BOMBEO DE PROTONES EN LEVADURA

Brenda Natalia Londoo Vlez 1240117, Oscar Eduardo Polania 1236096

Universidad del Valle
Programa de Biologa
Laboratorio de bioqumica y biologa celular II

Santiago de Cali, Colombia

natalialondo95@gmail.com; ospol990@hotmail.com
Resumen
Las levaduras (Saccharomyces cerevisiae) son hongos unicelulares no filamentosos, con
una morfologa caracterstica esfrica u ovalada. Estos organismos son hetertrofos, que
tienen la capacidad de crecer como organismos anaerobios facultativos o aerobios. En su
mitocondria se produce el ATP que utilizan para realizar sus funciones metablicas, el
objetivo de la prctica es comprobar la existencia de un bombeo de Iones H
+
hacia el
medio extracelular, para verificar esto, a la clula de levadura se le realizaron mediciones
del pH extracelular al agregar un nutriente como la glucosa y otros compuestos como el 2,4
dinitrofenol (DNP) y la azida de sodio, siendo el DNP el desacoplante y la azida de sodio el
inhibidor, la prueba control del experimento fue las levaduras con la glucosa y as lograr
establecer una relacin entre el trabajo realizado por las enzimas en su estado natural,
encontrando as una pH= 0,78 y un H
+
= 0,1659 que se obtuvo al realizar la diferencia
entre el pH del estado basal y el pH del estado final, luego se realizo la misma prueba y esta
vez se le agrego 2,4-dinitrofenol y as observar la accin desacoplante que este tiene sobre
la levadura y obteniendo pH=0,27y un H
+
=0,537, y finalmente se analizo el efecto
inhibidor que tiene la azida de sodio sobre las levaduras y esta dio como resultado una
pH=0,51 y un H
+
=0,309, Con estos datos se logro establecer una relacin entre bombeo
de protones y el ingreso de glucosa para generar de energa metablica, en conclusin el
efecto que tiene el DNP es de desacoplante y azida de sodio inhibidor en los procesos como
la respiracin celular, el transporte de protones y la produccin de energa en forma de
ATP.
Palabras claves: ATP, levaduras, metabolismo, 2,4dinitrofenol (DNP) desacoplante, azida
de sodio (inhibidor), pH
Introduccin
Las levaduras tienen un sistema para bombear protones al exterior, y ello resulta de la
generacin de un potencial elctrico, negativo en el interior. Por esta razn el K
+
, un catin
se ve atrado al interior de tal manera que, con la sola presencia de un sistema de transporte
que facilite su entrada, puede traspasar la membrana y acumularse con mayor
concentracin que afuera.
Las investigaciones que se realizaron fundamentalmente en los cincuentas por Conway,
estimularon el desarrollo de la hiptesis quimiosmtica. Durante muchos aos se busc un
intermediario qumico que acoplara la oxidacin metablica con la sntesis de ATP.
Posteriormente Mitchell en 1961, postul su hiptesis quimiosmtica con el propsito de
explicar los mecanismos de conservacin de energa y el transporte de iones en los sistemas
vivos. Como consecuencia, Mitchell sugiri que el nico intermediario en la fosforilacin
oxidativa era un gradiente de protones creado a travs de la membrana. La idea central de la
hiptesis establece que la cadena transportadora de electrones de las mitocondria o
bacterias est acoplada a la sntesis de ATP mediante un potencial electroqumico de
protones, el cual crea a travs de las membranas trasductoras de energa y es necesario
tambin para mover los iones al interior de las membranas de las mitocondrias o bacterias,
en contra de un gradiente de concentracin qumico mediante sistema de transporte
especfico. De acuerdo con esta teora, los sistemas de transporte de electrones pueden ser
sistemas de transposicin primaria o bombas, que proporcionan energa con que opera una
ATP sintetasa para generar ATP de la clula. Los experimentos en levadura y la teora de
Mitchell condujeron al planteamiento de la existencia de una bomba de protones en la
membrana plasmtica.
Posteriormente se llevaron a cabo experimentos con desacoplantes y se observ que el
efecto de los mismos dependa de la direccin de los gradientes combinados de H
+
y K
+
o
del potencial electroqumico de la clula y de acuerdo con la capacidad reportada para
conducir protones a travs de la membrana, demostr la existencia de una bomba de
protones (ATP asa), responsable de crear el potencial electroqumico que involucra el
transporte de potasio de una forma acoplada pero independiente, acorde a lo escrito por la
hiptesis quimiosmtica.
La bomba de protones de la membrana plasmtica dirige funciones fisiolgicas que son
vitales para la levadura, y por esto, se espera que su actividad sea fuertemente regulada por
diversos factores, como lo reportan algunas investigaciones que han observado la
hiperpolarizacin de las clulas de levadura, cuando se preincuban con glucosa, o induccin
de un estado activado de la ATPasa de membrana plasmtica por este sustrato.
La prctica se llev a cabo con el propsito de comprobar la existencia de dicho bombeo de
protones de la levadura hacia el medio extracelular, establecer una relacin entre el bombeo
de protones y el transporte de nutrientes y la generacin de energa metablica.




Resultados
Se midi la diferencia del pH extracelular de la levadura con 3 compuestos: glucosa, 2,4-
dinitrofenol y azida de sodio. Se determin pH de los 3 compuestos entre el estado basal y
el estado final, el pH=0,78 de solo la glucosa fue mayor que el pH de las otras 2
mezclas: glucosa+2,4-DNP con un pH= 0,27 y glucosa + azida de sodio con un pH=
0,51


Tabla No 1. Diferencia del pH de glucosa, 2,4-DNP y azida de sodio en diferentes intervalos de
tiempo.
Tiempo (min) Glucosa pH 2,4 -dinitrofenol pH Azida de sodio pH
0 4,73 4,24 5,12
3 4,43 4,36 5,28
6 4,41 4,43 5,36
11 4,26 4,44 5,13
16 4,05 4,37 5,01
21 3,92 4,31 4,99
26 3,83 4,27 4,98
31 3,77 4,25 4,94
41 3,69 4,2 4,86
51 3,63 4,16 4,85
pH 0,78 0,27 0,51
H+ 0,1659 0,537 0,309



Figura No 1.Grfico en el cual se compara el cambio de pH a medida que pasa el tiempo para
soluciones que contienen glucosa, glucosa + 2,4-DNP y glucosa + azida de sodio se realiz el
clculo del cambio de pH en la glucosa, con el propsito de obtener control, para as lograr
comparar con los resultados obtenidos del cambio de pH de las dos mezclas (glucosa+2,4-DNP,
glucosa+ azida de sodio), estos cambios de pH se logran registrar en la levadura por las dos mezclas
es debido a que el 2,4-DNP es un desacoplante y la azida de sodio es un inhibidor de la enzima
(ATP-asa) que es la encargada de hidrolizar el ATP.
Discusin
La teora quimiosmtica de la sntesis del ATP: Para poder entender la relacin entre el
funcionamiento de la cadena respiratoria y la sntesis de ATP, se deben tener presentes
algunos aspectos importantes como la creacin del gradiente de protones por la cadena
respiratoria entre la matriz mitocondrial y el espacio intermembrana y segundo, la
presencia de la membrana interna de un complejo proteico que va a permitir a partir de
dicho gradiente, la sntesis de ATP. Este complejo se conoce como la ATP-sintasa o
complejo V. (Fornaguera & Gomez 2001)
Este gradiente se origina como producto del funcionamiento de la cadena respiratoria que
utilizando la fuerza electromotriz de los electrones, favorece el paso de protones de la
matriz hacia el espacio intermembrana; de esta manera, se aumenta la concentracin de
protones en el espacio intermembrana y se establece un gradiente o diferencia entre las dos
regiones separadas por la membrana interna de la mitocondria. (Fornaguera & Gomez
2001)
El gradiente que se crea tiene dos componentes, uno de concentracin y otro elctrico; por
eso recibe el nombre de gradiente electroqumico. Un gradiente siempre contiene una
3.5
4
4.5
5
5.5
0 10 20 30 40 50
glucosa
2,4 - DNF
Azida de sodio
pH

Tiempo
(minutos)
energa inherente a esa diferencia que hace que las partculas, en este caso los protones, se
vean impulsados por las cargas y por concentracin (difusin) hacia la atriz mitoconcdrial
(regin con menor concentracin de protones y adems con una carga relativa negativa
mayor que el espacio intermembrana). Como la membrana interna es tan impermeable, los
protones no pueden pasar simplemente a travs de ella; deben hacerlo a travs de una
protena especifica (canal). Esta protena es subunidad F
0
de la ATP-sintasa. (Fornaguera &
Gomez 2001)
Los protones pasan por F
0
hacia la matriz impulsados por las dos fuerzas mencionadas;
cuando llegan a F
1
producen cambios conformacionales complejos en sus subunidades
proteicas y estimulas la sntesis de ATP y su liberacin a la matriz mitocondrial. En otras
palabras, el paso a los protones se convierte en la fuerza motriz de la sntesis y la liberacin
de la modena energtica de la clula: el ATP; las molculas de ATP sintetizadas se liberan
a la matriz mitocondrial por la F
1
.(Fornaguera & Gomez 2001)
Existen muchos agentes que pueden alterar la sntesis de ATP asociada a la cadena
respiratoria. De acuerdo con los mecanismos de accin de pueden clasificar en
desacoplantes e inhibidores del transporte de electrones, los inhibidores de la ATP-sintasa y
los inhibidores de la ATP-translocasa. (Foranguera & Gmez, 2004)
Los desacoplantes son sustancias que evitan en acopla entre el transporte de electrones y la
fosforilacin de ADP para sintetizar el ATP. (Foranguera & Gmez, 2004). El 2,4-
dinitrofenol funciona como un transportador de protones (H+); como consecuencia se
genera un aumento en la conduccin de electrones a lo largo de la cadena respiratoria sin
un aumento proporcional de la sntesis de ATP. El efecto del 2,4-dinitrofenol causa un
efecto dramtico pues no solo disminuye el gradiente elctrico sino que tambin disminuye
el gradiente qumico. (Foranguera & Gmez, 2004)
Al realizar la prctica cuando se le agrego glucosa a la solucin con levadura, en ella se
incremento la produccin de ATP en el citosol, por el aumento en la accin de la ATPasa,
que utiliza la energa liberada por hidrolizar el ATP para transportar iones H
+
al exterior
celular, de manera que se genera un gradiente, el cual es utilizado para el ingreso de la
glucosa. Una vez en el interior de la clula, la glucosa se utiliza para producir energa y
para mantener los gradientes, mientras que el medio extracelular se acidifica con la salida
de iones H
+
, lo cual se logra observar con la disminucin del pH al transcurrir el tiempo
(Figura No. 1)(Quesada, 2007).
Como se observ en los resultados, la adicin del 2,4-dinitrofenol produjo una disminucin
del pH, esto debido a que la concentracin de H
+
extracelular disminuye al ser captado y
transportado al interior de la levadura mediante el desacoplante. Como consecuencia, en el
interior de la clula de levadura se acumula ADP y se interrumpe la proporcin ADP/ATP.
Los inhibidores de la Cadena de Transporte de Electrones (CTE) son substancias que se
enlazan a alguno de los componentes de la cadena de transporte de electrones bloqueando
su capacidad para cambiar de una forma reversible desde la forma oxidada a la forma
reducida y viceversa. (Melo & Cuamatzi, 2006)
Esta inhibicin resulta en una acumulacin de los componentes en sus formas reducidas
antes del punto de inhibicin, y la presencia de las formas oxidadas de los componentes de
la CTE despus del punto de inhibicin. (Melo & Cuamatzi, 2006)
La azida de sodio es un compuesto inico que consta de un in sodio y un anin azida, es
un grupo con fuerte carga negativa, que afectan a la cadena respiratoria de una forma muy
similar al cianuro, inhibiendo a los grupos Hem de los citocromos en la Citocromo Oxidasa
(Complex IV). Catalizado la transferencia de electrones desde el citocromo C al oxigeno,
de la cadena respiratoria que se encuentra en la mitocondria unida fuertemente a la zona
hemoa
3
(Fe
2+
) (zona oxidada) y esto impide que se logre la transferencia de electrones
desde el hemo
a
al centro binuclear, lo cual da a entender que el oxgeno no podr ser
absorbido en el ncleo del citocromo y adems que esto desestabilizara el gradiente
necesario para generar la fuerza protn-motriz, encargada de otorgarle la energa a la
ATPsintasa para la sntesis de ATP, lo cual explica que al agregar la azida de sodio se
observara que el nivel de acidez en el exterior de la membrana plasmtica disminuyera an
ms que al utilizar el 2,4-dinitrofenol (Berg,et al 2008).
Como resultado de la accion de cualquiera de estos inhibidores, se detienen las reacciones
redox de la cadena respiratoria, no se libera energa, las bombas de protones no funcionan,
por lo que no hay protones que regresen a travs del complejo V, y la produccin de ATP
cesa. (Melo & Cuamatzi, 2006)
En el laboratorio se tomaron las medidas del pH de la solucin de levadura con glucosa,
observndose un rpido decrecimiento del pH en funcin del tiempo. La velocidad de
oxidacin de la glucosa se ajusta para satisfacer las necesidades de ATP de la clula.
(Lodish, Berk et al. 2006)
En conclusin se puede decir que el desacoplante y el inhibidor afectan negativamente el
transporte de protones en la membrana, lo cual afecta la entrada de glucosa en la membrana
y baja la produccin de ATP en la clula





Bibliografa
Alberts B. Bray D. Introduccin a la biologa celular.(2004). 2 edicin. Editorial mdica
Panamericana. Madrid-Espaa Pp 459-467
Berg, J. Stryler, L. Tymoczko, J.2008. Bioqumica. Revert S.A Ed. Barcelona, Espaa. Pg.
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Fornaguera J. & Gmez G. Bioqumica, la ciencia de la vida (2004). 1 edicin. Editorial
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Melo V & Cuamatzi O. Bioqumica de los procesos metablicos (2006).Editorial Revert.
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Quesada, S. 2007. Manual de experimentos de laboratorio para bioqumica. Universidad
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Revista latinoamericana de microbiologa. Mxico DC-Mxico. Volumen 41, N 2 MX
ISSN -0034-9771. P 95 Abril-Junio 1999. Editada por la asociacin mexicana de
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Lodish H. Berk A. Matsudaira P. Kaiser C. Krieger M. Scott M. Zipursky L. Darnell J.
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