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U UN NI ID DA AD D D DI ID D C CT TI IC CA A N N 1 12 2


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UD N 12: Espectrofotometra

En este captulo se le ofrecer un pantallazo general del tema enfocado en la espectrofotometra
de absorcin molecular UV-visible y se dejar que usted lo ample consultando libros de texto.
Desde antiguo se ha utilizado el color para reconocer sustancias. Al reemplazar el ojo humano
por instrumentos de deteccin de radiacin se hizo posible estudiar la absorcin de luz por
sustancias no solamente en la zona del espectro visible, sino tambin en ultravioleta e infrarrojo.
Se denomina espectrofotometra a la medicin de la cantidad de energa radiante que absorbe
un sistema qumico en funcin de la longitud de onda de la radiacin, y a las mediciones a una
determinada longitud de onda. La teora ondulatoria supone que un haz de luz es un flujo de
cuantos de energa llamados fotones. Cada fotn de una dada longitud de onda posee una
cantidad definida de energa.
Consideremos una porcin de materia (slido, lquido o gas) sobre la cual incide un haz de luz
monocromtico. El haz de radiacin, que posee intensidad I
0
(fotones.s
1
.m
2
) y potencia
radiante P
0
(W.m
2
), llega al bloque perpendicular a la superficie. Cuando atraviesa el material
de longitud b, que contiene partculas absorbentes (tomos, iones o molculas), la intensidad
del mismo disminuye a I y, luego, su potencia radiante a P como resultado de la absorcin.


Cuando una molcula absorbe un fotn su energa aumenta y se dice que ha pasado a un estado
excitado. Por el contrario, si una molcula emite un fotn, su energa disminuye y se
denomina estado fundamental al estado de mnima energa. Sin embargo, an no est claro
cmo las molculas pueden apropiarse de la energa que reciben. La interaccin de la radiacin
con las molculas se puede producir por mecanismos diferentes que dependen de la zona del
espectro electromagntico que se trate. Asi, por ejemplo, a frecuencias del orden de las
microondas las molculas absorben la energa radiante produciendo un salto cuntico a un
estado de rotacin de mayor energa. La siguiente tabla resume los mecanismos de interaccin
posibles y su efecto en el estado fsico de las molculas.
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Regin del
espectro
Rayos
gamma
Rayos X
UV y
Visible
Infrarrojo Microondas Radio
Longitudes
de onda
< 100 pm
100 pm a
10 nm
10 nm a
1000 nm
1000 nm a
100 m
100 m a
1 cm
> 1 cm
Cambio
cuntico
Cambio de
configuracin
nuclear
Ruptura de
enlaces y
ionizacin
Cambio de
configuracin
electrnica
Cambio
vibracional
Cambio
rotacional
Cambio
de spin

Recuerde que a la frecuencia de la radiacin () es inversamente proporcional a su longitud de
onda () y que la energa de un cuanto de luz est dada por la famosa ecuacin:

c
h h E = =
donde h es la constante de Planck cuyo valor es 6,63.10
-34
J.s y c es la velocidad de la luz
cuyo valor es 3,00.10
8
m/s.
Los rayos gamma (y en mayor medida los rayos csmicos) son los mas energticos y luego los
que producen los cambios ms dramticos para las molculas.
Cualquiera sea el proceso molecular que se produzca, como consecuencia de las interacciones
entre los fotones y la materia, la potencia del haz es atenuada. Se define como transmitancia
T de la solucin a la fraccin de la radiacin incidente transmitida por la solucin:

0
P
P
T =

La transmitancia se expresa a menudo en forma porcentual si se la multiplica por 100. La
absorbancia A de una solucin se define mediante la ecuacin:

+ =

= =
P
P
P
P
T A
0
0
log log log

La mayor parte de los trabajos analticos se realizan con disoluciones acuosas de manera que es
de nuestro inters investigar la relacin que existe entre la concentracin de la solucin y su
capacidad de absorber radiacin (absorbancia).
La transmitancia y la absorbancia se miden en un instrumento llamado espectrofotmetro, la
solucin de analito se coloca en un recipiente transparente denominado cubeta o celda. Cuando
el haz de luz atraviesa la celda, puede ocurrir reflexin en la interfase aire-pared pared-
solucin y la atenuacin del haz resultante es importante. Adems, puede ocurrir atenuacin del
haz por dispersin de molculas grandes y a veces por absorcin de las paredes del recipiente.
Para compensar estos efectos, la potencia del haz transmitido por la solucin del analito se
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compara con la potencia del haz transmitido por una celda idntica que contiene solamente el
solvente y los reactivos: el blanco. De este modo, una determinacin experimental que se
aproxima mucho a la absorbancia verdadera se obtiene con la ecuacin:

=
blanco
soluc
P
P
A log
Normalmente los espectrofotmetros poseen una escala lineal que va de 0 a 100% de
transmitancia. Para poder hacer una lectura directa del porcentaje de transmitancia, se deben
efectuar dos ajustes previos, llamados 0%T y 100%T, es decir calibrar el instrumento. El
ajuste del 0%T se lleva a cabo mediante el cierre mecnico del detector y el ajuste de 100%T se
hace con el cierre abierto y el blanco colocado en el camino de la luz.
Normalmente el solvente est contenido en una celda idntica a las que contienen las muestras.
Cuando la celda del solvente se reemplaza por la celda que contiene la muestra, la escala da la
transmitancia porcentual. Los instrumentos modernos poseen un sistema electrnico que realiza
la operacin matemtica y da la respuesta directamente como absorbancia.
Volvamos al haz de radiacin paralela monocromtica que atraviesa una capa de una solucin
de espesor de b que posee concentracin c de una especie absorbente. Como consecuencia
de interacciones entre los fotones y las partculas absorbentes, la potencia del haz es atenuada.
La ley de Lambert-Beer establece que la absorbancia es directamente proporcional a la
longitud del camino b a travs de la solucin y la concentracin c de la especie absorbente.
Esta relacin se puede expresar matemticamente como:
A = abc
Siendo a una constante de proporcionalidad llamada absortividad coeficiente de extincin.
La magnitud de a depender de las unidades empleadas para b y c. Con frecuencia, b se expresa
en cm y c en gramos por litro, entonces la absortividad tiene unidades de L.g
1
.cm
1
. Cuando la
concentracin se expresa en moles por litro y la longitud de la celda en centmetros, la
absortividad se llama absortividad molar, se designa como y tiene unidades de L.mol
1
.cm
1
,
entonces la absorbancia es:
A = bc

Denominamos espectro (de absorcin) una sustancia a la representacin de la absorbancia
(A) en funcin de longitud de onda (). Este grfico presenta ondulaciones con mximos que
se deben a las interacciones de los distintos grupos funcionales con la radiacin. Veamos el
caso de la clorofila como ejemplo:

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Para hacer determinaciones cuantitativas es conveniente elegir la longitud de onda correspon-
diente a un pico de absorcin, pues el error de medicin es mnimo y la sensibilidad mxima.
Para verificar el cumplimiento de la ley de Beer, se debe realizar una curva de calibracin;
absorbancia (A) en funcin de concentracin (c), para lo cual se preparan soluciones de la
sustancia de concentraciones conocidas y se mide la absorbancia a la longitud de onda elegida.
Si es vlida la ley de Beer para esa sustancia a esas concentraciones, la relacin debe ser una
recta que pasa por el origen de coordenadas; cuya pendiente se puede calcular utilizando el
criterio estadstico de los mnimos cuadrados restringido al orgen como:

=
2
.
i
i i
C
C A
b

La ley de Beer tambin se puede aplicar a una solucin que contiene ms de una sustancia
absorbente. Siempre que no haya interaccin entre las varias especies, la absorbancia total para
un sistema multicomponente est dada por:

A = A
1
+ A
2
+ ... + A
n
=
1
b c
1
+
2
b c
2
+ ... +
n
b c
n


indicando con los subndices 1,2,,n, las especies absorbentes. Desde el punto de vista
matemtico es necesario plantear tantas ecuaciones independientes como incgnitas tenga. Por
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ello, para n concentraciones incgnitas se deben hacer, como mnimo, n mediciones de
absorbancia a distintas longitudes de onda.
Existen muy pocas excepciones a la relacin lineal entre la absorbancia y la longitud del camino
ptico. En cambio, las desviaciones a la proporcionalidad directa entre la absorbancia y la
concentracin (a b constante) son ms frecuentes. Estas desviaciones son fundamentales y
representan limitaciones reales de la ley. Algunas ocurren como consecuencia de la manera en
que se hacen las mediciones de absorbancia, o como resultado de cambios qumicos asociados
con cambios en la concentracin. Otras ocurren a veces como desviaciones instrumentales.
La ley de Beer describe con buena exactitud el comportamiento de soluciones diluidas. Cuando
las concentraciones son altas (generalmente mayores a 0,01 M), la distancia promedio entre las
molculas de analito disminuye hasta el punto en que cada una afecta la distribucin de cargas
de sus vecinas. Esta interaccin puede alterar la habilidad de las especies para absorber a una
longitud de onda de radiacin. Debido a que la interaccin depende de la concentracin, la
ocurrencia de este fenmeno provoca desviaciones de la relacin lineal entre absorbancia y
concentracin. Por otro lado, se encuentran algunas excepciones entre ciertos iones o molculas
orgnicas grandes, que presentan interacciones significativas a concentraciones debajo de 0,01
M, por lo que presentan desviaciones an a bajas concentraciones.
Las denominadas desviaciones qumicas surgen cuando un analito se disocia, se asocia, o
reacciona con el solvente para producir un producto que posee un espectro de absorcin
diferente del analito. Por ejemplo, la absorbancia del una solucin de cromato depende del pH.
Las denominadas desviaciones instrumentales se deben al uso de radiacin policromtica. Se
observa una adhesin estricta a la ley de Beer solamente cuando la radiacin es monocromtica
verdadera; esta observacin es otro indicador del carcter limitante de la ley. El uso de
radiacin restringida a una longitud de onda nica es raro porque los instrumentos que aislan
porciones de una fuente de radiacin continua producen una banda ms o menos estrecha de
longitudes de onda alrededor de la deseada.
Las mediciones fotomtricas o espectrofotomtricas se pueden emplear para detectar el punto
de equivalencia de una titulacin, siempre que el analito, el reactivo o el producto de la
titulacin absorban radiacin. Asimismo, un indicador absorbente puede proveer el cambio
necesario de absorbancia para la deteccin del punto final. Una curva de titulacin fotomtrica
es un grfico de absorbancia en funcin del volumen del titulante. Si se eligen las condiciones
adecuadas, la curva consistir en dos lneas rectas con distinta pendiente, una de ellas se produce
antes y la otra despues del punto de equivalencia. Segn sea el analito, el reactivo o algn
producto de la titulacin quien absorba la radiacin se obtienen los siguientes casos:
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Caso 1: Solo absorbe radiacin el titulante, es decir que
A
=
P
= 0.
Caso 2: Solo absorbe radiacin el producto, es decir que
A
=
T
= 0.
Caso 3: Solo absorbe radiacin el analito, es decir que
T
=
P
= 0.
Caso 4: Solo no absorbe radiacin el producto, es decir que:
T
= 0, con
A
>
P
.
Caso 5: Solo no absosbe radiacin el analito, es decir que
A
= 0, pero
T
>
P
.
Caso 6: Solo no absorbe radiacin el analito, es decir que
A
= 0, pero
P
>
T
.

Si la reaccin no es cuantitativa cerca del punto de equivalencia se pueden extrapolar los dos
segmentos lineales y su interseccin determina dicho punto, siempre con la condicin de que se
cumpla la ley de Beer.
La deteccin espectrofotomtrica es mucho ms sensible que el ojo humano por lo que puede
utilizarse en titulaciones cuyas reacciones poseen constantes de equilibrios pequeas que no
permiten la deteccin visual del punto final. Adems, trabajando en una banda muy estrecha de
longitudes de onda, la selectividad de las determinaciones espectrofotomtricas es alta y permite
titular soluciones coloreadas, lo cual es mucho ms difcil con mtodos visuales.
Los equipos comerciales para hacer titulaciones automticas poseen un espectrofotmetro, un
vaso para la titulacin, una bureta automtica una jeringa con bomba y una interfaz para
procesar los datos con un ordenador.