significativas, analizadas por mtodos de referencia tradicionales.
Ventajas
Rpido, anlisis de multicomponentes. Aplicable a materiales slidos. Cuantifica
protena en presencia de agua.
Desventajas
Interfieren almidones y lpidos.
Desplazamiento de espectro de reflectancia por humedad contenida en las partculas.
Proceso de calibracin complejo.
c) Espectrofotometra ultravioleta
Fundamento
Mide protenas en solucin con absorcin mxima a 280 nm atribuible a los anillos
aromticos de tirosina y triptfano y entre 180-220nm.
Ventajas
Rpido, no destructivo.
Util para monitorear eluentes en columnas cromatogrficas.
Desventaja
Interferencia de otros compuestos (cidos nucleicos, nucletidos).
d) Mtodos refractomtricos
Fundamento
Mide la refraccin directa de la protena en solucin o el cambio de ndice de
rafraccin causado por la remocin de la protena de la solucin.
e) Mtodo turbidimtrico
Fundamento
Mide la reduccin de la intensidad de la luz al pasar por una suspensin de partculas
de protenas. Este cambio se relaciona con el contenido de protena.
f) Espectroscopa electrnica
Fundamento
Irradiacin del material con rayos X y cuantificacin de los fotoelectrones liberados
caractersticos al tomo de N del grupo amida de la protena.
Ventaja
Buena correlacin con contenido de N total.
Pueden determinarse simultneamente otros grupos de inters (grupos sulfuras de
aminocidos).
g) Polarografia
Determina trazas de protena.
METODOS DE DETERMI NACI ON DE AMI NOACI DOS
Los aminocidos constituyen la estructura primaria de la protena y le confieren el
valor nutricional a los alimentos.
Para el anlisis de los aminocidos es necesario romper los enlaces peptdicos de las
protenas por medio de hidrlisis que puede ser cida, alcalina o enzimtica. La
hidrlisis cida se realiza con cido clorhdrico de concentracin 6N. El reactivo debe
ser puro y no debe dejar residuos por lo que se recomienda una hidrlisis en fase
gaseosa. Para que la hidrlisis de las protenas sea completa es necesario tener en
cuenta factores como la razn cido/protenas, la temperatura y el tiempo de hidrlisis
y evitar la presencia de oxgeno en el medio aplicando vaco y nitrgeno para
minimizar la oxidacin de los aminocidos.
Consideraciones de la hidrlisis cida
La hidrlisis cida afecta la estructura de ciertos aminocidos, como:
a. Destruccin parcial de treonina, serina, cistina, cisterna, metionina y tirosina.
La destruccin de cistina, cistena y metionina se evita oxidando primero la
muestra con cido perfrmico y se determinan en su lugar el cido cisteico y
metionina sulfona.
El triptfano se destruye totalmente con el cido clorhdrico por lo que para su
determinacin es necesario realizar una hidrlisis alcalina.
b. Conversin de: tirosina a un cloro- derivado; asparagina a cido as- prtico; y
glutamina a cido glutmico.
c. Liberacin lenta de isoleucina y valina.
Para compensar las prdidas producidas en los aminocidos y adems para
cuantificar los aminocidos presentes se puede adicionar a la muestra antes de la
hidrlisis, una cantidad conocida de un estndar interno que puede ser el cido 2-
aminobutrico.
Los aminocidos libres se derivatizan por mtodos precolumna o postcolumna y se
separan aplicando la cromatografa de intercambio inico, la cromatografa lquida de
alta resolucin o la cromatografa gas-lquido.
Requisitos de una derivatizacin precolumna:
Condiciones de reaccin suave y rpida.Que forme derivados estables y de respuesta
lineal.
Que los factores de respuesta sean similares para todos los aminocidos.
Que sea reproducible.
Alta resolucin de los derivados de aminocidos.
Que reaccione con aminocidos primarios y secundarios.