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SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE SENA

REGIONAL BOLIVAR
CENTRO AGROEMPRESARIAL Y MINERO
GUIA DE LABORATORIO N 16 AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
CON CAPACIDAD ENZIMATICA
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1. INTRODUCCION.
Cada organismo produce una gran variedad de enzimas, muchas de las cuales solo se sintetizan en
pequea cantidad y estn implicadas en procesos celulares. No obstante, algunas enzimas se
producen en cantidades muchas ms grandes por algunos organismos, y en vez de quedarse en el
interior de la clula, se excretan al medio de cultivo. Las enzimas extracelulares (exoenzimas) son
capaces de digerir polmeros insolubles como la celulosa, protenas, almidn, pectina, lpidos, quitina,
entre otros; posteriormente, los productos de digestin son transportados al interior de las clulas
donde que utilizan como nutrientes para el crecimiento. Algunas de las exoenzimas se utilizan en las
industrias alimenta, lctica, farmacutica y textil, y se producen en grandes cantidades por sntesis
microbiana.

Las enzimas son biocatalizadores especialmente tiles porque a menudo actan en grupos
funcionales qumicos que son nicos, distinguen fcilmente entre grupos funcionales similares en
una misma molcula y en muchos casos, catalizan reacciones de forma estereoespecificas,
produciendo solo uno de los dos posibles enantiomeros (por ejemplo, el enantiomero D- de un azcar
o un L-aminoacido).

Tanto los hongos como las bacterias producen enzimas. Las enzimas microbianas producidas en
mayores cantidades, desde el punto de vista industrial, son las proteasas, que se usan como aditivos
en los detergentes para la lavar la ropa. La mayora de los detergentes para lavar ropa actuales
contiene enzimas, principalmente proteasas, pero tambin amilasas, lipasas, reductasas y otras.
Muchas de estas enzimas se aslan de bacterias alcalofilas, sobre todo de especies del genero Bacillus,
como Bacillus licheniformis. Estas enzimas tienen un pH ptimo entre 9 y 10, permanecen activos al
pH alcalino de las soluciones de los detergentes. (Ver tabla 1)


Tabla 1: Enzimas microbianas y sus aplicaciones

2. OBJETIVOS.
Aislar microorganismos con capacidad amilolitica y proteoltica
Seleccionar microorganismos con mayor capacidad amilolitica y proteoltica
Identificar macroscpica y microscpicamente el microorganismos con mayor amilolitica y
proteoltica

3. EQUIPOS,MATERIALES E INSUMO

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Equipos: Cabina de flujo lamiar, balanza, nevera, autoclave, incubadora de bacterias, incubadoras de
hongos,
Materiales: 5 Cajas de Petri con A. almidn (Almidn soluble 10, Peptona de casena 5, NaCl 8,
Extracto de carne 3, Agar 15, g/L. Ajustar pH 6.5 a 7), 5 Cajas de Petri con agar leche (Caseina
hidrolizada 5, Extracto de levadura 2,5, Glucosa 1, Leche en polvo 1, alar 15 g/L pH final 7,2 0,2),
5 Cajas deAgar Carboximetilcelulosa (Carboximetilcelulsa 10, extracto de levadura 2.5, peptona
universal 2.5, sulfto de amonio 0.5, Cloruro de calcio 0.5, fosfato monobsico de potasio 0.1, fosfato
dipasico de potasio 0.1, agar 15 g/L pH final 7,2 0,2) 1 Pipeta de 10 mL, 1 Pipeteador, 2 pipetas de 1
mL graduadas, 1 Frasco tapa rosca con 90 ml de solucin salina al 0,85%p/v, 5 tubos tapa rosca con
9 ml de solucin salina al 0,85%p/v. 1 esptula o cuchara estril, 1 Gradilla. Marcador permanente.

4. PROCEDIMIENTO
4.1. Aislamiento de microorganismos por dilucin
Colocarse la indumentaria correspondiente (bata, gorro, tapa boca y polainas) antes de iniciar el
anlisis.
Esterilizar la cabina de flujo laminar media hora antes de iniciar con el anlisis.
Alistar los materiales
Pesar 10 g de muestra en el frasco con 90 ml de solucin salina (dilucin 10
-1
)
Realizar las diluciones seriadas desde 10
-2
hasta 10
-6

Sembrar en superficie
Adicionar 0,1 mL de la dilucin seleccionada en cada caja de agar leche, almidn y celulosa
Esparcir con la pipeta o variila de jokey bien la muestra
Repetir este proceso con cada una de las cajas de petri inoculadas
Rotular con el nombre de la tcnica, No. De la muestra, responsable, fecha de anlisis, fecha de
lectura y dilucin sembrada.
Invertir las placas y cubrir con vinipel
Incube por 24 48 horas entre 35+/-2C.
Revelar la actividad enzimtica, agar almidn con unas 4 gotas de lugol y agar CMC con rojo Congo.
Cuente las colonias.
Informar el resultado

4.2. Aislamiento de microorganismos por agotamiento
Tomar las colonias con produccin de enzimas con un asa de siembra, previamente esterilizada,
Extender sobre un rea pequea de la superficie de la placa con agar de acuerdo con la capacidad en
forma de estras muy juntas, pero sin hacer presin para no daar el agar
Flamear el asa, se enfra y despus de rozar la siembra realizada previamente,
Extender de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estras.
Repetir este proceso, flameando y enfriando el asa al comienzo de las sucesivas siembras en estra.
Llevar a incubar, a la temperatura adecuada, siempre en posicin invertida.
Mediante esta tcnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que contenga un elevado
nmero de bacterias.

4.3. Identificacin macroscpica y microscpica de los microrganismos
Realizar la observacin macroscpica
Hacer la descripcin de la forma, tamao, aspecto, textura y color de las colonias de los
microorganismos aislados
De las colonias presuntamente de levaduras y bacterias realizar un frotis y una coloracin de gram;
de hongos filamentosos realizar una coloracin fresca con azul de lactofenol.
Observar en microscopio
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5. RESULTADOS
5.1. Resultado de aislamiento
Recuento total
UFC/mL A. leche
Recuento total
UFC/mL A.
almidn
Recuento total
UFC/mL A. CMC
Colonias
proteoliticas
A. leche
Colonias
amiloliticas
A. almidn
Colonias
celuloliticas
A. CMC








5.2. Resultados de identificacin micro y macroscpica
Identificacin macroscpica
Forma
Tamao
Aspecto
Textura
Color
Identificacin microscpica
Gram
Pureza
Endoesporas
Flagelo



6. DISCUSION DE RESULTADOS











7. CONLUSIONES




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8. PREGUNTAS
8.1. Con la caracterizacin micro y macroscpica es suficiente para identificar el gnero de un
microorganismo?





8.2. Cules pruebas bioqumicas realizara para identificar a Bacillus licheniformis?





8.3. Qu bacterias producen proteasas extracelulares?





8.4. Qu bacterias producen amilasas extracelulares?





8.5. Qu bacterias producen celulasas extracelulares?