Ensayo Polímeros Hidrofilicos

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

Departamento de Qumica Orgnica

SISTEMAS POLIMRICOS HIDROFLICOS CON
GRUPOS IONIZABLES Y SU APLICACIN COMO
BIOMATERIALES

MEMORIA PRESENTADA PARA OPTAR AL GRADO DE
DOCTOR POR

Mara Rosa Aguilar de Armas

Bajo la direccin de los Doctores:

Alberto Gallardo Ruiz
J ulio San Romn del Barrio

Madrid, 2002

ISBN: 84-669-1812-4
M MA AR R A A R RO OS SA A A AG GU UI IL LA AR R D DE E A AR RM MA AS S

T TE ES SI IS S D DO OC CT TO OR RA AL L

S SI IS ST TE EM MA AS S P PO OL LI IM M R RI IC CO OS S H HI ID DR RO OF F L LI IC CO OS S C CO ON N
G GR RU UP PO OS S I IO ON NI IZ ZA AB BL LE ES S Y Y S SU U A AP PL LI IC CA AC CI I N N C CO OM MO O
B BI IO OM MA AT TE ER RI IA AL LE ES S

U UN NI IV VE ER RS SI ID DA AD D C CO OM MP PL LU UT TE EN NS SE E D DE E M MA AD DR RI ID D
F Fa ac cu ul lt ta ad d d de e C Ci ie en nc ci ia as s Q Qu u m mi ic ca as s
D De ep pa ar rt ta am me en nt to o d de e Q Qu u m mi ic ca a O Or rg g n ni ic ca a

I IN NS ST TI IT TU UT TO O D DE E C CI IE EN NC CI IA A Y Y T TE EC CN NO OL LO OG G A A D DE E P PO OL L M ME ER RO OS S
D De ep pa ar rt ta am me en nt to o d de e Q Qu u m mi ic ca a M Ma ac cr ro om mo ol le ec cu ul la ar r

M Ma ad dr ri id d, , 2 20 00 02 2

M MA AR R A A R RO OS SA A A AG GU UI IL LA AR R D DE E A AR RM MA AS S

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M Ma ad dr ri id d, , 2 20 00 02 2

NDICE

v

INTRODUCCIN ....................................................................................................... 3

CAPITULO 1. SNTESIS Y CARACTERIZACIN DE LOS SISTEMAS
COPOLIMRICOS BASADOS EN AMPS

1 INTRODUCCIN..................................................................................................21
1.1 Introduccin a la copolimerizacin radical.....................................................21
1.2 Copolimerizacin con AMPS.........................................................................23
2 MATERIALES Y MTODOS...............................................................................26
2.1 Reactivos y muestras.......................................................................................26
2.1.1 Reactivos.................................................................................................26
2.1.1.a Sntesis de THEMA............................................................................26
2.1.1.b Sntesis de los polmeros.....................................................................27
2.2 Caracterizacin general de los sistemas copolimricos:.................................28
2.2.1 Tcnicas espectroscpicas......................................................................28
2.2.2 Tcnicas cromatogrficas........................................................................28
2.2.3 Mtodos trmicos....................................................................................29
3 RESULTADOS Y DISCUSIN............................................................................30
3.1 Caracterizacin general de los sistemas copolimricos..................................30
3.1.1 Tcnicas espectroscpicas......................................................................30
3.1.1.a RMN-
1
H..............................................................................................30
3.1.1.b FTIR....................................................................................................33
3.1.2 Mtodos cromatogrficos........................................................................36
3.1.3 Mtodos trmicos....................................................................................38
3.1.3.a Calorimetra diferencial de barrido (DSC) .........................................38
3.1.3.b Termogravimetra (TGA)....................................................................41
4 BIBLIOGRAFA ....................................................................................................45
vi

CAPITULO 2. ESTIMACIN DE LAS RELACIONES DE REACTIVIDAD DE LOS
SISTEMAS COPOLIMRICOS CON AMPS POR RMH-
1
H in situ

1 INTRODUCCIN..................................................................................................49
1.1 Modelo terminal de copolimerizacin............................................................49
1.2 Ecuacin diferencial de composicin.............................................................51
1.3 Ecuacin integrada..........................................................................................52
1.4 Anlisis por RMN-
1
H in situ...........................................................................53
2 MATERIALES Y MTODOS:..............................................................................56
3 RESULTADOS Y DISCUSIN............................................................................60
3.1 Mtodo 1.........................................................................................................63
3.1.1 Clculo de las elipses de confianza.........................................................67
3.2 Mtodo 2.........................................................................................................70
4 EVOLUCIN DE LA COPOLIMERIZACIN CON LA CONVERSIN.........74
6 BIBLIOGRAFA ....................................................................................................79
vii

CAPITULO 3. ESTUDIO DE REACCIONES DE COPOLIMERIZACIN
RADICAL POR ELECTROCROMATOGRAFA CINTICA MICELAR (MECK)

1 Introduccin............................................................................................................83
2 Fundamentos de la electroforesis capilar................................................................85
2.1 Equipo de electroforesis capilar......................................................................87
2.2 Electroforesis capilar en zona libre (CZE)......................................................88
2.3 Electrocromatografa cintica micelar (MEKC).............................................91
3 Materiales y mtodos:.............................................................................................93
3.1 Reactivos y muestras.......................................................................................93
3.2 Anlisis por MEKC.........................................................................................94
3.3 Anlisis conductimtrico................................................................................95
4 Resultados y discusin:...........................................................................................96
4.1 Cinticas de copolimerizacin analizadas por MEKC....................................96
4.2 Anlisis conductimtrico..............................................................................102
4.3 Influencia del peso molecular y la composicin..........................................103
5 BIBLIOGRAFA ..................................................................................................112
viii

CAPITULO 4. EVALUACIN DE LOS COPOLMEROS THEMA-AMPS PARA SU
APLICACIN COMO RECUBRIMIENTOS DE PRTESIS VASCULARES DE
PEQUEO DIMETRO

1 INTRODUCCIN................................................................................................115
1.1 Propiedades y mecanismo de accin del Triflusal ........................................117
2 MATERIALES Y MTODOS:............................................................................119
2.1 Medidas de hinchamiento.............................................................................119
2.2 Estudio de la liberacin del frmaco.............................................................119
2.3 Medidas de ngulo de contacto.....................................................................120
2.4 Recubrimiento de las prtesis.......................................................................120
2.5 Adhesin plaquetaria....................................................................................120
2.6 Ensayos de biocompatibilidad in vivo...........................................................121
3 RESULTADOS Y DISCUSIN..........................................................................122
3.1 Medidas de ngulo de contacto.....................................................................122
3.2 Estudio del hinchamiento y la liberacin......................................................125
3.3 Adhesin de plaquetas..................................................................................128
3.4 Compatibilidad in vivo de los implantes copolimricos...............................131
3.4.1 Observacin macroscpica...................................................................132
3.4.2 Observacin microscpica....................................................................133
4 BIBLIOGRAFA ..................................................................................................136
ix

CAPITULO 5. SNTESIS Y CARACTERIZACIN DE LOS COMPLEJOS
POLIELECTROLTICOS (PEC) OBTENIDOS CON PLANTILLA (TEMPLATE
POLYMERIZATION)

1 INTRODUCCIN................................................................................................141
1.1 Complejos polielectrolticos (PEC) ..............................................................141
2 MATERIALES Y MTODOS.............................................................................144
2.1 Reactivos.......................................................................................................144
2.2 Interacciones quitosano-monmero AMPS..................................................144
2.3 Sntesis de los complejos polielectrolticos..................................................144
2.4 Caracterizacin.............................................................................................145
2.5 Medidas de hinchamiento.............................................................................145
2.6 Liberacin de teofilina del sistema HA-Q....................................................146
3.1 Interacciones quitosano-monmero AMPS..................................................147
3.2 Caracterizacin de los PEC...........................................................................148
3.3 Hinchamiento y anlisis gravimtrico de los complejos obtenidos con plantilla
151
3.4 Liberacin de teofilina..................................................................................155
4 BIBLIOGRAFA ..................................................................................................158
x

CAPTULO 6. BIOCOMPATIBILIDAD in vitro DE LOS COMPLEJOS
POLIELECTROLTICOS OBTENIDOS CON PLANTILLA

1 INTRODUCCIN................................................................................................161
2.1 Cultivo celular in vitro..................................................................................164
2.2 Tests de citotoxicidad...................................................................................166
2.2.1 Medio de elucin...................................................................................166
2.2.2 Ensayo MTT .........................................................................................167
2.2.3 Ensayo Alamar Blue.............................................................................167
2.2.4 Ensayo Neutral Red..............................................................................168
2.3 Microscopa...................................................................................................168
2.3.1 Microscopa ptica................................................................................168
2.3.2 Microscopa confocal: Ensayo Vida/Muerte........................................168
3.1 Sistema HA-Q...............................................................................................170
3.2 Sistema DA-Q...............................................................................................171
3.3 Microscopa confocal: Ensayo Vida/Muerte................................................174
4 BIBLIOGRAFA ..................................................................................................176
xi

CAPTULO 7. APLICACIN DE LA RESONANCIA DE PLASMN
SUPERFICIAL (SPR) AL ANLISIS DE COMPLEJOS POLIELECTROLTICOS
(PEC) Y SU INTERACCIN CON PROTENAS

CONCLUSIONES ....................................................................................................... 199

APNDICE. DESARROLLO DEL PROGRAMA CONVERSION PARA LA
PREDICCIN DE LA EVOLUCIN DE LA REACCIN DE
COPOLIMERIZACIN (MODELO TERMINAL) CON LA CONVERSIN ....... 203

1 INTRODUCCIN................................................................................................179
1.1 Teora de la SPR...........................................................................................182
1.2 Aplicaciones de la SPR.................................................................................184
2.1 Reactivos.......................................................................................................185
2.2 Resonancia de Plasmn.................................................................................185
2.3 Preparacin de la muestra.............................................................................186
2.4 Interacciones polielectrolticas quitosano-copolmeros................................186
3.1 Sistema quitosano-HEMA:AMPS................................................................189
3.2 Sistema quitosano-DMAA:AMPS................................................................191
4 BIBLIOGRAFA ..................................................................................................194

INTRODUCCIN

INTRODUCCIN GENERAL 1

El trmino biomaterial puede definirse como un material no vivo usado en un
dispositivo mdico, destinado a interaccionar con el sistema biolgico
1
. Esta
definicin incluye diversos tipos de materiales: metales, cermicos o polmeros, tanto
naturales como sintticos y se emplean para mejorar o reemplazar las funciones de los
tejidos vivos. La condicin indispensable para que un material pueda utilizarse con fines
biomdicos es que sea biocompatible, es decir, que sea capaz de coexistir con el
organismo sin desencadenar un efecto inapropiado o no deseable.

Los biomateriales desempean en la actualidad un papel muy importante en la
calidad de vida de la poblacin. Los numerosos dispositivos mdicos que existen en el
mercado, son el resultado de un largo trabajo de investigacin y desarrollo de carcter
multidisciplinario, involucrando reas tales como ingeniera de materiales, biologa
celular, ciencia de biomateriales (interaccin material-medio biolgico), qumica
macromolecular, biologa molecular, ingeniera gentica, electrnica, microingeniera,
informtica o tecnologa de adquisicin y anlisis de datos.

La Qumica Macromolecular es una de las disciplinas que brindan un aporte
fundamental para el desarrollo de instrumentos e implantes de alta prestacin, ya que
permite la obtencin de formulaciones que satisfagan los requerimientos necesarios para
cada problema concreto, mediante el diseo de propiedades de masa y superficie. Entre
los temas de estudio de este campo podemos destacar: la sntesis de polmeros y
copolmeros especiales de aplicacin en diferentes reas (Ingeniera de Tejidos,
Elementos de Diagnstico, Farmacia, etc), el desarrollo de modificadores de superficie,
la obtencin de hidrogeles, la formulacin de materiales bioabsorbibles y de sistemas
destinados a la liberacin controlada de frmacos. La copolimerizacin radical nos
ofrece la oportunidad de obtener materiales con propiedades preestablecidas ya que la
combinacin de monmeros y la disposicin de stos en las cadenas macromoleculares,
nos conduce a un nmeros ilimitado de materiales. Las propiedades fisicoqumicas y el
comportamiento biolgico de los sistemas polimricos dependen de los monmeros de
los que estn hechos
2
y de las caractersticas microestructurales de las cadenas
sintetizadas durante el proceso de polimerizacin
3
. Por ello, en esta tesis se ha
desarrollado una nueva metodologa para determinar dos de los parmetros cinticos
ms caractersticos que definen a un sistema copolimrico que se ajusta al modelo
terminal, sus relaciones de reactividad
4
. Estos parmetros proporcionan informacin
acerca de la composicin media y la distribucin estadstica de secuencias de
monmeros en el sistema copolimrico
5,6
. Se determinaron mediante la monitorizacin
in situ por RMN-
1
H de la reaccin de copolimerizacin y el ajuste no lineal por
mnimos cuadrados de los datos de composicin a la ecuacin integrada de
copolimerizacin
7
. Se obtuvieron datos de relaciones de reactividad sin manipulacin
de la muestra, ni aislamiento del copolmero y en uno o dos experimentos.

Para hacer ms sencilla la interpretacin de los valores de las relaciones de
reactividad, se ha desarrollado un programa en BASIC para la construccin de
diagramas tridimensionales que relacionen la composicin en alimentacin, la
conversin y otras variables, como la composicin instantnea o promedio en el
copolmero, la distribucin estadstica de secuencias, su longitud media...etc
8
.

Dependiendo de la reactividad de los monmeros, la composicin en
alimentacin y la conversin, se obtienen macromolculas que difieren
significativamente en composicin y en ocasiones en compatibilidad, llegando a formar
en caso extremo mezclas polimricas. Por ello es interesante estimar la distribucin de
composiciones qumicas y estudiar en profundidad el proceso de copolimerizacin de
los nuevos sistemas objeto de estudio. Utilizando la electrocromatografa cintica
micelar (MEKC) se han estudiado dos de los sistemas copolimricos sintetizados en
esta tesis
9
. La MEKC aprovecha dos factores opuestos en el anlisis de las
macromolculas: su carga y su hidrofobicidad, hacindola muy til a la hora de estudiar
reacciones en las que intervienen especies inicas. El anlisis por MEKC proporcion
una valiosa informacin acerca de la distribucin de composiciones qumicas, la
evolucin con la conversin, as como la formacin de especies de bajo peso molecular.

Tradicionalmente se consideraba a un material adecuado para ser usado en
contacto con el cuerpo cuando no produca ningn dao ni reaccin adversa en el
organismo, y en estos casos el material era definido como inerte. Sin embargo, con el
tiempo se ha demostrado que todo cuerpo extrao causa alguna reaccin en el
organismo. La respuesta biolgica desencadenada en presencia de los materiales
inertes es usualmente inespecfica, se desarrolla a una velocidad lenta y activa un
amplio rango de procesos de forma simultnea de consecuencias impredecibles
10
. El
avance en el conocimiento alcanzado en las diferentes disciplinas involucradas en el
campo de los biomateriales, ha llevado a la comunidad cientfica a la formulacin de un
nuevo objetivo: lograr una segunda generacin de biomateriales y dispositivos
avanzados en estructura y funcionalidad, que posean la cualidad de interaccionar con
el medio biolgico siendo activos en el sentido fisiolgico y correctores de patologas
durante periodos extendidos.

La mayora de los materiales polimricos utilizados actualmente en dispositivos
mdicos son materiales estndar aplicados no slo en medicina, sino en otras reas muy
diversas. Los principales polmeros empleados son polietileno de baja densidad
(LDPE), policloruro de vinilo (PVC), poliestireno (PS), polietileno de alta densidad
(HDPE), polipropileno, polisteres termorrgidos, poliuretanos (PU), acrlicos, nylon,
epoxis y otros (poliacetales, celulsicos, polisteres termoplsticos, policarbonatos,
polisulfonas, siliconas, resinas urea-formaldehdo). Todos estos materiales tienen la
caracterstica de no haber sido originalmente diseados para aplicaciones mdicas,
aunque han demostrado ser clnicamente aceptables. Aunque tienden a desaparecer
puesto que se busca desarrollar materiales que interaccionen activa y adecuadamente
con el medio biolgico.

El trmino biocompatibilidad en ocasiones se confunde con el de citotoxicidad.
La prueba de toxicidad implica un primer paso de evaluacin para alentar o descartar la
utilizacin de una dada formulacin. Una vez se ha comprobado que el material no
libera al medio ningn compuesto txico, ya sea este ltimo un contaminante
constitutivo del material o se genere a travs de procesos de biodegradacin, su
biocompatibilidad recae en otra serie de eventos que pueden ocurrir en la interfase, los
cuales se deben conocer y controlar (formacin de la cpsula fibrosa, vascularizacin,
inflamacin, etc). Resulta claro entonces, que las fronteras del desarrollo de la ciencia e
ingeniera de biomateriales estn dadas por el entendimiento y el control de las
reacciones biolgicas generadas en respuesta a la estimulacin ejercida por un
determinado sustrato. En este sentido, los avances en la qumica macromolecular
permitirn nuevas rutas de sntesis y mayor control de los procesos de polimerizacin,
que llevan al diseo de biomateriales polimricos con mayores prestaciones, y un
conocimiento ms profundo de las relaciones entre la estructura y las propiedades de los
mismos. Para lograr una buena prestacin del componente o dispositivo final
implantable se deben tener en cuenta los requerimientos de la aplicacin y llevar a cabo
la seleccin o diseo y desarrollo de los materiales adecuados en cuanto a propiedades,
procesabilidad del material para adquirir la forma final, reproducibilidad (tanto del
biomaterial como de la pieza), biocompatibilidad y bioestabilidad.

En el campo de la liberacin controlada de principios activos vemos que la
sntesis de macromolculas ha posibilitado el desarrollo de sofisticados sistemas de
liberacin controlada, que consiguen mantener la dosis de frmaco dentro del ndice
teraputico (es decir, entre los lmites de concentracin mnima efectiva y concentracin
mnima txica) durante largos periodos de tiempo. Esto conlleva la mayor comodidad
del paciente que reduce considerablemente la toma de dosis, la proteccin del frmaco
frente a la metabolizacin rpida y la disminucin de la toxicidad derivada de la
sobredosificacin. El diseo de nuevos sistemas degradables o no degradables que
permitan la liberacin de diferentes agentes activos mediante diversos mecanismos, es
un tema de investigacin de gran inters a nivel mundial en la actualidad.

La aplicacin convencional de formulaciones farmacolgicas en el organismo
humano est supeditada a la solubilidad de las sustancias activas, de tal forma que
resulta muy difcil poder alcanzar el nivel ptimo de dosificacin para obtener la
respuesta farmacolgica ms adecuada, teniendo que llegar en la mayora de los casos a
soluciones de compromiso. Los sistemas conjugados de dosificacin controlada
polmero-frmaco ofrecen una va apropiada para evitar los problemas inherentes a las
sobredosis de las formas de administracin convencionales, sobretodo para aquellas
sustancias cuyo ndice teraputico es pequeo. As, es posible disear sistemas en los
que la dosificacin de frmaco activo se ajusta a las curvas que mantienen dosis
teraputicas efectivas durante largos periodos de tiempo, evitando oscilaciones bruscas
de concentracin y efectos secundarios asociados a la sobredosis. Por otra parte, el
tratamiento clnico de una determinada afeccin se realiza a travs de una dosificacin
generalizada, cuando en muchas ocasiones est localizada en un determinado rgano; en
este sentido, podramos considerar que normalmente se recurre a una invasin
desproporcionada del frmaco, cuando slo es necesaria su accin a nivel local. Por
ello, se trabaja en el diseo de sistemas conjugados polmero-frmaco, capaces de
dosificar y dirigir el principio activo a su lugar de accin. La actividad de tales
compuestos estar ligada tanto a la naturaleza qumica de los grupos funcionales, como
al carcter macromolecular de las propias sustancias.

Desde el punto de vista estructural, los sistemas polimricos con actividad
farmacolgica pueden presentar una estructura qumica muy variada, aunque pueden
clasificarse genricamente en dos tipos
11
. El primero, est basado en la unin fsica de
compuestos farmacolgicamente activos a matrices polimricas. La liberacin del
frmaco en este caso se produce por simple difusin a travs de una matriz hinchada, o
una membrana semipermeable. Las formulaciones biodegradables hicieron posible el
suministro controlado de nuevos antgenos, protenas y drogas de alto peso molecular,
los cuales no podan difundir a travs de matrices polimricas convencionales. En esta
memoria, se presentan sistemas de dosificacin controlada de teofilina de los complejos
polielectrolticos a base de quitosano y poli(2-hidroxietilmetacrilato -co- cido 2-
acrilamido-2-metilpropanosulfnico) (poli(HEMA-co-AMPS), que ofrecen una gran
variedad de cinticas de liberacin. Por otra parte, la degradabilidad enzimtica del
quitosano, y la solubilidad de las macromolculas copolimricas permitirn la
eliminacin total del sistema del organismo.

El segundo tipo de sistemas con actividad farmacolgica, consiste en sistemas
que incorporan el principio activo en la propia macromolcula, o unido covalentemente
a ella. En estos casos, los enlaces que unen el frmaco al esqueleto macromolecular
deben ser hidrolticamente inestables a pH fisiolgico. Pueden ser sintetizados por dos
vas diferentes: bien mediante reacciones de polimerizacin, o bien mediante reacciones
de modificacin de grupos laterales capaces de reaccionar con algn grupo funcional del
propio frmaco. Cuando los compuestos farmacolgicamente activos no presentan
grupos polimerizables, pueden ser transformados mediante la adicin de restos vinlicos
o acrlicos, que posteriormente polimerizarn para dar macromolculas en las que la
cadena principal acta como matriz o soporte.

En general todo frmaco polimrico debe ser soluble y fcil de sintetizar, de
peso molecular moderado y estrecha distribucin de tamaos moleculares. Debe
presentar una estabilidad moderada en los puntos de anclaje del compuesto activo. Y
debe ser compatible con el medio fisiolgico e idealmente biodegradable despus de
cumplir su funcin.

Desde el punto de vista qumico, este tipo de sistemas brindan la posibilidad de
combinar en una misma macromolcula diferentes grupos funcionales, que puedan
controlar los procesos fisiolgicos y bioqumicos a los que estar expuesto el sistema
una vez dentro del organismo.

El diseo de este tipo de sistemas de control qumico, han constituido una de las
principales lneas de investigacin desarrolladas en nuestro grupo de trabajo
12-18
y
tambin ha sido objeto de estudio en esta tesis. Se ha llevado a cabo la sntesis,
caracterizacin y evaluacin de un nuevo sistema copolimrico a base de [(2-acetiloxi)-
4-trifluorometil]benzoato de metacriloiloxietilo (THEMA, derivado metacrlico del
Triflusal sintetizado en nuestro laboratorio
19
), y el cido 2-acrilamido-2-
metilpropanosulfnico (AMPS). El sistema poli(THEMA-co-AMPS), incorpora por una
parte un frmaco antiagregante plaquetario (Triflusal) unido covalentemente a la cadena
macromolecular, y por otra, un monmero que presenta grupos sulfnicos en su cadena
lateral, los cuales han sido a su vez descritos como antitrombognicos
20-22
. Se
sintetizaron cuatro formulaciones ricas en THEMA con el fin de obtener materiales
insolubles que presentaron actividad en su forma macromolecular (al igual que otros
polmeros anlogos
12,14
). Todas ellas desarrollaron una cintica de liberacin del
principio activo de orden cero, claramente dependiente del pH. Y tras la prdida del
frmaco su esqueleto polimrico se transforma progresivamente en poli(HEMA-co-
AMPS), soluble y eliminable en medio fisiolgico. La buena adhesin y la capacidad
para formar pelculas hacen que las formulaciones sintetizadas pudiesen ser utilizadas
con dos funciones simultneamente: como recubrimientos de prtesis vasculares de
pequeo dimetro que mejoren la trombogeneidad de las prtesis y como dispositivos
de liberacin controlada de frmaco, alternativos a las formas de dosificacin
tradicionales.

Las caractersticas superficiales de los dispositivos biomdicos juegan un
papel importante en la comprensin de fenmenos y de los mecanismos involucrados en
la interaccin del biomaterial con el medio biolgico. La regin superficial de un
material posee una reactividad particular, inevitablemente diferente a la del interior del
mismo. Aquellos materiales que no liberan sustancias txicas al medio, es decir,
aquellos que superan los tests rutinarios de toxicidad, se comunican con el entorno
biolgico a travs de su superficie, el cuerpo lee la estructura superficial y responde a
ella. Por ello, el control de la superficie de un biomaterial es importante a la hora de
disear dispositivos en contacto con medios biolgicos. Se han estudiado multitud de
propiedades, tales como la relacin hidrofobicidad/hidrofobicidad, la carga elctrica de
la superficie, la humectabilidad del material, los grupos funcionales especficos, los
receptores superficiales, la rugosidad...etc. A pesar de haberse realizado numerosos
esfuerzos para correlacionar estas propiedades con el comportamiento del material en el
medio biolgico, existen muy pocas reglas que lo consigan
23
, ya que las reacciones
biolgicas pueden deberse a la combinacin de varias de estas propiedades. Adems, se
debera prestar atencin a otros parmetros superficiales ms sutiles como son la
distribucin de grupos funcionales, la orientacin de estos grupos, la distribucin
superficial de dominios, la movilidad molecular, la contaminacin superficial, las trazas
de compuestos qumicos txicos...etc. La superficie de un material exhibe a menudo
cierto grado de movilidad, los tomos y molculas cercanos a la superficie pueden
reordenarse en respuesta al medio externo. As en respuesta a un medio hidrofbico
como el aire, los componentes de menor energa superficial pueden migrar hacia la
superficie, mientras que en medio acuoso, la superficie puede reordenar su estructura y
los grupos polares interactan con el medio. Por estos motivos los mtodos tradicionales
para caracterizar la estructura de los materiales no son adecuados para determinaciones
superficiales. La mayora de los materiales polimricos empleados en la industria en los
ltimos 50 aos han sido sometidos a diversos tipos de modificacin superficial. Existen
numerosos mtodos fsicos, qumicos, mecnicos y biolgicos para ello. El desarrollo
de estos mtodos ha permitido nuevas formas de controlar la qumica superficial. Entre
las diversas tcnicas empleadas actualmente para modificar las propiedades
superficiales de biomateriales se encuentran:

La modificacin de la superficie original mediante el bombardeo de iones,
descarga corona en aire, plasma (nitrgeno, argn, oxgeno), radiacin gamma o
beta, tratamiento de surfactantes pre-adsorbidos con descarga de gas argn,
silinizacin...
24
Se trata de uno de los mtodos ms utilizados para la
modificacin superficial de biomateriales polimricos sin alterar
significativamente las propiedades fisicoqumicas y mecnicas de los mismos
25
.
Recubrimientos unidos covalentemente a la superficie utilizando irradiacin
UVA de biomolculas pre-adsorbidas conjugadas con fotosensibilizador,
ozonizacin, irradiacin con radiacin ionizante, injertos empleando plasma
fro
26
... Esta tcnica permite sintetizar estructuras macromoleculares
superficiles a travs de mecanismos de depsito, injerto o funcionalizacin de
superficies.
Recubrimientos no covalentes sobre la superficie por evaporacin de
disolventes
27
, deposicin de filmes de monocapas autoensambladas o
Langmuir-Blodgett
28
, aditivos con actividad superficial, deposicin de vapores
de carbono y metales, etc.

Por lo tanto, la modificacin superficial de biomateriales constituye un rea de
investigacin y desarrollo de notable importancia dado que puede mejorar la
biocompatibilidad de un material sin alterar sus propiedades en masa. En primer lugar,
las propiedades superficiales resultan determinantes en el proceso de adhesin celular
ya que influirn directamente sobre la adsorcin de protenas plasmticas. Este evento
ocurre inmediatamente despus de que un dispositivo toma contacto con el medio
biolgico (despus de unos segundos)
29
y antes de que las clulas se acerquen al
substrato (despus de un minuto aproximadamente)
30
. Las protenas por lo general
prefieren el ambiente acuoso. Sin embargo, cuando una solucin de protenas se pone en
contacto con otra fase tienden a acumularse en la interfase. En una interfase slida, las
protenas interaccionan con la superficie a travs de fuerzas electrostticas, polares e
hidrofbicas. La extensin de este tipo de interacciones depende un elevado nmero de
factores (estructura de la superficie, estructura y concentracin de la protena, tiempo de
contacto, temperatura, condiciones de flujo...etc). Las protenas se adhieren en la
superficie del material y sufren cambios conformacionales o incluso se desnaturalizan.
Dado que las clulas responden especficamente a la naturaleza de la pelcula proteica
inicial, esta ejerce una funcin reguladora sobre la posterior reaccin del organismo al
implante. Por lo tanto, uno de los mayores retos que se le plantean al cientfico para
mejorar la funcionalidad de los biomateriales es controlar la adhesin proteica, bien
favoreciendo cierto tipo de conformaciones, bien reduciendo la cantidad de protenas
sobre la superficie
31
. Se ha demostrado que la adsorcin de protenas transportadoras,
como la albmina, en la superficie de un biomaterial influye notablemente y
positivamente en su trombogeneidad, reduciendo el nmero de plaquetas que se
adhieren a su superficie
32,33
. Sin embargo el fibringeno se ha identificado como un
mediador de la agregacin y adhesin plaquetaria mediante su interaccin directa con
los receptores GPIIb/IIIa de las plaquetas
34
. Estas observaciones han provocado el
desarrollo de materiales que adsorban preferentemente albmina sobre su
superficie
35,36
, e incluso la albmina ha sido inmovilizada sobre superficies
polimricas con el fin de mejorar la trombogeneidad. Sin embargo, estos materiales han
demostrado no poseer buena estabilidad a largo plazo
37-39
.

Por otro lado, se han injertado con este fin hidrogeles polimricos en las
superficies. Se trata de materiales hidroflicos entrecruzados, insolubles en agua a
temperatura, pH y fuerza inica fisiolgica. Su uso como modificadores de superficies
de biomateriales da lugar a una disminucin del coeficiente de friccin
40
y a un control
de la adsorcin de protenas especficas o de la adhesin de microorganismos
41,42
. En
este sentido, se han estudiado varios complejos polielectrolticos obtenidos por
interaccin directa de macromolculas con grupos inicos complementarios, es decir,
interaccin del quitosano (con grupos amino libres) y copolmeros aninicos con grupos
sulfnicos en su estructura. As, se trata de combinar las excelentes propiedades del
quitosano, con la estructura qumica hemocompatible de los copolmeros. Estos
materiales se sintetizaron con el fin de disminuir, evitar o hacer ms selectiva la
adsorcin de protenas plasmticas de superficies que vayan a estar en contacto con
medios biolgicos.

Los avances tecnolgicos de la ltima dcada han sido relevantes para
interpretar los fenmenos de interaccin biomaterial-medio biolgico. La morfologa y
la qumica superficial de los materiales as como la calidad de las estructuras biolgicas
adsorbidas o adheridas a las mismas puede investigarse de manera ms precisa gracias a
la aparicin de nuevos mtodos de caracterizacin tales como la resonancia de plasmn
superficial (SPR), la microscopa de fuerza atmica (AFM), la microscopa de efecto
tnel (STM), espectroscopia electrnica para anlisis qumico (ESCA)...etc. Por otra
parte el desarrollo de la microscopa ambiental de barrido (ESEM) permite la
observacin de materiales en el medio en el que desempearn su actividad utilizando
bajo vaco. De esta manera se buscan los datos necesarios para correlacionar la qumica
y la topografa de cada biomaterial, con los procesos biolgicos estimulados. Sobre la
base de la observacin del orden estructural de substratos y del reconocimiento de
macromolculas y sitios especficos de reaccin que definen una respuesta, ser posible
en un futuro cercano el diseo de dispositivos de alta prestacin con superficies capaces
de definir y controlar las reacciones fisiolgicas. Nosotros hemos utilizado la
Resonancia de Plasmn Superficial con el fin de monitorizar diversos fenmenos que
tienen lugar en nuestros sistemas. La tcnica registra los cambios que se producen en el
ndice de refraccin en las proximidades de los materiales y los relaciona con la
adhesin molecular. En primer lugar, se estudi la formacin de algunos complejos
polielectrolticos in situ. Y en segundo lugar, se observ la interaccin de estos
materiales con albmina y fibringeno. De los materiales ensayados observamos que
aquellos que poseen N,N-dimetilacrilamida (DMAA) en su estructura son capaces de
adherir selectivamente albmina en su superficie. Mientras que los PEC que incorporan
2-hidroxietilmetacrilato (HEMA), no adhieren ninguna de las dos protenas plasmticas
ensayadas.

Finalmente, la Qumica Macromolecular ha brindado tambin un gran aporte al
desarrollo de sistemas polimricos biodegradables dirigidos al reemplazo de tejidos
daados (piel, hueso, nervios y vasos sanguneos). El rea de ingeniera de tejidos
muestra hoy un crecimiento exponencial y existe la perspectiva de que se mantenga este
ritmo debido a la utilizacin de conocimientos y recursos provenientes de otras
disciplinas, que tambin experimentan en la actualidad una evolucin acelerada, tales
como la ingeniera gentica, biologa, ciencia de materiales, medicina y electrnica
43
.
Aprovecha los principios de ingeniera de transportes, fenmenos de reacciones
superficiales, as como los mtodos de anlisis aplicados a los complejos procesos
biolgicos. Para ello, es necesario el conocimiento de la estructura molecular de
sustratos y su relacin con las reacciones bioqumicas que se producen. Las especies
normalmente implicadas en la ingeniera de tejidos son clulas vivas, as como sus
componentes extracelulares que participan en el desarrollo de dispositivos que permitan,
estimulen o favorezcan, la reparacin o restauracin, de un rgano o tejido
daado
44,45
. La regeneracin y sustitucin de tejidos no funcionales se desarrollan en
base a estrategias que emplean como medio algn sistema polimrico, ya sea de origen
natural o artificial. Las de mayor importancia:
La sustitucin con materiales tanto bioestables como degradables
La utilizacin de xenoinjertos obtenidos de tejidos animales, tratados
qumicamente para estabilizarlos y evitar en lo posible las reacciones
inmunolgicas propias de cuerpo extrao.
La encapsulacin de clulas en cmaras de difusin, microcpsulas o sustratos
reabsorbibles.
La aplicacin in situ de sustancias especficas conocidas como factores de
crecimiento, que en combinacin con un soporte adecuado pueden utilizarse
como sistemas de vectorizacin y de dosificacin controlada en zonas del
organismo humano donde son necesarios.

Los materiales polmeros ms utilizados en la actualidad con este propsito son:
los polmeros de origen natural y sus modificaciones y sistemas polimricos sintticos.
Nuestro grupo ha desarrollado nuevos sistemas de quitosano modificado por
polimerizacin con cido acrlico. El sistema polimrico formado es una red
interpenetrada de policido acrlico en las macromolculas de quitosano, en las que
adems se produce la formacin de copolmeros de injerto, mediante reacciones de
transferencia de las cadenas de policido acrlico en las unidades de glucopiranosa
repetitivas del propio quitosano
46
. Este tipo de sistemas puede ser utilizado para la
formacin de soportes biodegradables in situ que proporcionen un medio adecuado para
la regeneracin de tejido blando. Siguiendo esta lnea de investigacin, hemos diseado
nuevos sistemas en base a quitosano copolmeros del cido 2-acrilamido-2-
metilpropanosulfnico (AMPS) con HEMA sintetizados en presencia del quitosano, que
estn siendo empleados como canales de gua en estudios preliminares de regeneracin
de nervio citico en rata.

En resumen, la sntesis de nuevas estructuras polimricas constituye el paso
inicial necesario para el desarrollo de dispositivos biomdicos de alta prestacin. El
diseo racional de un biomaterial que formar parte de un sistema implantable o de un
dispositivo destinado a una prctica teraputica o quirrgica, comienza con la seleccin
de reactivos qumicos y mtodo de sntesis adecuado. Finalmente es necesario remarcar
que tanto la calidad fisico-qumica de las macromolculas sintetizadas, como el mtodo
de fabricacin elegido y los parmetros de procesado seleccionados, condicionarn el
logro de las propiedades deseadas (en masa y superficie) de los dispositivos producidos.

Esta tesis se centra en el desarrollo y caracterizacin de nuevos sistemas
polimricos multifuncionales de inters biomdico as como en la aplicacin de nuevas
metodologas y tcnicas instrumentales para su caracterizacin. Ha sido estructurada en
dos partes, la primera (dividida en cuatro captulos), estudia la sntesis y caracterizacin
de los sistemas copolimricos por las tcnicas convencionales de caracterizacin de
monmeros y polmeros. Aborda el estudio de las relaciones de reactividad de los
sistemas copolimricos mediante RMN-
1
H in situ, utilizando una nueva metodologa
diseada en nuestro laboratorio
4
. Estudia mediante electrocromatografa cintica
micelar (MEKC) la cintica de reaccin as como de la distribucin de composiciones
qumicas de los dos sistemas copolimricos sintetizados con comportamiento ms
extremo
9
. Y el ltimo evala el sistema copolimrico THEMA-AMPS como
recubrimiento de prtesis vasculares de pequeo dimetro
27
.

La segunda parte de la memoria estudia la formacin de complejos
polielectrolticos tanto sintetizados con una macromolcula plantilla (template
polymerization), como por mezcla de macromolculas con grupos inicos
complementarios. Evala la citotoxicidad in vitro de algunos de los materiales con
posible aplicacin como dispositivos de liberacin controlada de frmacos, para lo que
se utilizaron cultivos primarios de clulas osteoblsticas. Y la aplicacin de una de las
formulaciones como estructura de andamiaje para la regeneracin de nervio perifrico,
empleando el nervio citico de rata como modelo experimental. Por ltimo, estudia la
adsorcin de protenas plasmticas sobre la superficie de los complejos con posible
aplicacin como recubrimientos vasculares mediante Resonancia de Plasmn
Superficial (SPR).


1)Williams D.F. Definitions in Biomaterials-Proceedings of a Consensus Conference of
the European Society for Biomaterials; Elsevier: New York, 1987.
2)Alencar de Queiroz, A. A., Gallardo A., San Romn J . Biomaterials 2000, 21, 1631-
1643.
3)Van Krevelen D.V. Properties of Polymers. Their stimation and correlation with
chemical structure.; Ed. Elsevier: Amsterdam, 1990.
4)Aguilar M.R., Gallardo A., Fernndez M.M., San Romn J . Macromolecules 2002.
5)Fukuda T., Kubo K., Ma Y.D. Progress in Polym Sci 1992, 17, 875.
6)Szymanski R. Progress in Polym Sci 1992, 17, 917.
7)Mayo F.R., Lewis F. M. J Am Chem Soc 1944, 66, 1594-1601.
8)Gallardo A., Aguilar M. R., Abraham G., San Romn J . Journal of Chemical
Education 2002, submitted.
9)Aguilar M.R., Gallardo A., San Romn J ., Cifuentes A. Macromolecules 2002, 36.
10)Williams D.F. Concise enciclopedia of medical and dental devices; 1st Ed ed.;
Pergamon Press: Oxfrod, UK, 1990.
11)Baker R. Controlled Release of Biologically Active Agents; Wiley Intersci: New
York, 1987.
12)San Romn J ., Bujn J ., Belln J .M., Gallardo A., Escudero M.C., J orge E., lvarez
L., Castillo-Olivares J .L. Journal of Biomedical Materials Research 1996, 32, 19-27.
13)Liso P.A., Revuelta M., San Romn J ., Gallardo A., Villar A.M. Controlled Release
1995, 33 (3), 429-436.
14)San Romn J ., Escudero M. C., Gallardo A., Santa Cruz R., J orge E., Haro J .,
Alvarez L., Milln I., Bujn J ., Belln J .M., Castillo-Olivares J .L. Biomaterials 1994,
15 (10), 759-765.
15)Liso P.A., Revuelta M., San Romn J ., Gallardo A., Villar A.M. Polymethacrylic
delivery system with NSAID properties, 1995, pp 469-470.
16)Alencar de Queiroz A.A., Gallardo A., San Romn, Higa O.Z. J Biomater Sci Polym
Ed 1995, 7(6), 523-530.
17)San Romn J ., Gallardo A., Levenfeld B. Macromol Symp 1994, 84, 145-158.
18)Gallardo A., Fernndez F., Cifuentes A., Dez-Masa J .C., Bermejo P., Revuelta M.,
Lpez-Bravo A., San Romn J . J Controlled Release 2001, 72 (1-3), 1-11.
19)Rodriguez G., Gallardo A., San Romn J ., Rebuelta M., Bermejo P., Bujn J ., Belln
M., Hoduvilla N.G., Escuerdo C. Journal of Materials Science: Materials in Medicine
1999, 10, 1-6.
20)Keogh J .R., Wolf M. F., Overend M.E., Tang L., Eaton J .W. Biomaterials 1996, 17,
1987-1994.
21)Tamada Y., Murata M., Makino K., Yoshida Y., Yoshida Y., Hayashi Y.
Biomaterials 1998, 19, 745-750.
22)Tamada Y., Murata M., Hayashi T., Goto K. Biomaterials 2002, 23, 1375-1382.
23)Ratner B.D., J . A. B., Lenk T.J . J Biomed Mater Res: Appl Biomat 1987, 21, 59-90.
24)Lee J .H., Park J . W., Lee H.B. Biomaterials 1991, 12, 443-448.
25)Abraham G.A., Elvira C., San Romn J . Revista de Plsticos Modernos 2001,
81(535), 70-80.
26)Zhang F., Kang E. T., Neoh K.G., Wang P., Tan K.L. J Biomed Mater Res 2001, 56
(3), 324-332.
27)Aguilar M.R., Rodrguez G., Fernndez M.M., Gallardo A., San Romn J . J Biomed
Mater Sci: Mater Med 2002, 13 (12).
28)Chen W., McCarthy T. J . Macromolecules 1997, 30, 78-86.
29)Vroman L., Adams A. L., Klings M., Fischer G.C., Muoz P.C., Solensky R.P.
Annals of the New York Academy of Sciences 1977, 283, 65-76.
30)Baier R.E. Artificial Organs 1978, 2 (4), 422-426.
31)Brash J .L. Role of plasma protein adsorption in the response of blood to foreing
surfaces; Sharma C.P., S. M., Ed.; Technomic: Lancaster , PA, 1991, pp 3-24.
32)Mustard J .F., Glynn M. F., Nishizawa E.E., Packham M.A. Platelet-surface
interactions, relationship to thrombosis and haemostasis, 1967; Vol. 26, pp 106-114.
33)Young B.R., Lambrecht L. K., Cooper S.L., Mosher D.F. Plasma proteins: their role
in initiating platelet and fibrin deposition on biomaterials; Cooper S.L., P. N. A., Ed.;
Adv Chem Ser, 1982; Vol. 199, pp 317.
34)Horbett T.A. Cardiovasc Pathol 1993, 2, 137s-148s.
35)Alencar de Queiroz A.A., Castro S. C., Higa O.Z. Journal of Biomaterial Science,
Polymer Edition 1997, 8 (5), 335-347.
36)Tanaka M., Motomura T., Kawada M., Anzai T., Kasori Y., Shiroya T., Shimura K.,
Onishi M., Mochizuchi A. Biomaterials 2000, 21, 1471-1481.
37)Alencar de Queiroz A.A., Barrak E. R., Gil H.A.C., Higa O.Z. Journal of
Biomaterial Science: Polymer Edition 1997, 8 (9), 667-681.
38)J oseph G., Sharma C. P. J Biomed Mater Res 1987, 21, 937-945.
39)Ryu G.H., Han D. K., Kim Y.H., Min B. Am Soc Artif Int Org J 1992, 38 (3), M644-
M648.
40)Ratner B.D. Biomedical applications of hydrogels: review and critical appraisal;
Williams D.F., Ed.; CRC Press: Boca Ratn, Florida, 1981; Vol. 2.
41)Ikada Y. Adv Polym Sci 1984, 57, 103-140.
42)Amiji M.M., Park K. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition 1993, 4 (3),
217-234.
43)Patrick C.W., Mikos A. G., McIntire L.V. Frontiers in tissue engineering; 1st ed.;
Pergamon, Elsevier Science Ltd: Oxford, Uk, 1998.
44)Heineken F.G., Skalak R. J Biomechanical engineering 1991, 113, 111-120.
45)Langer J .P., V. Science 1993, 260, 920-926.
46)Peniche C., Argelles-Covas W., Davidenko N., Sastre R., Gallardo A., San Romn
J . Biomaterials 1999, 20, 1869-1878.

CAPTULO 1

SNTESIS Y CARACTERIZACIN DE LOS
SISTEMAS COPOLIMRICOS BASADOS EN
AMPS

Captulo 1: Sntesis y Caracterizacin de sistemas copolimricos 20

CAPTULO 1: SNTESIS Y CARACTERIZACIN DE LOS SISTEMAS
COPOLIMRICOS BASADOS EN AMPS

1 INTRODUCCIN.................................................................................................. 21
1.1 Introduccin a la copolimerizacin radical .................................................... 21
1.2 Copolimerizacin con AMPS......................................................................... 23
2 MATERIALES Y MTODOS............................................................................... 26
2.1 Reactivos y muestras...................................................................................... 26
2.1.1 Reactivos................................................................................................ 26
2.1.1.a Sntesis de THEMA............................................................................ 26
2.1.1.b Sntesis de los polmeros.................................................................... 27
2.2 Caracterizacin general de los sistemas copolimricos:................................. 28
2.2.1 Tcnicas espectroscpicas...................................................................... 28
2.2.2 Tcnicas cromatogrficas....................................................................... 28
2.2.3 Mtodos trmicos................................................................................... 29
3 RESULTADOS Y DISCUSIN............................................................................ 30
3.1 Caracterizacin general de los sistemas copolimricos.................................. 30
3.1.1 Tcnicas espectroscpicas...................................................................... 30
3.1.1.a RMN-
1
H............................................................................................. 30
3.1.1.b FTIR ................................................................................................... 33
3.1.2 Mtodos cromatogrficos....................................................................... 36
3.1.3 Mtodos trmicos................................................................................... 38
3.1.3.a Calorimetra diferencial de barrido (DSC)......................................... 38
3.1.3.b Termogravimetra (TGA)................................................................... 41
4 BIBLIOGRAFA.................................................................................................... 45

1 INTRODUCCIN

La polimerizacin de monmeros que contienen grupos funcionales activos es
sumamente atractiva, por la amplia gama de propiedades que pueden lograrse mediante
homopolimerizacin o copolimerizacin con otros monmeros adecuados.

Este captulo describe la copolimerizacin radical de tres sistemas que
incorporan cido 2-acrilamido-2-metilpropanosulfnico (AMPS) en su estructura,
adems de 2-hidroxietilmetacrilato (HEMA), [(2-acetiloxi)-4-trifluorometil]benzoato de
metacriloiloxietilo (THEMA) o N,N-dimetilacrilamida (DMAA). La diferente
estructura qumica de los monmeros y por tanto el diferente comportamiento fsico de
las molculas nos permite obtener sistemas con propiedades muy diferentes (desde
polmeros solubles hasta insolubles) con la simple variacin de los monmeros en la
mezcla de reaccin.

1.1 Introduccin a la copolimerizacin radical

La polimerizacin en cadena que se lleva a cabo entre dos monmeros se
denomina copolimerizacin y el producto que se obtiene copolmero. Los dos
monmeros se incorporan a la cadena en cantidades que dependen de su reactividad y
de la concentracin relativa en que se encuentran en la mezcla de reaccin. Los mtodos
de copolimerizacin nos brindan la oportunidad de obtener materiales con propiedades
preestablecidas debido a la amplias posibilidades que han abierto los conocimientos
logrados sobre polimerizacin y sobre la relacin estructura-propiedades. La
combinacin de monmeros existentes y de nueva sntesis, la variacin de la cantidad
relativa de stos en el medio de reaccin, la disposicin de las diferentes unidades bien
al azar, alternadas, en bloque o en forma de injerto y los diferentes mtodos de
procesado, nos conducen a un nmero ilimitado de materiales que difieren tanto en
composicin qumica como en propiedades fsicas.

La copolimerizacin, como medio de obtencin de numerossimas estructuras, es
actualmente un proceso estudiado en profundidad en diversos laboratorios del mundo.
Por consiguiente, existe un cuerpo de doctrina amplio, si bien, dadas las ilimitadas
posibilidades de reaccin, sigue siendo un tema objeto de estudio. Por otra parte, la
copolimerizacin constituye tambin un camino interesante para el estudio de la
reactividad de los monmeros y su relacin con la estructura.

Tipos de copolmeros

Un copolmero estadstico posee una distribucin de monmeros a lo largo de la
cadena copolimrica que sigue una ley estadstica, de tal modo que tendremos
copolmeros Bernoullianos (o Markov de orden-cero), Markov de primer orden o
Markov de segundo orden.

Los copolmeros pueden presentar sus componentes distribuidos al azar
formando copolmeros al azar:

AAABBABBAABABBBA

Si las estructuras monomricas se alternan dentro de la cadena, se trata de
copolmeros alternantes:

ABABABABABAB

Si los monmeros se disponen en largas secuencias en la misma unidad, los
copolmeros se denominan copolmeros de bloque:

AAAAAABBBBBB

Por ltimo, existe otro tipo de copolmeros que son productos polimricos
ramificados en los que la cadena principal est formada por un nico monmero y la
cadena lateral por otro monmero de estructura diferente. Son denominados
copolmeros de injerto.

AAAAAAAAAAAA
B B B
B B B
B B B
B B
B

Estos dos ltimos tipos de copolmeros no pueden sintetizarse mediante
copolimerizacin simultnea de dos monmeros y se obtienen mediante otro tipo de
reacciones.

Existe un gran inters tanto acadmico como industrial en el desarrollo de
polmeros funcionalizados entre los que cabe destacar aquellos que poseen grupos
inicos en su estructura. La incorporacin de grupos ionizables altera la morfologa
polimrica y consecuentemente altera sus propiedades fsicas y qumicas.

1.2 Copolimerizacin con AMPS

En este trabajo se describe la preparacin de copolmeros biocompatibles de
AMPS con HEMA, THEMA o DMAA para posibles aplicaciones biomdicas. AMPS
es un monmero aninico, portador de un grupo sulfnico (cido fuerte) ionizado en
prcticamente todo el rango de pHs
1
(Figura 1.1). Fuera del campo biomdico y debido
a su carcter altamente hidroflico (asociado a su carcter inico) y a su estabilidad
hidroltica, trmica y mecnica, tiene gran inters como componente activo de fibras
acrlicas, adhesivos, ltex, en el tratamiento de aguas y tambin en ciertos productos
para el cuidado personal como cremas, aceites, etc.

En el rea mdica presenta una serie de caractersticas que le hacen
enormemente atractivo: por una parte presenta una excelente capacidad de absorcin de
agua (sus derivados pueden considerarse en algn caso como superabsorbentes) lo que
le hace til en formulaciones de hidrogeles. Adems, puede formar complejos con
polielectrolitos catinicos y tiene propiedades lubricantes
2
, adhesivas
3
y es un
componente biocompatible
4
. Pero si se debe resaltar una propiedad en este terreno, es la
asociada a la naturaleza sulfnica de sus grupos inicos, la cual es responsable de sus
caractersticas anticoagulantes por su mimetismo con la heparina
5
(molcula natural con
gran actividad antitrombognica y portadora de grupos sulfnicos
6-10
).

Por otra parte, tanto los polmeros como los copolmeros de HEMA tienen
amplias aplicaciones en ciruga y medicina, entre las que cabe destacar: lentes de
contacto, cicatrizantes, recubrimientos hemocompatibles, sistemas de liberacin de
frmaco, prtesis quirrgicas, membranas de dilisis, crneas artificiales...etc
11,12
.
Esto se debe a su capacidad para formar hidrogeles biocompatibles con una excelente
tolerancia y buena estabilidad
11,13
. Los materiales en base a DMAA han sido
sintetizados del mismo modo para aplicaciones biomdicas consiguiendo una
extraordinaria biocompatibilidad de los sistemas
14
. La copolimerizacin de estos dos
monmeros con AMPS se realiz con la intencin de combinar las buena
biocompatibilidad de HEMA y DMAA con las propiedades caractersticas de los grupos
sulfnicos. Estos copolmeros adems, fueron diseados con el fin de formar complejos
polielectrolticos combinndolos con otras macromolculas que posean grupos inicos
complementarios, como el quitosano, que incorpora grupos amina en su estructura. De
este modo pueden obtenerse estructuras entrecruzadas fsicamente capaces de responder
a cambios de pH y/o a la temperatura, obteniendo sistemas inteligentes con gran
potencial para ser utilizados como agentes de liberacin de frmacos o incluso como
sistemas de andamiaje para ingeniera de tejidos.

El [(2-acetiloxi)-4-trifluorometil]benzoato de metacriloiloxietilo) (THEMA), un
derivado metacrlico del cido [(2-acetiloxi)-4-trifluorometil]benzico (Triflusal,
comercializado con el nombre de Disgren), ha sido funcionalizado y polimerizado en
nuestro laboratorio con xito
15-17
, formando matrices polimricas no slo con
actividad farmacolgica sino tambin con propiedades de dosificacin controlada de
frmaco, capaces de mantener un nivel elevado de medicamento en plasma de forma
controlada durante largos periodos de tiempo. En este trabajo, THEMA ha sido
copolimerizado con el AMPS con el fin de obtener materiales apropiados para su uso
como recubrimientos de prtesis vasculares de pequeo dimetro, conjugando la accin
antiagregante de ambas molculas.

La copolimerizacin radical de AMPS con HEMA, DMAA o THEMA ha dado
lugar a tres series de materiales con propiedades muy diferentes. Existe una diferencia
estructural clara asociada a la naturaleza del componente no inico, HEMA DMAA o
THEMA respectivamente. HEMA es ms hidrofbico que DMAA (como lo demuestra
el hecho de que su correspondiente homopolmero, poli-HEMA, no es soluble en agua
mientras que el poli-DMAA s lo es). Adems, e ntimamente relacionado con lo
anterior, la reactividad de las dos parejas de comonmeros es muy diferente, debido a la
naturaleza acrilamida de AMPS y DMAA frente al HEMA que es un metacrilato con
mayor reactividad inherente en polimerizacin radical. Este hecho tiene una gran
importancia, tal y como se describe en este trabajo, ya que la distribucin de unidades
tiende a la formacin de bloques en un caso (HEMA-AMPS) mientras que en el otro
(DMAA-AMPS) es ms aleatoria.

El THEMA es un monmero metacrlico muy hidrofbico que conduce a
materiales insolubles en medios acuosos tras su copolimerizacin con el AMPS, a
fracciones molares altas en THEMA. Su hidrlisis da lugar a la liberacin directa del
Triflusal y a la transformacin progresiva de la matriz polimrica de THEMA-AMPS en
HEMA-AMPS, soluble y eliminable por el organismo. El Triflusal es un frmaco
antiagregante con accin farmacolgica dual: inhibe la produccin de Tromboxano A
2

por inhibicin de la ciclooxigenasa plaquetaria e incrementa la tasa plaquetaria de
AMP
c
por inhibicin del enzima AMP
c
fosfodiesterasa (accin que tambin presenta su
principal metabolito, HTB). Estas caractersticas le hacen un candidato excepcional para
emplearlo en la sntesis de frmacos polimricos para el recubrimientos de prtesis
vasculares de pequeo dimetro. Adems de la caracterizacin qumica del sistema
THEMA-AMPS se llev a cabo una exhaustiva evaluacin del sistema tanto in vitro
(medidas de la hidrofilia y energa superficial de los copolmeros, liberacin del
frmaco a diferentes pHs, estimacin de la capacidad antiagregante del sistema...),
como in vivo (estudio de la biocompatibilidad) para su posible aplicacin como
recubrimiento de prtesis vasculares y se recoge en el Captulo 4 de esta memoria.


2 MATERIALES Y MTODOS

2.1 Reactivos y muestras

2.1.1 Reactivos

El cido 2-acrilamido-2-metilpropanosulfnico, AMPS, fue suministrado por
Avocado y utilizado sin purificacin previa. La N,N-dimetilacrilamida, DMAA,
(Aldrich) se destil cuidadosamente a presin reducida. El 2-Hidroxietilmetacrilato,
HEMA, (Fluka) fue purificado segn la literatura
18
. El Triflusal fue amablemente
cedido por Uriach & Cia. y fue utilizado sin purificacin previa. El dioxano (Panreac) se
purific sobre hidrxido potsico (KOH) manteniendo a reflujo durante 24 horas.
Despus se destil a presin atmosfrica. El ter de dietilo (SDS) se utiliz en su forma
comercial sin previa purificacin. El 2,2-Azo-bis-isobutironitrilo (AIBN) se utiliz
previa recristalizacin de metanol; punto de fusin 104 1C. Los dems reactivos
fueron utilizados en su forma comercial por ser extra-puros.

2.1.1.a Sntesis de THEMA

Los copolmeros poli(THEMA-co-AMPS), se obtuvieron mediante
polimerizacin radical en solucin del derivado metacrlico del Triflusal (THEMA) con
AMPS. La sntesis del derivado de Triflusal se llev a cabo siguiendo un protocolo de
trabajo desarrollado en nuestro laboratorio
17
. En primer lugar se prepara el cloruro de
cido y posteriormente se esterifica con el 2-hidroxietilometacrilato (HEMA); el
proceso de sntesis se detalla a continuacin.

Sntesis del cloruro de cido

Se llev a cabo por la reaccin de cloruro de tionilo, SOCl
2
, (70 ml), con
Triflusal (0,1 moles) en presencia de trieltilamina como catalizador a reflujo, durante 4
horas. Posteriormente se procedi a la destilacin del cloruro de cido en exceso que no
haba reaccionado y a continuacin, se destil el cloruro de cido a presin reducida (64
% de rendimiento).

Sntesis del derivado metacrlico portador del Triflusal (THEMA)

La esterificacin del HEMA con el cloruro de cido se realiz del siguiente
modo: 0,025 moles de HEMA y la trietilamina se disolvieron en ter. A esta solucin se
le aadi, gota a gota, el cloruro de cido (0,025 moles) disuelto tambin en ter. El
producto de reaccin se mantuvo bajo corriente de nitrgeno y agitacin magntica
durante 24 horas. El clorhidrato de trietilamina precipitado durante la reaccin se
elimin por filtracin y el filtrado se lav con una solucin acuosa de hidrxido sdico
(5 %) varias veces eliminando la fase acuosa. La fase orgnica se sec con sulfato
magnsico anhidro (MgSO
4
) y el disolvente se elimin a vaco hasta pesada constante.
(Rendimiento 52 %).

2.1.1.b Sntesis de los polmeros

Se sintetizaron homopolmeros y copolmeros de los sistemas HEMA-AMPS y
DMAA-AMPS, a conversin total y en todo el rango de composiciones molares (de 0 a
1). Sern nombrados como HA10, HA30... etc, dependiendo de la composicin molar
en alimentacin en HEMA (Tabla 1.1) o DA10, DA30... etc, dependiendo de su
composicin molar en DMAA (Tabla 1.2). Los homopolmeros poli(2-hidroxi-
etilmetacrilato), poli(N,N-dimetilacrilamida) y poli(cido 2-acrilamido-2-metilpropano-
sulfnico) sern nombrados como PHEMA, PDMAA y PAMPS respectivamente. Estos
materiales se obtuvieron por polimerizacin radical en solucin, usando
H
2
O:isopropanol (50:50) como disolvente, a 50 C y AIBN como iniciador en
concentracin 1,5x10
-2
M. Se utiliz isopropanol como disolvente con el fin de obtener
copolmeros de peso molecular controlado debido a su baja toxicidad (clasificado por la
Food and Drugs Administration (FDA) como clase 3)
19
y alta constante de
transferencia
20
. La disolucin fue desoxigenada burbujeando nitrgeno durante 30
minutos. La concentracin total de monmero fue 0,30 M para el sistema poli(HEMA-
co-AMPS) y 0,50 para el sistema poli(DMAA-co-AMPS). Transcurridas 24 horas de
reaccin, se elimin el disolvente de las muestras y posteriormente se liofilizaron.

Con el fin de obtener materiales insolubles, apropiados para su aplicacin como
recubrimientos de prtesis vasculares de pequeo dimetro, se sintetizaron copolmeros
portadores de Triflusal que incorporaban grandes cantidades de THEMA en su
estructura. Su nomenclatura ser a partir de ahora THA60, THA70...etc, dependiendo de
la composicin molar en alimentacin en THEMA (Tabla 1.3). El homopolmero del
derivado metacrlico del Triflusal se denominar PTHEMA en este trabajo. Estos
materiales se sintetizaron por polimerizacin radical en solucin, utilizando
dioxano/agua (90:10) como disolvente, una concentracin monomrica de 0,25 M, a 50
C, durante 48 horas. Se emple AIBN como iniciador en una concentracin de 1,510
-
2
M. Las mezclas de reaccin se desoxigenaron burbujeando nitrgeno (N
2
) durante 30
minutos. Los copolmeros sintetizados a conversin total se precipitaron en ter,
redisolvieron en la mnima cantidad de agua y liofilizaron. Posteriormente, los slidos
obtenidos se disolvieron en cloroformo y precipitaron en ter. Por ltimo se filtraron y
secaron a vaco hasta peso constante.
2.2 Caracterizacin general de los sistemas copolimricos:

2.2.1 Tcnicas espectroscpicas

Los copolmeros obtenidos de las diferentes mezclas de HEMA-AMPS o
DMAA-AMPS se disolvieron en D
2
O DMSO-d
6,
dependiendo de su solubilidad, en
una concentracin de 10 mg ml
-1
y se realizaron espectros de RMN-
1
H en un equipo
Varian 300-XL trabajando a una frecuencia de 300 MHz. Los espectros de RMN-
13
C se
registraron en el mismo equipo (Varian 300-XL) trabajando a una frecuencia de 75,5
MHz a partir de soluciones al 100 mg ml
-1
en D
2
O, DMSO-d
6
metanol deuterado,
segn el caso y a 40 C. Los espectros de IR de todos los materiales se obtuvieron en
pastillas de KBr utilizando un equipo FTIR Perkin-Elmer 1720.

2.2.2 Tcnicas cromatogrficas

Las medidas de cromatografa de exclusin por tamao (SEC) se realizaron
en dimetilformamida (DMF) con 0,1% (m/v) de LiBr. El sistema estaba formado por
una bomba Perkin-Elmer Isocratic LC pump 250, trabajando a un flujo de 1 mL min
-1
.
El sistema se termostatiz a 70C con un horno Perkin-Elmer modelo LC OVEN 101.
La distribucin de pesos moleculares se obtuvo mediante un refractmetro diferencial
Waters 410. Se usaron tres columnas poliestireno-divinilbenceno pl-gel con tamao de
poro nominal de 500, 10
4
y 10
5
.

2.2.3 Mtodos trmicos

Las medidas de calorimetra diferencial de barrido (DSC) se llevaron a cabo
en un aparato Perkin-Elmer DSC-7. Se utiliz nitrgeno para purgar la celda de anlisis.
Las muestras (aproximadamente 12 mg) se cerraron hermticamente en cpsulas de
aluminio y se calentaron a una velocidad de 10C min
-1
. La T
g
se defini como el punto
de inflexin de la regin de transicin vtrea. El calibrado de temperaturas se realiz
utilizando indio como patrn.

Las medidas de termogravimetra (TGA) se realizaron en una termobalanza
Perkin-Elmer TCA7. Los experimentos se realizaron bajo flujo de nitrgeno de 50 ml
min
-1
, a una velocidad de calentamiento de 10C min
-1
, desde 50 hasta 550C.

3 RESULTADOS Y DISCUSIN

3.1 Caracterizacin general de los sistemas copolimricos

3.1.1 Tcnicas espectroscpicas

3.1.1.a RMN-
1
H

Se llev a cabo el anlisis por RMN-
1
H de los tres sistemas copolimricos
sintetizados a alta conversin. Sus estructuras qumicas se encuentran representadas en
la Figura 1.1. Las fracciones molares de los monmeros se encuentran detalladas en las
Tablas 1.1, 1.2 y 1.3.

Fig. 1.1: Estructura qumica de los sistemas copolimricos estudiados.

Poli(HEMA-co-AMPS)
Poli(DMAA-co-AMPS)
Poli(THEMA-co-AMPS)
O
O
O
O
CF
3
O
O
O
HN
SO
3
H
n
m
m n
O
O
OH
O
HN
SO
3
H
O
N
O
HN
SO
3
H
n
m
En las Figuras 1.2, 1.3 y 1.4 se muestran espectros de RMN-
1
H (300 MHz) de un
copolmero representativo de cada sistema y la asignacin de cada una de las seales a
su correspondiente protn o grupo de protones. La composicin de cada uno de los
copolmeros sintetizados se recoge en las Tablas 1.1, 1.2 y 1.3 y fueron calculadas
utilizando la seal A
5
(AMPS) y las H
3
y H
4
(HEMA), para el sistema HEMA-AMPS.
El clculo de las composiciones del sistema DMAA-AMPS se realiz empleando, por
un lado las seales A
5
, D
2
, D
3
y D
4
y por otro, las del conjunto A
1
, A
2
, A
3
, A
4
y D
1
y
con los datos obtenidos se resolvi un sistema de ecuaciones que nos proporcion la
composicin molar de los correspondientes copolmeros. Por ltimo, para el sistema
THEMA-AMPS, se emplearon las seales asignadas para los 3 protones aromticos del
THEMA (T
5
, T
6
, T
7
) y el grupo de seales asignado a los 9 protones del AMPS (A
1
, A
2
,
A
3
y A
4
) y 5 correspondientes al monmero portador de Triflusal (T
2
y T
8
) (1,6-3 ppm).
Se comprob la ausencia de monmero residual en todas las muestras.

Fig. 1.2: Espectro de RMN-
1
H de HA70 registrados en D
2
O, a 300 MHz.
O
O
OH
O
HN
SO
3
H
0,67 0,33
H
1
H
2
H
3
H
4
A
1
A
2
A
4
A
5
A
3
5 4 3 2 1 0

ppm
H
2
O
H
4
H
3
A
5
H
2
H
1
A
1,2,3,4
O
O
OH
O
HN
SO
3
H
0,67 0,33
H
1
H
2
H
3
H
4
A
1
A
2
A
4
A
5
A
3
5 4 3 2 1 0

ppm
H
2
O
H
4
H
3
A
5
H
2
H
1
A
1,2,3,4
Captulo 1: Sntesis y Caracterizacin de sistemas copolimricos

32

1
H de DA70 registrados en D
2
O, a 300 MHz.

1
H de THA70 registrados en metanol deuterado, a 300 MHz.
10 8 6 4 2 0

ppm
A
7
A
6
, T
5,6,7
CH
3
OH
T
3,4
A
5
A
3,4
T
1
T
8
A
1,2
,T
2
T
4
T
3
T
2
T
1
A
5
A
4
A
3
A
2
A
1
0
.
30
0
.
70
O
O
O
O
CF
3
O
O
O
HN
SO
3
H
T
5
T
6
T
7
T
8
A
6
A
7
10 8 6 4 2 0

ppm
A
7
A
6
, T
5,6,7
CH
3
OH
T
3,4
A
5
A
3,4
T
1
T
8
A
1,2
,T
2
10 8 6 4 2 0

ppm
A
7
A
6
, T
5,6,7
CH
3
OH
T
3,4
A
5
A
3,4
T
1
T
8
A
1,2
,T
2
T
4
T
3
T
2
T
1
A
5
A
4
A
3
A
2
A
1
0
.
30
0
.
70
O
O
O
O
CF
3
O
O
O
HN
SO
3
H
T
5
T
6
T
7
T
8
A
6
A
7
0,27 0,73
O
N
O
HN
SO
3
H
A
1
D
1
A
2
A
3
A
4
A
5
D
2
D
4
D
3
5 4 3 2 1 0

ppm
D
1
D
2
D
3,4
A
1,3,4
A
2
A
5
H
2
O
0,27 0,73
O
N
O
HN
SO
3
H
A
1
D
1
A
2
A
3
A
4
A
5
D
2
D
4
D
3
5 4 3 2 1 0

ppm
D
1
D
2
D
3,4
A
1,3,4
A
2
A
5
H
2
O

PHEMA HA90 HA70 HA50 HA30 HA10 PAMPS
f
HEMA alimentacin
1 0,90 0,70 0,50 0,30 0,10 0
F
HEMA copolmero
1 0,89 0,67 0,47 0,27 0,10 0

Tabla 1.1: Composiciones molares de HEMA en el sistema HEMA-AMPS
tanto en alimentacin (f
HEMA alimentacin
) como en el copolmero (F
HEMAcopolmero
)
sintetizados a conversin total, halladas mediante RMN-
1
H a 300 MHz.

PDMAA DA90 DA70 DA50 DA30 DA10 PAMPS
f
DMAA alimentacin
1 0,90 0,70 0,50 0,30 0,10 0
F
DMAA copolmero
1 0,89 0,73 0,52 0,31 0,09 0

Tabla 1.2: Composiciones molares de DMAA en el sistema DMAA-AMPS
DMAA alimentacin
DMAAcopolmero
),
1
H a 300 MHz.

PTHEMA THA90 THA80 THA70 THA60 PAMPS
f
THEMA alimentacin
1 0,90 0,80 0,70 0,60 0
F
THEMA copolmero
1 0,90 0,81 0,69 0,63 0

Tabla 1.3: Composiciones molares de THEMA en el sistema THEMA-AMPS
THEMA alimentacin
THEMA copolmero
),
1
H a 300 MHz.

3.1.1.b FTIR

Sistema HEMA-AMPS

Los espectros de IR correspondientes a los homopolmeros y dos copolmeros
representativos sintetizados para este sistema se encuentran detallados en la Figura 1.5
Como puede observarse no se distinguen picos olefnicos
C=C
a 1635-1620 indicando la
ausencia de monmero residual en las muestras caracterizadas. Las cadenas polimricas

34
estn formadas por unidades AMPS (
NH
a 3311,
C=O
(amida I) a 1650,
CN
y
CNH
(amida II)1551,
C(CH3)2
a 1391,

SO2
a 1224,
SO3H
a 1021 y
S-O
a 617 cm
-1
) y unidades
HEMA (
OH
a 3437,
CHsp3
2943,
C=O
a 1721,
CH3

(metacrilato)
a 1452,
COHip
de 1400 a
1000,
C-O
1156 y
COHoop
de 700 a 550 cm
-1
)

Fig. 1.5: Espectros de FTIR de dos copolmeros representativos del sistema HEMA-
AMPS (HA30 y HA70) y de sus correspondientes homopolmeros (PHEMA y
PAMPS).

Sistema DMAA-AMPS

Los espectros de IR correspondientes a los homopolmeros y alguno de los
copolmeros sintetizados para este sistema se encuentran detallados en la Figura 1.6. En
los espectros FTIR no se distinguen picos olefnicos
C=C
a 1635-1620 y las cadenas
polimricas estn formadas por unidades AMPS (
NH
a 3311,
C=O
(amida I) a 1650,
CN
y
CNH
(amida II)1551,
C(CH3)2
a 1391,

SO2
a 1224,
SO3H
a 1021 y
S-O
a 617 cm
-1
)
y unidades DMAA (
CHsp3
a 2934,
C=O
a 1638,
CH3NC
a 1490,
CN
a 1422,
CNC
a 1267y
NCO
a 616 cm
-1
)

Fig. 1.6: Espectros de FTIR de dos copolmeros representativos del sistema DMAA-
AMPS (DA30 y DA70) y de sus correspondientes homopolmeros (PDMAA y
PAMPS).

Sistema THEMA-AMPS

Los espectros de IR correspondientes a los homopolmeros y dos copolmeros
representativos sintetizados para este sistema se encuentran detallados en la Figura 1.7
Como puede observarse las cadenas polimricas estn formadas por unidades AMPS
(
NH
a 3318,
C=O
(amida I) a 1687,
CN
y
CNH
(amida II)1633,
NH
a 1544,
CH3
a
1455cm
-1
,

SO2
a 1214,
SO3H
a 1041,
S-O
a 624) y unidades TH (
C=O
a 1777 y 1731,
comb
ar
1700-1550 (1630 y 1584),
CH3

(metilcetonas)
a 1418,
C-O (acetato)
1257,
CF3
y
oop
arC-H
785, 750 y 704cm
-1
).

4000 3000 2000 1000

(cm
-1
)
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400

(cm
-1
)
PDMAA
DA70
DA30
PAMPS
4000 3000 2000 1000

(cm
-1
)
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400

(cm
-1
)
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400

(cm
-1
)
PDMAA
DA70
DA30
PAMPS

36

Fig. 1.7: Espectros de FTIR de dos copolmeros representativos del sistema THEMA-
AMPS (THA90 y THA70) y de sus correspondientes homopolmeros (PTHEMA y
PAMPS).

3.1.2 Mtodos cromatogrficos

Durante el anlisis de polielectrolitos por SEC pueden aparecer algunas
desviaciones en las medidas debido a interacciones entre el polmero, el disolvente y el
material de relleno de la columna. Estas interacciones tienden a aumentar la dispersin y
disminuir la resolucin.

Sistema HEMA-AMPS

Los cromatogramas de exclusin por tamao obtenidos para los copolmeros
HEMA-AMPS ponen de manifiesto que la polimerizacin del sistema copolimrico no
es homognea sino que da lugar a una distribucin bimodal de especies de diferente
tamao molecular. Se obtiene una poblacin de alto peso molecular, probablemente rica
en HEMA y una segunda especie de bajo peso molecular probablemente rica en AMPS
(como se discutir en el captulo 3 de esta memoria). El ndice de polidispersidad de las
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

cm
-1
PAMPS
THA70
THA90
PTHEMA
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

cm
-1
PAMPS
THA70
THA90
PTHEMA
PAMPS
THA70
THA90
PTHEMA
dos poblaciones es muy diferente siendo la fraccin que eluye a tiempos ms cortos
(mayor tamao) ms polidispersa que aquella que eluye a mayores tiempos (menor
tamao), cuya curva de distribucin de tamaos moleculares es bastante estrecha. En los
distintos cromatogramas puede observarse la aparicin de picos no genuinos a partir
de los 18 minutos de anlisis. Este perfil de picos, reproducible en todos y cada uno de
los cromatogramas, es consecuencia de turbulencias debidas a la inyeccin de la
muestra en el sistema, que quedan registradas en el detector por ndice de refraccin.
Los cromatogramas de exclusin por tamao registrados en la Figura 1.8, no son una
medida exacta de los pesos moleculares de los copolmeros, sino una aproximacin de
la distribucin de pesos moleculares que se forman durante la reaccin de
copolimerizacin. Esto se debe a que para el calibrado de los pesos moleculares se
emplearon patrones de poliestireno, cuya estructura qumica es muy diferente a la de los
copolmeros sintetizados en este trabajo. Adems, la incorporacin de grupos inicos en
las cadenas macromoleculares puede provocar fenmenos de adsorcin o exclusin en
la fase estacionaria y por lo general, obliga a una conformacin extendida de las
cadenas formando estructuras tipo varilla, de distinto comportamiento hidrodinmico
que las estructuras adoptadas por sistemas no polielectrolticos. Por todo ello hay que
considerar estos pesos moleculares como aparentes.

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (min)
DA90
DA70
DA50
DA30
DA10
0 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (min)
HA90
HA70
HA50
HA30
HA10

38
Fig. 1.8: Cromatogramas de exclusin por tamao de los copolmeros HA y DA
Sistema DMAA-AMPS

Los cromatogramas obtenidos para el sistema DMAA-AMPS (Fig. 1.8)
muestran una distribucin de pesos moleculares ms homognea. La formacin de una
distribucin bimodal de pesos moleculares se intuye en los grficos, pero la diferencia
entre poblaciones es menos acusada que en el sistema anterior.

3.1.3 Mtodos trmicos

3.1.3.a Calorimetra diferencial de barrido (DSC)

Sistema HEMA-AMPS

Resulta muy difcil determinar la T
g
de los copolmeros ricos en AMPS ya que
se observa la superposicin de esta pseudotransicin de primer orden, con una
endoterma que aparece inmediatamente despus de la T
g
. Este pico aumenta a medida
que lo hace la concentracin de AMPS y puede ser indicativo de una reaccin de
degradacin, i.e. ciclacin de las unidades monomricas. Los termogramas que se
representan en la Figura 1.9 confirman que el PAMPS comienza a degradar a 181C,
una temperatura muy prxima a la de su T
g
(175C).

Fig. 1.9: Grficos de DSC para el sistema HEMA-AMPS.
100 150 200

Temperatura (C)
HA90
HA70
HA50
HA30
HA10
Tg=124 C
Tg=150 C
Tg=145 C
Tg=167 C
100 150 200

Temperatura (C)
HA90
HA70
HA50
HA30
HA10
Tg=124 C
Tg=150 C
Tg=145 C
Tg=167 C

Por lo tanto, se podra interpretar que para que se produzca la reaccin de
ciclacin es necesario que las cadenas tengan suficiente movilidad, lo que no sucede
hasta la transicin vtrea. El razonamiento anteriormente expuesto est en buena
concordancia con los datos obtenidos por termogravimetra y desarrollados en el
siguiente apartado.

Sistema DMAA-AMPS

En los termogramas obtenidos para los copolmeros DMAA:AMPS no se puede
distinguir la T
g
. Las diferencias en el calor especfico que se producen como
consecuencia de la T
g
en la muestra son muy pequeas y la sensibilidad del aparato no
es suficiente como para distinguir dicha transicin.

Sistema THEMA-AMPS

La T
g
del homopolmero PTHEMA es de 42 C, prxima a la fisiolgica,
resultando un valor muy conveniente para su aplicacin como recubrimiento de prtesis
vasculares. Los copolmeros sintetizados experimentan un progresivo aumento de su T
g

a medida que aumenta en sus cadenas macromoleculares el contenido de AMPS, siendo
en todos los casos inferior a 100 C. Sin embargo, el valor de esta T
g
slo puede
relacionarse con la rigidez de los polmeros en estado seco y no en las condiciones de
aplicacin del mismo, es decir, en estado hmedo. Los materiales estudiados presentan
un incremento de la hidrofilia y el hinchamiento a medida que se incrementa el
contenido de monmero inico. Esto supone un mayor contenido de agua en la red
polimrica y la consencuente disminucin de la T
g
en estado hidratado, debido al bien
conocido efecto de plastificacin que ejercen las molculas de agua en las cadenas
macromoleculares.


40

La rigidez de los copolmeros poli(THEMA-co-AMPS) depende de su
composicin media y las T
g
s obtenidas se ajustan a la ecuacin de Fox (Figura 1.10):

2 2 1
1
1 1 1 1
g g g g
T T T
W
T
+
=

siendo T
g1
y T
g2
las temperaturas de transicin vtreas de los homopolmeros del sistema
y T
g
la temperatura de transicin vtrea del copolmero correspondiente.

Figura 1.10: Variacin del inverso de la T
g
en funcin de la fraccin en peso de
THEMA del sistema poli(THEMA-co-AMPS).

Segn esta ecuacin, la contribucin de las unidades monomricas a la
flexibilidad de las cadenas es aditiva. Ambos monmeros no interaccionan
especficamente y contribuyen a los segmentos macromoleculares como componentes
aislados. Este hecho esta de acuerdo con la tendencia a formar bloques (que se
comentar en al Captulo 2), donde las interacciones entre unidades adyacentes
(responsables de las desviaciones de la ecuacin de Fox) se minimizan debido a que las
diadas AMPS-AMPS y TH-TH son las mayoritarias (Ver Captulo 2_relaciones de
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
3,0
3,2
3,4
3,6
3,8
4,0
1
/
T
g

(
K
)
x

1
0
3
w(THEMA)
reactividad); el sistema se comporta desde el punto de vista trmico como una mezcla
de homopolmeros.

3.1.3.b Termogravimetra (TGA)

La degradacin trmica de las macromolculas sigue por lo general dos tipos de
mecanismos que a menudo coexisten haciendo su interpretacin muy complicada:

1. Despolimerizacin por va radical u otros mecanismos

2. Reacciones de modificacin de polmeros portadores de grupos
funcionales laterales mediante la eliminacin de compuestos y formando
en la cadena nuevos grupos de estructura cclica y en ocasiones,
entrecruzamientos.

Los termogramas obtenidos en este trabajo se realizaron en condiciones no
isotermas, a una velocidad de calentamiento de 10C min
-1
). En las Figuras 1.11, 1.12 y
1.13 representadas a continuacin, se muestran las derivadas de la prdida de peso en
funcin de la temperatura. De esta forma se observan las variaciones de pendiente en las
curvas, y por tanto, se pueden distinguir ms fcilmente los cambios en los mecanismos
de degradacin. Puesto que el mecanismo de degradacin de los sistemas HEMA-
AMPS y THEMA-AMPS son muy parecidos, se discutirn conjuntamente para despus
comentar el sistema DMAA-AMPS.

Sistema HEMA-AMPS y THEMA-AMPS

El mecanismo de degradacin trmica de compuestos acrlicos y metacrlicos
(como el HEMA) es por lo general de tipo 1. A partir de una determinada temperatura el
polmero comienza a degradar mediante escisiones de la cadena principal. Sin embargo,
el PAMPS degrada segn el mecanismo 2 y fue estudiado por Aggour en
profundidad
21-23
. El proceso degradativo no implica la rotura aleatoria de la cadena
macromolecular, sino la formacin de nuevos grupos qumicos en la misma. En algunas
ocasiones, las causas de degradacin de los polmeros que contienen en su estructura

42
grupos como -NH, -OH -Cl hay que buscarlas en la reactividad de estos grupos, que
son eliminados de la cadena en forma de H
2
O, HCl, NH
3
, alcohol, etc. El mecanismo de
degradacin del PAMPS se describe mediante tres etapas consecutivas. Una primera
prdida de peso (181C) correspondiente al desprendimiento de amoniaco tras la
reaccin de imidacin entre dos grupos amida adyacentes. Una segunda prdida de peso
(218C) debida a la degradacin los grupos sulfnicos y una tercera etapa de
degradacin (278C) debida a la descomposicin del esqueleto polimrico y de las
imidas formadas durante la primera etapa de degradacin.

Los poli(HEMA-co-AMPS) son materiales slidos blancos que durante su
degradacin trmica se vuelven en primera instancia amarillos y despus funden y se
expanden mientras que velocidad de degradacin disminuye. La formacin de espumas
y expansin del material durante la degracin trmica es tpico de sistemas que liberan
molculas voltiles durante su descomposicin. Las molculas de HEMA y AMPS
pueden sufrir ciclaciones formando estructuras imida o anhdridos dependiendo de si se
produce entre dos molculas AMPS o entre una HEMA y otra AMPS.
Fig. 1.11: Primera derivada de los termogramas obtenidos por TGA para el sistema
HEMA-AMPS.

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550

TEMPERATURA
HA90
HA70
HA50
HA30
HA10
PAMPS
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550

TEMPERATURA
HA90
HA70
HA50
HA30
HA10
PAMPS
HA90
HA70
HA50
HA30
HA10
PAMPS

La degradacin trmica del sistema THEMA-AMPS (Figura 1.12) es similar a la
del sistema HEMA-AMPS (Figura 1.11). En todos los copolmeros estudiados aparece
la etapa de ciclacin (140-210C) correspondiente a la formacin de estructuras imida o
anhdrido entre dos monmeros adyacentes. Al igual que en sistema HEMA-AMPS, el
perfil de degradacin corresponde aproximadamente, a la adicin de ambas
degradaciones lo que est de acuerdo con la tendencia de estos copolmeros a la
homopolimerizacin consecutiva por la gran diferencia que existe en sus relaciones de
reactividad (ver Captulo 2_relaciones de reactividad).

Fig. 1.12: Primera derivada de los termogramas obtenidos por TGA para el sistema THA.

Sistema DA

La degradacin trmica del PDMAA sigue un proceso de degradacin en bloque
por escisin de la cadena principal a partir de los 330C. La ausencia de hidrgenos
reactivos en el grupo amida que puedan reaccionar con unidades de AMPS adyacentes
hace imposible la degradacin de los poli(DMAA-co-AMPS) mediante un mecanismo
de tipo 2, cuando encontramos diadas del tipo AMPS-DMAA. Slo se producir
ciclacin de unidades monomricas cuando existan dos unidades AMPS juntas, y por
100 200 300 400 500
TEMPERATURA (C)
PTHEMA
THA90
THA80
THA70
THA60
PAMPS
100 200 300 400 500
TEMPERATURA (C)
PTHEMA
THA90
THA80
THA70
THA60
PAMPS

44
tanto a mayor concentracin de AMPS, mayor ser la poblacin de diadas AMPS-
AMPS contribuyendo a este mecanismo. Por esta razn las composiciones ricas en
DMAA no presentan la etapa de ciclacin en su termograma (no se observa la aparicin
del correspondiente pico a 180 C), como ocurre en el DA90.

Fig. 1.13: Primera derivada de los termogramas obtenidos por TGA para el sistema DA.

100 200 300 400 500

TEMPERATURA (C)
DA10
DA30
DA50
DA70
DA90
PAMPS
PDMAA
100 200 300 400 500

TEMPERATURA (C)
DA10
DA30
DA50
DA70
DA90
PAMPS
PDMAA
4 BIBLIOGRAFA
1)Mackles L., Gary H. H. Lubricant for cosmetics and toiletries; Bristol-Myers:
Canada, 1980.
2)Cahalan P.T., J evne A. H., Coury A.J ., Kallock M.J . Hydrogel adhesive; Lifecore
Biomedical, Inc.: United States, 1998.
3)Quarfoot A.J ., Hyla P. H., Patience D. Hydrogel wound dressing; The Kendall
Company: United States, 1990.
4)Coury A.J ., Keogh J . R., Hobot C.M., Howland W.W. Thromboresistant material and
articles; Medtronic Inc: United States, 1994.
1987-1994.
6)Tamada Y., Murata M., Makino K., Yoshida Y., Yoshida Y., Hayashi Y. Biomaterials
1998, 19, 745-750.
8)Yui N., Suzuki K., Okano T., Sakurai Y., Ishikawa C., Fujimoto K., Kawaguchi H.
Adsorption behavior of fibrinogen to sulfonated polyethylleneoxide-grafted
polyurethane surfaces; 1st Ed. ed.; Cooper S.L., B. C. H., Tsuruta T., Ed.; VSP:
Utrecht, The Netherlands, 1995, pp 237-253.
9)Amiji M.M. Colloids and surfaces B: Biointerfaces 1998, 10, 263-271.
10)Lpez G.P., Ratner B. D., Rapoza R.J ., Horbett T.A. Macromolecules 1993, 26(13),
3252.
11)Wichterle O., Lim D. Nature 1960, 165, 117.
12)Montheard J .P., Chatzopoulos M., Chappard D. Rev Macromol Chem Phys 1992,
C32(1), 1.
13)Alencar de Queiroz A.A., Gallardo A., San Romn, Higa O.Z. J Biomater Sci Polym
Ed 1995, 7(6), 523-530.
15 (10), 759-765.

46
1999, 10, 1-6.
17)Fort R.J ., Polyzoidis. T. M. Eur Polym J 1976, 12, 685-689.
18)Guidance for the Industry Q3C Impurities: Residual Solvents; US Federal Register,
1997; Vol. 62 FR67377.
19)Brandrup J ., Immergut E. H., Grulke E.A. Polymer Handbook; 4th ed.; Wiley, 1999.
20)Aggour Y.A. Polymer Degradation and Stability 1994, 44, 71-73.

CAPTULO 2

ESTIMACIN DE LAS RELACIONES DE
REACTIVIDAD DE LOS SISTEMAS
COPOLIMRICOS CON AMPS POR RMH-
1
H
in situ

Captulo 2: Estimacin de las relaciones de reactividad por RMN-
1
H

48
C CA AP P T TU UL LO O 2 2: : ESTIMACIN DE LAS RELACIONES DE
REACTIVIDAD DE LOS SISTEMAS COPOLIMRICOS CON AMPS
POR RMN-
1
H in situ

1 INTRODUCCIN.................................................................................................. 49
1.1 Modelo terminal de copolimerizacin............................................................ 49
1.2 Ecuacin diferencial de composicin............................................................. 51
1.3 Ecuacin integrada......................................................................................... 52
1
H in situ .......................................................................... 53
2 MATERIALES Y MTODOS: ............................................................................. 56
3 RESULTADOS Y DISCUSIN............................................................................ 60
3.1 Mtodo 1......................................................................................................... 63
3.1.1 Clculo de las elipses de confianza........................................................ 67
3.2 Mtodo 2......................................................................................................... 70
4 EVOLUCIN DE LA COPOLIMERIZACIN CON LA CONVERSIN......... 74
5 CONCLUSIONES.................................................. Error! Marcador no definido.
6 BIBLIOGRAFA.................................................................................................... 79

1
H 49

1 INTRODUCCIN

Las propiedades fisicoqumicas y el comportamiento biolgico de los sistemas
polimricos dependen de las caractersticas microestructurales de las cadenas
sintetizadas durante el proceso de polimerizacin
1-6
. La mayora de las reacciones de
copolimerizacin siguen un perfil cintico que se ajusta al modelo modelo terminal. Se
trata del modelo de polimerizacin ms sencillo y fue descrito por Mayo y Lewis en
1944
7
. En este captulo se muestra la utilidad de la monitorizacin de reacciones de
polimerizacin por RMN-
1
H in situ para la determinacin de los dos parmetros
cinticos ms caractersticos descritos por este modelo, denominados relaciones de
reactividad. stas, proporcionan informacin clara acerca de la composicin media y de
la distribucin estadstica de secuencias de monmeros en el sistema copolimrico
8,9
.

1.1 Modelo terminal de copolimerizacin

La copolimerizacin de dos monmeros M
1
y M
2
, produce dos tipos de especies
en propagacin, una con M
1
al final de la cadena en propagacin y otra con M
2
. El
modelo terminal de copolimerizacin asume que la reactividad de la especie en
propagacin depende nicamente de la unidad final que porta el centro activo y no de la
composicin de la cadena que le precede.

Considerando el caso de dos monmeros M
1
y M
2
, los dos tipos de especies en
propagacin sern M
1
*

y M
2
*
. Las reacciones de propagacin posibles sern:

k
11

M
1
*
+M
1
M
1
*
(2.1)

k
12

M
1
*
+M
2
M
2
*
(2.2)

k
21

M
2
*
+M
1
M
1
*
(2.3)

k
22

M
2
*
+M
2
M
2
*
(2.4)

1
H

50

Siendo k
11
, k
12
, k
21
y k
22
las constantes cinticas de cada una de las reacciones de
propagacin. Se asume que el estado estacionario se alcanza rpidamente y la
concentracin de radicales permanece constante durante toda la reaccin. Esto supone,
que la velocidad a la que los radicales M
1
* se convierten en M
2
* es igual que la
velocidad a la que M
2
* se convierte en M
1
*, de tal forma, que el nmero de radicales
que se forman es igual al nmero de radicales que se consumen. Por lo tanto, las
velocidades de reaccin (2.2) y (2.3) son iguales:

k
21
[M
2
*
][M
1
] =k
12
[M
1
*
][M
2
] (2.5)

Las velocidades de desaparicin de los monmeros sern:

-d[M1]/dt =k
11
[M
1
*
][M
1
] +k
21
[M
2
*
][M
1
] (2.6)
- d[M
2
]/dt =k
12
[M
1
*
][M
2
] +k
22
[M
2
*
][M
2
] (2.7)

donde se desprecia en buena aproximacin el monmero consumido en iniciacin . Y
dividiendo (2.5) entre (2.6), obtenemos:

] ][ [ ] ][ [
] ][ [ ] ][ [
] [
] [
2 2 22 2 1 12
1 2 21 1 1 11
2
1
* *
* *
M M k M M k
M M k M M k
M d
M d
+
+
= (2.8)

La ecuacin anterior se puede reescribir introduciendo las relaciones de
reactividad de los monmeros, r
1
=k
11
/k
12
y r
2
=k
22
/k
22
, que expresan las reactividades
relativas de cada tipo de radical con su propio monmero respecto del otro monmero:

] [ ] [
] [ ] [
] [
] [
] [
] [
2 2 1
2 1 1
2
1
2
1
M r M
M M r
M
M
M d
M d
+
+
= (2.9)

sta es la ecuacin de composicin del copolmero o ecuacin de
copolimerizacin, que expresa la composicin instantnea del copolmero en funcin
de las relaciones de reactividad y de la concentracin de los monmeros en la
alimentacin. La ecuacin de copolimerizacin puede expresarse tambin en funcin de
las fracciones molares, ya que la relacin dM
1
/dM
2
es la relacin F
1
/F
2
o fraccin molar
1
H 51
instantnea en el copolmero
.
Considerando que f
1
y f
2
son las fracciones molares de las
unidades monomricas, podemos llegar a la siguiente ecuacin:

) (
) (
2 2 1 2
2 1 1 1
2
1
F r F F
F F r F
F
F
+
+
= (2.10)

La estimacin de las relaciones de reactividad en reacciones de copolimerizacin
radical es un rea de gran inters tanto a nivel acadmico como industrial. Esto queda
reflejado en el gran nmero de artculos y publicaciones que describen y determinan
dichos parmetros para diferentes sistemas copolimricos.

1.2 Ecuacin diferencial de composicin

El punto de partida habitual para la estimacin de las relaciones de reactividad es
la ecuacin diferencial de composicin, (Ecuaciones 2.9 y 2.10). El protocolo ms
utilizado en este caso consiste en la preparacin de copolmeros a baja conversin
cubriendo todo el rango de composiciones molares del sistema, de 0 a 1 (se acepta como
aproximacin que las cadenas formadas a cortos tiempos de reaccin cumplen la
ecuacin de copolimerizacin). Despus de la determinacin de las fracciones molares
tanto en alimentacin como en el copolmero, se pueden aplicar distintos tratamientos
que ajusten estos datos a la ecuacin diferencial de copolimerizacin. A partir de parejas
f
1
/F
1
, los mtodos clsicos de determinacin de las relaciones de reactividad
7,10,11

utilizan diferentes linealizaciones de la ecuacin instantnea de composicin, donde los
parmetros r
1
y r
2
(relaciones de reactividad del sistema) son las dos nicas incgnitas y
son estimadas mediante la representacin grfica y el ajuste lineal por mnimos
cuadrados a dicha ecuacin. Sin embargo, estas aproximaciones no son vlidas
estadsticamente hablando, ya que la variable independiente contiene errores, y la
dependiente no posee una varianza constante. Estas dos condiciones son necesarias para
llevar a cabo un ajuste lineal por mnimos cuadrados. Como resultado ODriscoll y
Reilly
12
entre otros, han demostrado que la linealizacin de la ecuacin de composicin
propuesta por Mayo-Lewis no es una aproximacin rigurosa y conduce, en ocasiones, a
graves errores con intervalos de confianza errneos.

1
H

52
Por lo tanto, la aplicacin de mtodos no lineales es la aproximacin ms
correcta a la hora de estimar dichos parmetros y fue propuesto por primera vez por
Behnken
13
. A pesar de tratarse de un proceso laborioso, se ha convertido en rutinario
con los avances informticos de los ltimos tiempos. Una extensin del tratamiento no
lineal es el uso del modelo de error-in-variables (EVM), que evala correctamente el
error en todas las variables. Fue propuesto por Van der Meer et al.
14
y Patino-Leal et
al.
15
. Este mtodo estadstico tiene en cuenta el error cometido tanto en la variable
independiente como en la dependiente, es decir, tanto en la composicin en
alimentacin como la composicin en el copolmero respectivamente. Otra forma de
estimar valores de relaciones de reactividad mediante ajustes no lineales por mnimos
cuadrados o por EVM, ha sido recientemente diseado por J enkins
16,17
y est basado
en una modificacin del esquema Q-e clsico.

1.3 Ecuacin integrada

El protocolo de trabajo expuesto anteriormente y empleado por los mtodos
clsicos, mediante el aislamiento de muestras a baja conversin, es tedioso y posee
errores y problemas intrnsecos ineludibles. En ocasiones se arrastran restos de
monmero residual y disolventes durante el aislamiento del polmero o se fraccionan las
muestras del copolmero. Adems, el copolmero obtenido no corresponde al formado
instantneamente con la composicin inicial en alimentacin, sino que se trata del
promedio de copolmeros formados hasta que la copolimerizacin se para a baja
conversin. A pesar de que esta aproximacin est ampliamente aceptada, conlleva un
inevitable error y es especialmente acusado en el caso de parejas con muy diferentes
relaciones de reactividad, donde la composicin del copolmero es muy diferente de la
composicin en la alimentacin. La utilizacin de la ecuacin integrada no conlleva esta
limitacin y puede ser utilizada para conversiones mayores del 15-20%, ya que tiene en
cuenta la variacin de composicin
12,18
.

) 1 )( 1 (
1
2 20 10 1
2 2 1 1
1
2 10
1 20
20
2
2 1
2 1
2
2
1 ]) [ ] [ )( 1 (
1 ]) [ ] [ )( 1 (
] ][ [
] ][ [
] [
] [
r r
r r
r
r
r M M r
r M M r
M M
M M
M
M

= (2.11)

Su forma ms utilizada es la aproximacin de Skeist, desarrollada en 1946, que
relaciona la composicin del copolmero con la conversin.
1
H 53

=
1
0 1
0 2
2
0 1
1
0
) (
) ( ) (
1 1
f
f
f
f
f
f
M
M
(2.12)
siendo:
) 1 (
2
2
r
r
=
) 1 (
1
1
r
r
=
) 1 )( 1 (
) 1 (
2 1
2 1
r r
r r

=
) 2 (
) 1 (
2 1
2
r r
r

=

Mao y Huglin
19
entre otros, han propuesto nuevos mtodos lineales y no
lineales para la estimacin de las relaciones de reactividad mediante la ecuacin
integrada. Los mtodos lineales proporcionan buenas aproximaciones para algunos
casos, aunque fueron ms fiables a la hora de estimar estos parmetros los mtodos no
lineales.

En este captulo se ha utilizado un ajuste no lineal por mnimos cuadrados a la
solucin exacta de la ecuacin integrada de copolimerizacin (Ec.2.11) de datos de
composicin instantnea obtenidos por RMN-
1
H in situ.

1
H in situ

La determinacin de las relaciones de reactividad con pequeos intervalos de
confianza requiere tcnicas analticas sensibles, la cuidadosa planificacin de los
experimentos y el uso de mtodos estadsticos de validacin.

La composicin del copolmero puede determinarse de dos formas:
indirectamente, midiendo la concentracin de los monmeros que no han reaccionado
y haciendo balances de materia para calcular la fraccin molar de monmeros en el
copolmero acumulado, o bien directamente, midiendo la composicin del copolmero
formado. En cualquiera de los dos casos es necesaria la separacin de monmeros y
copolmero, ya que ambos poseen prcticamente los mismos grupos funcionales. La
concentracin de monmeros se mide por lo general mediante cromatografa de gases
(CG) o cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC). Por otro lado, la
determinacin de composicin en el copolmero (mediante espectroscopia de infrarrojo
(IR), ultravioleta (UV) o resonancia magntica nuclear (RMN) entre otras) es menos
1
H

54
precisa por la complejidad de los espectros, pero es necesaria cuando existen reacciones
secundarias que consumen significativas cantidades de monmero.

Recientemente, varias escuelas han propuesto el uso de la espectroscopa de la
resonancia magntica nuclear, RMN, para el anlisis directo del medio de reaccin de
diferentes sistemas de copolimerizacin. Ito y colaboradores han descrito el anlisis in
situ de reacciones de copolimerizacin radical por RMN
20,21
y llevaron a cabo un
riguroso estudio de la cintica de reaccin, incluyendo la determinacin de las
relaciones de reactividad y la simulacin de la reaccin utilizando estos valores. Koole y
Kruft
22
estudiaron la reaccin de copolimerizacin radical de nuevos steres
metacrlicos que contenan grupos yodobenzoilo con metacrilato de metilo y 2-
hidroxietilmetacrilato (HEMA). Ms recientemente, Mc Brierty y colaboradores
23,24

han propuesto un interesante y elegante mtodo basado en RMN-
1
H y FTIR para la
monitorizacin de la dinmica de curado de formulaciones acrlicas y vinlicas activadas
por radiacin UV. Los resultados obtenidos del anlisis de los espectros de protn de
mezclas de HEMA, N-vinilpirrolidona y 4 5-t-butil-2-hidroxiciclohexilmetacrilato al
cabo de distintos tiempos de irradiacin permiten determinar la fraccin estos
componentes en funcin del grado de conversin. La comparacin de los datos
experimentales obtenidos por los espectros de RMN con la simulacin estadstica
asistida por ordenador a partir de los parmetros Q-e fue excelente en todo el intervalo
de conversin, demostrando la validez del mtodo para el estudio de sistemas de
polimerizacin complejos aunque existan reacciones de entrecruzamiento.

En este captulo proponemos una simple y novedosa metodologa para la
estimacin de las relaciones de reactividad de los sistemas poli(HEMA-co-AMPS),
poli(DMAA-co-AMPS) y poli(THEMA-co-AMPS). El mtodo utiliza la solucin
integrada exacta de la ecuacin diferencial de copolimerizacin definida para el modelo
terminal, para ajustar directamente la evolucin de las concentraciones de monmeros
obtenidas por anlisis cuantitativo de RMN-
1
H. Si la reaccin se ajusta al modelo
terminal, un ajuste no lineal por mnimos cuadrados nos da los valores ptimos de las
relaciones de reactividad. Se describen dos aproximaciones diferentes para obtener estos
parmetros por este mtodo. El proceso posee varias ventajas sobre el mtodo estndar,
ya que al tratarse de una monitorizacin in situ, no es necesaria la manipulacin de la
1
H 55
muestra, ni el aislamiento del copolmero y obtiene datos instantneos de composicin
en el copolmero a partir del consumo del monmero. Uno de los puntos ms polmicos
de este trabajo es la influencia del campo magntico sobre las propiedades Q-e del
sistema y por lo tanto sobre la reaccin de copolimerizacin
25
. Sin embargo, el trabajo
de Mc Brierty
23,24
demuestra que esta influencia es muy pequea. Adems, la
concordancia entre las relaciones de reactividad obtenidas por este mtodo y las
descritas en la literatura demuestran la validez del mtodo. Esta metodologa podra
aplicarse con otras tcnicas no invasivas, tales como FTIR.
1
H

56

2 MATERIALES Y MTODOS:

Reactivos

Los reactivos empleados en este captulo han sido previamente detallados en el
Captulo 1(Materiales y Mtodos_Reactivos).

Copolimerizacin

La copolimerizacin HEMA-AMPS se llev a cabo dentro de un equipo de
RMN utilizando D
2
O como disolvente, a 50 0,1C y con persulfato amnico como
iniciador en concentracin 0,02 M. La disolucin fue desoxigenada burbujeando
nitrgeno durante 15 minutos. La concentracin total de monmero fue 0,30 M y la
fraccin molar de HEMA en la alimentacin 0,50.

Las reacciones de copolimerizacin DMAA-AMPS se realizaron en D
2
O a 40
0,1C, utilizando persulfato amnico como iniciador (0,02 M) y una concentracin de
monmero total de 0,30 M. Las fracciones molares de DMAA en alimentacin fueron
0,75, 0,54 y 0,33.

La determinacin de las relaciones de reactividad del sistema THEMA-AMPS
se llev a cabo monitorizando la sntesis de los copolmeros en DMSO-d
6
, a 50 0,1 C
y AIBN (1,510
-2
M) como iniciador. La concentracin de monmeros fue 0,25 M y las
fracciones molares de THEMA 0,8 y 0,6.

Con la intencin de comprobar la exactitud del mtodo, se sintetizaron muestras
a baja conversin (<5%) para los sistemas HEMA-AMPS y DMAA-AMPS, en las
mismas condiciones que las mencionadas anteriormente pero en H
2
O y en una estufa
termostatizada a la temperatura adecuada. Las fracciones molares en alimentacin
fueron F
HEMA
0,5 y 0,2 y F
DMAA
0,75 y 0,2 respectivamente. Transcurrido un corto
tiempo de reaccin, los frascos se retiraron de la estufa y se precipitaron en un gran
1
H 57
exceso de acetona, se redisolvieron en agua y liofilizaron durante 24h. Posteriormente
se caracterizaron por RMN-
1
H.

Medidas de los tiempos de relajacin T
1

Con el fin de establecer un tiempo de espera entre adquisiciones adecuado para
las reacciones ms rpidas (DMAA-AMPS y HEMA-AMPS), se calcul el tiempo de
relajacin spn-red (T
1
) de los protones vinlicos, empleados en el clculo de las
concentraciones de los monmeros.

T
1
se determin empleando una tcnica de pulsos inversin-recuperacin, en un
equipo Bruker 300. El momento macroscpico M se hizo girar a lo largo del eje z, para
luego aplicar un segundo pulso de 90. Si el tiempo entre pulsos (d
1
)

es menor que T
1
, la
componente z de magnetizacin no habr tenido tiempo para aumentar hasta el valor del
equilibrio M
0
. Por lo tanto, midiendo M
z
a diferentes d
1
(en nuestro caso tomamos
valores entre 10 y 0,01 segundos), se puede llegar a determinar T
1
.

Anlisis por RMN-
1
H

Todos los experimentos se llevaron a cabo en un equipo Varian 400. Con el fin
de obtener datos cuantitativos, se utiliz una secuencia de pulsos de 7s, equivalentes a
un pulso de 90. Se adquiri un espectro (un punto experimental) cada 60s para los
sistema HEMA-AMPS y DMAA-AMPS. El tiempo de espera entre espectro y espectro
result suficiente para permitir la total relajacin de los protones vinlicos, cuyos
tiempos de relajacin, T
1
, nunca superaron los 1,5 s (el tiempo de espera entre pulsos
aconsejado, debe ser superior a cinco veces el tiempo de relajacin T
1
). Para el sistema
THEMA-AMPS se pudo aplicar un tiempo de espera entre espectro y espectro de 600s
(15 min), ya que la velocidad de copolimerizacin de este sistema copolimrico es
significativamente menor. En todas la reacciones la velocidad de giro del tubo fue de 7
Hz y cada espectro se obtuvo mediante una sola adquisicin, asegurando de esta forma
que los datos obtenidos correspondan a medidas instantneas de
composicin/conversin y no a un promedio. La temperatura de las muestras se
mantuvo a 40 50 0,1C con el controlador de temperatura automtico del equipo.
Dentro del tubo de RMN se introdujo un capilar de vidrio con una solucin de N,N-
1
H

58
dimetilaminopiridina (DMAP, 10 % w/v) en D
2
O DMSO-d
6
(dependiendo del
disolvente empleado en la reaccin), que se utiliz como referencia. Las seales se
integraron utilizando el programa NUTS (2D Versin 5.097). Las concentraciones
instantneas en alimentacin se determinaron del siguiente modo:

Sistema HEMA-AMPS:

[ ]
R
H H
HEMA
2
2 1
+
= (2.13)

[ ]
R
A A A
AMPS
3
3 2 1
+ +
= (2.14)

donde H
1
y H
2
corresponden a la contribucin de protones metilnicos asignados a
HEMA, A
1
, A
2
y A
3
son atribuidos a los protones acrlicos del AMPS y R a los picos de
referencia (DMAP). Las contribuciones los protones fueron normalizadas para
composiciones iniciales en alimentacin de [HEMA]=[AMPS]=0,15 mol/L. En la Fig.
2.1 se muestra la estructura qumica de los monmeros y en la Figura 2.2 los espectros
registrados a distintos tiempos de reaccin.

Sistema DMAA-AMPS:

[ ]
R
D D
DMAA
2
2 1
+
= (2.15)

[ ]
R
A
AMPS
2
= (2.16)

donde D
1
y D
2
corresponden a las contribuciones de los protones metilnicos de la
DMAA (Figuras 2.1 y 2.3). Los valores fueron normalizados utilizando la composicin
inicial en alimentacin.

1
H 59

Sistema THEMA-AMPS:

[ ]
( ) [ ]
3
3 1 2 2 1
A T T A A
AMPS
+ + +
= (2.17)

1
] [ T THEMA = (2.18)

donde T
1
y T
2
corresponden a la contribucin de los protones metilnicos del THEMA
en la (Figuras 2.1 y 2.4). Como en los dos casos anteriores estos valores se
normalizaron respecto de la composicin inicial en alimentacin.

1
H

60

Las reacciones de copolimerizacin fueron monitorizadas por RMN-
1
H. En las
Figuras 2.2, 2.3 y 2.4 se muestran varios espectros de los sistemas HEMA-AMPS,
DMAA-AMPS y THEMA-AMPS a distintos tiempos de reaccin. En la Figura 2.1 se
muestra la asignacin de los protones empleados para la determinacin de las
concentraciones de los monmeros tal y como se especific en la seccin de materiales
y mtodos. La dimetilaminopiridina (DMAP) se utiliz como referencia para el anlisis
cuantitativo.

C
H
H
O
H
2
C
CH
2
O
C
O
O
O
CF
3
CH
3
CH
3
O
C
H
H
HN
C
O
H
C CH
3
H
3
C
H
2
C
SO
3
H
T
1
T
2
A
1
A
2
A
3
THEMA
AMPS
C
H
H
OH
H
2
C
CH
2
O
C
O
CH
3
C
H
H
N
C
O
H
CH
3 H
3
C
HEMA DMAA
H
1
H
2
D
1
D
2
D
3

Fig. 2.1: Estructura qumica de los monmeros utilizados para la sntesis de
los correspondientes copolmeros junto con la nomenclatura de los protones
acrlicos y metacrlicos objeto de estudio.

1
H 61

Fig.2.2: Detalle de la regin acrlica de espectros representativos de la reaccin
de copolimerizacin HEMA-AMPS con una fraccin molar inicial en
alimentacin de F(HEMA) =0,50.

de copolimerizacin DMAA-AMPS con una fraccin molar inicial en
alimentacin de F(DMAA) =0,75.
7,00 6,75 6,50 6,25 6,00 5,75 5,50
A
2
H
1
A
1
H
2
A
3
DMAP
t=45 min
t=30 min
t=20 min
t=12 min
t=6 min
t=1 min
ppm
H
E
M
A
-
A
M
P
S

(
5
0
:
5
0
)
7,00 6,75 6,50 6,25 6,00 5,75 5,50
A
2
H
1
A
1
H
2
A
3
DMAP
t=45 min
t=30 min
t=20 min
t=12 min
t=6 min
t=1 min
ppm
H
E
M
A
-
A
M
P
S

(
5
0
:
5
0
)
7,00 6,75 6,50 6,25 6,00 5,75 5,50
A
2
D
2 D
3
+A
1
+A
3
D
1
DMAP
t=75 min
t=65 min
t=55 min
t=45 min
t=35 min
ppm
D
M
A
A
-
A
M
P
S

(
7
5
:
2
5
)
7,00 6,75 6,50 6,25 6,00 5,75 5,50
A
2
D
2 D
3
+A
1
+A
3
D
1
DMAP
t=75 min
t=65 min
t=55 min
t=45 min
t=35 min
ppm
D
M
A
A
-
A
M
P
S

(
7
5
:
2
5
)
1
H

62

de copolimerizacin THEMA-AMPS con una fraccin molar inicial en
alimentacin de F(THEMA) =0,80.

La variacin de la concentracin de monmeros se relacion con las relaciones de
reactividad utilizando la ecuacin integrada de copolimerizacin que describe el modelo
terminal
12,18
(Ecuacin 2.11).

Si [M
1
]/[M
2
] =x, [M
2
] =y, r
1
=a y r
2
=b

y y
x
x
b a x
b a x
o
b
b
ab
a b
=

+
+

0
1
0
1
1 1
1 1
1 1
( )
( )
( )( )
(2.19)

[ ] y k x b a x
b
b
ab
a b
= +

1
1
1 1
1 1 ( )
( )( )
(2.20)

7,5 7,0 6,5 6,0 5,5

A
3
T
1
A
1
+ A
2
+ T
2
DMAP
t = 300 min
t = 240 min
t = 180 min
t = 120 min
t = 15 min
ppm
5,75 6,25 6,75 7,25 7,75
T
H
E
M
A
-
A
M
P
S

(
8
0
:
2
0
)
7,5 7,0 6,5 6,0 5,5

A
3
T
1
A
1
+ A
2
+ T
2
DMAP
t = 300 min
t = 240 min
t = 180 min
t = 120 min
t = 15 min
ppm
5,75 6,25 6,75 7,25 7,75
T
H
E
M
A
-
A
M
P
S

(
8
0
:
2
0
)
1
H 63
donde k es una constante que incluye las condiciones iniciales de copolimerizacin. A
pesar de que esta ecuacin es bien conocida en la literatura, el mtodo ms utilizado
para analizar las composiciones en alimentacin y copolmero en funcin de la
conversin es el desarrollado por Skeist
26
, el cul utiliza composiciones promedio. En
nuestro caso, en cambio, hemos utilizado la solucin integrada exacta y los datos
experimentales x e y ([M
2
], [M
1
]/[M
2
]) los obtuvimos del anlisis in situ por RMN-
1
H
de la reaccin de copolimerizacin. Hemos desarrollado dos aproximaciones para
estimar las relaciones de reactividad de sistemas que se ajustan al modelo terminal,
basados un ajuste no lineal por mnimos cuadrados a las Ecuaciones 2.19 y 2.20.

Las Figuras 2.5 y 2.7 representan los datos experimentales obtenidos de varias
reacciones de copolimerizacin para los sistemas HEMA-AMPS y DMAA-AMPS
como ejemplo. La dispersin de los datos se atribuy al error experimental de la RMN.
Existen fuentes de error que pueden alterar las medidas, como la preparacin de la
muestra, la integracin de las seales...etc. Por ello, la utilizacin de un nico punto
como condicin inicial (x
0
, y
0
) puede conducir a grandes errores en la estimacin de r
1
y
r
2
utilizando la Ecuacin 2.19. Para solventar este inconveniente se desarrollaron dos
metodologas.

3.1 Mtodo 1.

El error experimental se promedi utilizando k como tercer parmetro en el
ajuste no lineal a la Ecuacin 2.20 en vez de x
0
,y
0
. La optimizacin por mnimos
cuadrados proporcion los valores ptimos de r
1
, r
2
y k. Se aplic este tratamiento a los
sistemas HEMA-AMPS y DMAA-AMPS, los cuales presentaron un comportamiento
muy diferente: mientras en el sistema DMAA-AMPS ambos monmeros se consumen a
velocidades similares (relaciones de reactividad prximas a la unidad), en el sistema
HEMA-AMPS, HEMA se consume a mucha mayor velocidad, lo que se traduce en
relaciones de reactividad muy diferentes (r
HEMA
debe ser mayor que 1 y r
AMPS
menor que
1).

1
H

64

Figura 2.5: Concentracin molar de AMPS
[AMPS] frente a la relacin
[HEMA]/[AMPS], obtenido de la
monitorizacin in situ por RMN-
1
H de la
reaccin de copolimerizacin HEMA-
AMPS. F(HEMA) =0,50.
Figura 2.6: Diagrama de composicin
obtenido con las relaciones de reactividad
determinadas por el tratamiento propuesto
para el sistema HEMA-AMPS. La lnea
gruesa corresponde a la regin recorrida por
los datos experimentales. Los crculos
representan los datos obtenidos con los
experimentos a baja conversin.

Como consecuencia de esto, una buena eleccin de las condiciones iniciales de
reaccin para el sistema HEMA-AMPS permiti utilizar una nica reaccin para
obtener relaciones de reactividad fiables. [AMPS] frente [HEMA]/[AMPS] es
representado en la Figura 2.5 para una fraccin molar en alimentacin inicial de 0,50.
La alta velocidad de reaccin del HEMA hace que [HEMA]/[AMPS] vare de 1 a 0,1,
mientras que [AMPS] disminuye ligeramente. El ajuste a la Ecuacin 2.20 dio unos
valores ptimos r
HEMA
=6,81 y r
AMPS
=0,116. Para estas relaciones de reactividad se
calcul el diagrama terico de composicin (Figura 2.6), donde se represent en tramo
grueso el rango de composiciones en alimentacin recorridas por la reaccin, el cul fue
considerado suficiente para estimar de forma fiable estos parmetros cinticos. Los
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
R^2 = 0.9699

r(HEMA) 6.81
r/AMPS) 0.116
[
A
M
P
S
]
[HEMA]/[AMPS]
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0

f
(
H
E
M
A
)
,

c
o
p
o
l
m
e
r
o
F(HEMA), alimentacin
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
R^2 = 0.9699

r(HEMA) 6.81
r/AMPS) 0.116
[
A
M
P
S
]
[HEMA]/[AMPS]
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0

f
(
H
E
M
A
)
,

c
o
p
o
l
m
e
r
o
F(HEMA), alimentacin
1
H 65
puntos experimentales obtenidos mediante las reacciones estndar a baja conversin
tambin estn representadas en la Figura 2.6 y estn en concordancia con el diagrama
obtenido.

Figura 2.7: Concentracin molar de AMPS
[AMPS]frente a la relacin
[DMAA]/[AMPS] a partir de la
monitorizacin in situ por RMN-
1
H de las
reacciones de copolimerizacin DMAA-
AMPS con una composicin molar en
alimentacin de F(DMAA)=0,74; 0,54 y
0,33 (experimentos 1, 2 y 3
respectivamente).
Figura 2.8: Diagramas de composicin
obtenidos con las relaciones de reactividad
para el sistema DMAA-AMPS. Las lneas
gruesas corresponden a las regiones
recorridas por los datos experimentales.

En el caso del sistema de copolimerizacin DMAA-AMPS, a altas conversiones,
es decir, cuando se alcanza el lmite de deteccin de la tcnica de RMN, la relacin
M
1
/M
2
ha sufrido una variacin relativamente pequea, lo que se traduce en un pequeo
rango de puntos en el diagrama f/F. La reaccin de copolimerizacin contina en
cualquier caso recorriendo el resto de composiciones del diagrama pero por debajo del
lmite de deteccin. Para solucionar este inconveniente se decidi emplear sucesivos
experimentos que solapasen cortos rangos de [M
1
]/[M
2
], es decir, empezar una reaccin
donde termin la anterior. La Figura 2.7 representa la concentracin molar de AMPS
([AMPS]) frente [DMAA]/[AMPS] para tres reacciones. El ajuste de cada una de las
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0,22
0,24
reaccin1
R^2 = 0.99157

r(DMAA) 2.01
r(AMPS) 0.99
reaccin3
R^2 = 0.97879

r(DMAA) 1.13
r(AMPS) 0.35
reaccin
R^2 = 0.99079

r(DMAA) 2.29
r(AMPS) 0.59
[
A
M
P
S
]
[DMAA]/[AMPS]
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0

f
(
D
M
A
A
)
,

c
o
p
o
l
m
e
r
o
F(DMAA), alimentacin
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0,22
0,24
reaccin1
R^2 = 0.99157

r(DMAA) 2.01
r(AMPS) 0.99
reaccin3
R^2 = 0.97879

r(DMAA) 1.13
r(AMPS) 0.35
reaccin
R^2 = 0.99079

r(DMAA) 2.29
r(AMPS) 0.59
[
A
M
P
S
]
[DMAA]/[AMPS]
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0

f
(
D
M
A
A
)
,

c
o
p
o
l
m
e
r
o
1
H

66
reacciones por separado conduce a las relaciones de reactividad r
DMAA
=2,01
r
AMPS
=0,99, r
DMAA
=2,29 r
AMPS
=0,59 y r
DMAA
=1,13 r
AMPS
=0,35 respectivamente. En la
Figura 2.8 se representan los correspondientes diagramas de composicin, donde los
tramos gruesos resaltan, de nuevo, el rango de composiciones recorrido por las
reacciones. Existe una notable discordancia entre las tres curvas atribuido al error
asociado al uso de datos en cortas regiones de composicin.

Figura 2.9: Concentracin molar corregida
de AMPS [AMPS] frente a la relacin
[DMAA]/[AMPS] obtenido mediante el
tratamiento propuesto en el texto.

Figura 2.10: Diagrama de composicin
obtenido con las relaciones de reactividad
para el sistema DMAA-AMPS. La lneas
punteadas corresponden a los diagramas de
la Figura 2.8 y los crculos representan los
datos obtenidos con los experimentos a baja
conversin.

Para solucionar este problema se aplicaron unos factores de desplazamiento de
las curvas p
1
=[AMPS]
ajuste2
/[AMPS]
ajuste1
=8,649 para [DMAA]/[AMPS] =1,156 (la
relacin [M
1
]/[M
2
] final e inicial para el primer y segundo experimento respectivamente)
y p
2
=30,763 =p
1
[AMPS]
ajuste3
/[AMPS]
ajuste2
para [DMAA]/[AMPS] de 0,45 y siendo
[AMPS]
fiti
el valor terico obtenido por la Ecuacin 2.20 en cada caso. Debido a que x
0
e
y
0
han sido parametrizados y x depende de la relacin [M
1
]/[M
2
] y no de valores
absolutos de concentracin M
1
y M
2
, podemos crear estos parmetros de desplazamiento
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
R^2 = 0.99741

r(DMAA) 1.50
r(AMPS) 0.40
[
A
M
P
S
]
-
c
o
r
r
e
g
i
d
o
[DMAA]/[AMPS]
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0

f
(
D
M
A
A
)
,

c
o
p
o
l
m
e
r
o
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
R^2 = 0.99741

r(DMAA) 1.50
r(AMPS) 0.40
[
A
M
P
S
]
-
c
o
r
r
e
g
i
d
o
[DMAA]/[AMPS]
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0

f
(
D
M
A
A
)
,

c
o
p
o
l
m
e
r
o
1
H 67
que compatibilizan matemticamente los datos de las tres reacciones. Multiplicando los
datos de los experimentos 2 y 3 por 1/p
1
y 1/p
2
respectivamente, obtenemos una
representacin del siguiente tipo (Figura 2.9) la cual se ajusta a la ecuacin 2.20 y
obteniendo datos de relaciones de reactividad r
DMAA
=1,50 r
AMPS
=0,40.

Adems de la considerable disminucin del error de la regresin no lineal, el diagrama
terico de composicin obtenido con estos valores (Figura 2.10) presenta una
considerable concordancia con los diagramas anteriores (Figura 2.8) ya que se ajusta a
la reaccin 1 a altas concentraciones de DMAA (altas composiciones iniciales de
DMAA en alimentacin), mientras que a intermedias y bajas concentraciones de
DMAA se ajusta a las reacciones 2 y 3 respectivamente. Estos resultados resaltan la
gran importancia de utilizar datos que cubran todo el rango de composiciones. En la
literatura se describen valores de relaciones de reactividad para este sistema de
r
DMAA
=1,03 y r
AMPS
=0,53
27
, aunque estos autores utilizaron muestras a relativamente
alta conversin, por lo que posiblemente el error asociado a este hecho es el responsable
de que obtengan valores de r ms prximos a la unidad, que los valores obtenidos en
nuestro laboratorio. Existe, de nuevo, una buena concordancia con los puntos
experimentales obtenidos a baja conversin.

3.1.1 Clculo de las elipses de confianza

De cara a valorar el error experimental de los datos , se hallaron las dimensiones
de la elipse de confianza generada a partir del mtodo descrito por Box y colaboradores
(95% de confianza)
28
y el cual se resume a continuacin. Se representaron en la Figura
2.11, para los sistemas estudiados por el Mtodo 1.

Si tenemos un modelo biparamtrico (por ejemplo, nuestra ecuacin integrada
exacta que incluye dos parmetros r
1
y r
2
) y n puntos experimentales, la suma de las
diferencias cuadrticas entre los valores experimentales y
exp
y aquellos dados por el
modelo y
i
, para cualquier pareja de r
1
y r
2
, se define como S:

[ ]
=
=
n
i
i
y y S
1
2
exp
(ec. 2.21)
1
H

68

Fig.2.11: Elipses de confianza ( =95%) de las relaciones de reactividad estimadas
mediante el Mtodo 1.

Cada pareja r1/r2 dar lugar a un valor de S (ms grande o ms pequeo). La
estimacin de r
1
y r
2
por el mtodo de ajuste por mnimos cuadrados se lleva a cabo
mediante la minimizacin de S (es decir, se estiman aquellos r
1
y r
2
que dan lugar a la
S
min
). ste mtodo se puede utilizar con sistemas con parmetros lineales y en buena
aproximacin con sistemas de parmetros no lineales (como es nuestro caso).

Una caracterstica de S (suma de las diferencias cuadrticas) es que aquellos
valores de r
1
y r
2
(en nuestro caso) que dan lugar a un mismo valor de S (ms o menos
alejado de S
min
), se representan en el espacio paramtrico (r
1
frente a r
2
en nuestro caso,
o viceversa) como una elipse o elipsoide. As, una regin de confianza 1- para r
1
y r
2
,
viene definido por un valor de S que se aleja de S
min
segn la expresin probabilstica:

A p n p F
p n
p
S S
R
=
+ = ) , ( 1

(ec. 2.22)

valor de S que se corresponde con una elipse en el espacio r
1
-r
2
(la elipse de confianza),
siendo S
R
la suma de los cuadrados de los residuales para los r
1
y r
2
estimados por el
0,10 0,11 0,12 0,13 0,14
6,0
6,5
7,0
7,5
8,0
r
(
H
E
M
A
)
r(AMPS)
0,30 0,35 0,40 0,45 0,50
1,40
1,45
1,50
1,55
1,60
r
(
D
M
A
A
)
r(AMPS)
0,10 0,11 0,12 0,13 0,14
6,0
6,5
7,0
7,5
8,0
r
(
H
E
M
A
)
r(AMPS)
0,30 0,35 0,40 0,45 0,50
1,40
1,45
1,50
1,55
1,60
r
(
D
M
A
A
)
r(AMPS)
Captulo 2: Estimacin delas relaciones de reactividad por RMN-
1
H 69
mtodo de mnimos cuadrados (es decir, S
R
es S
min
), F
el valor de distribucin F con

% de confianza, p el nmero de parmetros y n-p los grados de libertad (para
n puntos experimentales). Una elipse del 90% de confianza, por ejemplo, tiene el mismo
significado que el del intervalo de confianza del 90%: si repetimos la experimentacin
muchas veces, el 90% de la regin de confianza incluir el valor verdadero r
1
/r
2
y un
10% no. Por otra parte, la estimacin de errores (para un modelo de dos parmetros) de
un ajuste por mnimos cuadrados (lineal o no lineal), cuyos parmetros dependen unos
de otros, debe realizarse mediante elipses de confianza (o regiones) y no con los
intervalos de confianza comnmente utilizados. Esto se debe a que podran existir
valores que entran dentro de los intervalos de confianza de cada uno de los parmetros
por separado, pero no en la elipse de confianza que relaciona ambos errores. De esta
forma se podran dar por buenos valores que no lo son.

En nuestro ejemplo concreto, una vez estimados r
1
y r
2
(por medio de un ajuste
no lineal de mnimos cuadrados) y conocidos S
R
, n, p y F para un intervalo de
confianza dado (1-), calculamos A en la ecuacin anterior y la elipse vendr dada por
la expresin:

[ ]
=
=
n
i
i
A y r r y
1
2
exp 2 1
) , ( (ec. 2.23)

Debido a la complejidad de nuestro modelo, para determinar los puntos de la
elipse hemos definido una funcin
= A x f ) ( donde r
2
es x.

x =0 f(x) para un valor de b

Con la ayuda del software Mathsoft hemos calculado las parejas de puntos r
1
/r
2

(r
1
/x) que hacen f(x)=0 mediante la representacin grfica de f(x) para diferentes
valores de r
1
. Para los valores de r
1
que definen la elipse, encontramos dos x (r
2
) que
hacen f(x)=0 (corte del eje x). De esta manera se obtuvieron los puntos que generarn la
elipse de confianza.
1
H

70

3.2 Mtodo 2.

Mayo y Lewis en 1944 desarrollaron un mtodo para determinar grficamente
las relaciones de reactividad en el caso de sistemas obtenidos a alta conversin
utilizando la ecuacin integrada de copolimerizacin. El mtodo puede resumirse del
siguiente modo: partiendo de la ecuacin 2.11 y tras una reorganizacin de trminos se
llega a la expresin 2.24.

] [
] [
1
] [
] [
1
log
1
] [
] [
log
] [
] [
1
] [
] [
1
log
1
] [
] [
log
20
10
2
1
1
10
20
10
2
1
2
20
2
M
M
p
M
M
p
p M
M
M
M
p
M
M
p
p M
M
r
= (2.24) siendo
2
1
1
1
r
r
p
= (2.25)

Se lleva a cabo una reaccin a alta conversin y se determinan las
concentraciones de los monmeros tanto al principio ([M
i0
]) como al final de la reaccin
([M
i
]). Se eligen arbitrariamente valores positivos o negativos de p mediante ensayo y
error, con el fin de obtener puntos en la regin significativa, y se sustituyen en la
ecuacin 2.24, conducindonos a diferentes valores de r
2
. El valor de r
1
se calcula
sustituyendo en la ecuacin 2.25. Se representa r
2
vs. r
1
obteniendo para cada
experimento una lnea recta de pendiente positiva que aumenta a medida que aumenta
[M
1
]/[M
2
]. Por ello se necesitan dos o ms experimentos para estimar las relaciones de
reactividad del sistema ya que el punto de interseccin de las rectas indicaran el valor
ptimo para este sistema.

Nuestro Mtodo 2 es, en definitiva, una variacin del mtodo de Mayo y Lewis.
Aplicando la ecuacin 2.19 y tomando distintos valores de x
0
,y
0
, es decir considerando
distintos puntos experimentales x
t
,y
t
como puntos iniciales de la reaccin del sistema
1
H 71
objeto de estudio, ajustamos por mnimos cuadrados el conjunto de puntos
experimentales a la ecuacin 2.19. De esta manera, obtenemos valores de r
1
y r
2
(Figura
2.13) para cada uno de los ajustes. Los datos presentan una particular tendencia lineal,
que al igual que en el modelo de Mayo-Lewis, posee pendiente positiva que aumenta al
aumentar [M
1
]/[M
2
]. El error experimental asociado a cada x
0
,y
0
, hace que los valores de
r
1-
r
2
se desplacen a lo largo de una lnea recta para cada serie de datos obtenida con
cada una de las reacciones. Esto se debe a que las relaciones de reactividad que se
ajustan a cada grupo de puntos experimentales estn altamente relacionadas. En la
Figura 2.12 se representan el conjunto diagramas de composicin obtenidos para las
reacciones llevadas a cabo con el sistema DMAA-AMPS, considerando distintos puntos
experimentales x
t
, y
t
como x
0
, y
0
. Por otro lado, la familia de diagramas de composicin
que cruzan un punto de F/f comn (lo que es una simplificacin de nuestro caso) queda
descrito por una lnea recta en funcin de r
1
y r
2
.

El punto de corte de las lneas representadas en la Figura 2.13 debera estar muy
cerca del valor de las relaciones de reactividad verdadero, independientemente del error
introducido por x
0
,y
0.
Si la tcnica experimental y el desarrollo terico fueran
completamente perfectos, las rectas de los tres experimentos poseeran un nico punto
de interseccin comn y no delimitaran una regin de puntos. Es decir, a mejor diseo
del experimento, menor es la regin r
1
-r
2
ptima.

La gran diferencia entre el Mtodo 2 y aquel descrito por Mayo-Lewis para
polmeros sintetizados a alta conversin es que ellos determinaban r
1
y r
2
mediante
iteraciones, con un slo dato de composicin inicial y final. Sin embargo, mediante el
Mtodo 2, r
1
y r
2
se obtienen de la monitorizacin de las reacciones de
copolimerizacin y multitud de datos de composicin (no menos de 10). El mtodo de
Mayo-Lewis utiliza datos de composicin puntuales y el Mtodo 2 obtiene datos de
composicin instantnea en todo el rango de conversiones monitorizadas.

La ventaja del Mtodo 2 sobre el Mtodo 1 es que no necesita la existencia de
puntos comunes de composicin en las distintas reacciones, lo que se traduce en una
mayor versatilidad a la hora de planear los experimentos. Por ello, este tratamiento se
aplic al sistema DMAA-AMPS con el fin de comparar los resultados obtenidos por
1
H

72
mtodos diferentes y al sistema THEMA-AMPS ya que presentaba pocos puntos
comunes de composicin en los experimentos complicando el desarrollo del Mtodo 1.

SISTEMA DMAA-AMPS

Figura 2.12: Diagramas de composicin correspondientes a los diferentes ajustes llevados a
cabo con los puntos experimentales de las reacciones 1 (a), 2 (b) y 3 (c), siguiendo el protocolo
de trabajo del Mtodo 2.

Fig.2.13: r
AMPS
vs r
DMAA
obtenido por el Mtodo 2.

En la Figura 2.13 se muestra el diagrama r
1
, r
2
correspondiente al sistema
DMAA-AMPS obtenido segn el Mtodo 2. Cada punto que constituye las rectas
corresponde a los valores de las relaciones de reactividad calculados para cada una de
las reacciones. La regin que definen la interseccin de las tres rectas corresponde a los
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
reaccin 1
reaccin 2
reaccin 3
r
(
A
M
P
S
)
r(DMAA)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0

f
(
D
M
A
A
)
,

c
o
p
o
l
m
e
r
o
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0

f
(
D
M
A
A
)
,

c
o
p
o
l
m
e
r
o
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0

f
(
D
M
A
A
)
,

c
o
p
o
l
m
e
r
o
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0

f
(
D
M
A
A
)
,

c
o
p
o
l
m
e
r
o
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0

f
(
D
M
A
A
)
,

c
o
p
o
l
m
e
r
o
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0

f
(
D
M
A
A
)
,

c
o
p
o
l
m
e
r
o
a b c
1
H 73
valores de r
1
, r
2
ptimos (entre los que se encuentra el valor calculado por el Mtodo 1:
r
DMAA
=1,50; r
AMPS
=0,40).

SISTEMA THEMA-AMPS

Las relaciones de reactividad de este sistema se calcularon por el Metodo 2
partiendo de fracciones molares de THEMA de 0,6 y 0,8 obtenindose r
THEMA
=4,54 y
r
AMPS
=0,32, tal y como puede observarse en la Figura 2.14 (el punto de interseccin
corresponde al valor de r
1
y r
2
ptimo).

Figura 2.14: Relaciones de reactividad ptimas para el sistema THEMA-AMPS calculadas
mediante el Mtodo 2.

4 6 8 10 12
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
2,0
2,4
2,8
r
THEMA
=4,54
r
AMPS
=0,32
reaccin2
reaccin1
r
(
A
M
P
S
)
r(THEMA)
1
H

74

4 EVOLUCIN DE LA COPOLIMERIZACIN CON LA
CONVERSIN

A travs de los valores obtenidos de relaciones de reactividad podemos estimar
tericamente la evolucin, con la fraccin inicial en alimentacin y con la conversin,
de diferentes parmetros como las fracciones molares promedio e instantnea en el
copolmero, la distribucin de secuencias monomricas en las cadenas
macromoleculares, la longitud media de dichas secuencias, etc. Para ello, ha de
emplearse alguna de las formas integradas de la ecuacin de copolimerizacin, siendo la
ms comnmente utilizada la aproximacin de Skeist
26
. Sin embargo, nosotros hemos
desarrollado un algoritmo
29
que nos permite usar la solucin exacta de la ecuacin
diferencial de copolimerizacin
7
para predecir la evolucin de los parmetros
anteriormente mencionados con la conversin. De esta forma evitamos el uso de
aproximaciones. El desarrollo detallado de este algoritmo se encuentra al final de esta
memoria (Apndice), en el que se describe el funcionamiento del programa y la
construccin de diagramas tridimensionales.

La finalidad de este apartado es el estudio de la evolucin de diferentes
parmetros caractersticos de las reacciones de copolimerizacin con la conversin, en
base a las relaciones de reactividad calculadas anteriormente (Tabla 2.1), empleando
para ello distintas representaciones grficas.

SISTEMA r
1
r
2

Poli(HEMA-co-AMPS) 6,81 0,12
Poli(THEMA-co-AMPS) 4,54 0,32
Poli(DMAA-co-AMPS) 1,50 0,40

Tabla 2.1: Relaciones de reactividad estimadas por RMN-
1
H in situ de los
sistemas copolimricos objeto de estudio.

1
H 75

Figura 2.15: Diagrama de composicin de los tres sistemas copolimricos
estudiados: (--) poli(HEMA-co-AMPS), (--) poli(THEMA-co-AMPS) y (--)
poli(DMAA-co-AMPS)

El comportamiento de la mayora de los sistemas copolimricos se encuentra
entre una copolimerizacin ideal (r
1
r
2
=1) y una copolimerizacin alternante (r
1
=r
2

=0). A medida que r
1
r
2
disminuye desde la unidad hasta cero, aumenta la tendencia a
la copolimerizacin alternante. Se alcanza una situacin especial cuando uno de los
monmeros posee una relacin de reactividad mucho mayor que el otro. En el caso que
r
1
>>1 y r
2
<<1, ambos tipos de especies en propagacin adicionan preferentemente el
monmero M
1,
existiendo una tendencia a la homopolimerizacin consecutiva de los
dos monmeros. Es decir, M
1
tiende a homopolimerizar hasta que es consumido en gran
parte y entonces M
2
tiende a homopolimerizar a continuacin.

Los tres sistemas estudiados presentan un comportamiento de copolimerizacin
muy diferente, como reflejan las relaciones de reactividad calculadas. stas varan
desde valores prximos a la unidad para ambos monmeros, como en el sistema
DMAA-AMPS (r
DMAA
=1,50, r
AMPS
=0,40), hasta valores muy diferentes, como en el
HEMA-AMPS (r
HEMA
=6,81, r
AMPS
=0,12), mientras que el sistema THEMA-AMPS
toma valores intermedios entre uno y otro (r
THEMA
=4,54, r
AMPS
=0,32). La notable
diferencia en las reacciones de copolimerizacin queda reflejada en los diagramas de
composicin (Figura 2.15) que representan, de acuerdo a las relaciones de reactividad,
las fracciones molares instantneas en el copolmero para una composicin dada en
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0

THEMA-AMPS
HEMA-AMPS
DMAA-AMPS
f

c
o
p
o
l
m
e
r
o
F alimentacin
1
H

76
alimentacin. Por ejemplo, la polimerizacin de una mezcla equimolecular de
monmeros (F
alimentacin
= 0,5), conduce inicialmente a la formacin de cadenas
macromoleculares con un contenido molar en AMPS de 0,12, 0,20 y 0,36 para los
sistemas HEMA-AMPS, THEMA-AMPS y DMAA-AMPS respectivamente. Como
puede verse en la Figura 2.15, se producir una progresiva disminucin en la
composicin en alimentacin del monmero ms reactivo (HEMA, THEMA o DMAA).
Los grficos tridimensionales representados en las Figuras 2.16 1a, 1b y 1c
proporcionan informacin ms clara acerca de la variacin instantnea de las fracciones
molares de HEMA, THEMA o DMAA en las cadenas de copolmero en funcin de la
conversin y la fraccin molar en alimentacin. Estas figuras ilustran el distinto
comportamiento de los sistemas durante la copolimerizacin y en ella se ha
representado la fraccin instantnea en el copolmero del monmero ms reactivo
(HEMA, THEMA o DMAA) en funcin de la fraccin inicial en alimentacin y de la
conversin. Las lneas rojas, en todos los grficos, representan las reacciones de
copolimerizacin utilizadas para la preparacin de los copolmeros a conversin total
(Captulo 1-Tablas 1.1, 1.2 y 1.3).

Debido a que el sistema THEMA-AMPS presenta unas relaciones de reactividad
intermedias y por ello un comportamiento de copolimerizacin intermedio entre los
otros dos sistemas, se compararn los sistemas de comportamiento extremo para
despus comentar las reacciones de copolimerizacin del sistema THEMA-AMPS.

A pesar de ser AMPS el monmero menos reactivo en los tres sistemas
copolimricos, su incorporacin en las cadenas macromoleculares es bastante diferente.
Mientras HEMA se incorpora con gran preferencia frente a AMPS (Figuras 2.16-1a) en
el sistema HEMA-AMPS, DMAA lo hace a una velocidad ligeramente superior en el
sistema DMAA-AMPS (Figuras 2.16-1c). Esto se debe a que la diferencia en las
relaciones de reactividad de los monmeros es mucho mayor en el primer sistema.
HEMA se consume inicialmente a mucha mayor velocidad que AMPS y por tanto, en
los diagramas tridimensionales podemos diferenciar dos regiones bien definidas, con
una transicin aguda entre ellas. La primera regin corresponde a la formacin de
macromolculas ricas en HEMA (a bajas conversiones), mientras que la segunda regin
corresponde a la formacin de macromolculas ricas en unidades de AMPS (a altas
conversiones). Entre una y otra etapa se forman pocas macromolculas de composicin
1
H 77
intermedia. Es decir, una vez que se consume la mayor parte de HEMA, AMPS empieza
a reaccionar formndose cadenas polimricas con largas secuencias de AMPS, que
correspondera al plateau inferior de la Figura 2.16-1a. En cambio, el sistema DMAA-
AMPS copolimeriza de forma ms homognea hasta muy altas conversiones donde se
forman cadenas ricas en AMPS, tal y como se observa en la parte izquierda de la Figura
2.16-1c. Entre uno y otro comportamiento encontramos el sistema THEMA-AMPS el
cual presenta unos diagramas tridimensionales similares a los del HEMA-AMPS
(Figuras 2.16-1b), aunque su transicin entre la regin rica en el monmero ms
reactivo y el menos reactivo es menos aguda. Por lo tanto, se forman ms cadenas de
composicin intermedia, aunque se sigue apreciando cierta tendencia a la
homopolimerizacin consecutiva. Y se diferencian dos etapas durantes la
copolimerizacin, consumindose preferentemente en primer lugar el monmero ms
reactivo, para despus consumirse preferentemente el menos reactivo, formndose
algunas cadenas de composicin intermedia entre una y otra etapa.

En definitiva, tal y como se explic anteriormente la tendencia a la
homopolimerizacin consecutiva aumenta al aumentar la diferencia entre los valores de
las relaciones de reactividad. De esta forma, se obtendrn poblaciones de cadenas
macromoleculares ms heterogneas cuanto ms difieran estos parmetros entre s. Esto
queda claramente reflejado en las Figuras 2.16-2, donde la longitud media de las
secuencias centradas en el monmero ms reactivo se representa en funcin de a
fraccin inicial en alimentacin y la conversin. Las mesetas o plateaus superiores son
artefactos del programa que representan las secuencias superiores a 20 unidades. HEMA
forma largas secuencias en los primeros estados de la reaccin, mientras que las
reacciones con DMAA no llegan a formar estas largas secuencias salvo a fracciones en
alimentacin de DMAA muy elevadas. Por otra parte, se forman largas secuencias de
unidades AMPS en los ltimos estados de la reaccin, una vez consumido el
monmero ms reactivo. El rea de los plateaus superiores (HEMA-AMPS >THEMA-
AMPS >DMAA-AMPS) est relacionado con la existencias de largas secuencias y es
de nuevo indicativo de la diferente heterogeneidad microestructural de las cadenas
macromoleculares.

1
H

78

Figura 2.16: Evolucin de la fraccin molar instantnea en el copolmero (1) y longitud media
de secuencias (2) de HEMA (a), THEMA (b) o DMAA (c) con la fraccin molar en
alimentacin y con la conversin.

1a
2a
2b
2c
1b
1c
1
H 79

En conclusin, se han descrito dos nuevas y sencillas metodologas para analizar
reacciones de copolimerizacin radical siguiendo la disminucin de las concentraciones
de los monmeros. Este protocolo utiliza el anlisis cuantitativo por espectroscopa de
RMN-
1
H in situ de la desaparicin de los picos de los monmeros durante la
copolimerizacin para determinar las relaciones de reactividad y asociarlo a la forma
integrada de la ecuacin de copolimerizacin. Los mtodos se aplicaron para los
sistemas HEMA-AMPS, THEMA-AMPS y DMAA-AMPS. Sus relaciones de
reactividad indican que HEMA-AMPS y THEMA-AMPS en menor medida, presentan
una tendencia a la homopolimerizacin consecutiva y con ello a la formacin de dos o
ms poblaciones de macromolculas claramente diferenciadas. Sin embargo, el sistema
DMAA-AMPS, cuyas relaciones de reactividad se acercan ms a la unidad, da lugar a
una copolimerizacin mucho ms homognea. .

5 BIBLIOGRAFA

1)Van Krevelen D.V. Properties of Polymers. Their stimation and correlation with
chemical structure.; Ed. Elsevier: Amsterdam, 1990.
2)Bamford C.H., Middleton I. P., Al.Lamee K.G. Polymer 1986, 27, 1981.
3)Maruyama Y., Sung-J o Y., Inoue Y., Chj R., Tasaka S., Miyata S. Polymer 1987,
28, 1087.
4)Ross J .F. Macromol Sci Chem 1984, A21, 453.
5)Baumert M., Frey H., Hlderle M., Kressler J ., Sernetz F.G., Mlhaupt R. Macromol
Symp 1997, 121, 53.
6)Nagai K. TRIP 1996, 4, 122.
8)Fukuda T., Kubo K., Ma Y.D. Progress in Polym Sci 1992, 17, 875.
9)Szymanski R. Progress in Polym Sci 1992, 17, 917.
10)Fineman M., Ross S. D. Journal of Polymer Science 1950, 5 (2), 259-265.
11)Kelen T., Tudos F. J Macromol Chem 1975, A9, 1-27.
1
H

80
12)ODriscoll K.F., Reilly P. M. Makromol Chem Macromol Symp 1987, 10/11, 355-
374.
13)Behnken D.W. Journal of Polymer Science: Part A 1964, 2, 645.
14)Van der Meer R., Linssen H. N., German A.L. Journal of Polymer Science: Part A:
Polymer Chemistry 1978, 16, 2915.
15)Patino-Leal H., Reilly P. M., ODriscoll K.F. Journal of Polymer Science, Polymer
Letters 1980, 18, 219.
16)J enkins A.D. Macromol Rapid Commun 1996, 17, 275.
17)J enkins A.D. Journal of Polymer Science: Part A: Polymer Chemistry 1996, 34,
3495.
18)Kruse R.L. Polymer Letters 1967, 5, 437-440.
19)Mao R., Huglin M. B. Polymer 1993, 34, 1709-1715.
20)Ito H., Dalby C., Pomerantz A., Sherwood M.J ., Sata R., Sooriyakumaran R., Guy
K., Breyta G. Macromolecules 2000, 33, 5080-5089.
21)Ito H., Miller D., Sveum N., Sherwood M.J . Journal of Polymer Science: Part A:
Polymer Chemistry 2000, 38, 3521-3542.
22)Kruft M-A.B., Koole L. H. Macromolecules 1996, 29, 5513.
23)Martin S.J ., Mc Brierty V. J ., Dowling J ., Douglas D.C., Macromol Rapid Commun
1999, 20, 95-97.
24)Martin S.J ., Mc Brierty V. J ., Douglass D.C. Macromolecules 2001, 34, 8934-8943.
25)Bag D.S., Maiti S. Indian Journal of Chemistry 1998, 37A, 212-221.
26)Fort R.J ., Polyzoidis T. M. Eur Polym J 1976, 12, 685-689.
27)Skeist I. J Am Chem Soc 1946, 68, 1781.
28)Tong Z., Lin X. Macromolecules 1994, 27, 844-848.
29)Box G.E.P., H. J . S. Statistics for Experiments: An Introduction to Design, Data
Analysis and Model Building; J ohn Wiley & Sons: New York, 1978.
30)Gallardo A., Aguilar M. R., Abraham G., San Romn J . Journal of Chemical
Education 2002, submitted.

CAPTULO 3

ESTUDIO DE REACCIONES DE
COPOLIMERIZACIN RADICAL POR
ELECTROCROMATOGRAFA CINTICA
MICELAR (MECK)

Captulo 3: Estudio de las reacciones de copolimerizacin por MEKC

82
CAPTULO 3: ESTUDIO DE LAS REACCIONES DE
COPOLIMERIZACIN RADICAL POR
ELECTROCROMATOGRAFA CINTICA MICELAR (MEKC)

1 Introduccin............................................................................................................ 83
2 Fundamentos de la electroforesis capilar................................................................ 86
2.1 Equipo de electroforesis capilar ..................................................................... 87
2.2 Electroforesis capilar en zona libre (CZE)..................................................... 88
2.3 Electrocromatografa cintica micelar (MEKC)............................................. 91
3 Materiales y mtodos:............................................................................................. 93
3.1 Reactivos y muestras...................................................................................... 93
3.2 Anlisis por MEKC........................................................................................ 94
3.3 Anlisis conductimtrico................................................................................ 95
4 Resultados y discusin: .......................................................................................... 96
4.1 Cinticas de copolimerizacin analizadas por MEKC................................... 96
4.2 Anlisis conductimtrico.............................................................................. 101
4.3 Influencia del peso molecular y la composicin......................................... 103
5 bibliografa........................................................................................................... 112

Captulo 3: Estudio de las reacciones de copolimerizacin por MEKC 83

1 INTRODUCCIN

Cuando dos o ms monmeros de diferente estructura qumica polimerizan se
forman, por lo general, copolmeros qumicamente heterogneos en vez de
homopolmeros homogneos, considerando no slo el peso molecular y la distribucin
de pesos moleculares, sino tambin la composicin qumica y estructural y la
distribucin de las unidades comonomricas a lo largo de la cadena macromolecular.
Dependiendo de la reactividad de los monmeros, la composicin en alimentacin y la
conversin, se obtienen macromolculas que difieren significativamente en
composicin y en ocasiones, en compatibilidad, llegando a formar en caso extremo
mezclas polimricas. Como ya se coment en el captulo anterior, la reactividad relativa
de radicales y monmeros viene descrita por las relaciones de reactividad del sistema.
nicamente se obtienen copolmeros homogneos (composiciones idnticas tanto en
alimentacin como en el copolmero) en el punto azeotrpico de copolimerizaciones
azeotrpicas o en el caso de copolmeros que sigan estrictamente un comportamiento de
copolimerizacin al azar donde r
1
=r
2
=1. Por lo general, la composicin instantnea
del copolmero difiere de la de la mezcla, causando una disminucin en la concentracin
del monmero ms reactivo. De esta forma se obtienen copolmeros heterogneos, ya
que la mezcla de reaccin vara progresivamente con la conversin. La descripcin de
estos copolmeros ha de hacerse en base a su distribucin de pesos moleculares y
composicin qumica.

La distribucin de composiciones qumicas de copolmeros al azar proporciona
gran informacin acerca de las cadenas polimricas: distribucin de secuencias,
heterogeneidad instantnea y heterogeneidad en funcin de la conversin entre otras.
Esta funcin de distribucin puede obtenerse bien a travs de clculos tericos basados
en algn modelo de copolimerizacin, bien va tcnicas de separacin. Aparte de las
predicciones tericas se ha mostrado muy poco inters en el desarrollo y
perfeccionamiento de las tcnicas de separacin respecto a la composicin qumica. La
distribucin de secuencias en los copolmeros pueden realizarse por estudios de RMN
1
,
pero obtener espectros de alta resolucin y la asignacin inequvoca de bandas puede
resultar muy complicado. Por lo tanto, parece evidente la necesidad de utilizar alguna

84
tcnica de separacin para el estudio de la distribucin de composicin qumica a lo
largo del copolmero y con ello, el estudio de la heterogeneidad en la distribucin de
carga en el caso de cadenas polielectrolticas. Por ejemplo, el anlisis por cromatografa
de lquidos de alta resolucin (HPLC) ha sido descrita en la literatura
2
con este
propsito.

La tcnica cromatogrfica ms empleada en la caracterizacin de polmeros es la
cromatografa de exclusin por tamaos (SEC), la cual nos proporciona informacin
acerca de la masa molecular promedio y su distribucin (Ver Figura 1.8). Sin embargo,
la caracterizacin de polielectrolitos por SEC es muy problemtica ya que este tipo de
polmeros son principalmente solubles en medios acuosos y suelen producir efectos de
exclusin y adsorcin en la fase estacionaria, adems, los efectos de agregacin de los
analitos pueden interferir en la determinacin de la masa molecular. Por otro lado, no
proporciona informacin acerca de la distribucin de composicin qumica, ya que esta
tcnica separa las macromolculas en base a su volumen hidrodinmico, que es funcin
de la composicin qumica y de la longitud de cadena, por lo que es capaz de dar
informacin acerca del peso molecular medio y de la polidispersidad del sistema, pero
no es capaz de separar muestras de similar peso molecular y diferente composicin.

La electroforesis capilar (EC) constituye una nueva herramienta para el anlisis
y caracterizacin de sistemas copolimricos cargados ya que aprovecha la diferencia de
velocidad desarrollada por los distintos analitos polielectrolticos sometidos a la accin
de un campo elctrico en el proceso de separacin. Por lo tanto, la mayor ventaja que
posee esta tcnica es la posibilidad obtener cierto anlisis qumico de los polmeros
como parte del proceso de separacin. Adems, proporciona elevadas eficacias (10
5
-10
6

platos tericos por metro de columna) con mnima difusin (perfil del flujo del tampn
plano) en pequeos intervalos de tiempo (normalmente inferior a 30 minutos). Requiere
muy poca cantidad de muestra (1-10 microlitros) y es capaz de detectar en continuo. En
el caso del anlisis de polmeros, las medidas de movilidad electrofortica pueden
proporcionar informacin del peso molecular, densidad de carga, hidrofobicidad e
interacciones no covalentes.

A pesar de existir un pequeo nmero de publicaciones sobre el anlisis de
copolmeros sintticos por electroforesis capilar, se han utilizado distintas modalidades
para el anlisis de la distribucin de la composicin qumica, entre los que cabe destacar
la isotacoforesis (CITP) con la que Whitlock y colaboradores analizaron tambin el
sistema HEMA-AMPS
3
, el anlisis por electroforesis capilar frontal (FACCE) utilizado
por Staggemeier y colaboradores
4
en el estudio del sistema acrilamida-AMPS la
electroforesis capilar con redes polimricas (CGE) que permiten la separacin de los
polmeros en funcin de su peso molecular
5
. Nuestro grupo de trabajo ha empleado con
anterioridad la electrocromatografa cintica micelar (MEKC) para el estudio del
sistema copolimrico neutro poli(HEMA-co-vinilipirrolidona) obteniendo la
elucidacin de diferentes especies copolimricas con distinta composicin en funcin de
su hidrofobicidad
6
. El grado de interaccin con el SDS del tampn y por tanto, la
movilidad electrofortica de las macromolculas, dependieron del contenido en el
monmero ms hidrfobo, es decir, del contenido en HEMA.

Aunque la MEKC fue diseada para separar compuestos no cargados
7
, puede
utilizarse tambin para la separacin de sustancias con carga incorporando interacciones
de tipo hidrfobo e interacciones inicas entre el analito y las micelas. De esta forma se
consigue mejorar sensiblemente la selectividad, hacindola ideal para la caracterizacin
de copolmeros inicos/no-inicos.

El objetivo de este captulo es el empleo de esta modalidad de EC para el estudio
de las reacciones de copolimerizarin radical de los sistemas polielectrolticos
poli(HEMA-co-AMPS) y poli(DMAA-co-AMPS). Fueron elegidos por tratarse de los
sistemas de comportamiento ms diferente (el sistema poli(THEMA-co-AMPS) posee
un comportamiento intermedio entre uno y otro sistema). Para ello, se llev a cabo un
estudio exhaustivo del proceso de polimerizacin y la estimacin de distribucin de
composicin qumica de los copolmeros. Tambin se determin la influencia del medio
de reaccin en la formacin de especies de bajo peso molecular durante la reaccin de
copolimerizacin.


86

2 FUNDAMENTOS DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR

La electroforesis capilar es una tcnica de separacin basada en la diferente
movilidad de las sustancias bajo la accin de un campo elctrico. Combina el poder de
separacin de la electroforesis convencional con el apoyo instrumental propio de la
cromatografa de lquidos de alta eficacia (HPLC). La separacin de las sustancias se
lleva a cabo en el interior de un tubo capilar, normalmente de slice fundida, cuyas
dimensiones oscilan entre 10-100 cm de longitud y 25-100 m de dimetro interno,
lleno de una solucin tampn. Una fuente de alimentacin de corriente continua
suministra una elevada diferencia de potencial (5-30 kV) y gracias a la conductividad
elctrica del tampn se origina una corriente elctrica entre los extremos del tubo. Cada
sustancia introducida en el capilar se desplaza por su interior a una velocidad que
depende de su carga elctrica global, su estructura, la viscosidad del medio y la
diferencia de potencial aplicado, que son los principales responsables de la separacin.

Existen distintas modalidades de electroforesis capilar, las cuales se diferencian
fundamentalmente en la naturaleza del contenido del tubo capilar. De las siguientes
modalidades se detallarn en profundidad los fundamentos de separacin de la
electroforesis en zona libre, por ser la ms utilizada, y de la electrocromatografa
cintica micelar, por ser la modalidad empleada en este trabajo.

Electroforesis en zona libre: en este caso el capilar contiene nicamente un
medio tamponado. La movilidad del analito depende fundamentalmente de la
relacin carga/masa.
Electrocromatografa cintica micelar (MEKC): se aade al medio tamponado
un tensioactivo en concentracin superior a la concentracin micelar crtica, se
forman micelas y al efecto carga/masa hay que aadir las interacciones soluto-
micela. En este caso existe una semejanza notable con la cromatografa puesto
que la micela podra considerarse como una fase pseudoestacionaria que se
mueve, de tal manera que esta modalidad tiene capacidad para separar tambin
sustancias no cargadas elctricamente.
Electroforesis capilar en gel: El capilar est relleno de un gel o solucin de
polmero hidroflico. En este caso, la propiedad del soluto que determina su
movilidad es el tamao molecular. De este manera pueden separarse polmeros
de similar relacin carga/masa en funcin de su tamao molecular.
Isoelectroenfoque: La separacin se produce en funcin de los puntos
isoelctricos (pI) de los solutos. Al medio se le aade una mezcla de anfolitos
en una gama de pHs que comprendan los pI de la mezcla a separar y se aplica
un campo elctrico. Cada soluto se mueve hasta encontrar la zona de pH igual a
su pI, donde su carga global se anula y deja de moverse.
Electrocromatografa: El capilar tiene un relleno parecido al empleado en
HPLC, pero el desplazamiento del tampn, que acta de fase mvil, se efecta
mediante la aplicacin de una diferencia de potencial entre los extremos del
capilar.
Isotacoforesis: La muestra se inyecta entre un tampn (denominado frontal)
cuya movilidad es superior a la del componente ms rpido de dicha muestra y
otro tampn (denominado terminal) cuya movilidad es inferior a la del
componente ms lento de la muestra. Al aplicar la diferencia de potencial las
sustancias que componen la muestra se separan en zonas entre ambos tampones.

2.1 Equipo de electroforesis capilar

Las partes fundamentales que componen un equipo de electroforesis capilar son
las siguientes (Figura 3.1):

1. Una fuente de alta tensin, que permite establecer diferencias de potencial de
varias decenas de kilovoltios (normalmente de hasta 30 kV con una corriente
elctrica mxima del orden de 200 A) entre los extremos del capilar.
2. Una columna capilar, normalmente de slice fundida. Como en
cromatografa, sta es la parte fundamental del equipo puesto que en su
interior se produce la separacin.
3. Dos recipientes que contienen generalmente el mismo tampn que el capilar,
que permiten establecer la diferencia de potencial entre los extremos del
tubo. Para la inyeccin se sustituye uno de estos recipientes por otro que

88
contenga la muestra a analizar y se aplica presin, vaco o una pequea
diferencia de potencial, con lo que se introduce en el capilar una banda de
muestra (casi siempre de anchura inferior a 10 mm)
4. Dos electrodos con los que se establece el contacto elctrico entre el capilar
y los recipientes llenos de tampn de separacin, y la fuente de tensin.
5. Un detector, de funcin idntica a los utilizados para cromatografa. La
deteccin suele hacerse en columna, es decir, en un punto del mismo capilar
de separacin.

Fig. 3.1: Esquema bsico del equipo empleado en electroforesis capilar en zona libre.

2.2 Electroforesis capilar en zona libre (CZE)

La primera modalidad de electroforesis capilar fue desarrollada por J orgenson y
Lukacs y sigue siendo la ms utilizada. En el interior del capilar slo se encuentra el
tampn donde se llevar a cabo el anlisis. Los componentes de la muestra, una vez
inyectada sern separados en funcin de su relacin carga/masa. Entre sus ventajas cabe
destacar la posibilidad de separar simultneamente sustancias con carga positiva y
negativa, siempre que el flujo electroosmtico sea lo bastante elevado como para
arrastrar ambos tipos de iones.

Las sustancias, una vez inyectadas en el capilar, se ven sometidas a la fuerza
originada por el campo elctrico aplicado, F
e

L
V
q F
e
=
siendo q la carga de la sustancia, V la diferencia de potencial aplicada y L la longitud del
capilar. F
e
es proporcional al campo elctrico aplicado (E = V/L) y la carga propia de la
sustancia, que depende principalmente del pH del tampn de separacin. A esta fuerza
se opone otra de origen viscoso debida al rozamiento, F
r
, cuyo valor, suponiendo que
las sustancias se comporten como partculas esfricas, viene dado por la ecuacin de
Stokes

e p r
r F 6 =
donde r
p
es el radio de la partcula, es la viscosidad del medio y
e
es la velocidad con
que dicha partcula se desplaza. El movimiento rectilneo uniforme de las partculas se
debe a que, tras un primer momento, las fuerzas F
e
y F
r
se igualan. La velocidad de
migracin vendr dada por
E
r
q
p
e
6
=
La expresin q/6r
p
es lo que se denomina movilidad electrofortica,
e
, que
depende de parmetros especficos de cada partcula y del tampn de separacin
(directamente a travs de la viscosidad o mediante su influencia sobre q y r
p
). La
importancia de este parmetro se debe a que es el que gobierna la selectividad del
sistema de separacin a travs de la relacin q/r
p
, que debe ser diferente para las
sustancias que se desean separar.

El otro desplazamiento al que estn sometidas las molculas de soluto, la
movilidad electroosmtica,
eo
, est asociado al movimiento global del tampn de
separacin en el interior del capilar, que es el resultado de la interaccin entre los
grupos con carga negativa del capilar y los contraiones del tampn que, bajo la accin
del campo elctrico, se desplazan hacia el polo negativo, arrastrando el agua de
solvatacin asociada. La observacin macroscpica es un movimiento global del

90
tampn en el interior del capilar. El valor de
eo
puede calcularse mediante la siguiente
expresin
) (x
eo

=
donde es la constante dielctrica del medio y (x) es la diferencia de potencial
elctrico generada entre la pared del capilar y el tampn a la distancia x de la pared.
Este parmetro es el que controla el valor del flujo electroosmtico.

El tiempo de migracin, t
m
, que una sustancia requiere para recorrer una
distancia l desde la entrada del capilar al punto de deteccin puede determinarse
mediante:

E
l
t
e eo
m
) (
=

Por lo tanto, cuanto mayor sea el campo elctrico aplicado menor ser el tiempo
de migracin de las sustancias, es decir, ms rpido ser el anlisis. Las sustancias que
se separan en la misma direccin que el flujo electroosmtico (cationes) tendrn
tiempos de migracin menores, mientras que los que lo hacen en contra (aniones)
permanecern ms tiempo dentro del capilar si el valor de la movilidad electroosmtica
es mayor que el de la electrofortica. Las sustancias cuya movilidad electrofortica sea
mayor y de sentido contrario a la movilidad electroosmtica permanecern en el capilar
un tiempo infinito. Las sustancias sin carga se desplazan solidariamente con el flujo
electroosmtico.

Las principales limitaciones de la tcnica son:

1. Baja reproducibilidad y baja sensibilidad a la concentracin.
2. Tendencia a la adsorcin de los analitos sobre la pared del capilar.
3. Falta de selectividad para sustancias con distinto peso molecular pero
igual relacin carga/masa.
4. No permite la separacin entre sustancias neutras.

2.3 Electrocromatografa cintica micelar (MEKC)

La electrocromatografa cintica micelar es una modalidad de electroforesis
capilar que fue diseada en un principio para la separacin de sustancias neutras
8
,
aunque tambin puede ser utilizada para analizar sustancias cargadas. En este apartado
se explicar el comportamiento de las sustancias neutras en contacto con las micelas por
ser el ms sencillo. A todas las interacciones descritas a continuacin habr que
aadirles las interacciones de tipo inico entre el analito y las micelas, las cuales
mejoran sensiblemente la selectividad.

La MEKC (Figura 3.2) incorpora un detergente en el tampn de separacin en
una concentracin superior a su concentracin micelar crtica. Las micelas formadas
actan como una pseudofase estacionaria que se desplaza a lo largo del capilar. Los
analitos sin carga interaccionan con la micela por hidrofobicidad y sus movilidades
electroforticas se modifican de acuerdo con sus solubilidades en la micela. Cada
sustancia interacciona con la micela en funcin de su coeficiente de reparto especfico,
obtenindose de esta manera una movilidad especfica que permite su separacin.

Fig. 3.2: Esquema bsico de los fenmenos que tienen lugar en el interior de un capilar de
electrocromatografa micelar. (S) soluto, (
m
) movilidad de la micela, (
neto
) movilidad global,
(
FEO
) movilidad del flujo electroosmtico.


92

El comportamiento de tres sustancias neutras que interaccionan de forma
diferente con las micelas sera:

1. Un compuesto N que no interacciona con las micelas y cuyo tiempo de
migracin correspondera al del flujo electroosmtico (t
N
= t
0
).
2. Un compuesto T que interacciona irreversiblemente con la micela y que tendr el
mismo tiempo de migracin que ella, (t
T
= t
mc
)
3. Un compuesto S (Figura 3.2) que interacciona parcialmente con la micela, cuyo
tiempo de migracin depender del coeficiente de reparto del compuesto entre el
tampn y la micela, en cuyo caso t
0
< t
S
< t
mc.
A la diferencia de los tiempos t
mc
-
t
0
se le denomina ventana de separacin y es el intervalo de tiempo en el que
todas las sustancias neutras pueden aparecer en el electroforegrama.

Esta tcnica puede realizarse con micelas de distinto tipo, bien sean aninicas,
catinicas, zwiterinicas o neutras. Tambin puede actuarse sobre la selectividad a
travs de la influencia de otros parmetros tales como aditivos orgnicos, temperatura
de separacin, etc.

Las sustancias a separar se reparten entre la micela y el tampn de la misma
manera que en cromatografa entre la fase estacionaria y la fase mvil. El factor de
retencin (coeficiente de reparto) de una sustancia en MEKC queda definido como:

t
mc
MECK
n
n
k =

donde n
mc
es el nmero de molculas de soluto en la fase micelar y n
t
es el nmero de
molculas de soluto en el tampn.

Por ltimo, sealar que los mayores inconvenientes de esta tcnica son la mayor
complejidad del tampn de separacin y la existencia de una ventana de separacin, en
cuyo intervalo (t
m
-t
0
) deben ser separadas todas las sustancias neutras.

3.1 Reactivos y muestras

Reactivos y polmeros

Todos los reactivos y polmeros utilizados para la realizacin de este captulo
fueron detallados en el Captulo 1. Las tablas 3.1 y 3.2 detallan la nomenclatura de los
materiales y la fraccin molar de uno de sus componentes, antes y despus de ser
sometidos a dilisis en agua destilada durante 48 horas, para eliminar la presencia de
especies de bajo peso molecular y monmero residual que no haya sido eliminado por
precipitacin. Para ello se utilizaron membranas de celulosa regenerada de corte por
peso molecular de 3500 Daltons (Slide-A-Lyzer Dilisis Cassette, PIERCE). Las
composiciones de los copolmeros de determinaron por RMN-
1
H.

PHEMA HA90 HA70 HA50 HA30 HA10 PAMPS
f
HEMA alimentacin
1 0,90 0,70 0,50 0,30 0,10 0
F
HEMA copolmero
1 0,89 0,67 0,47 0,27 0,10 0
F
HEMA cop_dial
1 0,92 0,80 0,67 0,51 0,23 0

Tabla 3.1: Composiciones molares de HEMA en los copolmeros poli(HEMA-
co-AMPS) tanto en alimentacin (f
HEMA alimentacin
), como en el copolmero antes
y despus de ser dializados (F
HEMAcopolmero
y F
HEMAcop-dial
respectivamente).
Halladas mediante RMN-
1
H a 300 MHz.

PDMAA DA90 DA70 DA50 DA30 DA10 PAMPS
f
DMAA alimentacin
1 0,90 0,70 0,50 0,30 0,10 0
F
DMAA copolmero
1 0,89 0,73 0,52 0,31 0,09 0
F
DMAA cop_dial
1 0,89 0,75 0,57 0,39 0,16 0

Tabla 3.2: Composiciones molares de DMAA tanto en alimentacin (f
DMAA
alimentacin
) como en el copolmero en los copolmeros del sistema DMAA-
AMPS sintetizados, antes y despus de ser dializados (F
DMAAcopolmero
y
F
DMAAcop-dial
respectivamente), halladas mediante RMN-
1
H a 300 MHz.


94
Cinticas de polimerizacin

Se llevaron a cabo distintas cinticas de polimerizacin en las mismas
condiciones que las descritas en el Captulo 1. De cada uno de los reactores se
extrajeron muestras del medio de reaccin (0,5 mL) con una jeringuilla, para evitar la
oxigenacin del medio, a diferentes tiempos. La reaccin se par instantneamente con
una solucin de hidroquinona (20 L; 0,375 M) e introduciendo los viales en un bao
de hielo. Las muestras se almacenaron en un congelador a 20C hasta su anlisis por
electroforesis capilar. Las muestras se diluyeron 1:10 antes de ser inyectadas en la
columna capilar.

3.2 Anlisis por MEKC

Todas las muestras fueron analizadas por electrocromatografa cintica micelar
(MEKC) en un equipo Beckman System 5500 (P/ACE) con detector UV ( =200 nm),
con inyector automtico, una columna capilar de slice fundida (Composite Metal
Services) de 37 cm de longitud y un dimetro interno de 50 m. La ventana de
deteccin se fij a 30 cm del punto de inyeccin. La temperatura externa del capilar se
mantuvo a 25 C, la inyeccin se llev a cabo en el nodo por presin de nitrgeno
durante 5 segundos (0,5 psi) y la separacin mediante un voltaje (V) de 10 kV. Los
datos se recogieron y analizaron con la ayuda de un software System Gold
proporcionado por Beckman. Las medidas de composicin se realizaron en un aparato
Beckman System 5000 (P/ACE) equipado con un detector UV de fila de diodos. Se
emple la relacin de absorbancias 200/220 nm para cuantificar la composicin del
copolmero. El capilar se lav despus de cada inyeccin con agua (1 minuto) y el
tampn correspondiente (1 minuto).

Tampones

Todas las soluciones tampn se prepararon con agua ultrapura, purificada con
un sistema Milli-Q (Millipore Corporation). Se utilizaron adems tetraborato sdico,
cido brico, dodecilsulfato sdico (SDS) y acetonitrilo, todos ellos de Sigma, en la
preparacin de los tampones.

La separacin de especies en el sistema poli(HEMA-co-AMPS) se consigui en
tampn 100mM cido brico / tetraborato sdico a pH 9, con 80 mM SDS. El sistema
poli(DMAA-co-AMPS) se analiz en tampn 100mM cido brico / tetraborato sdico
a pH 9, con 100 mM SDS, al que se le aadi 5 % (v/v) acetonitrilo como modificador
orgnico.

Microcones

Una solucin dializada de HA50 fue centrifugada a travs de un microcone de
celulosa regenerada de corte por peso molecular de 10000 Da (Microcone YM10,
Millipore Corporation). Tanto la fraccin filtrada como la retenida por la membrana se
recogieron y procesaron en las mismas condiciones que las mencionadas anteriormente.

3.3 Anlisis conductimtrico

Se realizaron medidas de intensidad de corriente elctrica de las muestras
extraidas durante la cintica de reaccin HEMA-AMPS (50:50). El capilar se
acondicion con un lavado exhaustivo con agua antes de cada medida. Seguidamente se
rellen con la muestra a analizar y se aplic una diferencia de potencial de 10 kV entre
dos viales que contenan la misma muestra. Pasado un tiempo de espera de 3 minutos
para asegurar la estabilidad de la medida, se registr el valor de intensidad de corriente
elctrica.


96
4 RESULTADOS Y DISCUSIN:

Se llev a cabo el anlisis de los sistemas copolimricos, poli(DMAA-co-
AMPS) y poli(HEMA-co-AMPS), por MEKC. Sus estructuras qumicas se encuentran
detalladas en la Figura 3.3.

poli(HEMA-co-AMPS) poli(DMAA-co-AMPS)

Fig. 3.3: Estructura qumica de los sistemas copolimricos.

Como ya ha sido comentado, existen notables diferencias en la hidrofilia de los
tres monmeros que constituyen los sistemas: DMAA es ms polar que HEMA (a pesar
de que los dos monmeros son hidrosolubles, los correspondientes homopolmeros
presentan un comportamiento diferente: el poli-DMAA es soluble en agua mientras que
el poli-HEMA no lo es). Por otro lado, el AMPS es un cido fuerte que se encuentra
ionizado en todo el rango de pH del estudio. Adems de estas diferencias de polaridad,
los dos sistemas presentan un comportamiento en copolimerizacin muy diferente,
como ya se coment en el Captulo 2 en base a las relaciones de reactividad calculadas.

4.1 Cinticas de copolimerizacin analizadas por MEKC

Se llevaron a cabo varios experimentos para estudiar la evolucin de dos
reacciones de copolimerizacin utilizadas como referencia, con una fraccin molar en
alimentacin inicial de 0,5. Se extrajeron alcuotas a tiempos de reaccin adecuados y se
analizaron por MEKC. Los dos mtodos de separacin por MEKC utilizados en este
trabajo se desarrollaron en nuestro laboratorio probando distintos voltajes de separacin
y medios tamponados hasta la correcta optimizacin de las condiciones experimentales.
O
N
O
HN
SO
3
H
n
m m n
O
O
OH
O
HN
SO
3
H

Fig. 3.4: Diagramas tridimensionales de la variacin relativa de la fraccin molar instantnea de
HEMA o DMAA en el copolmero en funcin de la fraccin molar inicial en alimentacin y el
grado de conversin. La lnea continua representa el curso de una reaccin equimolecular de
monmeros para cada uno de los sistemas. Las lneas a trazos corresponden a los tiempos de
reaccin de los electroforegramas representados en las Figuras 3.6 y 3.7 (conversin 0,18_170
minutos; conversin 0,74_ 10 horas; conversin 0,84_13 horas y conversin 0,98_24 horas para
el sistema HEMA-AMPS; conversin 0_10 minutos; conversin 0,10_30 minutos; conversin
0,50_50 minutos y conversin 0,94_ 240 minutos para el sistema DMAA-AMPS).

Con el fin de hacer ms sencilla la interpretacin de los datos obtenidos, la
Figura 3.4 se muestra la variacin de las fracciones molares instantneas en el
copolmero en funcin de la fraccin molar en alimentacin y la conversin para los dos
sistemas objeto de estudio. En estos grfico tridimensionales, se destaca en rojo la
evolucin de una reaccin equimolecular de monmeros para cada uno de los sistemas.
Las lneas de trazos azules muestran las conversiones de algunas de las muestras
analizadas durante el estudio, que coinciden con los electroforegramas representados en
las figuras 3.5 y 3.6.


Fig. 3.5: Electroforegramas de muestras de la reaccin de copolimerizacin DA50 a distintos
tiempos de reaccin. (1) monmero DMAA, (2) monmero AMPS, (*) hidroquinona, (3) regin
del copolmero, ampliada en la parte derecha de la Figura.

El anlisis por MEKC nos permite monitorizar el consumo de
monmeros en la copolimerizacin y por tanto, la conversin. El pico 1 corresponde al
monmero DMAA en la Figura 3.5 y al monmero HEMA en la Figura 3.6, y el pico 2
corresponde al AMPS en ambas. El pico designado con un asterisco corresponde a la
hidroquinona, la cual se emple simultneamente como inhibidor de radicales y como
patrn interno.

5.0 10.0 15.0 20.0
Tiempo (min)
1
2
3 1
2
3
U
A
*
10.0 15.0 20.0
Tiempo (min)
10 min
30 min
50 min
240 min
5.0 10.0 15.0 20.0
Tiempo (min)
1
2
3 1
2
3
U
A
*
10.0 15.0 20.0
Tiempo (min)
10 min
30 min
50 min
240 min

Fig. 3.6: Electroforegramas MEKC de muestras de la reaccin de copolimerizacin HA50 a
distintos tiempos de reaccin. (1) monmero HEMA, (2) monmero AMPS, (*) hidroquinona,
(3) regin del copolmero ampliada en la zona inferior de la Figura.

5.0 10.0 15.0
Tiempo (min)
1
2
A
U
13 horas
24 horas
10 horas
170 min
3
2
1
5.0 10.0 15.0
Time (min)
*
Copolmero
rico en HEMA
Copolmero
rico en AMPS
Tiempo (min)
5.0 10.0 15.0
Tiempo (min)
1
2
A
U
13 horas
24 horas
10 horas
170 min
3
2
1
5.0 10.0 15.0
Time (min)
*
Copolmero
rico en HEMA
Copolmero
rico en AMPS
Tiempo (min)

La variacin del rea de los picos 1 y 2 frente al tiempo queda resumida en las
Figuras 3.7 y 3.8, de las que pueden extraerse estimaciones cinticas bsicas: el sistema
HEMA-AMPS alcanza altas conversiones despus de transcurridas aproximadamente
29 horas mientras que el sistema copolimrico DMAA-AMPS lo hace despus 6 horas
de reaccin (Figura 3.8). En cualquier caso, la informacin obtenida en las Figuras 3.7 y
3.8 ser de gran utilidad a la hora de discutir el mecanismo de polimerzacin.

En el caso de la copolimerizacin del sistema HEMA-AMPS (Figura 3.6), las
cadenas macromoleculares formadas en los primeros estados de la reaccin, de menor
tiempo de anlisis, es decir, de menor carga aninica, estn formadas principalmente
por HEMA y corresponden en la Figura 3.4-izquierda al plateau superior del grfico.
Los picos que se forman despus del consumo de casi todo el HEMA (plateau inferior
del grfico), de mayor tiempo de migracin (mayor carga aninica) estn
principalmente constituidos por unidades AMPS. Estos datos estn de acuerdo con el
consumo de monmeros presentado en la Figura 3.7, donde el monmero HEMA se
consume casi en su totalidad aproximadamente a las 10 horas y media de reaccin (75
% de conversin), coincidiendo con la tapa de inflexin entre el plateau superior e
inferior de la Figura 3.4-izquierda. La formacin de varios picos a altas conversiones se
discutir posteriormente.

Fig. 3.7: Consumo de monmeros en funcin del tiempo de reaccin para el
sistema HEMA-AMPS

0
20
40
60
80
100
0 4 8 12 16 20 24
Tiempo (horas)
%
%HEMA
%AMPS

Fig. 3.8: Consumo de monmeros en funcin del tiempo de reaccin para el
sistema DMAA-AMPS

Por otra parte, las superficies tridimensionales de la Figura 3.4 predicen una
copolimerizacin relativamente homognea para la reaccin DMAA-AMPS y la
formacin de dos especies en el caso de HEMA-AMPS (especies ricas en HEMA y en
AMPS respectivamente). Los electroforegramas de la reaccin DMAA-AMPS
presentan un nico pico ancho durante casi todo el transcurso de la reaccin (Figura 3.5)
y la aparicin, en un caso, de un pico pequeo a mayores tiempos de anlisis
(probablemente debida a especies con una alta carga negativa) en los ltimos estados
de la reaccin que correspondera a la formacin de especies copolimricas ricas en
AMPS, coincidiendo con los datos de consumo de monmeros de la Figura 3.8.

4.2 Anlisis conductimtrico

En un trabajo anterior, Cifuentes y col. demostraron la utilidad de la electroforesis
capilar para determinar la concentracin micelar crtica de detergentes inicos mediante
el estudio de la variacin de la conductividad con la concentracin del detergente
9
.
Este tipo de experimento permite la obtencin de informacin utilizando un
volumen de muestra mnimo y de una forma limpia y rpida. Continuando con esta idea,
medimos la conductividad del medio de reaccin durante el proceso de polimerizacin
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5 6 7
Tiempo (horas)
%
%DMAA
%AMPS
para el sistema ms heterogneo (HEMA-AMPS), lo que debera proporcionar
informacin acerca del mecanismo de polimerizacin de este sistema polielectroltico.
Los resultados experimentales se representan en la Figura 3.9.

Fig. 3.9: Corriente elctrica en funcin del tiempo de reaccin para el
sistema copolimrico HEMA-AMPS.

La disminucin inicial de la intensidad de corriente est relacionada con la
formacin de copolmeros ricos en HEMA que incorporan pocas unidades de AMPS
(Etapa I). Esta variacin en la conductividad se debe a que el AMPS presenta un valor
de la conductividad elctrica, (), diferente en su forma monomrica que cuando est
unido a un copolmero rico en HEMA. En la Etapa II, la intensidad de corriente se
mantiene prcticamente constante debido a que bsicamente se forman especies muy
ricas en AMPS. El punto de inflexin (paso de Etapa I a Etapa II) coincide con el
consumo de la mayor parte de HEMA en la Figura 3.7. Por lo tanto, estos experimentos
nos proporcionan una valiosa corroboracin acerca del mecanismo de polimerizacin
heterognea que se predijo tericamente en la Figura 3.4-izquierda.

Etapa I
Etapa II
115
125
135
145
155
165
4 8 12 16 20 24 28 32
Tiempo (horas)
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d

c
o
r
r
i
e
n
t
e

(
u
A
)

4.3 Influencia del peso molecular y la composicin

El peso molecular juega un papel importante en la separacin de especies inicas
por MEKC, ya que los molculas son separadas segn su relacin carga/masa y su
hidrofobicidad. En el caso de polmeros que poseen alta densidad de carga,
uniformemente repartida, como en el caso de molculas de ADN o del
poliestirensulfonato, la separacin electrofortica de las cadenas de bajo peso molecular
puede llevarse a cabo por CZE, nicamente cuando el tamao molecular no excede de
unos cuantos miles de Daltons[Stellwagen, 1997 #312]
10
. Para tamaos moleculares
superiores, la relacin carga/masa se hace constante siendo imposible la separacin. En
el caso de especies no cargadas y MEKC, la longitud de cadena tambin juega un papel
importante en la separacin ya que la hidrofobicidad (y como consecuencia la movilidad
electrofortica de los analitos) cambia con el peso molecular.

Para determinar la influencia de la regin de bajo peso molecular de estos
compuestos, las muestras fueron dializadas utilizando una membrana de corte por peso
molecular de 3500 Daltons. Los experimentos de RMN-
1
H, antes y despus de la
dilisis (Tablas 3.1 y 3.2), demuestran la presencia de fracciones de bajo peso molecular
en ambos casos. La Tablas 3.1 y 3.2 muestran el enriquecimiento de los copolmeros en
HEMA o DMAA despus de la dilisis, lo cual est de acuerdo con la prdida de
cadenas ricas en AMPS durante el proceso. Este fenmeno es ms acusado para el
sistema HEMA-AMPS, el cual presenta una prdida de AMPS en todo el rango de
composiciones mientras que el DMAA-AMPS presenta una prdida significativa de
AMPS para composiciones altas en este monmero.

Con el fin de ayudar a la elucidacin de la regin rica en AMPS en el caso del
copolmeros HEMA-AMPS, una muestra de HA50 se dializ y centrfugo a travs de un
microcone de corte por peso molecular de 10000 Da.


Fig. 3.10: Electroforegramas MEKC del copolmero HA50 no purificado (A), dializado
a travs de una membrana de corte por peso molecular de 3500 Da (B) y de esta ltima
muestra centrifugada con centricones de corte por peso molcular de 10000 Da (filtrado
(C) y retenido (D))

La Figura 3.10, muestra los electroforegramas del copolmero HA50 a alta
conversin no tratado y las tres fracciones obtenidas por el tratamiento anterior (<3500,
>3500<10000 y >10000). Como puede observarse, el HA50 original (Figura 3.10A) da
lugar al electroforegrama Figura 3.10B despus de ser dializado, donde los picos
correspondientes a los monmeros y oligmeros cortos (t
m
<8 minutos) son eliminados.
Esta muestra dializada se centrifuga a travs de un microcone de 10000 Da de corte por
peso molecular. El filtrado, de peso molecular entre 10000 y 3500, da lugar al
electroforegrama Figura 3.10C, donde aparece la fraccin rica en AMPS (mayores
tiempos de migracin). En la fraccin retenida, con peso molecular mayor a 10000 Da
(Figura 3.10D), aparecen los copolmeros ricos en HEMA. Por lo tanto, aunque la
dilisis (3500 cut-off) del copolmero no vara demasiado el aspecto del
electroforegrama, la centrifugacin a travs del microcone (10000 cut-off) da lugar a
dos fracciones muy diferentes. Adems, la aparicin de especies de bajo peso molecular
5.0 10.0 15.0
Tiempo (min)
1
3
5
U
A
HA50
>3500
>10000
>3500
<10000
A
B
C
D
5.0 10.0 15.0
Tiempo (min)
1
3
5
U
A
HA50
>3500
>10000
>3500
<10000
A
B
C
D
parece estar relacionado con altos contenidos en AMPS, mientras que los mayores
tamaos moleculares lo estn con el contenido en HEMA.

La formacin de macromolculas de cadena corta en composiciones ricas en
AMPS se debe a la utilizacin de isopropanol como co-solvente en la reaccin de
copolimerizacin radical. Este co-solvente fue elegido por un lado por su baja toxicidad,
ya que ha sido clasificado por la FDA como clase 3 (menor toxicidad)
11
y es
comnmente utilizado en preparaciones farmacuticas y en formulaciones de algunos
productos del hogar
12,13
. Por otro lado, se ha escogido este disolvente por el inters
biomdico de los copolmeros, los cuales se pretenden eliminar a travs del rin una
vez ejercida su funcin, Para ello, sera necesario conseguir un peso molecular inferior
al lmite glomerular, el cual se encuentra alrededor de 30000-40000 Da
14
. Una de las
formas ms comunes de obtener polmeros sintticos con pesos moleculares
relativamente bajos, es la utilizacin de disolventes con una alta constante de
transferencia, como el isopropanol
15
. El AMPS, adems, presenta baja reactividad en
copolimerizacin radical no slo por su naturaleza acrilamida, sino tambin por poseer
un grupo lateral ionizado que le hace poco reactivo en medios de reaccin polares
debido a la repulsin electrosttica. Por otro lado, la transferencia al isopropanol debe
aumentar al aumentar el nmero de radicales terminados en AMPS, (as como con la
conversin, ya que se incrementaran las restricciones de difusin de dichas especies
cargadas en medios polares). El aumento de la relacin de transferencia debido a altas
concentraciones de radicales terminados en AMPS, se produce en los ltimos estados
de la reaccin o cuando la fraccin molar inicial de AMPS es alta para el sistema
DMAA-AMPS.

Para determinar la influencia del medio de reaccin, se llev a cabo una
copolimerizacin radical adicional del sistema HEMA-AMPS utilizando metanol, en
vez de isopropanol, como co-solvente. La transferencia al metanol es mucho menor
15

debido a que se trata de un alcohol de cadena corta incapaz de estabilizar radicales
libres como lo hace el isopropanol. En la Figura 3.11 se encuentran representados los
respectivos electroforegramas. La reaccin que se llev a cabo en agua:metanol (50:50)
no presenta la distribucin de picos agudos a altos tiempos de anlisis, y todo el
copolmero rico en AMPS se desplaza a altos tiempos de migracin lo que est de
acuerdo con un mayor peso molecular. La membrana de dilisis y el tratamiento con
microcones no extrajeron fracciones de bajo peso molecular. Este experimento
corrobora que la distribucin de picos que surgen a lo largo del electroforegrama son
fracciones de bajo peso molecular.

Fig. 3.11: Electroforegramas MEKC del copolmero HA50 sintetizado en metanol/agua
(1:1) e isopropanol/agua (1:1).

Se realizaron una serie de anlisis por MEKC de muestras a alta conversin con
el fin de estudiar el efecto de la composicin. Las muestras sintetizadas en todo el rango
de composiciones en alimentacin se dializaron (corte por peso molecular de 3500) con
el fin de eliminar todo el monmero residual as como los oligmeros formados. Las
Figuras 3.12 y 3.13 representan los electroforegramas correspondientes a los sistemas
DMAA-AMPS y HEMA-AMPS respectivamente.
10.0 15.0
Tiempo (min)
1
2
U
A
HA50 (MeOH:H
2
O)
HA50 (IsOH:H
2
O)
10.0 15.0
Tiempo (min)
1
2
U
A
HA50 (MeOH:H
2
O)
HA50 (IsOH:H
2
O)

Fig. 3.12: Electroforegramas MEKC de muestras copolimricas DMAA-
AMPS sintetizadas a alta conversin.

Las diferencias en los procesos de polimerizacin comentadas anteriormente
quedan ratificadas en las Figuras 3.12 y 3.13. La copolimerizacin DMAA-AMPS
(Figura 3.12) conduce a una distribucin de secuencias homognea (tal y como se
describi en la Figura 3.4-derecha), presentando un solo pico que se desplaza a tiempos
de anlisis que dependen de la composicin media (los homopolmeros PAMPS y
PDMAA fueron utilizados como referencia). Al aumentar el contenido en AMPS,
aumenta la carga negativa de las especies macromoleculares y aumenta el tiempo de
anlisis (y con un solo pico electroforticamente diferente, excepto para DA50, que
presenta un pequeo pico a mayores tiempos y que ha sido comentado anteriormente).
Este grfico demuestra la utilidad de MEKC para diferenciar entre copolmeros
relativamente homogneos de composicin diferente.

5.0 10.0 15.0 20.0 25.0
Tiempo (min)
1
2
3
4
U
A
PDMAA
DA90
DA70
DA50
DA30
DA10
PAMPS
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0
Tiempo (min)
1
2
3
4
U
A
PDMAA
DA90
DA70
DA50
DA30
DA10
PAMPS

Sin embargo, la influencia de la composicin en el tiempo de anlisis (al
aumentar la fraccin molar en el comonmero inico, aumenta el tiempo de migracin)
est limitada por la Ley de Manning o ley de condensacin de contraiones
16,17
. Esta
ley predice un valor de densidad de carga lmite, por encima del cual el aumento en el
nmero de cargas inicas no influye sobre la movilidad de la macromolcula, es decir,
se observar una movilidad constante en todas ellas. Este hecho se observa en la Figura
3.12 para el sistema DMAA-AMPS, donde los copolmeros ms inicos (DA30 y
DA10) migran a tiempos parecidos al del homopolmero poli-AMPS.

Fig. 3.13: Electroforegramas MEKC de muestras copolimricas HEMA-AMPS
sintetizadas a alta conversin. (H) copolmero rico en HEMA, (A) copolmero
rico en AMPS.

5.0 10.0 15.0
Tiempo (min)
1
3
5
U
A
PAMPS
HA10
HA30
HA70
HA90
HA50
H
70
68
58 54 52
49
H
70
H
67 66
63
70
55
44
56
50
50
40
A
H
5.0 10.0 15.0
Tiempo (min)
1
3
5
U
A
PAMPS
HA10
HA30
HA70
HA90
HA50
H
70
68
58 54 52
49
H
70
H
67 66
63
70
55
44
56
50
50
40
A
H
El sistema HEMA-AMPS, en cambio, presenta electroforegramas con un perfil
de picos ms complejos (Figura 3.13) y que tambin vara con la composicin. Un
primer anlisis nos dice que al incrementarse el contenido en AMPS, aumenta el rea de
las fracciones ricas en AMPS (a mayores tiempos de anlisis). Por otra parte, parece que
se produce un aumento en la concentracin de ciertas especies y la disminucin de otras
(y no nicamente el desplazamiento de un pico como sucede en el caso del DMAA-
AMPS). Esto puede interpretarse como un cambio en el balance de concentracin de las
distintas especies y no slo en su composicin media. En definitiva, en este caso,
MEKC es capaz de separar especies electroforticamente diferentes formadas durante la
reaccin y monitorizar su dependencia con la composicin inicial en alimentacin.

Fig. 3.14: Curva de calibrado utilizando el cociente 200 nm/220 nm tal y
como se describe en Materiales y Mtodos.

Llegado este punto ha de hacerse hincapi en los coeficientes de extincin molar
() de los distintos componentes: AMPS posee un aproximadamente dos veces
superior al del HEMA o al de la DMAA a la longitud de onda seleccionada. Esta es la
razn de la mayor seal detectada para AMPS a la longitud de onda empleada,
obtenindose reas mucho mayores para copolmeros ricos en AMPS que para
copolmeros ricos en cualquiera de los otros dos monmeros. Aprovechando la
diferencia existente entre los espectros UV del poli-AMPS y del poli-HEMA, ha sido
posible estimar la composicin de cada pico de la Figura 3.13 (los nmeros insertados
en la Figura corresponden a datos estimados de composicin de HEMA). Para ello, se
utilizaron medidas de absorbancia a 200 y 220 nm para construir la curva de calibrado
representada en la Figura 3.14. Se emplearon para ello homopolmeros y copolmeros
0
2
4
6
8
10
12
14
0 20 40 60 80 100
f HEMAcopol

2
0
0
/
2
2
0
sintetizados a alta conversin. De este modo se han obtenido datos de composicin
qumica aproximada utilizando un detector UV de filas de diodos con el que se
registraron valores de absorbancia a 200 y 220 nm simultneamente. Debe tenerse en
cuenta que los datos de composicin estimados son aproximados ya que la curva de
calibrado se aleja de la linealidad en composiciones cercanas a los homopolmeros, por
lo que slo puede utilizarse para composiciones intermedias (los picos designados como
H o A en la Figura 3.13, corresponden a copolmeros ricos en HEMA o AMPS
respectivamente, cuyas composiciones no pudieron ser determinadas por la falta de
linealidad en la curva). Cabe destacar que la composicin molar en AMPS por encima
de la cual la movilidad electrofortica se hace constante es 50-60. Esto est en
concordancia con los fenmenos predichos por la Ley de Manning
16
y con los
resultados obtenidos por Whitlock y Wheeler
3
para el sistema HEMA-AMPS por
isotacoforesis, lo que parece confirmar la utilidad de este mtodo.

De los datos de composicin aproximada puede concluirse como regla general
que a medida que aumenta el contenido en AMPS, aumenta el tiempo de anlisis. Los
picos correspondientes a fracciones muy ricas en AMPS son principalmente cadenas de
bajo peso molecular (Fig. 3.11).

Las fracciones ricas en HEMA (H en la Fig. 3.13) no presentan una marcada
dependencia trivial con la composicin. HA90 a pesar de poseer un bajo contenido en
AMPS, se desplaza a tiempos de migracin mayores que el HA70 y el HA50. Esto se
debe a la capacidad de MEKC de separar cadenas polimricas segn su hidrofobicidad
(el poli-HEMA no es hidrosoluble) y en el caso de copolmeros ms hidrofbicos la
interaccin con las micelas empieza a cobrar gran importancia. Por lo tanto, para
polmeros ms hidrofbicos, a medida que aumenta la hidrofobicidad de la
macromolcula, aumenta la interaccin con el SDS, disminuye la movilidad
electrofortica y por tanto aumente el tiempo de migracin.


En este captulo se demuestra la capacidad de MEKC para caracterizar
reacciones de copolimerizacin en las que intervienen especies inicas. Se han
estudiado los sistemas HEMA-AMPS, DMAA-AMPS, su evolucin con la conversin,
as como la formacin de especies de bajo peso molecular. La tcnica aprovecha dos
factores opuestos que influyen en el tiempo de anlisis (la carga de la molcula y su
hidrofobicidad) para obtener una valiosa informacin acerca de la distribucin de
composiciones qumicas del sistema.


5 BIBLIOGRAFA

1)Tonelli A.E. NMR spectroscopy and polymer microstructure: the conformational
connection New York, 1989.
2)Braun D., Krmer I., Pasch H. Macromol Chem Phys 2000, 201(10), 1048-1057.
3)Whitlock L.R., Wheeler L. M. Journal of Chromatography 1986, 368, 125-134.
4)Staggemeier B., Huang Q. R., Dubin P.L., Morishima Y., Sato T. Anal Chem 2000,
72, 255-258.
5)Grosche O., Bohrisch J ., Wendler U., J aeger W., Engelhardt H. Journal of
chromatography A 2000, 894, 105-116.
6)Gallardo A., Lemus R., San Romn J ., Cifuentes A., Dez-Masa J .C. Macromolecules
1999, 32, 610-617.
7)Terabe S., Otsuka K., Ichikawa K., Tsichiya A., Ando T. Anal Chem 1984, 56, 113.
8)Terabe S., Chen N., Otsuka K. Adv Electrophoresis 1994, 7, 87.
9)Cifuentes A., Bujn J . L., Dez-Masa J .C. Analytical Chemistry 1997, 69, 4271-4274.
10)Stellwagen N. C., Gelfi, C.; Righetti, P.G. Biopolymers 1997, 42, 687-703.
11)Viovy, J . L. Rev Mod Phys 2000, 72, 813-872.
12)Guidance for the Industry Q3C Impurities: Residual Solvents; US Federal Register,
1997; Vol. 62 FR67377.
13)Kirk R.E., Othmer D. F. Encyclopedia of chemical technology; 3rd Ed. ed.; Wiley
Interscience: New York, 1978-1984.
14)Santodonato J . "Monograph on human exposure to chemicals in the workplace:
isopropyl alcohol," Center for Chemical Hazard Assessment, Syracuse; Research
Corporation, 1985.
15)Seymour L.W. Systemic cancer therapy using polymer-based prodrugs and
progenies; Dumitriu S., D. M., Ed.: New York, 2002, pp 843-850.
16)Brandrup J ., Immergut E. H., Grulke E.A. Polymer Handbook; 4th ed.; Wiley, 1999.
17)Manning G. S. Acc. Chem. Res. 1979, 12, 443.
18)Kok W.T., Stol R. Analytical Chemistry 2000, 72(13), 468A-476A.

CAPTULO 4

EVALUACIN DE LOS COPOLMEROS
THEMA-AMPS PARA SU APLICACIN COMO
RECUBRIMIENTOS DE PRTESIS
VASCULARES DE PEQUEO DIMETRO

Captulo 4: Evaluacin del sistema THEMA-AMPS

114
CAPTULO 4: EVALUACIN DE LOS COPOLMEROS THEMA-
AMPS PARA SU APLICACIN COMO RECUBRIMIENTOS DE
PRTESIS VASCULARES DE PEQUEO DIMETRO

1 INTRODUCCIN................................................................................................ 115
1.1 Propiedades y mecanismo de accin del Triflusal ....................................... 117
2 MATERIALES Y MTODOS: ........................................................................... 119
2.1 Medidas de hinchamiento............................................................................. 119
2.2 Estudio de la liberacin del frmaco............................................................ 119
2.3 Medidas de ngulo de contacto.................................................................... 120
2.4 Recubrimiento de las prtesis....................................................................... 120
2.5 Adhesin plaquetaria.................................................................................... 120
2.6 Ensayos de biocompatibilidad in vivo .......................................................... 121
3 RESULTADOS Y DISCUSIN.......................................................................... 122
3.1 Medidas de ngulo de contacto.................................................................... 122
3.2 Estudio del hinchamiento y la liberacin..................................................... 125
3.3 Adhesin de plaquetas.................................................................................. 128
3.4 Compatibilidad in vivo de los implantes copolimricos............................... 131
3.4.1 Observacin macroscpica................................................................... 132
3.4.2 Observacin microscpica.................................................................... 133
4 BIBLIOGRAFA.................................................................................................. 136

Captulo 4: Evaluacin del sistema THEMA-AMPS 115
1 INTRODUCCIN

La trombosis es uno de los mayores problemas asociados al uso de biomateriales
como prtesis vasculares
1
. Para prevenir la formacin de cogulos sanguneos suele
administrarse un anticoagulante como la heparina. Sin embargo, no se recomienda la
administracin de altas concentraciones de heparina debido a que provoca efectos
secundarios graves como trombocitopenia o hemorragia
2
. Por este motivo, la
investigacin se ha dirigido hacia la sntesis de superficies antitrombognicas que no
necesiten la administracin de agentes anticoagulantes, mediante el desarrollo de
sistemas de liberacin controlada de este tipo de frmacos
3-5
.

El desarrollo de nuevos materiales con buenas propiedades en contacto con la
sangre requiere el diseo de materiales no trombognicos con una alta fiabilidad
6
. Se
han llevado a cabo numerosas estrategias para mejorar la antitrombogeneidad de dichos
materiales, especialmente la de los utilizados en fabricacin de prtesis de pequeo
dimetro (4 mm o menos).

En el diseo de prtesis vasculares se suele utilizar politetrafluoroetileno
expandido (PTFEe) ya que su estabilidad y propiedades mecnicas son excelentes y
presenta una baja incidencia de oclusin por trombosis o hiperplasia de la capa ntima
vascular. Sin embargo, estos fenmenos s ocurren con prtesis de PTFEe de pequeo
dimetro, no siendo recomendable su utilizacin como bypass o en la reconstruccin del
rbol vascular por debajo de la rodilla. El fracaso asociado a este tipo de prtesis podra
deberse a que un aumento de la relacin superficie/volumen produce un aumento en la
velocidad de activacin de los factores de coagulacin, complemento, plaquetas... ya
que chocan contra una superficie menos tromborresistente que una vena normal, o que
la disminucin del flujo en las vasos de pequeo dimetro produce un aumento en el
tiempo de contacto de los componentes de la sangre con la superficie, que puede activar
los procesos de agregacin o coagulacin. En la actualidad las investigaciones se
dirigen hacia la modificacin superficial del PTFEe, de manera que se mantengan las
propiedades fisicoqumicas del mismo, disminuyendo la adhesin proteica y plaquetaria
fundamentalmente, disminuyendo de esta forma, la trombogeneidad del material.


116
La modificacin superficial puede realizarse mediante modificacin qumica,
injerto, recubrimiento con polmeros con grupos funcionales adecuados o adsorbiendo
selectivamente molculas biolgicamente activas o biomimticas
7
. Uno de los mtodos
ms ensayados consiste en la inmovilizacin de grupos sulfnicos en la superficie que
se encontrar en contacto con la sangre. Estos grupos se incorporan con la intencin de
conseguir cierta similitud con la heparina, cuyos grupos sulfnicos han sido asociados a
su actividad anticoagulante
8-13
. Estos grupos, repelen la adsorcin de protenas, la
adhesin de clulas e inhiben factores de coagulacin por repulsin electrosttica.

Figura 4.1: Estructura qumica de la heparina, el Triflusal y del sistema copolimrico
poli(THEMA-co-AMPS), objeto de estudio en este captulo.
OH
O
O
CF
3
CH
3
O
O
OH
NH
C
O CH
3
O
CH
2
OSO
3
-
O
O
OH
OH
COO
-
O
OSO
3
-
NH
O
CH
2
OSO
3
-
SO
3
-
O
O
O
OH
NH
O
SO
3
-
CH
2
OSO
3
-
O
OH
OSO
3
-
COO
-
n
m
O
H
2
C
CH
2
O
O
O
O
CF
3
CH
3
O
CH
3
CH
2
HN
O
C CH
3
H
3
C
CH
2
SO
3
-
H
CH
2
HEPARINA
TRIFLUSAL
Poli(THEMA-co-AMPS)
OH
O
O
CF
3
CH
3
O
O
OH
NH
C
O CH
3
O
CH
2
OSO
3
-
O
O
OH
OH
COO
-
O
OSO
3
-
NH
O
CH
2
OSO
3
-
SO
3
-
O
O
O
OH
NH
O
SO
3
-
CH
2
OSO
3
-
O
OH
OSO
3
-
COO
-
O
OH
NH
C
O CH
3
O
CH
2
OSO
3
-
O
O
OH
OH
COO
-
O
OSO
3
-
NH
O
CH
2
OSO
3
-
SO
3
-
O
O
O
OH
NH
O
SO
3
-
CH
2
OSO
3
-
O
OH
OSO
3
-
COO
-
n
m
O
H
2
C
CH
2
O
O
O
O
CF
3
CH
3
O
CH
3
CH
2
HN
O
C CH
3
H
3
C
CH
2
SO
3
-
H
CH
2
n
m
O
H
2
C
CH
2
O
O
O
O
CF
3
CH
3
O
CH
3
CH
2
HN
O
C CH
3
H
3
C
CH
2
SO
3
-
H
CH
2
HEPARINA
TRIFLUSAL
Poli(THEMA-co-AMPS)

Por otro lado, se han inmovilizado en el lumen de los vasos sintticos diversos
agentes que, bien inhiben la adhesin o agregacin plaquetaria como la aspirina o la
prostaciclina, bien estimulan la anticoagulacin como la heparina, o la fibrinolisis
como la urokinasa, o bien inhiben la hiperplasia del ntima vascular como la fraccin
no anticoagulante de la heparina
14
. Nuestro grupo ha demostrado recientemente que la
aplicacin de recubrimientos polimricos derivados del cido acetilsaliclico y del
Triflusal (Disgren) en la superficie interior de prtesis vasculares de pequeo
dimetro, disminuye la adhesin y agregacin de plaquetas en su superficie
15-17
. En
estos sistemas, el agente activo se une covalentemente al esqueleto de un polmero
bioabsorbible por polimerizacin directa de la droga funcionalizada con otro monmero
biocompatible. As, se obtienen materiales no slo con actividad farmacolgica sino
tambin con propiedades de dosificacin controlada de frmaco, capaces de mantener
un nivel elevado de droga en plasma durante largos periodos de tiempo de forma
controlada, es decir, sin alcanzar niveles txicos ni caer en por debajo de los niveles
efectivos.

El sistema copolimrico poli([(2-acetiloxi)-4-trifluorometil]benzoato de
metacriloiloxietilo)-co-cido 2-acrilamido-2-metilpropano sulfnico) (poli(THEMA-co-
AMPS)) fue sintetizado con el fin de combinar ambas estrategias. Es decir, se han
incorporado simultneamente y de manera covalente grupos sulfnicos y un frmaco
antiagregante (Triflusal). Este sistema es atractivo como recubrimiento
farmacolgicamente activo de prtesis vasculares y/o como sistema de liberacin de
controlada de Triflusal. En este captulo se realiza un estudio preliminar que evala
cuatro copolmeros estadsticos del sistema THEMA-AMPS. Para ello se estudi la
cintica de liberacin in vitro del frmaco anclado al esqueleto polimrico, se evaluaron
las propiedades antiagregantes en condiciones estticas y la biocompatibilidad in vivo
empleando rata Wistar como modelo experimental.

1.1 Propiedades y mecanismo de accin del Triflusal

Con el fin de inhibir los procesos cardiovasculares trombognicos se han
desarrollado numerosos frmacos antiagregantes plaquetarios, entre ellos el Triflusal.
Este frmaco est relacionado estructuralmente con el cido acetilsaliclico y por tanto,

118
forma parte de la familia de los salicilatos. Su espectro de accin es diferente al del
cido acetil saliclico ya que presenta accin antiagregante plaquetaria pero carece de
actividad antiinflamatoria. Su sntesis surge a mediados de los aos 70 con el fin de
encontrar un frmaco antiagregante plaquetario con menos efectos secundarios que la
aspirina. Result ser una excelente alternativa ya que posee una accin ms selectiva
sobre la ciclooxigenasa plaquetar frente a la endotelial.

Las plaquetas se activan principalmente por estimulacin del ciclo del
fosfatidilinositol, que origina la formacin del inositol-trifosfato (IP
3
) y activa la sntesis
del tromboxano A
2
(T
x
A
2
) que es una de las molculas endgenas con actividad
vasoconstrictora y procoagulante ms potente. El T
x
A
2
facilita la salida del calcio al
citoplasma plaquetario y provoca la agregacin de las plaquetas, proceso mediado por el
complejo receptor glucoprotena IIb/IIIa (GP IIb/IIIa). Por otro lado, existe un
mecanismo defensivo que es el sistema AMP
c
/GMP
c
que tiende a preservar el calcio
dentro de sus depsitos evitando as la agregacin plaquetaria. Los principales
responsables de esta activacin son por un lado la prostaciclina y la adenosina, que
elevan los niveles de AMP
c
, y por otro el xido ntrico endotelial que incrementa el
GMP
c
.

El Triflusal inhibe la agregacin de las plaquetas mediante un mecanismo de
accin dual: inhibicin de la produccin de T
x
A
2
e incremento de la tasa
intraplaquetaria de AMP
c
. Es decir, consigue en primer lugar disminuir la produccin de
T
x
A
2
ya que se trata de un inhibidor irreversible de la ciclooxigenasa plaquetaria por
acetilacin de su centro activo. Este efecto tambin lo presenta su principal metabolito
en el organismo, el cido 2-hidroxi-4-trifluorometilbenzico (HTB), lo cual potencia la
accin del Triflusal. Sin embargo, este frmaco apenas presenta efecto sobre la
ciclooxigenasa del endotelio vascular por lo que respeta la sntesis de prostaciclina. Por
lo tanto, se trata de un inhibidor selectivo de la ciclooxigenasa plaquetaria ya que la
concentracin de frmaco necesaria para inhibir la funcin plaquetaria en un 50% es
900 veces menor que la necesaria para inhibir la sntesis vascular de prostaciclina
humana. En segundo trmino, el Triflusal incrementa la tasa de AMPS
c
por inhibicin
de la AMP
c
fosfodiesterasa plaquetaria, efecto que presenta principalmente el HTB.


2.1 Medidas de hinchamiento
Se realizaron medidas de hinchamiento de los copolmeros objeto de estudio en
soluciones tampn de concentracin 100 mM, a pH 2, 7,4 y 10,0 y 150 mM de fuerza
inica, a 37 C. El grado de hinchamiento se determin gravimtricamente a distintos
tiempos de anlisis en trminos de agua absorbida, es decir, a partir del peso de la
muestra hinchada respecto de la muestra seca segn la siguiente ecuacin:

% agua absorbida = 100
0
0
P
P P
i

siendo P
i
el peso de la muestra hinchada a un tiempo t y P
0
el peso de la muestra seca.

La superficie de las muestras se sec cuidadosamente con papel de filtro antes de cada
pesada.

2.2 Estudio de la liberacin del frmaco

Se estudi el proceso de liberacin de frmaco en medio acuoso a pHs 2,0, 7,4
y 10,0 de los copolmeros THA80 y THA60 tomados como modelo. Se monitoriz la
liberacin del principal metabolito del Triflusal, el cido 2-hidroxi-4-
trifluorometilbenzico (HTB), debido a la poca estabilidad del frmaco en medio
acuoso
18
. Se utilizaron pelculas de copolmero (25 mg) dentro de un soporte de
polister perforado, y se sumergieron en 10 ml de solucin tampn. A determinados
tiempos de anlisis se tomaron muestras de 0,2 ml que se repusieron por medio fresco.

La cuantificacin del HTB se realiz por Cromatografa Lquida de Alta
Resolucin (HPLC) en fase inversa con deteccin ultravioleta. El equipo empleado en
este trabajo const de una bomba Perkin-Elmer LC-250, un detector UV Perkin-Elmer
LC-95 y una columna Waters Boundapak C-18 de 3,0 300 mm. Como fase mvil se
utiliz una disolucin metanol/solucin acuosa de PIC A (Waters) (60:40)
microfiltrado y desgasificado, a una velocidad de flujo de 1 ml min
-1
. La deteccin se
produjo a una longitud de onda de 305 nm. Las medidas se realizaron a intervalos de

120
tiempo similares a los correspondientes a las medidas de hinchamiento con el fin de
relacionar la influencia del grado de hidrofilia y la solubilizacin de los sistemas en los
procesos de liberacin.

2.3 Medidas de ngulo de contacto

Las medidas de contacto se realizaron utilizando el mtodo sessile drop
empleando disolventes de tensin superficial conocida: agua (
L
=72,8 mJ m
-2
), glicerol
(
L
=63,4 mJ m
-2
) y diyodometano (
L
=51,8 mJ m
-2
). Siendo
L
la energa libre
superficial del lquido. La energa libre superficial tanto de homopolmeros como
copolmeros se calcularon por el mtodo de Owens
19
.

2.4 Recubrimiento de las prtesis

Las prtesis vasculares de politetrafluoroetilino expandido (PTFEe), Gore-
Tex, fueron homogneamente recubiertas aadiendo 100 l de disolucin de polmero
al 20 % (p/v) en THF o THF/etanol segn la solubilidad de cada polmero. El disolvente
se dej evaporar a temperatura ambiente durante 24 horas. Este proceso se repiti dos
veces. De esta forma se obtuvieron recubrimientos homogneos con una ganancia de
peso del 11,4 0,5 %.

2.5 Adhesin plaquetaria

Los ensayos de adhesin plaquetaria se realizaron en condiciones estticas sobre
las prtesis de Gore-Tex previamente recubiertas con los materiales polmeros. Las
prtesis se fijaron en contenedores cilndricos de 8 mm de dimetro y 10 mm de
profundidad. Se utiliz plasma rico en plaquetas (PRP) de voluntarios humanos sanos.
Para ello se centrfugaron 40 ml de sangre total a 1500 r.p.m durante 4 minutos y se
aisl el sobrenadante (PRP). Sobre cada una de los contenedores se aadieron 100 l de
PRP permitiendo el contacto del plasma con la prtesis vasculares durante 1 hora, 1 da
y 3 das. Las muestras se mantuvieron a 37 C en una estufa de cultivos con atmsfera
de CO
2
al 5 % durante el tiempo que dur el experimento.

2.6 Ensayos de biocompatibilidad in vivo

Para este estudio se utilizaron 4 ratas hembra Wistar de entre 200 a 250 g de
peso. En todas las ratas se implant una pieza de material en forma de pastilla de 5 mm
de dimetro previamente esterilizada sumergindola en etanol al 70 %. Los animales
fueron anestesiados con pentobarbital sdico (40 mg kg
-1
, i.p) y se les afeit el rea
dorsal. Se les realiz una incisin de 1 cm de longitud en el msculo dorsal en
condiciones aspticas. Las muestras se colocaron en esta cavidad y la piel se cerr con
hilo de sutura. A los 15 y 60 das, se sacrificaron por sobredosis de ter de dietilo y se
extrajeron los implantes junto con el tejido circundante para el posterior anlisis
histolgico.

Figura 4.2: Fotografa del proceso de implantacin del material polmero
esterilizado sobre el msculo dorsal de una rata Wistar anestesiada.

El estudio histolgico se realiz utilizando tinciones de hematoxilina-eosina. En
primer lugar se fijaron las muestras en formol al 10% en tampn fosfato, pH 7,4,
durante al menos 5 das. Las muestras se embebieron en parafina y se seccionaron en
lminas de 5 m. Por ltimo se tieron con hematoxilina y eosina. Las muestras se
observaron en un microscopio ptico (Leitz Dialux 22) y fueron fotografiadas con una
pelcula 100 ASA Kodachrome.


122


Se sintetizaron cuatro copolmeros de contenido molar en alimentacin de
AMPS de 0,10, 0,20, 0,30 y 0,40, con la intencin de obtener materiales polmeros con
posible aplicacin como recubrimiento de prtesis vasculares de pequeo dimetro. Las
composiciones anteriormente mencionada se encuentran dentro del rango de
insolubilidad en agua y por tanto, dentro del lmite de aplicacin de los materiales. La
introduccin de unidades AMPS en la estructura contribuye no slo a la incorporacin
en las macromolculas de grupos sulfnicos ionizados (biolgicamente activos, como se
mencion anteriormente), sino tambin a mejorar la adhesin y aumentar la hidrofilia
(humectabilidad), siendo ambas propiedades crticas en el comportamiento biolgico de
los materiales. El balance hidroflico/hidrofbico y consecuentemente la energa libre
interfacial en solucin acuosa, depender en gran medida de la composicin, ya que el
monmero THEMA es relativamente hidrofbico y el AMPS es ms hidroflico debido
especialmente a su naturaleza inica .

3.1 Medidas de ngulo de contacto

La energa superficial del slido (SES) es un parmetro clave en la interaccin
de un material con protenas y clulas, y por tanto, en su hemocompatibilidad. Se han
determinado las componentes de la energa libre interfacial de los cuatro copolmeros a
partir de la medidas de los ngulos de contacto de tres lquidos de tensin superficial
conocida, empleando la metodologa de Owens
19
que se resume mediante las siguientes
ecuaciones:
p
s
d
s s
+ =
2
1
2
1
) ( ) ( 2 / ) cos 1 (
p
l
p
s
d
l
d
s l
+ = +

donde es el valor del ngulo de contacto,
s
y
l
son la energa superficial del slido y
del lquido y
s
d
,
s
p
,
l
d

y

l
p
son las componentes dispersiva y polar de la energa
superficial del slido y del lquido respectivamente. La Figura 4.3 representa la
variacin de
s
d
,
y
s
p
, as como de la tensin superficial total de los materiales
sintetizados en funcin del contenido molar en THEMA.

Los valores de los ngulos de contacto se recogen en la Tabla 4.1. La
componente polar disminuye al disminuir el contenido en AMPS, de acuerdo con la
disminucin de la hidrofilia atribuida al componente inico. La componente dispersiva
se mantiene prcticamente constante. La SES de los copolmeros no se ajusta a la regla
de aditividad molar. La desviacin de los datos obtenidos experimentalmente hacia
menores valores respecto de las regla terica de aditividad molar, podra estar
relacionado con reagrupamientos moleculares dentro de las cadenas, que conduciran a
dominios superficiales ricos en el monmero THEMA. La tendencia que presenta el
sistema a la homopolimerizacin consecutiva durante la sntesis (ya comentada en el
Captulo 2), que conduce a la formacin de largas secuencias de uno y otro monmero
en las cadenas macromoleculares, podra dar lugar a estos reagrupamientos moleculares.

Figura 4.3: Variacin de la energa superficial del slido () y de las componentes
dispersiva () y polar () en funcin de la composicin del copolmero. Las rectas
corresponden a los valores tericos calculados segn la regla de adicin molar.

La tensin crtica superficial (
c
) es un parmetro muy valioso usado
frecuentemente en la literatura en la estimacin y prediccin de la hemocompatibilidad
de un material. A principios de los aos 70, Robert Baier y sus colaboradores
20

0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
f
THEMA
S
E
S

(
m
N
/
m
)
SES
P

124
desarrollaron una hiptesis que relacionaba las caractersticas superficiales y la
biorreactividad. Segn este autor, la compatibilidad de un material con la sangre se
consigue minimizando la adhesin de los componentes sanguneos y la superficie
artificial, siendo
c
uno de los parmetros ms importantes a determinar. La hiptesis se
basa en medidas de ngulos de contacto, , para la determinacin de enegas
superficiales y sugiere que tensiones crticas superficiales cercanas a 22 mN/m
presentan una mnima adhesin. Por ello,
c
ha sido calculado mediante el mtodo de
Zisman
21
y se encuentra representado en la Tabla 4.1, que expresa la media el error
estndar de almenos diez medidas. Este mtodo calcula
c
como una aproximacin a la
tensin superficial del slido. Para ello se colocan gotas de lquidos con tensin
superficial conocida y que difieran considerablemente entre si, sobre el material que se
desea estudiar y se mide el ngulo de contacto. Se hace una representacin grfica de la
tensin superficial del lquido frente al coseno del ngulo de contacto (cos )
obtenindose una lnea recta. Se extrapola la recta a cos = 1 obtenindose as
c
. Los
valores de
c
obtenidos para los copolmeros ensayados varan entre 26 y 33 mN/m, los
cuales se encuentran dentro o cercanos del rango mnima bioadhesion y mxima
hemocompatibilidad descrito por Baier (entre 20 y 30 mN/m)
20,22

Composicin ngulo de contacto
c
(mN/m)
SES
(mN/m)
f
THEMA

agua

glicerina

diiodometano

s
p

s
d

s

Poli(AMPS) 0 0.001.74 44.393.31 46.671.83 194.05 36.2 28.4 64.6
THA60 0.63 68.854.25 73.783.91 54.482.26 33.17 11.7 26.6 38.3
THA70 0.69 74.775.31 73.208.13 54.822.17 32.11 7.4 29.6 36.9
THA80 0.81 77.292.86 70.344.50 54.963.72 28.23 6.9 28.0 34.9
THA90 0.90 73.085.24 70.481.97 55.635.30 26.60 9.4 25.1 34.5
Poli(THEMA) 1 81.182.36 72.064.95 54.392.76 31.54 4.8 30.6 35.4

Tabla 4.1: ngulos de contacto en agua (
agua
), glicerina (
glicerina
) y diiodometano
(
diiodometano
) as como energa superficial del slido (
s
), componente polar (
s
p
) y
dispersiva (
s
d
) de los copolmeros poli(THEMA-co-AMPS) y homopolmeros

3.2 Estudio del hinchamiento y la liberacin

Los copolmeros hinchan y alcanzan el equilibrio en medio acuoso en pocas
horas, alcanzando valores de contenido en agua mximos de entre 25 y 150 %, tal y
como se registra en la Figura 4.4. El grado de hinchamiento aumenta considerablemente
con el contenido en AMPS, debido al mayor carcter hidrfilo del componente inico
comparado con la unidad de TH. Las cinticas de hinchamiento siguen un perfil muy
particular, alcanzando un mximo de absorcin a los pocos minutos para despus perder
hasta un 50% del medio absorbido. Esto podra deberse al efecto del contrain o a que
puedan existir fracciones de bajo peso molecular ricas en AMPS (Figura 4.5).

Figura 4.4: Dependencia del Hinchamiento mximo de los copolmeros THEMA-
AMPS en funcin del pH

Figura 4.5: Cinticas de hinchamiento de los copolmeros THEMA-AMPS a pH 7,4
0
50
100
150
200
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
tiempo (das)
%

a
g
u
a

a
b
s
o
r
b
i
d
a
THA60
THA70
THA80
THA90
0
50
100
150
200
%

a
g
u
a

a
b
s
o
r
b
i
d
a
THA90
THA80
THA70
THA60
pH 7.4 pH 10 pH 2

126

Figura 4.6: Representacin esquemtica de la hidrlisis de las macromolculas en medio
acuoso para dar lugar a Triflusal y a HTB, su principal metabolito.

Estos sistemas van a sufrir en medio acuoso la hidrlisis del enlace dbil que une
el frmaco con el esqueleto polimrico (Figura 4.6). Por ello se ha llevado a cabo el
estudio de liberacin in vitro a pH bsico, fisiolgico y cido de los copolmeros
THA80 y THA60. Las cinticas de liberacin se encuentran representadas en la Figura
4.7, expresadas en porcentajes (derecha) o moles/g de polmero (izquierda). Los
materiales estudiados presentan una interesante cintica de liberacin de orden cero, que
a pH 7,4 se mantiene durante 6 meses. Este comportamiento resulta muy interesante a la
hora de utilizar este material como recubrimiento de prtesis vasculares con actividad a
largo plazo, sin embargo, siempre es arriesgado extrapolar los resultados in vitro al
verdadero comportamiento in vivo.

PH=2 PH=7.4 PH=10
THA 60 3.6 13.1 65.9
THA80 2.6 11.6 62.4

Tabla 4.2: Constantes cinticas de liberacin (mol frmaco / g polmeros da)

n
m
O
H
2
C
CH
2
O
O
O
O
CF
3
CH
3
O
CH
3
CH
2
HN
O
C CH
3
H
3
C
CH
2
SO
3
-
H
CH
2
n
m
OH
H
2
C
CH
2
O
O
CH
3
CH
2
HN
O
C CH
3
H
3
C
CH
2
SO
3
-
H
CH
2
OH
O
O
CF
3
CH
3
O
OH
O
OH
CF
3
pH=2
pH=7,4
pH=10
37C
O
HO
H
2
O
TRIFLUSAL HTB
Poli(THEMA-co-AMPS)
Poli(HEMA-co-AMPS)
n
m
O
H
2
C
CH
2
O
O
O
O
CF
3
CH
3
O
CH
3
CH
2
HN
O
C CH
3
H
3
C
CH
2
SO
3
-
H
CH
2
n
m
OH
H
2
C
CH
2
O
O
CH
3
CH
2
HN
O
C CH
3
H
3
C
CH
2
SO
3
-
H
CH
2
OH
O
O
CF
3
CH
3
O
OH
O
OH
CF
3
pH=2
pH=7,4
pH=10
37C
O
HO
H
2
O
n
m
O
H
2
C
CH
2
O
O
O
O
CF
3
CH
3
O
CH
3
CH
2
HN
O
C CH
3
H
3
C
CH
2
SO
3
-
H
CH
2
n
m
OH
H
2
C
CH
2
O
O
CH
3
CH
2
HN
O
C CH
3
H
3
C
CH
2
SO
3
-
H
CH
2
OH
O
O
CF
3
CH
3
O
OH
O
OH
CF
3
pH=2
pH=7,4
pH=10
37C
O
HO
H
2
O
O
HO
H
2
O
TRIFLUSAL HTB
Poli(THEMA-co-AMPS)
Poli(HEMA-co-AMPS)

Esta cintica de liberacin de orden cero ha sido descrita con anterioridad para
sistemas acrlicos similares portadores de frmacos
23
y puede atribuirse al incremento
de la hidrofilia del sistema a medida que se libera el frmaco, ya que al desprendese
Triflusal al medio, la matriz polmerica cambia progresivamente de THEMA a HEMA,
ms polar que el monmero de partida. De la pendiente de la recta representada en la
parte izquierda de la Figura, se pueden determinar las constantes cinticas recogidas en
la Tabla 4.2.

La velocidad de hidrlisis aumenta considerablemente a pH alcalino (como
cabra esperar) debido a la naturaleza del enlace ster cuya susceptibilidad a ser
hidrolizado aumenta a este pH. Adems, la composicin tambin ejerce gran influencia
en la liberacin. A mayor contenido en AMPS, mayor es el hinchamiento y mayor la
velocidad de liberacin. Esto se debe a que el aumento de la hidrofilia de los materiales
incrementa la accesibilidad de las molculas de agua al enlace ster susceptible de ser
hidrolizado.

Figura 4.7: Monitorizacin de la liberacin de TH en medios acuosos tamponados a pH 2 (),
pH 7,4 () y pH 10 () a partir de THA60 (smbolos huecos) y THA80 (smbolos coloreados)
en valores absolutos (izquierda) y en % de liberacin (derecha).

0
500
1000
1500
2000
2500
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
t (das)
m
o
le
s

H
T
B
/
g
.

p
o
lm
e
r
o
pH=10
pH=7,4
pH=2
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
t (das)
%

l
i
b
e
r
a
c
i
n
pH=10
pH=7,4
pH=2
0
500
1000
1500
2000
2500
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
t (das)
m
o
le
s

H
T
B
/
g
.

p
o
lm
e
r
o
pH=10
pH=7,4
pH=2
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
t (das)
%

l
i
b
e
r
a
c
i
n
pH=10
pH=7,4
pH=2

128
Sin embargo, como el nmero absoluto de molculas de frmaco aumenta al
disminuir la cantidad de AMPS, los perfiles de liberacin de ambos copolmeros
(expresado como g de droga/g de recubrimiento; parte izquierda de la Figura 4.7) son
muy similares, debido a la relacin existente entre el incremento de la hidrofilia y la
disminucin de molculas de frmaco por gramo de material.

3.3 Adhesin de plaquetas

Los resultados que se obtienen de tests in vitro que evalan las interacciones
sangre-biomaterial, proporcionan gran informacin a nivel celular acerca de las
interacciones plaqueta-superficie y plaqueta-plaqueta.

La adhesin plaquetar y el grado de activacin de las mismas se considera un
indicador de la trombogeneidad potencial del biomaterial ensayado
10
. Estos parmetros
no son suficientes a la hora de clasificar un material como trambognico, y no predicen
la extensin de los efectos trombognicos locales o sistmicos, pero numerosos estudios
han demostrado que la acumulacin y activacin de plaquetas en la superficie del
material a cortos intervalos de tiempos, pueden provocar el fracaso del material,
especialmente en el caso de prtesis vasculares de pequeo dimetro
24
. Por lo tanto,
estos experimentos cortos deberan ser apropiados para detectar materiales altamente
trombognicos por la rpida acumulacin de plaquetas activadas en su superficie.

La adhesin y grado de extensin de las plaquetas estn fuertemente
relacionados con su grado de activacin en las superficies polimricas. Inicialmente
mantienen su forma de disco propia del estado no activado (rea 10-15m
2
). Cuando se
activan emiten pseudpodos y adquieren forma circular (rea 45-50 m
2
). Lin y
colaboradores
25
describieron, entre uno y otro estado, cinco etapas de activacin
basndose en el grado de extensin de las plaquetas. Tanto la adhesin de las plaquetas
como el grado de activacin de las mismas fueron evaluados empleando ESEM.


Figura 4.8: Micrografas de ESEM de las superficies de Gore-Tex: (a) no recubierto; (b)
recubierto con THA80 y (c) recubierto con THA90.

Se recubrieron prtesis de Gore-Tex con los copolmeros obtenindose
recubrimientos homogneos (Figura 4.8) con una ganancia de peso del 11,40,5%. La
serie A corresponde al control (Gore-Tex sin recubrir) y las series B y C a las prtesis
recubiertas con THA80 y THA90 respectivamente. La presencia de los grupos
sulfnicos en las cadenas copolimricas confiere una mayor adhesin de las cadenas a la
superficie del Gore-Tex comparado con el homopolmero y adems, los
recubrimientos son estables durante mayores periodos de tiempo. Esto fue confirmado
mediante microscopa ESEM. Del mismo modo, la agregacin plaquetaria en las
superficies de la prtesis puede ser controlada por las caractersticas del recubrimiento.
La Figura 4.9 muestra la retencin de las plaquetas en la superficie de prtesis
recubiertas y sin recubrir en funcin del tiempo. Como puede apreciarse las plaquetas
estn menos agregadas en el caso de las superficies recubiertas con THA80 y THA90.
Adems, como se observa en las micrografas, las plaquetas no han emitido
pseudpodos, lo que indica la no activacin de las mismas. Por lo tanto, y como ha sido
descrito previamente en la literatura
10,15
, la presencia de grupos sulfnicos y/o la
liberacin de Triflusal durante largos periodos de tiempo previene la adhesin y
activacin de las plaquetas.
a b c

130

Figura 4.9: Micrografas de ESEM de las plaquetas adheridas a (a) superficies no recubiertas de
Gore-Tex; a-1: 60 min de tratamiento; a-2: 24 h de tratamiento y a-3: 4 das de tratamiento;
(b) recubiertas con THA80; b-1: 60 min de tratamiento; b-2: 24 h de tratamiento b-3: 4 das de
tratamiento y (c) recubiertas con THA90, c-1: 60 min de tratamiento; c-2: 24 h de tratamiento y
c-3: 4 das de tratamiento.
1.1.1 CONTROLES THA80 THA90
a-1 b-1 c-1
a-2 b-2 c-2
a-3 b-3 c-3

3.4 Compatibilidad in vivo de los implantes copolimricos

El estudio de la biocompatibilidad in vivo de los biomateriales y dispositivos
mdicos es un paso imprescindible a la hora de ensayar un material que vaya a estar
implantado en humanos. A pesar de que los ensayos in vitro proporcionan informacin
fundamental acerca de algunas interacciones celulares y moleculares con los
biomateriales, no pueden reemplazar a los ensayos in vivo . Por ello, los modelos
animales son necesarios ya que:
1. Deben existir interacciones de distinto tipo de clulas con el material implantado
y entre si
2. Deben actuar factores paracrinos y endocrinos alrededor del implante
3. La implantacin del material en el ser vivo altera las interacciones de las clulas
con los componentes insolubles de la matriz extracelular y con molculas
solubles reguladoras
4. Deben existir interacciones con las clulas sanguneas, protenas y molculas
presentes en todo ser vivo

Adems, el ser vivo ha de responden a:
1. El espacio muerto creado por el implante
2. Agentes solubles que son liberados por el material
3. Partculas insolubles liberadas del material
4. Las interacciones qumicas entre la superficie del material y las molculas
biolgicas que lo rodean
5. Las alteraciones en las propiedades mecnicas en el tejido circundante al
implante provocado por la diferencia del mdulo de elasticidad entre el implante
y el tejido circundante.

Los mltiples procesos que tienen lugar en respuesta a la implantacin de un
biomaterial en un ser vivo, pueden resumirse en tres: (1) reaccin cicatrizante al trauma
post-operatorio, (2) aparicin de una reaccin inflamatoria crnica y (3) adaptacin del
tejido circundante a los cambios producidos por el implante. Se deben elegir aquellos
modelos animales que mejor simulen la respuesta del cuerpo humano, seleccionando
adems, el lugar de implantacin segn la vascularidad, la naturaleza de las clulas

132
parenquimales (capacidad de mitosis y migracin) ya que determinan la capacidad de
regeneracin, la presencia de clulas reguladoras y el efecto de la deformacin en el
comportamiento de las clulas parenquimales.

La simple presencia de un implante crea un espacio muerto en el tejido que atrae
macrfagos hacia la interfase tejido-biomaterial. Estos macrfagos, junto con los
fibroblastos que forman la cicatriz, crearn por lo general, una capa de clulas bien
definidas que envolver el implante. A esta reaccin tpica se le denomina
encapsulacin fibrtica. La presencia de macrfagos (clulas reguladoras) en la
interfase puede influir en la respuesta a cuerpo extrao, ya que estas clulas tienen la
capacidad de liberar agentes proinflamatorios si son estimuladas por los movimientos
del material o si este libera al medio sustancias txicas.

Se ha elegido el msculo paravertebral de las ratas, conejos y perros como un
sitio de implantacin estndar para detectar el efecto de las sustancias liberadas por un
implante. Debido al relativo movimiento entre el implante y el msculo, adems de la
limitada capacidad de regeneracin del msculo esqueltico, se crea tejido fibroso
alrededor de la superficie del biomaterial. El grosor de la cpsula fibrosa en este lugar
de implantacin se ha relacionado con el movimiento relativo del implante en este
emplazamiento.

Nosotros hemos elegido la rata Wistar como modelo experimental para ensayar
la biocompatibilidad in vivo de estos materiales copolimricos y se ha realizado un
profundo estudio histolgico con el fin de evaluar la respuesta tisular al biomaterial. Se
han observado las caractersticas morfolgicas del material implantado y del tejido a
diferentes tiempos de implantacin. La morfologa y los patrones de tincin, tanto de las
clulas como de la matriz extracelular, han proporcionado gran informacin acerca de la
respuesta del tejido circundante al implante.

3.4.1 Observacin macroscpica

Todas las ratas sobrevivieron al periodo de tiempo desde la intervencin hasta el
sacrificio. La herida, cicatrizacin y trauma quirrgico fueron normales ya que no se
observaron cambios visuales en el aspecto ni en el comportamiento de los animales. La
observacin macroscpica de los animales a los 15 y 30 das despus de la operacin
mostr una completa cicatrizacin de la herida para todos los materiales.

3.4.2 Observacin microscpica

Despus de 15 das post-implantacin, el tejido circundante mostr una aguda
reaccin inflamatoria (Figura 4.10 y 4.11). Esta reaccin es normal cuando un cuerpo
extrao se implanta en un animal y tiene lugar una interaccin dinmica entre el animal
y el implante. Las clulas inflamatorias, los fibroblastos y la produccin de colgeno se
dispara, conduciendo a la encapsulacin del material y a la correcta cicatrizacin del
implante. Adems, despus de 30 das post-implantacin (Figura 4.12 y 4.13) el grado
de la reaccin inflamatoria ha disminuido considerablemente y ha sido reemplazada por
tejido fibrtico en los dos copolmeros. Estos resultados indican que THA60 y THA80
presentan una buena biocompatibilidad.

Figura 4.10: Micrografa del tejido donde THA60 fue implantado: (a) formacin de una cpsula
fibrosa (tincin Hematoxilina y Eosina, 10) extrado a los 15 das post-operacin.

a

134

Figura 4.11: Micrografa del tejido donde THA80 fue implantado: (a) inflamacin aguda
(tincin Hematoxilina y Eosina, 10) extrado a los 15 das post-operacin.

Figura 4.12: Micrografa del tejido donde THA60 fue implantado: (a) tejido normal (tincin
Hematoxilina y Eosina, 10) extrado a los 30 das post-operacin.

a
a

Figura 4.13: Micrografa del tejido donde THA80 fue implantado: (a) tejido normal (tincin
Hematoxilina y Eosina, 10) extrado a los 30 das post-operacin.

En este captulo se han evaluado cuatro composiciones distintas del sistema
poli(THEMA-co-AMPS) con posible aplicacin como recubrimientos de prtesis
vasculares sintticas (Gore-Tex) de pequeo dimetro . Estos materiales presentan
estabilidad en medio acuoso y una cintica de liberacin de orden cero del frmaco
antiagregante (Triflusal) durante largos periodos de tiempo. Su grado de humectabilidad
y tensin crtica superficial se encuentran dentro de la zona descrita por Baier como de
mnima adhesin. Los datos obtenidos de agregacin plaquetaria en condiciones
estticas indican que la presencia de grupos sulfnicos y la liberacin del frmaco
antiagregante y tal vez, la actividad en su forma macromolecular (como ha sido descrito
para otros frmacos polimricos), favorecen la no agregacin de las plaquetas en la
superficie de los materiales. Los ensayos de biocompatibilidad in vivo utilizando en rata
Wistar como modelo experimental han dado lugar a resultados muy positivos.
a

136
4 BIBLIOGRAFA

1)Reynolds L.O., Newren W. H., Scolio J .F., Miller I.F. A model for
thromboembolization on biomaterials.; 1st Ed. ed.; Cooper S.L., B. C. H., Tsuruta T.,
Ed.; VSP: Utrecht, The Nederlands, 1995, pp 301-317.
2)Chong B.H. Br J Hoematol 1995, 89, 431-439.
3)Makris M. Semin Thromb Hemost 1999, 25 (1), 33-36.
4)Orloff L.A., Glenn M. G., Domb A.J ., Esclamado R.A. Surgery 1995, 117 (5), 554-
559.
5)Vasudev S.C., Chandy T., Sharma C.P., Mohanty M., Umasankar P.R. Artif Organs
2000, 24 (2), 129-136.
6)Yui N., Suzuki K., Okano T., Sakurai Y., Ishikawa C., Fujimoto K., Kawaguchi H.
Adsorption behavior of fibrinogen to sulfonated polyethylleneoxide-grafted
polyurethane surfaces; 1st Ed. ed.; Cooper S.L., B. C. H., Tsuruta T., Ed.; VSP:
Utrecht, The Netherlands, 1995, pp 237-253.
7)Xue L., Greisler H. P. Blood Vessels; 2nd Ed. ed.; Lanza R.P., L. R., Vacanti J ., Ed.;
Academic Press: California, 2000, pp 427-446.
8)Han D.K., Ryu G. H., Park K.D., J eong S.Y., Min B.G. Adsorption behavior of
fibrinogen to sulfonated polyethylleneoxide-grafted polyurethane surfaces; 1st Ed. ed.;
Cooper S.L., B. C. H., Tsuruta T., Ed.; VSP: Utrecht, The Nederlands, 1995, pp 181-
193.
1987-1994.
10)Tamada Y., Murata M., Makino K., Yoshida Y., Yoshida Y., Hayashi Y.
Biomaterials 1998, 19, 745-750.
11)Amiji M.M. Colloids and surfaces B: Biointerfaces 1998, 10, 263-271.
13)Ratner B.D., Hoffman A. S., Schoen F.J ., Lemons J .E. Biomaterials Science: an
introduction to materials in medicine; Academic Press: California, USA, 1996, pp 484.
1999, 10, 1-6.
15 (10), 759-765.
17)Ramis J ., Torrent J ., Mis R., Conte L., Barbanoj M.J ., J an J ., Forn J . Int J Clin
Pharm Ther Tox 1990, 28, 344-349.
18)Owens D.K., Wendt R. C. Journal of Applied Polymer Science 1969, 13, 1741-1747.
19)Baier R.E. Bull N Y Acad Med 1972, 48(2), 257-272.
20)Zisman W. A. Relation of equilibrium contact angle to liquid and solid constitution;
M., F. F., Ed.; American Chemical Society: Washington D. C, 1964; Vol. 43, pp 1-51.
21)Baier R.E., Meyer A. E. Surface energetics and biological adhesion; K.L., M., Ed.;
Plenum Press: New York, 1981; Vol. 2, pp 895-909.
22)Gallardo A., Peniche C., San Romn J . J Control Rel 2001, 71, 127.
23)Harker L.A., Kelly A. B., Hanson S.R. Circulation 1991, 83(6 Suppl.), IV41-55.
24)Lin J .C., Ko T. M., Cooper S.L. J Colloid Interface Sci 1994, 164, 99-106.

CAPTULO 5

SNTESIS Y CARACTERIZACIN DE LOS
COMPLEJOS POLIMRICOS (PEC)
OBTENIDOS CON PLANTILLA (TEMPLATE
POLYMERIZATION)

Captulo 5: Sntesis y Caracterizacin de PEC

140
CAPTULO 5: SNTESIS Y CARACTERIZACIN DE LOS
COMPLEJ OS POLIELECTROLTICOS (PEC)
1 INTRODUCCIN................................................................................................ 141
1.1 Complejos polielectrolticos (PEC).............................................................. 141
2 MATERIALES Y MTODOS............................................................................. 144
2.1 Reactivos...................................................................................................... 144
2.2 Interaccin del quitosano con el monmero AMPS..................................... 144
2.3 Sntesis de los complejos polielectrolpiticos................................................ 144
2.4 Caracterizacin............................................................................................. 145
2.5 Medidas de hinchamiento............................................................................. 145
2.6 Liberacin de teofilina del sistema HA-Q.................................................... 146
3.1 Interacciones quitosano-monmero AMPS.................................................. 147
3.2 Caracterizacin de los PEC.......................................................................... 149
3.3 Estudio del hinchamiento de los complejos obtenidos con plantilla............ 151
3.4 Liberacin de teofilina.................................................................................. 155
4 BIBLIOGRAFA.................................................................................................. 158

Captulo 5: Sntesis y Caracterizacin de PEC 141

1 INTRODUCCIN

1.1 Complejos polielectrolticos (PEC)

Los complejos polielectrolticos (PEC) resultan de la interaccin de
macromolculas que poseen grupos inicos complementarios. Por lo general, se forman
bien mezclando soluciones de policationes y polianiones, bien polimerizando
monmeros con grupos inicos adecuados en presencia de un polmero plantilla
(template polymerization). Las fuertes interacciones coulmbicas entre
polielectrolitos que poseen grupos inicos complementarios conducen a la agregacin
espontnea de los componentes de la solucin. Estas interacciones especficas entre las
molculas confieren al complejo unas propiedades fsicas y qumicas especiales, ya que
es capaz de controlar la velocidad de flujo de solutos y la especificidad de este flujo,
mediante cambios en las condiciones ambientales en las que se encuentra el complejo.
Por ello, este tipo de materiales ha sido utilizado como sistemas de liberacin
controlada de frmacos, para separacin de protenas, como recubrimientos
anticoagulantes, en la sntesis de membranas de dilisis, como biosensores, etc .

La formacin de complejos entre polianiones y policationes con grupos inicos
fuertes y pesos moleculares comparables forman sistemas agregados (tipo huevo
revuelto scramble egg) que por lo general, conducen a la floculacin macroscpica
del complejo. El grado de agregacin se controla fundamentalmente mediante la
concentracin de la solucin. En sistemas concentrados, los complejos polielectrolticos
se forman casi estequiomtricamente como coacervados que son solubles nicamente en
disolventes especficos, como por ejemplo, mezclas ternarias agua-acetona-bromuro
potsico. La caracterizacin de este tipo de sistemas es extremadamente compleja. En
disoluciones altamente diluidas (<10
-4
g/ml) conducen a dispersiones de partculas
coloidales que pueden estudiarse por los mtodos estndar. La formacin de los PEC
est condicionada por las caractersticas de sus componentes (densidad de carga, rigidez
de las cadenas y posicin de los restos inicos) y del entorno qumico en el que se
encuentran (pH, fuerza inica, temperatura, concentracin...)
1
.


142
Dentro de los polmeros ms utilizados en la obtencin de este tipo de complejos
se encuentra el quitosano (1,4)-[2-amino-2-desoxi--glucano] (CHI), un polisacrido
natural que se obtiene de la N-desacetilacin cataltica de la quitina, dando lugar a una
macromolcula que contiene unidades glucosamina y unidades de N-acetilglucosamina
(Figura 5.1). Es por tanto, un polisacrido bsico que a pH neutro o bsico, posee
grupos amino libres, mientras que a pH cido estos grupos se encuentran protonados
hacindole soluble en agua. Su solubilidad depende de la distribucin de los grupos
amino libres en la molcula. Se trata de un polielectrolito lineal a pH cido, con una alta
densidad de carga, que puede interaccionar en solucin acuosa con polianiones de
distinto tipo (heparina, alginato sdico, carboximetilquitina, poli(cido acrlico)...etc)
para formar complejos polielectrolticos
2

Figura 5.1: Estructura qumica del quitosano (CHI)

El quitosano ha sido empleado en numerosas aplicaciones biomdicas como
soporte para ingeniera tisular, suturas reabsorbibles, agente hipocolestirmico, sistemas
de liberacin controlada de frmacos, inmovilizacin de enzimas, agente cicatrizante,
etc
3-5
. Entre sus caractersticas ms importantes se encuentran su biodegradabilidad y
su alta biocompatibilidad dentro del organismo humano.

En este captulo se describe la sntesis y caracterizacin de PEC formados a base
de quitosano y copolmeros que incorporan AMPS en su estructura (poli(HEMA-co-
AMPS) y poli(DMAA-co-AMPS)), sintetizados en presencia del quitosano como
plantilla (template polymerization), o por mezcla de disoluciones acuosas de ambas
macromolculas. El primer mtodo de sntesis permite la formacin de hidrogeles con
OH
NHCOCH
3
o
CH
2
OH
OH
NH
2
o
CH
2
OH
O O
x x-y
gran capacidad de absorcin de agua (hinchamiento), que resultan muy apropiados para
su utilizacin como sistemas de liberacin controlada de frmacos macromoleculares,
frmacos que presenten interacciones especficas con la matriz polimrica o frmacos
poco solubles en agua. Esto se debe, adems de a su alto grado de hinchamiento, a su
gran cantidad de grupos funcionales, apropiados para interaccionar activamente con un
frmaco incorporado en su estructura. Las cinticas de liberacin de frmacos dependen
de numerosos parmetros adems de la geometra del dispositivo de liberacin. Es decir,
estn condicionadas por las propiedades de la matriz polimrica que forma el sistema
(geometra, peso molecular, cristalinidad y temperatura de transicin vtrea) y por las
propiedades del propio frmaco (concentracin inicial, interacciones frmaco-polmero,
presin osmtica y solubilidad del frmaco). La combinacin y control de todos estos
parmetros, permitir la obtencin de sistemas de liberacin controlada apropiados para
cada requerimiento. En este sentido, se han estudiado algunos de los PEC sintetizados
en presencia de quitosano como dispositivos de liberacin controlada de teofilina. La
teofilina es un broncodilatador potente que se utiliza en la fase inmediata del ataque
asmtico, con un ndice teraputico muy estrecho. Su posologa es complicada y
requiere una administracin muy particular. Una primera etapa de liberacin rpida
como tratamiento de choque, seguida de una segunda etapa lenta de mantenimiento de
los niveles de teofilina dentro del lmite teraputico. Los PEC ensayados presentaron
unos perfiles de liberacin de este frmaco muy prometedores.


144

2.1 Reactivos

El quitosano de bajo peso molecular (Mr 150000) de grado de acetilacin 19
% fue suministrado por Fluka. Antes de ser utilizado se purific hinchndolo en agua
destilada (1 % p/v) al que se le aadi unas gotas de cido actico glacial (Normasol,
99,5 % pureza) hasta llegar a un pH aproximado de 4. La solucin viscosa se filtra con
el fin de eliminar todo el residuo slido insoluble y el filtrado se precipita con una
solucin de hidrxido sdico al 40 %. El slido se asla por filtrado y posteriormente se
liofiliza durante 48 horas. Los monmeros y copolmeros empleados en la sntesis de
estos PEC han sido descritos en el Captulo 1 (Materiales y Mtodos).

2.2 Interaccin del quitosano con el monmero AMPS

En primer lugar, se estudiaron las interacciones entre el CHI y el monmero
AMPS (AMPSm). Para ello, se disolvieron diferentes proporciones de quitosano en
soluciones acuosas del monmero AMPS. Las mezclas de partida se nombrarn como
CHI-AMPSm (20:80), CHI-AMPSm (30:70), CHI-AMPSm (40:60) o CHI-AMPSm
(50:50), dependiendo de la composicin molar de las mezclas. stas se dejaron bajo
agitacin magntica durante el tiempo necesario para la completa disolucin del
polisacrido. Posteriormente se precipitaron en etanol, con el fin de eliminar el
monmero residual que no haya interaccionado con el quitosano, y el precipitado se
sec a vaci hasta peso constante. Por ltimo, se analizaron por FTIR (Perkin-Elmer
1720) y los espectros obtenidos se compararon unos con otros con el software del
equipo (OMNIC-4.1).

2.3 Sntesis de los complejos polielectrolpiticos

Las reacciones de polimerizacin en presencia de quitosano se llevaron a cabo
en agua destilada como disolvente, empleando persulfato amnico como iniciador, a 50
C. La concentracin global de monmeros fue 0,3 M y las fracciones molares en
alimentacin se encuentran especificadas en la Tabla 5.1. Los complejos se
denominaron DA50-Q, DA70-Q, DA90-Q y HA50-Q. HA70-Q, HA90-Q HA95-Q
dependiendo del tipo de sistema al que pertenezcan (DA: Sistema DMAA-AMPS; HA:
Sistema HEMA-AMPS) y de la composicin molar de DMAA o HEMA que incluyan.
La letra Q indica que los materiales contienen un 20% en peso de quitosano en
alimentacin (excepto el HA95-Q, que incluye un 25% en peso de quitosano).

El AMPS fue disuelto en el agua con el fin de obtener el pH cido necesario para
disolver el quitosano. Despus de la completa solubilizacin del quitosano, se aadi a
la mezcla de reaccin el segundo monmero y se burbuje nitrgeno durante 30
minutos. Posteriormente se aadi el iniciador y la disolucin se introdujo en una estufa
a 50 C, durante 24 horas. La disolucin homognea y viscosa, mezcla de los reactivos,
da lugar a un precipitado blanco y un sobrenadante mucho menos viscoso que la mezcla
de reaccin de partida. Ambas fases fueron aisladas, para su posterior anlisis. El
precipitado se lav con agua para eliminar el copolmero no injertado o no unido por
medio de enlaces inicos al quitosano.

2.4 Caracterizacin

Todas las muestras (tanto su fase precipitada como el sobrenadante) fueron
analizadas por RMN-
1
H (Varian 300) y FTIR (Perkin-Elmer 1720). Adems, los
precipitados se visualizaron mediante microscopa electrnica de barrido (SEM-
Philips).

2.5 Medidas de hinchamiento

Debido a la poca consistencia de los PEC sintetizados por este mtodo, las
medidas de hinchamiento se realizaron en el interior de unas cesta de malla metlica
para proteger el material. La capacidad de absorcin de agua con el tiempo de los
compuestos sintetizados se estudi en soluciones tampn a pH 2, 7,4 y 10, con una
fuerza inica 0,1 M a 37 C. Los resultados fueron expresados como:
100 %
0
0
=
P
P P
i

siendo P
i
el peso de la muestra hidratada a tiempo i y P
0
el peso de la muestra seca.


146
Adems se registraron los mximos de hinchamiento de los materiales en todo el
rango de pHs.

2.6 Liberacin de teofilina del sistema HA-Q

La prepararon pastillas de 100 mg PEC con 25 mg de teofilina, por mezcla
mecnica de ambos compuestos y compresin de la mezcla final (3 toneladas), para
obtener pastillas de 1 cm de dimetro y 110 0,07 m de espesor. La liberacin se llev
a cabo en tampn fosfato a pH 7,4. Las pastillas se introdujeron en botes cerrados con
20 ml del tampn, y todo ello, en el interior de una estufa a 37 C. A diferentes tiempos
se tomaron alcuotas de la solucin tampn (0,5ml) que se reemplazaron por tampn
fresco. Las muestras se almacenaron en un congelador a 20 C hasta su anlisis por
UV ( =350 nm)(espectrofotmetro UV-Visible, Perkin-Elmer).


Cuando el proceso de polimerizacin de los PEC tiene lugar en presencia del
quitosano (CHI), en primer lugar se producirn las interacciones CHI-monmero
aninico (apartado 3.1). Una vez iniciada la polimerizacin se producirn eventuales
reacciones de transferencia de los radicales polimricos en crecimiento a los grupos
funcionales de los ciclos que constituyen el CHI, incluyendo tanto a los grupos amino
como a los grupos OH presentes en su estructura
6
. Adems, algunos autores defienden
que el sistema de iniciacin redox (persulfato amnico), tambin producir reacciones
de transferencia a los ciclos de pirano del CHI
7
. Este tipo de reaccin de injerto se
produce con gran frecuencia entre polisacridos y monmeros vinlicos al utilizar
iniciacin radical va redox. El sistema iniciador ms empleado con este propsito son
las sales de cerio, con las que se ha conseguido injertar acrilonitrilo,
dimetilaminoetilmetacrilato, 2-hidroxietilmetacrilato, etilenglicol monometilacrilato,
acrilamida y vinil prirrolidona en el esqueleto polisacrido del quitosano
8
.

En la obtencin de los PEC obtenidos en presencia de quitosano sintetizados en
este captulo, se utiliz persulfato amnico como iniciador y por lo tanto, pueden sufrir
estas reacciones de injerto dando lugar a redes entrecruzadas. Si la estructura posee la
densidad de puntos de entrecruzamiento adecuada, se pueden llegar a formar estructuras
tridimensionales insolubles incluso cuando los grupos inicos no se encuentran
ionizados, tal y como ocurre en el sistema HA-Q. Las propiedades de este tipo de
complejos se vern condicionadas por la hidrofilia de los monmeros, la proporcin de
polmero plantilla, la cantidad de grupos ionizables y su capacidad para formar enlaces
inicos que creen puntos de entrecruzamiento fsico en la estructura.

3.1 Interacciones quitosano-monmero AMPS

Se han estudiado las interacciones que tienen lugar entre el quitosano y el
monmero AMPS (AMPSm) con el fin de determinar la formacin del complejo entre
ambas especies y en qu medida se forma. Se mezclaron soluciones acuosas de CHI y
AMPSm en diferentes proporciones. El monmero cido siempre se aadi en exceso,
con el propsito de disolver el polisacrido. Las mezclas CHI-AMPSm se precipitaron

148
en etanol, con el fin de aislar el complejo (el AMPSm es soluble en este disolvente).
As, el AMPSm que no interacciona con el CHI, permanecer en solucin, mientras que
el complejo precipita. ste se aisl por centrifugacin y se lav varias veces con etanol,
posteriormente se sec a vaci hasta peso constante. Su anlisis por FTIR (Figura 5.2)
confirma que se obtiene el mismo producto (99 % de correlacin entre unos compuestos
y otros), independientemente de la mezcla de reaccin, y que este precipitado est
formado por ambos compuestos. Ya que se distinguen bandas caractersticas del CHI
(3500-3300 vibracin NH-,OH-; 1651 cm
-1
amida I, 1577cm
-1
amida II, 1377 cm
-1
CH
2

y las bandas caractersticas de los polisacridos a 1153, 1030 y 1077 cm
-1
) y bandas
caractersticas del AMPS (3420-3490 cm
-1
vibraciones NH- y OH-, 1647 cm
-1
amida I,
1522 cm
-1
amida II y 1393 cm
-1
CH
2
, las bandas debidas a los grupos sulfnicos se
observan entre 1224-1153 cm
-1
). Adems, se observa el desplazamiento y cambio de
intensidad de algunas de las bandas, especialmente en la regin donde aparecen los
grupos sulfnicos (que se desplazan a mayores frecuencias y cambian de intensidad).
Adems, el hombro ancho que aparece a 2500 cm
-1
se puede atribuir a la formacin de
grupos NH
3
+
. Todo esto sugiere que tiene lugar la interaccin inica de ambas especies
y por tanto, el CHI actuar como plantilla de la polimerizacin, dando lugar a una
polimerizacin dirigida.

Figura 5.2: Espectros de FTIR del complejo CHI-monmero AMPS obtenidos por
mezcla de soluciones acuosas de ambos compuestos.

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

cm
-1
CHI-AMPSm
(20:80)
CHI-AMPSm
(30:70)
CHI-AMPSm
(40:60)
CHI-AMPSm
(50:50)
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

cm
-1
CHI-AMPSm
(20:80)
CHI-AMPSm
(30:70)
CHI-AMPSm
(40:60)
CHI-AMPSm
(50:50)
3.2 Caracterizacin de los PEC

Las dos fases que se obtuvieron tras la polimerizacin de los copolmeros en
presencia de quitosano se analizaron por separado. Los espectros de RMN-
1
H
demostraron que tanto el sobrenadante, como el precipitado (PEC) tenan el mismo
contenido en monmeros, y que nicamente el precipitado presentaba quitosano en su
estructura. Esto indica, que la reactividad relativa del los monmeros no se ve afectada
por la presencia del quitosano, aunque s podra afectar a la velocidad de
polimerizacin.

La Tabla 5.1 muestra la composicin de los PEC obtenida mediante RMN-
1
H.
En ella se muestran las composiciones tanto en alimentacin como en el complejo
despus de la polimerizacin, aislamiento y purificacin del material. Con el fin de
comprender el comportamiento de los sistemas, se debe comparar la proporcin de
grupos sulfnicos (AMPS) y grupos amino libres (CHI, se ha de tener en cuenta el
grado de desacetilacin de la molcula). De esta forma se puede tener una idea de las
interacciones inicas que puedan tener lugar entre ambas macromolculas. Del mismo
modo, estas interacciones darn gran informacin acerca del comportamiento de los
sistemas en medios acuosos tamponados.

Tabla 5.1: Composicin molar de los PEC sintetizados por template determinada por
RMN-
1
H.

La Figura 5.3, muestra el espectro infrarrojo del complejo HA70-Q, de los
homopolmeros PHEMA y PAMPS, adems del espectro del CHI. Se observan bandas
caractersticas de todos los componentes del sistema y adems, se observa el
desplazamiento de algunas de estas bandas como resultado de la interaccin entre
grupos funcionales.

150

Figura 5.3: Espectros de FTIR del PEC HA70-Q, del copolmero HA70, de sus
correspondientes homopolmeros (PHEMA y PAMPS) y del quitosano (CHI).

Figura 5.4: Imgenes de SEM de los complejos sintetizados por template a diferentes
aumentos. Debe tenerse en cuenta que las fotografas han sido tomadas a diferentes aumentos.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
HA70-Q
HA70
PAMPS
CHI
PHEMA
(cm
-1
)
DA50-Q 29 m DA70-Q 43 m
DA90-Q 60 m
HA70-Q
200 m
DA50-Q 29 m DA70-Q 43 m
DA90-Q 60 m
HA70-Q
200 m
Los materiales obtenidos por este mtodo forman redes tridimensionales cuyo
tamao de poro viene gobernado por su capacidad de absorcin de agua. Fueron
visualizados por microscopa electrnica de barrido (SEM). En la Figura 5.4 se
muestra el aspecto de algunos de estos compuestos. Los complejos del sistema DA-Q,
son muy diferentes unos de otros: DA50-Q forma lminas desordenadas, DA70-Q
forma una estructura ms organizada en forma de celdas alargadas y DA90-Q forma una
red fina tipo maraa. Sin embargo el sistema HA-Q forma estructuras muy similares,
parecidas a la estructura del HA70-Q, similar a su vez a la del DA70-Q (ntese la
distinta magnificacin de las imgenes).

3.3 Estudio del hinchamiento de los complejos obtenidos con plantilla

La disolucin de un polmero soluble se produce mediante una primera etapa de
difusin del disolvente en el interior de la masa del polmero hinchndolo, hasta lograr
la separacin de las cadenas y su incorporacin en la disolucin. Cuando un polmero
no es soluble, nicamente se produce la etapa de hinchamiento. Este proceso est
directamente relacionado con el carcter hidroflico del polmero. En este apartado se
han estudiado los procesos de hinchamiento y disolucin de los PEC sintetizados con
plantilla (template polymerization), con el fin de comprender los parmetros que
gobiernan el comportamiento de estos materiales en soluciones acuosas tamponadas a
distinto pH y de esta forma, elegir los complejos apropiados para la liberacin
controlada de teofilina.

El sistema HA-Q da lugar a hidrogeles con gran capacidad de absorcin de agua
que mantienen su estructura a lo largo de todo el experimento (excepto la formulacin
HA50-Q). En la Figura 5.5 se muestran la variacin del grado de hinchamiento de los
materiales con el tiempo. En ella se observa un primer periodo de difusin rpido (entre
1 y 2 horas dependiendo del material) hasta que se alcanza el equilibrio. De las cuatro
formulaciones sintetizadas, slo tres permanecen estables a lo largo de todo el ensayo (2
meses) puesto que HA50-Q comienza a perder peso a las pocas horas de empezar el
anlisis. HA50-Q es el PEC con mayor AMPS en su estructura y por tanto, el que
presenta mayor cantidad de grupos inicos (ms hidroflico). La entrada masiva de
molculas de agua en su estructura dbilmente entrecruzada, provoca que el PEC no
soporte su propio peso y termine disolvindose
9
.

152

Figura 5.5: Variacin del grado de hinchamiento con el tiempo de () HA50-Q, () HA70-Q,
()HA90-Q y ()HA95-Q en midio acuoso tamponado a pH 2 y 37 C, a tiempos cortos de
anlisis.

El hinchamiento de estos sistemas est directamente relacionado con la cantidad
de grupos inicos presentes en su estructura, as como el grado de ionizacin de los
mismos. Por lo tanto, a la hora de interpretar el comportamiento de los sistemas con el
pH, se han de tener muy presentes tanto la composicin molar de cada uno de los
componentes, como el pK
a
de cada una de las especies inicas. El AMPS presenta
grupos sulfnicos en su estructura, cuyo grado de ionizacin puede considerarse igual a
la unidad
9
. El quitosano presenta grupos amino libres en su estructura y un pK
a

CHI
=
6,3. Si observamos la Figura 5.6 en la que se representa la variacin del mximo de
hinchamiento en el rango de pH entre 2 y 12, para el PEC HA70-Q, observamos que el
mximo de hinchamiento est gobernado por el grado de ionizacin del CHI. Es decir, a
pHs en los que el CHI est ionizado o parcialmente ionizado (pH <pKa (6,3)), se
forman enlaces inicos que entrecruzan la red con mayor efectividad y disminuyen la
hidrofilia, haciendo ms difcil la entrada de agua en la estructura tridimensional
(disminuyendo el hinchamiento). Sin embargo, a pH > pK
a
(6,3) el mximo de
hinchamiento permanece prcticamente constante. A pesar de no existir enlaces inicos
entre las macromolculas, la estructura tridimensional se mantiene. Esto se debe a los
puntos de entrecruzamiento creados en las reacciones de transferencia, comentadas
anteriormente en el apartado 3.1.

Hinchamiento HA-Q pH=2
0
200
400
600
800
0 2 4 6 8
Tiempo (h)
%
% ha50 %ha70
%ha90 %ha95

Figura 5.6: Variacin del mximo de hinchamiento con el pH, del PEC HA70-Q.

En la Figura 5.7 se muestran los mximos de hinchamiento de los complejos
polielectrolticos registrados a pH 2, 7,4 y 10. El asterisco indica que el PEC se disuelve
a lo largo del experimento. Por lo tanto, los datos de hinchamiento de HA50-Q no son
significativos y en definitiva no son comparables con las dems formulaciones.

Como puede observarse en el diagrama de barras, el comportamiento de los PEC
a pH > pK
a CHI
(6,3) es muy similar, y el hinchamiento aumenta al aumentar la
proporcin en AMPS (ya que es la nica especie ionizada en este pH).

Sin embrago, a pH < pK
a CHI
(6,3) el perfil de absorcin de agua es muy
diferente. La capacidad de hinchamiento est gobernada por la densidad de puntos de
entrecruzamiento por enlace inico, y por tanto, por la proporcin de grupos sulfonato y
grupos amino libres ionizado que puedan interaccionar. HA70-Q contiene mayor
cantidad de AMPS que CHI en su estructura. A pH =2, una vez ionizados los grupos
amino y formados los enlaces inicos, quedarn menos grupos sulfnico sin
interaccionar que a pHs 7,4 y 10 y en consecuencia, la estructura entrecruzada tendr
menor capacidad de absorcin de agua.

En la Tabla 5.1, se observa que HA90-Q contiene una cantidad similar de
grupos inicos complementarios (9 % AMPS y 12,15 % grupos amino libres o anillos
desacetilados de CHI). Esto implica un mayor nmero de enlaces inicos en la
800
840
880
920
960
1000
0 2 4 6 8 10 12 14
pH
%

h
i
n
c
h
a
m
i
e
n
t
o
HA70-Q

154
estructura y una menor proporcin de grupos inicos libres y en definitiva un menor
hinchamiento a este pH.

Figura 5.7: Mximos de hinchamiento del los PEC HA-Q.

HA95-Q es el PEC con mayor cantidad de grupos amino libres (13,77 % grupos
amino libres, frente a un 3% de AMPS en la estructura). Una vez formados los enlaces
inicos, quedarn grupos amino ionizados sin interaccionar que contribuyen a aumentar
la hidrofilia del material a este pH. En estas condiciones el PEC presentar una carga
global positiva, mientras que HA70-Q la presenta negativa.

Los complejos polielectrolticos DA-Q forman tambin estructuras
tridimensionales dbilmente entrecruzadas que absorben grandes cantidades de agua en
su estructura, pero tal y como se ha descrito en otras ocasiones
9
, la gran hidrofilia de la
DMAA provoca la entrada masiva de agua al sistema que estos materiales dbilmente
entrecruzados no pueden soportar su propia masa y terminan por disolverse. Su
comportamiento el medios acuosos tamponados pueden resumirse como una primera
etapa de difusin de agua en la estructura (1-2 horas), un pseudoequilibrio y una ltima
etapa de disolucin que en algunos casos, slo se observa a tiempos de anlisis largos
(Figura 5.8). La etapa de pseudoequilibrio y la de disolucin dependen tanto de la
composicin e hidrofilia del material como del pH del medio tamponado.

0
400
800
1200
1600
2000
pH=2 pH=7.4 pH=10
%

h
i
n
c
h
a
m
i
e
n
t
o
HA50-Q HA70-Q HA90-Q HA95-Q
*
*
*
0
400
800
1200
1600
2000
pH=2 pH=7.4 pH=10
%

h
i
n
c
h
a
m
i
e
n
t
o
HA50-Q HA70-Q HA90-Q HA95-Q
*
*
*

Figura 5.8: Representacin grfica del estudio gravimtrico de absorcin de agua de los PEC
DA50-Q (), DA70-Q () y DA90-Q () en medio acuoso tamponado a pH 10 y 37 C a
tiempos cortos (izquierda) y tiempos largos de anlisis (derecha).

Las diferencias observadas en el comportamiento de ambos sistemas podra estar
relacionadas con la menor hidrofilia del monmero HEMA.

3.4 Liberacin de teofilina

La teofilina (Figura 5.9) es una metilxantina empleada en el tratamiento de la
fase inmediata del ataque asmtico y su efecto principal es la dilatacin de los
bronquios. La estrechez de los mrgenes entre la dosis teraputica y de seguridad, el
problema de interaccin con otros frmacos y la posibilidad de efectos a largo plazo
sobre el sistema nervioso central han provocado la intranquilidad de muchos autores
que han sugerido que este frmaco no debera ser el principal en el tratamiento del
asma. No obstante, las preparaciones de liberacin sostenida pueden ser provechosas
para tratar el asma nocturna
10
. Debido a las grandes variaciones interindividuales en la
eliminacin de la teofilina, el ajuste de la dosis debe ser individualizado y establecido
por el mdico. En el tratamiento de las crisis asmticas severas se recomienda el uso de
la va intravenosa. En las crisis leves o moderadas pueden ser tiles las teofilinas orales
de liberacin rpida. En estos casos, se recomiendan tratar al paciente con una dosis de
ataque de 5-6 mg/kg y posteriormente ajustar la posologa segn la tolerancia que
presente el individuo al frmaco
11
. Por lo tanto, es importante disponer de dispositivos
de dosificacin controlada que proporcionen este tipo de perfil de liberacin, es decir,
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
0 10 20 30 40 50 60
Tiempo (horas)
%
DA50-Q DA70-Q DA90-Q
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
0 250 500 750 1000
Tiempo (horas)
%
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
0 10 20 30 40 50 60
Tiempo (horas)
%
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
0 250 500 750 1000
Tiempo (horas)
%

156
una primera etapa de liberacin rpida, seguida de una etapa de liberacin lenta o
mantenimiento durante periodos ms largos de tiempo.

Figura 5.9: Estructura qumica de la teofilina

Los hidrogeles que absorben grandes cantidades de agua son especialmente
indicados en el caso de frmacos poco solubles en agua, frmacos que presenten
interacciones especficas o macromolculas. Nuestros PEC HA-Q pertenecen a este tipo
de hidrogeles y se utilizaron con el fin de conseguir matrices de liberacin controlada de
teofilina. La teofilina, es una molcula bsica que presenta un pK
a
=8,77 y un pK
b
=
13,5-11,5. Es soluble en agua caliente, en solucin alcalina y solucin cida e insoluble
en disolvente orgnicos. La liberacin del frmaco se monitoriz por espectroscopia UV
y se consiguieron los perfiles de liberacin que aparecen representados en la Figura
5.10.

Figura 5.10: Liberacin controlada de teofolina de los PEC () HA70-Q, () HA90-Q
y () HA95-Q, en tampn fosfato 0,1 M, pH 7,4 y fuerza inica 0,1 M, a 37 C.

0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60 80 100
Tiempo (horas)
L
i
b
e
r
a
c
i
n

(
%
)
HA70-Q HA90-Q HA95-Q
N
N
O
O
N
N
H
3
C
CH
3
H
Los perfiles de liberacin obtenidos para estos tres materiales son muy
interesante para la liberacin sostenida de la teofilina. En los tres casos se produce
una primera etapa de liberacin rpida que coincide con la etapa de difusin de
agua en la matriz macromolecular (Figura 5.5) y una segunda etapa de liberacin
ms lenta que se mantiene durante das. La cintica de liberacin est estrechamente
relacionada con el proceso de absorcin de agua de la matriz polimrica y con la
naturaleza cida o bsica de la misma. Si nicamente influyese el hinchamiento del
sistema, se obtendra una velocidad de liberacin que variara en este sentido
HA70-Q > HA90-Q > HA95-Q. Sin embargo, las interacciones especficas
polmero-frmaco juegan un papel importante en el proceso de liberacin. La
teofilina (bsica) interacciona en mayor medida con aquellos PEC que incorporan
mayor proporcin de molculas cidas (AMPS). As se obtiene que el perfil de
liberacin ms rpido es el de HA95-Q (con menor proporcin de AMPS y mayor
de CHI).

En definitiva, en el proceso de liberacin sostenida de teofilina de las
matrices polimricas intervienen dos caractersticas de las molculas
conjuntamente: su capacidad de absorcin de agua (hinchamiento) y la basicidad o
acidez de la matriz polimrica. La combinacin apropiada de monmeros y CHI
podra dar lugar a numerosos perfiles de liberacin diferentes, apropiados para el
tratamiento de este tipo de enfermedades respiratorias.

158

4 BIBLIOGRAFA

1)Tsuchida E., Abe K. Interactions Between Macromolecules in Solution ans
Intermolecular Complexes; Springer-Verlang: Berlin, 1982.
2)Dutkiewicz J ., Tuora M. ; Brine J ., S.-B. G., Anthonsen T., Sandford P., Ed.;
Elsevier: New York, 1992, pp 496.
3)Singh D., Ray A. R. J.M.S.- Rev Macromol Chem Phys 2000, C40 (1), 69-83.
4)Gupta K.C., Ravi Kumar M. N. V. J.M.S.-Rev Macromol Chem Phys 2000, C40
(4), 273-308.
5)Ravi Kumar M.N.V. Chitin and chitosan drug delivery systems homepage, 2001;
Vol. 2001.
6)Peniche C., Elvira C., San Romn J . Polymer 1998, 39 (25), 6549-6554.
7)Abduel Majid K., Wan Md Zin Wuang Y., Mansor B. Ahmad Journal of Applied
Polymer Science 2000, 77, 2314-2318.
8)Brown C., Hoffman A. S. Modification of natural polymers: chitosan, 2001, pp
565-574.
9)Tong Z., Liu X. Macromolecules 1994, 27, 844-848.
10)Rang H.P., Dale M. M. Farmacologa; Alhambra Longman: Madrid, 1992.
11)Vademecum Internacional; 42th ed.; Medicom S.A.: Madrid, 2001.

CAPTULO 6

BIOCOMPATIBILIDAD in vitro DE LOS
COMPLEJOS POLIELECTROLTICOS
OBTENIDOS CON PLANTILLA

Captulo 6: Estudio de biocompatibilidad in vitro de los PEC.

160
CAPTULO 6: BIOCOMPATIBILIDAD IN VITRO DE LOS
COMPLEJOS POLIELECTROLTICOS OBTENIDOS CON
PLANTILLA

1 INTRODUCCIN.................................................................................................161
2 MATERIALES Y MTODOS..............................................................................164
2.1 Cultivo celular in vitro.................................................................................. 164
2.2 Tests de citotoxicidad................................................................................... 166
2.2.1 Medio de elucin.................................................................................. 166
2.2.2 Ensayo MTT......................................................................................... 167
2.2.3 Ensayo Alamar Blue............................................................................. 167
2.2.4 Ensayo Neutral Red.............................................................................. 168
2.3 Microscopa.................................................................................................. 168
2.3.1 Microscopa ptica............................................................................... 168
2.3.2 Microscopa confocal: Ensayo Vida/Muerte........................................ 169
3 RESULTADOS Y DISCUSIN...........................................................................170
3.1 Sistema HA-Q.............................................................................................. 170
3.2 Sistema DA-Q.............................................................................................. 171
3.3 Microscopa confocal: Ensayo Vida/Muerte................................................ 174
4 BIBLIOGRAFA...................................................................................................176

Captulo 6: Estudio de biocompatibilidad in vitro de los PEC. 161
1 INTRODUCCIN

Tal y como se describi en la introduccin, un biomaterial se define como
cualquier material, natural o sinttico, utilizado para la fabricacin de dispositivos
biomdicos destinados a interaccionar con un medio biolgico, para mejorar o
reemplazar las funciones de los tejidos vivos
1
. El requisito fundamental para que un
biomaterial pueda ser utilizado con fines biomdicos es que pueda coexistir con el
organismo humano sin que desencadene un efecto inapropiado o no deseado, es decir
debe ser biocompatible. Se puede decir que un material es biocompatible si resulta
inerte o presenta una interaccin apropiada y positiva con el medio fisiolgico. La
evaluacin de la biocompatibilidad de un biomaterial, generalmente se refiere a la
determinacin de las interacciones biolgicas que tienen lugar entre un dispositivo
biomdico y el entorno vivo. stas deben determinarse mediante la magnitud y duracin
de las alteraciones en los mecanismos homeostticos. Por lo general, un biomaterial
debe ser no-txico, no-carcinognico, no-trombognico, debe tener unas propiedades
mecnicas apropiadas para su aplicacin, no debe causar reaccin inmunolgica y si
degrada, los nuevos productos formados deben ser a su vez no-txicos. La norma ISO
10993
2
recoge todas las especificaciones a tener en cuenta y los ensayos que deben
realizarse durante el diseo de un nuevo dispositivo biomdico.

La interaccin de la superficie de un biomaterial con la sangre es el primer
evento que tendr lugar tras su implantacin, siendo la adhesin de las protenas
plasmticas el paso ms rpido despus de la adsorcin de agua e iones inorgnicos
3
.
La adsorcin de protenas influye en las interacciones celulares con la superficie del
material, es decir, determinadas clulas pueden no adherirse a la superficie de un
material, pero pueden llegar a hacerlo si existen ciertas protenas sobre su superficie.
Por lo tanto, las protenas adsorbidas mediarn la adhesin celular al biomaterial. Debe
tenerse en cuenta que no slo el tipo y la cantidad de protenas adsorbidas determinan la
actividad biolgica de un dispositivo, sino tambin la organizacin y conformacin de
las mismas. Por lo tanto, la adsorcin de protenas en la superficie de un biomaterial
puede ser la clave para mejorar o disear un biomaterial biocompatible
4
.


162

La actividad celular local en el lugar donde se coloca un implante juega un papel
principal en el destino y funcionalidad del biomaterial y en la recuperacin y
cicatrizacin del tejido que lo rodea. Los cultivos celulares proporcionan un modelo de
investigacin de las interacciones entre clulas y el medio que las rodea, por ejemplo, su
respuesta a factores de estimulacin y el contacto con un biomaterial. Todos los
materiales con posible aplicacin clnica deberan someterse a un riguroso screening
in vitro de toxicidad y biocompatibilidad. Estos ensayos poseen ciertas ventajas sobre la
experimentacin in vivo, ya que permiten el estudio detallado de un tipo particular de
clulas sin la complejidad asociada a los modelos in vivo y deberan utilizarse como
estudio preliminar antes de recurrir a un modelo animal. Los cultivos celulares, con un
nmero limitado de variables, permiten la directa observacin de las interacciones
clula-biomaterial. Adems, el microentorno de los sistemas de cultivo puede ser
diseado, modificado y mantenido para estudiar el efecto de distintas variables en
condiciones controladas.

La biocompatibilidad de un hidrogel est directamente relacionada con su
capacidad de absorcin de gran cantidad de agua. Su permeabilidad al agua, iones y
pequeas molculas permiten el paso de nutrientes, metabolitos y productos de desecho
de los tejidos circundantes. Adems, su suave consistencia reduce la irritacin del tejido
receptor por efectos mecnicos o de friccin. El alto grado de hidratacin alcanzado por
estos materiales proporciona una tensin interfacial polmero-tejido muy baja o nula,
reduciendo la adhesin proteica y celular a un mnimo. Adems, los microdominios
hidroflicos-hidrofbicos influirn en las caractersticas de las protenas adsorbidas y
por tanto en la adsorcin celular, favorecindola o impidindola. Dependiendo de la
aplicacin del biomaterial buscaremos uno u otro efecto.

Las buena biocompatibilidad que suelen presentar los hidrogeles ha hecho que
estos materiales se hayan utilizado en casi todos los campos de aplicacin mdica:
recubrimientos (suturas, catteres, sensores...), dispositivos de liberacin controlada de
frmaco (antibiticos, anticoagulantes, anticuerpos, enzimas, anticonceptivos...) o como
materiales homogneos (lentes de contacto, corneas artificiales, dentaduras...)
5,6


El objetivo de este captulo fue evaluar la citotoxicidad de algunos de los
materiales sintetizados en el Captulo 5: los complejos polieletrolticos (PEC) HA-Q y
DA-Q, sintetizados por copolimerizacin de los monmeros correspondientes en
presencia de quitosano. Su alto grado de hinchamiento y porosidad, les proporcionan
buenas caractersticas para ser utilizados como dispositivos de liberacin controlada de
frmaco, ya que las clulas no se adhieren en su superficie.


164

La biocompatibilidad de los materiales HA-Q (HA70-Q, HA-90-Q y HA95-Q)
se test sobre los materiales tal y como se obtuvieron (Captulo 5: Materiales y
Mtodos). Para ello se hicieron pastillas por compresin, de 1cm de dimetro y
aproximadamente 100 m de espesor. Sin embargo, la mayor hidrofilia y menor
consistencia de los PEC DA-Q (DA50-Q, DA70-Q y DA90-Q) hizo imposible su
manipulacin para este tipo de ensayos, ya que las pastillas terminaban por disgregarse
a lo largo de los experimentos. Por ello, el sistema DA-Q fue entrecruzado con vapor de
glutaraldehdo durante distintos tiempos de reaccin (24 horas, 48 horas y 5 das), la
nomenclatura que tomaremos a continuacin se detalla en la Tabla 1.

Tiempo reaccin DA50-Q DA70-Q DA90-Q
No entrecruzado DA50-Q DA70-Q DA90-Q
24 horas DA50-Q-24glut DA70-Q-24glut DA90-Q-24glut
48 horas DA50-Q-48glut DA70-Q-48glut DA90-Q-48glut
5 das DA50-Q-5glut DA70-Q-5glut DA90-Q-5glut

Tabla 7.1: Nomenclatura de los materiales del sistema DA-Q entrecruzados y no entrecruzados.

El medio de cultivo, los aditivos y los discos de Thermanox (TMX) y
policloruro de vinilo (PVC) fueron suministrados por Life Technologies, y todo el
material de plstico para el cultivo por Becton-Dockinson. La tripsina, el tampn
fosfato (PBS), el ascorbato y el MTT los administr Sigma. Los dems reactivos fueron
obtenidos de Merck. Todas las muestras fueron esterilizadas mediante irradiacin
gamma, utilizando una dosis de 2,5 Mrad (Swann Morton, UK) siguiendo estrictamente
los mtodos estndar para dispositivos mdicos.

2.1 Cultivo celular in vitro

En primer lugar se obtuvieron cultivos primarios de clulas osteoblsticas
(HOB) mediante su aislamiento de cabezas de fmur de pacientes sometidos a una
artroplastia de cadera siguiendo el protocolo de trabajo descrito por Di Silvio en 1995
7
,
las clulas se cultivaron a 37C y atmsfera de CO
2
al 5%.

Figura 7.1: Pasos para obtener un cultivo celular primario de clulas osteoblsticas (HOB) a
partir de una cabeza de fmur.


166
El medio de cultivo fue Dubelcos Modified Eagles Mdium (DMEM),
complementado con un 10% de suero fetal bovino (FCS), un 1% de aminocidos no
esenciales (NEAA), 0,02M de tampn cido [4-(2-(hidroxietil)-1-piperazinetano-
sulfnico] (HEPES), L-Glutamina 2 mM, 100 unidades ml
-1
de penicilina y 100 g ml
-1
estreptomicina y 150 g ml
-1
de ascorbato. El medio de cultivo se cambi cada tres das.
Cuando los frascos alcanzaron la confluencia, las clulas se digerieron utilizando
tripsina (Sigma) al 0,02% en PBS y HEPES 0,02 M. La suspensin de clulas se
centrfugo a 2000 rpm durante 5 minutos y el precipitado se resuspendi en medio de
cultivo utilizando una jeringuilla para romper los agregados. La viabilidad de las clulas
se observ mediante su tincin con Tripan Blue y la densidad celular se calcul
mediante un hematocitmetro. La suspensin original de clulas se diluy hasta la
densidad deseada y se homogeneiz con la ayuda de una pipeta Pasteur antes de
sembrarlas sobre los materiales.

2.2 Tests de citotoxicidad

Se realizaron mtodos tanto directos, como indirectos, para determinar la
citotoxicidad de los materiales. En los mtodos indirectos, la citotoxicidad se mide tras
exponer a las clulas a los extractos acuosos de los materiales obtenidos a distintos
tiempos de elucin. Los ensayos indirectos se basan en la medida de la accin de
enzimas mitocondriales sobre sales de tetrazolio (MTT), la accin redox de clulas en el
medio de cultivo (Alamar Blue) y el uso de tintes de viabilidad (Neutral Red). En los
ensayos directos, las clulas se ponen en contacto directo con los materiales y despus
de diferentes tiempos se tratan con tintes fluorescentes capaces de diferenciar las clulas
vivas de las muertas.

2.2.1 Medio de elucin

Se obtuvieron extractos acuosos tanto de los materiales ensayados, como de los
controles (Thermanox: control negativo; PVC: control positivo). Se introdujeron las
muestras (110 mg) en tubos Falcon con 20 ml de medio de cultivo sin ascorbato (este
reactivo interfiere con el ensayo MTT). Los tubos colocaron en un rotor a 37C y el
medio se recopil al cabo de diferentes tiempos (4 horas, 24 horas, 48 horas y 7 das).
Los extractos obtenidos se almacenaron a 20C hasta su anlisis. Todo el protocolo de
trabajo se realiz bajo condiciones estriles.

2.2.2 Ensayo MTT

El ensayo MTT mide la accin de las deshidrogenasas mitocondriales de las
clulas vivas sobre la sal de tetrazolio: bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-
difeniltetrazolio (MTT)
8
. La sal es transformada por las enzimas en cristales azules
insolubles, que absorben a 570 nm. Las enzimas que realizan esta accin slo se
encuentran en clulas vivas, y el color azul producido es proporcional al nmero de
clulas vivas presentes
9
. Este ensayo fue elegido por su gran sensibilidad
10
.

Se sembraron clulas HOB en microplacas estriles de 96 pocillos en una
densidad de 110
4
clulas/pocillo en medio de cultivo completo hasta que alcanzaron la
confluencia. En este momento el medio se reemplaz por el correspondiente extracto
(100l/pocillo). Las placas se colocaron en una incubadora a 37C, aire humidificado y
atmsfera de CO
2
al 5%. Al cabo de 24 horas, se aadi una solucin de MTT en PBS a
37C a cada pocillo para dar una concentracin final de 0,5mg/ml y las placas se
volvieron a meter en la incubadora durante 4 horas. Despus, se desecha el exceso de
medio de cultivo y MTT y se aaden 100 l de dimetilsulfxido (DMSO) a cada
pocillo, con el fin de disolver los cristales formados. Las microplacas se agitan durante
10 minutos para asegurarnos que los cristales se disuelven en el DMSO y se midi la
absorbancia a 570 nm, con una longitud de onda de referencia de 630 nm, en un lector
de microplacas Dynatech MR700. Para evaluar el efecto citotxico de los extractos de
los materiales, los resultados fueron normalizados respecto al control negativo (TMX =
100 %) y se realizaron test estadsticos de ANOVA (p<0,05).

2.2.3 Ensayo Alamar Blue

El Alamar Blue es un indicador redox que responde a la reduccin u oxidacin
del medio
11,12
. En este ensayo se produce fluorescencia y cambio de color en respuesta
a la reduccin qumica del medio de cultivo por la accin del crecimiento y divisin
celular
13
.

168

Al igual que en el ensayo MTT, se sembraron clulas HOB en microplacas
estriles de 96 pocillos en una densidad de 110
4
clulas/pocillo en medio de cultivo
completo hasta que alcanzaron la confluencia. En este momento el medio se reemplaz
por el correspondiente extracto (100l/pocillo). Al cabo de 24 horas de incubacin, se
reemplaz el extracto por 100 l de una disolucin de Alamar Blue (Alamar Blue
(Bioscource) al 10% en medio DMEM sin phenol red). Pasadas tres horas de
incubacin, la fluorescencia creada se midi en un fluormetro Fluoroskan, empleando
una longitud de onda de excitacin de 510 nm y una longitud de onda de emisin de
590nm. Para determinar el efecto de los extractos de los materiales sobre las HOB, los
resultados fueron normalizados respecto al control negativo (TMX =100 %) y se
realizaron test estadsticos de ANOVA (p<0,05) respecto al mismo (TMX).

2.2.4 Ensayo Neutral Red

El ensayo Neutral Red (NR) mide la actividad lisosomal de las clulas y est
basado en la determinacin espestroscpica del hidrocloruro de 3-amino-m-
dimetilamino-2-metilfenazina (NR) almacenado por en los lisosomas de clulas
viables
10,14,15
. Como en los dos casos anteriores, los resultados fueron normalizados
respecto al control negativo (TMX = 100 %) y se realizaron test estadsticos de
ANOVA (p<0,05) respecto al mismo (TMX), con el fin de evaluar la respuesta celular.

2.3 Microscopa

2.3.1 Microscopa ptica

En los ensayos indirectos, la morfologa de las clulas expuestas a los extractos
de los materiales, fue observada cada da para detectar los efectos citotxicos de los
mismos. Durante el ensayo directo(Vida/Muerte), se examin regularmente la
morfologa de las clulas HOB sobre TMX (control negativo) mediante un microscopio
ptico, con el fin de monitorizar cualquier cambio o anomala en los cultivos.

2.3.2 Microscopa confocal: Ensayo Vida/Muerte

Se utiliz una combinacin de calcein AM, un tinte no fluorescente que es
transformado por las clulas vivas en calcein fluorescente, y ethidium homodimer-
1, tinte que pasa a travs de las membranas daadas para unirse al ADN
16
, para
determinar la viabilidad de las clulas HOB sembradas en contacto directo con los
materiales.

Las clulas HOB se sembraron en micromasa sobre los materiales secos o
previamente hinchados en una densidad de 1,510
5
clulas ml
-1
durante 24 horas. El
medio de cultivo se reemplaz por una disolucin (100 l) de 1g ml
-1
de los dos tintes
anteriormente mencionados. Despus de una hora de incubacin, las muestras se
visualizaron en un microscopio confocal (Nikon).


170

3.1 Sistema HA-Q

Los resultados obtenidos mediante el ensayo MTT sugieren que los extractos
liberados al medio por el sistema HA-Q a las 4 horas de poner el material en contacto
con el medio, ejercen un efecto perjudicial sobre la actividad mitocondrial de las
clulas. Sin embargo, se recuperan niveles normales o incluso superiores de actividad
mitocondrial con las alcuotas de 24 horas, 48 horas y 7 das de los materiales en
contacto con el medio de cultivo (Fig 7.2).

Figura 7.2: Resultados del ensayo MTT del sistema HA-Q y de los controles negativo (TMX) y
positivo (PVC). Los resultados son la media desviacin estndar (DS), para n=8.

Los ensayos Alamar Blue y Neutral Red no detectan cambios en el
metabolismo celular y actividad lisosomal de una poblacin de HOB expuesta a
alcuotas eluidas de los materiales HA-Q, respectivamente.

Por lo tanto, se pueden sacar conclusiones similares de los tres ensayos
indirectos que monitorizan diferentes aspectos de la actividad celular. Todos los
extractos txicos (monmero residual, cadenas de bajo peso molecular...) se liberan
durante las primeras 4 horas del ensayo de elucin y las clulas recuperan niveles
normales en las siguientes horas. La informacin obtenida por los tres experimentos
confirma los mismos resultados. Sin embargo, la mayor sensibilidad de el ensayo
MTT HA-Q
0
30
60
90
120
150
TMX PVC HA70-Q HA90-Q HA95-Q
%
4h 24h 48h 7d
MTT
10
hace que sea el nico en detectar el efecto negativo de los productos liberados
por los materiales.

Figura 7.3: Resultados del ensayo AB para el sistema HA-Q y de los controles negativo
(TMX) y positivo (PVC). Los resultados son la media desviacin estndar (SD), para n =8.

3.2 Sistema DA-Q

El sistema DA-Q fue entrecruzado utilizando para ello vapor de glutaraldehdo
durante diferentes tiempos de reaccin, obteniendo los materiales detallados en la Tabla
7.1.

Figura 7.4: Esquema de la estructura en equilibrio del glutaraldehdo en solucin acuosa.

El glutaraldehdo es un reactivo muy utilizado en el campo de la medicina, que
ha sido ampliamente utilizado como agente de entrecruzamiento para la preparacin de
prtesis y para el entrecruzamiento de protenas y polisacridos en el diseo de
dispositivos de liberacin controlada de frmacos.
17
.
H
2
C
CH
2
CH
2
C C
O
H H
O
H
2
C
CH
2
CH
2
CH CH
O OH HO
H
2
C
CH
2
CH
2
CH CH
O
O
HO
n
H
2
C
CH
2
CH
2
C C
O
H H
O
H
2
C
CH
2
CH
2
CH CH
O OH HO
H
2
C
CH
2
CH
2
CH CH
O
O
HO
n
Alamar Blue HA-Q
0
20
40
60
80
100
120
140
TMX PVC HA70-Q HA90-Q HA95-Q
%
4h 24h 48h 7d

172

Figura 7.5: Esquema de la reaccin del glutaraldedo con aminas primarias.

La ventaja del glutaraldehdo frente a otros es que reacciona rpidamente y es
capaz de extenderse distintas distancias entre molculas, ya que una solucin acuosa de
glutaraldehdo est formada por una mezcla de especies en equilibrio (aldehdo libre,
hemiacetales polimricos cclicos y varios polmeros ,-insaturados) (Figura 7.4). De
esta forma es capaz de reaccionar con un mayor nmero de grupos amino de las
molculas obteniendo redes fuertemente entrecruzadas, en las que se retarda la
biodegradacin y aumenta la estabilidad estructural
18,19
.

El glutaraldehdo polimerizado reaccionar con las aminas primarias del
quitosano para formar un enlace imino estabilizado (base de Schift) y no reacciona
mediante una adicin tipo Michael (Figura 7.5).

Los extractos liberados al medio de los materiales DA-Q durante las primeras
cuatro horas del experimento, resultaron citotxicos en todos los casos, segn los datos
obtenidos mediante el ensayo MTT (Figura 7.6). La toxicidad aumenta
considerablemente con el tiempo de entrecruzamiento con glutaraldehdo. Esto
significa, que el efecto citotxico descrito, probablemente se debe a los restos de
glutaraldehdo que permanecen sin reaccionar en la superficie de los materiales. Sin
O
H
CH
2
CH C
CHO
3
CH
2
CH C
CHO
CH
2
H
O
2
2
n
+ R NH
2
n
2
2
CH
2
CH C
CH
CH
2
H
O
NR
3
O
H
CH
2
CH C
CH NR
+
H
2
O
O
H
CH
2
CH C
CHO
3
CH
2
CH C
CHO
CH
2
H
O
2
2
n
+ R NH
2
n
2
2
CH
2
CH C
CH
CH
2
H
O
NR
3
O
H
CH
2
CH C
CH NR
+
H
2
O
embargo, la respuesta recupera niveles normales con los siguientes extractos,
confirmndose los resultados expuesto por Gendler et al.
20
, quienes defendan que los
efectos citotxicos del glutaraldehdo residual desaparecan por eliminacin o
inactivacin del mismo, tras un lavado exhaustivo de los materiales.

Figura 7.6: Resultados del ensayo MTT del sistema DA-Q entrecruzado a diferentes tiempos de
reaccin (a: no entrecruzado; b: 1 da de reaccin; c: 2 das de reaccin; d: 5 das de reaccin) y
de los controles negativo (TMX) y positivo (PVC).

Los ensayos Alamar Blue y Neutral Red detectan nicamente la citotoxicidad
de los extractos de los materiales entrecruzados con vapor de glutaraldehdo durante 5
das. Esto se debe, como ya se indic anteriormente, a la menor sensibilidad de estos
ensayos respecto al MTT.

MTT DA-Q-48 glut
0
30
60
90
120
TMX PVC DA50
(48h-glut)
DA70
(48h-glut)
DA90
(48h-glut)
%
4h 24h 48h 7d
MTT DA-Q
0
30
60
90
120
TMX PVC DA50 DA70 DA90
%
4h 24h 48h 7d
MTT DA-Q-5 glut
0
30
60
90
120
TMX PVC DA50
(5d-glut)
DA70
(5d-glut)
DA90
(5d-glut)
%
4h 24h 48h 7d
MTT DA-Q-24 glut
0
30
60
90
120
TMX PVC DA50
(24h-glut)
DA70
(24h-glut)
DA90
(24h-glut)
%
4h 24h 48h 7d
MTT DA-Q-48 glut
0
30
60
90
120
TMX PVC DA50
(48h-glut)
DA70
(48h-glut)
DA90
(48h-glut)
%
4h 24h 48h 7d
MTT DA-Q
0
30
60
90
120
TMX PVC DA50 DA70 DA90
%
4h 24h 48h 7d
MTT DA-Q-5 glut
0
30
60
90
120
TMX PVC DA50
(5d-glut)
DA70
(5d-glut)
DA90
(5d-glut)
%
4h 24h 48h 7d
MTT DA-Q-24 glut
0
30
60
90
120
TMX PVC DA50
(24h-glut)
DA70
(24h-glut)
DA90
(24h-glut)
%
4h 24h 48h 7d
a b
c
d

174
3.3 Microscopa confocal: Ensayo Vida/Muerte

El ensayo Vida/Muerte llevado a cabo mediante microscopa confocal es un
ensayo cualitativo y directo, con el que se pretenda tener una idea de la morfologa y
supervivencia de las clulas en contacto con los PEC. No se llev a cabo el recuento de
clulas vivas y muertas, pero se observ la fluorescencia de las clulas teidas y
sembradas en toda la superficie del material.

Existen notables diferencias entre los resultados obtenidos para los hidrogeles
secos y previamente hinchados. Cuando la siembra de las clulas se realiz sobre los
materiales secos, se observaron pocas clulas sobre la superficie de los hidrogeles. Su
morfologa se mantena redonda, y no se observ en ningn caso indicios de adhesin
celular (pseudpodos o aplanamiento de las clulas). Este comportamiento es muy
comn en el caso de clulas en contacto con superficies muy hidroflicas. Adems, la
mayora de ellas estaban muertas. Es decir, el ncleo de las HOB se observ teido de
rojo, lo que indica que el ethidium homodimer atraves las membranas daadas de las
clulas muertas y lleg hasta el ncleo para unirse al ADN nuclear (Figuras 7.7-a y 7.9-
a). Esto indica que la viabilidad de las clulas se ve tremendamente afectada por el
proceso de hinchamiento de los materiales, y probablemente sufran un proceso de
deshidratacin severa durante el mismo. En las Figura 7.7 las clulas que se observan
sobre la superficie del DA70-Q poseen una morfologa redondeada y sus ncleos
aparecen teidos de rojo. El sistema HA70-Q (Figura 7.9) muestra el mismo
comportamiento, las clulas que se encuentran sobre la superficie presentan el ncleo
teido de rojo.

Sin embargo, cuando la siembra se realiz sobre los materiales previamente
hinchados, se observ que la morfologa celular se mantena redonda (materiales muy
hidroflicos) y las pocas clulas que permanecan sobre el material tenan un aspecto
mucho ms sano que en el caso anterior, ya que la estructura celular se mantena teida
de color verde y existan muchos menos ncleos de color rojo. Como puede observarse
en las Figuras 7.8 y 7.10 no aparece nada en la Imagen a (no existe dao en la
membrana y el ethidium homodimer no llega a teir el ncleo). Adems en la Figura
7.10 se muestran dos clulas en divisin, signo de que el ambiente en el que se
encuentran es mucho menos agresivo que en el caso de las muestras no hidratadas.

Figura 7.7: Imagen de
microscopa confocal de
HOB sobre DA70-Q.

HOB sobre DA70-Q
hidratado

HOB sobre HA70-Q.

HOB sobre HA70-Q
hidratado.

Las distintas imgenes corresponden a: imagen del ncleo daado de las clulas en las que el
ethidium homodimer se ha unido al ADN (a), imagen de la membrana celular teida por
accin del calcein fluorescente (b), imagen conjunta del ncleo y la membrana celular (c).

Por lo tanto, los datos obtenidos mediante los test in vitro de citotoxicidad,
indican que los materiales no presentan una accin citotxica sobre las clulas HOB si
son exhaustivamente lavados (durante al menos 4 horas) e hidratados antes de ponerlos
en contacto con las clulas.

a
a
a
a
a
a
b
b
b
b
c
c
c
c

176
4 BIBLIOGRAFA

1)Williams D.F. Concise enciclopedia of medical and dental devices; 1st Ed ed.;
Pergamon Press: Oxfrod, UK, 1990.
2)ISO 10993 Biological evaluation of medical devices, 1992.
3)Vroman L., Adams A. L., Klings M., Fischer G.C., Muoz P.C., Solensky R.P.
Annals of the New York Academy of Sciences 1977, 283, 65-76.
5)Peppas N.A. Hydrogels in medicine and pharmacy; CRC Press: Boca Ratn, Florida,
1987.
7)Di Silvio L. Development of cell culture model and primary human osteobleoasts;
University of London: London, 1995.
8)Mosmann T. J Immunol Meth 1983, 65, 55-63.
9)Wan H. et al. J Mat Sci: Mat in Med 1994, 5, 154-159.
10)Clifford C.J ., Downes S. Journal of Materials Scinece: Materials in Medicine 1996,
7, 637-643.
11)Nakayama G.R., Caton M. C., Nova M.P.,Parandoosh Z. J immunol Methods 1997,
204, 205-208.
12)Nikolaychik V.V., M. M., Lelkes P.I. J Biomater Sci Polym Ed 1996, 7, 181-191.
13)Nociari M.M., Shalev A., Benias P., Russo C. J Immunol Methods 1998, 213, 157-
167.
14)Borenfreund E., Puerner J . A. J Tiss Cultt Meth 1984, 9, 7-9.
15)Borenfreund E. et al. Toxicol in vitro 1988, 2, 1-6.
16)Moore P.L., Mc Coubrey I., Hougland R.P. Journal of Cell Biology 1990, 111, 58a
[Abstract N 304].
17)J ayakrishnan A., J ameela S. R. Biomaterials 1996, 17, 471-484.
18)J ameela S.R., J ayakrishnan A. Biomaterials 1995, 16, 769-775.
19)Yao K., Peng T., Goosen M.F.A., Min J .M., He Y.Y. Journal of Applied Polymer
Science 1993, 48, 343-354.
20)Gendler E., Gendler S., Nimni M.E. J Biomed Mater Res 1984, 18, 727-736.

CAPTULO 7

APLICACIN DE LA RESONANCIA DE
PLASMN SUPERFICIAL (SPR) AL ANLISIS
DE COMPLEJOS POLIELECTROLTICOS
(PEC) Y SU INTERACCIN CON PROTENAS

Captulo 7: Aplicacin de la SPR al anlisis de PEC

178
CAPTULO 7: APLICACIN DE LA RESONANCIA DE
PLASMN SUPERFICIAL (SPR) AL ANLISIS DE COMPLEJOS
POLIELECTROLTICOS (PEC) Y A SU INTERACCIN CON
PROTENAS.
1 INTRODUCCIN................................................................................................ 179
1.1 Teora de la Resonancia de Plasmn Superficial (SPR)............................... 182
1.2 Aplicaciones de la SPR ................................................................................ 184
2 MATERIALES Y MTODOS............................................................................. 185
2.1 Reactivos...................................................................................................... 185
2.2 Resonancia de Plasmn................................................................................ 185
2.3 Preparacin de la muestra............................................................................. 186
2.4 Interacciones polielectrolticas quitosano-copolmeros................................ 186
3.1 Sistema quitosano-HEMA:AMPS................................................................ 189
3.2 Sistema quitosano-DMAA:AMPS............................................................... 191
4 BIBLIOGRAFA.................................................................................................. 194

Captulo 7: Aplicacin de la SPR al anlisis de PEC 179
1 INTRODUCCIN

Las interacciones superficiales de los biomateriales polimricos son
fundamentales a la hora de determinar ciertos comportamientos, tales como la respuesta
de cuerpo extrao o la biocompatibilidad. De hecho, muchos esfuerzos en el diseo de
materiales biocompatibles se dirigen hacia el control de las interacciones superficiales,
ya que la superficie del material posee una reactividad particular inevitablemente
diferente a la del interior del mismo. Los instrumentos mdicos modernos estn hechos
de materiales como metales, cermicos y polmeros. Debido a la mayor energa libre
superficial de los metales y cermicos, sus superficies se recubren con polmeros
biolgicamente inertes en aplicaciones en contacto con el medio fisiolgico. De hecho,
polmeros que forman pelculas homogneas proporcionan mejor biocompatibilidad que
las superficies originales y se han utilizado ampliamente en circuitos extracorpreos,
catteres de drenaje, injertos vasculares, membranas de dilisis...etc
1
.

A la hora de estudiar la hemocompatibilidad de un biomaterial, determinar la
interaccin de las plaquetas con ste es primordial. Sin embargo, antes de la adhesin de
las plaquetas, se absorben rpidamente protenas plasmticas sobre la superficie del
material
2,3
, las cuales influyen notablemente en las interacciones de la sangre con el
mismo. La composicin y reversibilidad de dicha adsorcin depende principalmente de
las caractersticas superficiales del polmero. Por lo tanto, la actividad anticoagulante o
antitrombognica del material polmero viene determinada por sus caractersticas
superficiales. No se pueden especificar qu parmetros son los ms importantes para
entender las respuestas biolgicas a las superficies (probablemente interactan varios de
estos parmetros simultneamente), pero se han publicado numerosos estudios sobre la
rugosidad, la distribucin de grupos funcionales aninicos y la densidad de
interacciones electrostticas en el polmero, balance hidrofbico/hidroflico en la
superficie, separacin de microdominios heterogneos, etc
4
. Por la tanto, uno de los
mayores retos que se le plantean al cientfico para mejorar la funcionalidad de los
biomateriales es controlar la adhesin proteica, bien favoreciendo cierto tipo de
conformaciones, o bien reduciendo la cantidad de protenas sobre la superficie
5
.
El fibringeno parece ser un componente muy importante de dicha capa protica
ya que es capaz de inducir la adhesin y agregacin plaquetaria por interaccin directa

180
con los receptores plaquetarios GPIIb/IIIa
6
. Adems, Chinn et al. demostraron que la
adhesin plaquetaria se inhiba casi por completo cuando el plasma era deficiente en
fibringeno
7
. Por otro lado, se sabe que la adhesin y activacin de plaquetas se ve
significativamente reducida sobre materiales recubiertos con albmina. Esto se debe a
que la membrana plaquetaria no tiene receptores de albmina y por tanto, no
interacciona especficamente con ella
8
.

Como ya se ha comentado en el captulo anterior, el quitosano es un polmero
bsico semisinttico que se obtiene de la quitina. Sus propiedades qumicas y biolgicas
le hacen tremendamente atractivo para su aplicacin en el campo de los biomateriales
9-
12
. Sus propiedades ms destacables son su biocompatibilidad, biodegradabilidad, nula
toxicidad (sus productos de degradacin son metabolitos naturales)
13
, su capacidad de
atrapar lpidos cidos y de formar filmes, recubrimientos, fibras, partculas y
disoluciones
9
. Sin embargo, ha sido descrito como un material que activa tanto el
complemento
14
, como los sistemas de coagulacin
15
. Esto se debe a que absorbe gran
cantidad de fibringeno y otras protenas plasmticas
16
. Y se ha demostrado que el
grado de activacin de los sistemas de coagulacin est ntimamente relacionado con el
grado de acetilacin del quitosano
16,17
.

El principal objetivo de este captulo ha sido el estudiar la formacin de PEC por
interaccin directa de molculas con cargas complementarias y la adsorcin en la
superficie de estos materiales de protenas plasmticas de inters biomdico. Una de las
estrategias ms utilizadas a la hora de buscar recubrimientos hemocompatibles es el
recubrimiento de los dispositivos biomdicos con un hidrogel
18
, ya que la pequea
tensin interfacial que se establece entre el gel hinchado y el flujo sanguneo, reduce la
adsorcin de protenas plasmticas y por tanto, la adhesin de plaquetas a la superficie.
Otra de las estrategias empleadas (y ya comentada en esta memoria) para inhibir la
adhesin plaquetaria en materiales polmeros es modificar su carga elctrica superficial.
Ha sido descrito en la literatura que algunos materiales cargados positivamente son
trombognicos, mientras que aquellos cargados negativamente tienden a ser no-
trombognicos
19
. Esto sugiere que las interacciones electrostticas que tienen lugar
entre los conductos vasculares y la sangre tambin controlan los fenmenos que
desencadenan la cascada de coagulacin. Por otro lado, los grupos sulfnicos han sido
relacionados con cierta capacidad anticoagulante de la heparina
20
.

Se han empleado muchas tcnicas de anlisis superficial a la hora de caracterizar
biomateriales, aunque muy pocas son capaces de monitorizar las interacciones
dinmicas que surgen en un ambiente fluido, ms similar al que existira in vivo.
Algunas de estas tcnicas incluiran la elipsometra, la reflexin interna total, las guas
de onda dielctricas monomodo y la resonancia de plasmn. El conjunto de todas ellas
nos ofrece la posibilidad de estudiar fenmenos dinmicos en un amplio rango de
superficies.

Con el fin de obtener recubrimientos hidroflicos y con grupos sulfnicos en su
estructura, se han formado complejos polielectrolticos insolubles quitosano-
copolmero sinttico con AMPS en su estructura. De esta forma aprovechamos las
buenas caractersticas descritas para el quitosano (entre las que habra que destacar
desde el punto de vista prctico, su capacidad para formar pelculas) y las de los
polmeros sintticos, negativamente cargados por grupos sulfnicos (biolgicamente
activos) en sus cadenas laterales.

La resonancia de plasmn superficial (SPR) es capaz de monitorizar cualquier
proceso dinmico
21
, tales como adsorcin
22,23
o degradacin
24
, en un nmero amplio
de superficies con inters biomdico
25
, a tiempo real, sin necesidad de marcar el analito
ni de complicados procesos preparativos y con una elevada sensibilidad
3,26
. Es capaz
de obtener rpidamente informacin acerca de la velocidad de adsorcin y de su
extensin, permitiendo la determinacin de propiedades dielctricas, cinticas de
asociacin/disociacin y constantes de afinidad de interacciones especficas ligando-
ligando
27
.

En este captulo estudiaremos mediante SPR, en primer lugar, la formacin de
complejos polielectrolticos entrecruzados fsicamente mediante enlaces inicos, por
mezcla directa de macromolculas con grupos inicos de carga opuesta y la posibilidad
de formar materiales multicapas. En segundo lugar, se determinar la interaccin de
estos materiales preparados in situ con dos de las protenas plasmticas ms abundantes

182
en el plasma y de mayor significado en los ensayos de hemocompatibilidad, la albmina
(4,0 g/dl) y el fibringeno (0,3 g/dl).

1.1 Teora de la Resonancia de Plasmn Superficial (SPR)

La SPR se basa en un fenmeno ptico asociado a la oscilacin de densidad de
carga en la interfase entre dos medios que poseen constantes dielctricas de signos
opuestos (por ejemplo un metal y un dielctrico). La excitacin ptica de un plasmn
superficial se produce mediante una onda evanescente y se consigue cuando un rayo de
luz incide en la interfase entre la capa metlica y el medio dielctrico a un ngulo
determinado, denominado ngulo de resonancia. La excitacin del plasmn superficial
provoca un descenso muy grande de la reflectancia del metal. Si se mide la intensidad
del haz reflejado en funcin del ngulo de incidencia de la luz, se observa un mnimo
muy pronunciado para el ngulo de resonancia. El ngulo de resonancia depende
fuertemente del ndice de refraccin del medio colindante a la lmina metlica.

Para excitar una onda de plasmn superficial con una onda electromagntica
incidente en la superficie, se deben cumplir las condiciones de resonancia, es decir, que
los vectores de propagacin del plasmn superficial y de la onda electromagntica
deben ser iguales. Los plasmones superficiales nicamente existirn si la permeabilidad
elctrica del metal y el medio dielctrico son de signo contrario. Estas condiciones slo
se cumplen para frecuencias del infrarrojo o del visible con algunos metales. La
eleccin del metal es crtica, ya que debe presentar electrones libres. Los metales ms
apropiados son la plata, el oro, el cobre y el aluminio siendo los dos primeros los ms
comnmente utilizados. La plata, porque proporciona picos de resonancia muy agudos y
el oro por su estabilidad. En general los plasmones superficiales se producen con
frecuencias del rango del visible con grandes prdidas a medida que nos desplazamos
hacia el IR. La determinacin del espesor ptimo de la capa metlica es fundamental a
la hora de obtener el valor de reflectancia mnimo y depende de las constantes pticas
del metal y de la longitud de onda de la luz (el espesor ptimo del oro es 45 nm a una
longitud de onda de 790 nm). Existen dos formas de excitar pticamente y alcanzar las
condiciones de resonancia: mediante reflexin total con estructuras prismticas
acopladas o empleando redes de difraccin. La primera es la ms utilizada debido a su
simplicidad y se le denomina configuracin Kretschmann (Figura 6.1).

Figura 6.1: Esquema de un aparato de SPR con configuracin Kretschmann y
de su unidad de deteccin.

El ngulo de resonancia es muy sensible a los cambios que se producen en el
ndice de refraccin en las proximidades de la superficie metlica y cualquier cambio en
el ndice de refraccin, como por ejemplo una interaccin qumica, se puede detectar a
travs de cambios en el ngulo de resonancia (Figura 6.1).

El ngulo de resonancia depende de la longitud de onda incidente, del ndice de
refraccin del prisma, del metal y de la capa de muestra que se desea detectar. Si
nicamente el ltimo cambia, la SPR puede utilizarse para monitorizar cambios en el
ndice de refraccin de las capas adsorbidas en la superficie metlica. Los cambios en el
ndice de refraccin, pueden relacionarse con variaciones de masa y por tanto se pueden
relacionar con interacciones especficas entre las molculas de analito depositadas
previamente en la superficie metlica y sus receptores especficos.

Cuando se utiliza luz monocromtica para excitar la respuesta de la SPR, existen
dos formas de medirla: seguir la variacin del ngulo de resonancia acoplado o seguir la
intensidad de la luz reflejada a un ngulo fijo. En este trabajo se utilizar el segundo
mtodo. Para ello se elige un ngulo a la mitad de la anchura del valle de resonancia y
se mide la intensidad de la luz reflejada para ese ngulo. De esta forma se pueden
registrar cambios a tiempo real debido a que las variaciones del ndice de refraccin
pueden medirse con una alta sensibilidad. Esta forma de medida slo puede utilizarse
cuando los cambios en el ndice de refraccin son pequeos, como sera el caso de
interacciones biomoleculares. Adems de la monitorizacin in situ de las interacciones,
Fuente
de luz
Luz
polarizada
Sensor con
lmina de oro
Canal
de flujo
Luz
reflejada
Unidad de
deteccin
ptica
Intesidad
ngulo
Tiempo
Seal de
resonancia
Fuente
de luz
Luz
polarizada
Sensor con
lmina de oro
Canal
de flujo
Luz
reflejada
Unidad de
deteccin
ptica
Intesidad
ngulo
Tiempo
Seal de
resonancia

184
se puede obtener informacin acerca de la especificidad, concentracin y cintica de
dichas interacciones.

1.2 Aplicaciones de la SPR

Las aplicaciones de esta tcnica son numerosas y en continuo aumento
3
. Entre
otras cabra destacar el estudio de las propiedades pticas de una capa metlica, medidas
de espesor de filmes y de ndices de refraccin de capas orgnicas sobre superficies
metlicas
22
, estudio de la adsorcin de protenas a biomateriales
2
y la adsorcin de
gases en superficies para su utilizacin como biosensores
26
.


2.1 Reactivos

La albmina de suero bovino n A0281, BSA (pI =4,9; 68 kD; >99 % pureza),
y el fibringeno de plasma bovino n. F8630 (pI =6,0; 340 kD, 75 % de protena, 10 %
citrato de sodio y 15 % cloruro de sodio) fueron suministrados por Sigma y se
utilizaron sin previa purificacin. El quitosano de bajo peso molecular (Mr 150000)
de grado de acetilacin 19 % fue suministrado por Fluka y el mtodo de purificacin
empleado con este compuesto ha sido descrito anteriormente (Captulo 5).

2.2 Resonancia de Plasmn

Todas las medidas se llevaron a cabo en un prototipo de Sensor SPR
desarrollado en el Departamento de Biosensores del Instituto Nacional de
Microelectrnica del CSIC (Figura 6.2).

Figura 6.2: Fotografa del aparato de SPR empleado en este trabajo .

La fuente de luz es un diodo de lser de 3 mW (670 nm) que se divide en dos
haces iguales mediante un divisor de haz. La luz se hace incidir a travs de un prisma
semicircular sobre una lmina de oro de 41 nm. La luz reflejada es detectada por un

186
fotodiodo cuadrante, amplificada y digitalizada por una tarjeta de adquisicin. Los datos
digitales se transmiten a un PC, donde se procesaron a tiempo real. sta configuracin
permite la realizacin de medidas simultneas independientes o el uso de una de las
cubetas como referencia. Esto es de gran importancia a la hora de discriminar las
variaciones de intensidad provocadas por inestabilidad del lser y cambios en la
temperatura, as como para diferenciar la seal debida a la reaccin de reconocimiento
frente a las de los cambios de ndice de refraccin de la disolucin.

2.3 Preparacin de la muestra

Sobre la superficie metlica se deposit una capa de quitosano mediante spin-
coating. Se cubri la placa metalizada con una solucin acuosa de quitosano de 5
mg/ml y se hizo girar con una aceleracin de 75 y una velocidad de 120 durante 30
segundos. Posteriormente, las muestras se secaron en una estufa a 180 C durante 30
minutos.

2.4 Interacciones polielectrolticas quitosano-copolmeros

Sobre la capa de quitosano se hicieron pasar a una velocidad de 10 l min
-1

diferentes soluciones acuosas de los homopolmeros PDMAA, PAMPS y de los
copolmeros HA30 y HA70 del sistema HEMA-AMPS, y DA30 y DA 70 del sistema
DMAA-AMPS en concentracin 1x10
-2
M. Adems, se estudiaron las interacciones de
los complejos polielectrolticos con las protenas BSA y fibringeno. Para ello se
prepararon disoluciones proteicas de concentracin 1 mg ml
-1
en PBS (Sigma), pH 7,4
que se pasaron a una velocidad de flujo constante de 1 l min
-1
.



Cuando una superficie artificial se pone en contacto con la sangre, pasados unos
segundos se adsorben sobre su superficie protenas plasmticas, para despus producirse
la adhesin de plaquetas. A nivel molecular la estructura superficial tiene un efecto en la
adsorcin de protenas y stas a su vez sobre la adhesin de las plaquetas. En este
captulo, se ha seguido por SPR la formacin de recubrimientos polimricos in situ,
mediante la deposicin sucesiva de capas (capa a capa). La deposicin de sustancias
sobre la placa original, queda reflejado en las curvas de SPR como cambios en la
intensidad de luz reflejada a un ngulo fijo, cercano al ngulo de resonancia. En la
Figura 6.3 se muestra la respuesta que registrar un aparato de SPR ante la adhesin y
NO adhesin de sustancias en la superficie del sensor (la placa metlica o la placa
metlica previamente recubierta).

Figura 6.3: Esquema del registro del aparato de SPR ante la adsorcin () y la NO adsorcin
() de sustancias sobre la superficie del sensor.

El aparato de SPR es sensible a los cambios de ndice de rafraccin en las
proximidades del sensor, que registrar curvas similares a la de la Figura XXX. Si en
primer lugar hacemos pasar sobre el sensor una solucin que contenga molculas que se
adhieren en su superficie (), el aumento de masa sobre la mismo, que conlleva un
aumento del ndice de refraccin, se traduce en un salto de la seal que registra el
Sustancia que se
adsorbe en la superficie
Sustancia que NO
se adsorbe en la
superficie
Sustancia que se
adsorbe en la superficie
Sustancia que NO
se adsorbe en la
superficie

188
aparato. La magnitud del escaln ser proporcional a la cantidad de sustancia adherida
sobre la superficie. Si por el contrario pasamos sobre la superficie del sensor una
solucin de molculas que no se adhieren a la misma (), tras un primer aumento de la
seal, sta recupera la lnea base, alcanzando los niveles originales. La variacin en la
seal se debe a la diferencia en el ndice de refraccin entre la solucin tampn y el
tampn que incorpora la molcula ().

El objetivo de este apartado es el estudio de la formacin de complejos
polielectrolticos in situ por interaccin directa de macromolculas con grupos inicos
complementarios, mediante SPR. Los PEC se formaron a base de quitosano y
poli(HEMA-co-AMPS) o poli(DMAA-co-AMPS). Sobre una fina pelcula de quitosano
(con grupos NH
3
+
) colocada previamente sobre el sensor, se pas una disolucin de
copolmero portador de AMPS (con grupos SO
3
-
), detectando la interaccin entre
ambas macromolcula por cambios en la seal de resonancia. Prcticamente todos los
complejos polielectrolticos sintetizados en este apartado, poseen el mismo perfil de
adhesin. En todos los sistemas se observ que tras una primera inyeccin del
copolmero en el circuito, se produce una primera etapa de adsorcin debida a la
adhesin del copolmero por enlace inico entre el grupo amino ionizado del quitosano
y el sulfonato del AMPS (Figura 6.6). Y una segunda etapa en la que se deposita una
capa de copolmero que se une al resto mediante uniones dbiles inespecficas. Este
segunda etapa se detecta en la curva de plasmn mediante un cambio en la pendiente de
la curva (Figura 6.4, a).

Si se hace pasar sobre el complejo CHI-copolmero una disolucin de quitosano,
ste no vuelve a depositarse, ya que la seal recupera los niveles de partida, y por tanto,
no se obtienen sistemas multicapa (CHI-copolmero-CHI). Si posteriormente se hacen
pasar soluciones de copolmero sobre el PEC, se observa que las capas de copolmero
unidas mediante interacciones dbiles pueden seguir unindose sucesivamente,
quedando registradas en la curva como escalones de la misma pendiente e intensidad.
Estas interacciones dbiles se pierden al cambiar las condiciones del medio (cambio de
agua a PBS, y con ello, cambio del pH y la fuerza inica del medio), permaneciendo
unida nica y exclusivamente la capa unida mediante enlace inico.

3.1 Sistema quitosano-HEMA:AMPS
Quitosano-Poli(HEMA-co-AMPS) (70:30)

Figura 6.4: Diagrama de la respuesta de SPR a tiempo real de la interaccin macromolecular
entre quitosano y el copolmero HA30

Quitosano-Poli(HEMA-co-AMPS) (30:70)

Figura 6.5: Diagrama de la respuesta de SPR a tiempo real de la interaccin macromolecular
entre quitosano y el copolmero HA30
0 1000 2000 3000 4000
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
a
0 10 0 20 0 30 0 40 0 50 0 60 0
4 , 4
4 , 6
4 , 8
5 , 0
5 , 2
5 , 4
5 , 6
V
(V
)
T i empo ( s )
a
5.11V
4.51V
agua
PBS
HA70 [1x10
-2
M]
Quitosano
[1x10
-2
M]
HA70 [1x10
-2
M]
V

(
V
)
Tiempo (s)
0 2000 4000 6000 8000
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
3,50 V
3,11 V
agua
PBS (10mM)
Quitosano
[1x10
-2
M]
Quitosano
[1x10
-2
M]
HA30 [1x10
-2
M]
HA30 [1x10
-2
M]
V

(
V
)
Tiempo (s)

190
La interaccin de los distintos complejos con la albmina y el fibringeno es
significativamente diferente de un sistema a otro. Cuando se hace pasar una disolucin
de protenas plasmticas sobre una capa de quitosano (Figura 6.7), observamos que
sobre su superficie se produce la adhesin tanto de la albmina, como del fibringeno,
siendo la adhesin de esta ltima una de las causas de su mala hemocompatibilidad
16
,
ya que activa tanto el complemento
14
, como los sistemas de coagulacin
15
. Cuando la
superficie del quitosano es modificada por la formacin de complejos con los
copolmeros poli(HEMA-co-AMPS), la adhesin de estas protenas plasmticas es
inhibida totalmente (Figura 6.8) .

Figura 6.6: Esquema de las
interacciones inicas que tienen lugar
en los complejos polielectrolticos
quitosano poli(HEMA-co-AMPS).

Figura 6.7: Diagrama de SPR a tiempo real
y ngulo fijo de las interacciones del
quitosano con las protenas plasmticas
BSA y fibringeno.

y ngulo fijo de las interacciones del
complejo quitosano-HA30 con las protenas
plasmticas BSA y fibringeno.
400 600 800 1000 1200 1400 1600
2,96
2,98
3,00
3,02
3,04
3,06
3,08
3,10
3,12
3,14
Fibringeno
[1mg/mL]
BSA [1mg/mL]
V
(
V
)
Tiempo (s)
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
4,4
4,5
4,6
4,7
4,8
4,9
Fibringeno
[1mg/mL]
BSA [1mg/mL]
V
(
V
)
Tiempo (s)
400 600 800 1000 1200 1400 1600
2,96
2,98
3,00
3,02
3,04
3,06
3,08
3,10
3,12
3,14
Fibringeno
[1mg/mL]
BSA [1mg/mL]
V
(
V
)
Tiempo (s)
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
4,4
4,5
4,6
4,7
4,8
4,9
Fibringeno
[1mg/mL]
BSA [1mg/mL]
V
(
V
)
Tiempo (s)
O
O
NH
3
+
O
O
O
NHCOCH
3
O
O
NH
3
+
O
O
OH OH
O
O
OH
O
O O
NH
SO
3
-
O
NH
SO
3
-
Quitosano
HEMA:AMPS
O
O
NH
3
+
O
O
O
NHCOCH
3
O
O
NH
3
+
O
O
OH OH
O
O
OH
O
O O
NH
SO
3
-
O
NH
SO
3
-
Quitosano
HEMA:AMPS
O
O
NH
3
+
O
O
O
NHCOCH
3
O
O
NH
3
+
O
O
OH OH
O
O
OH
O
O O
NH
SO
3
-
O
NH
SO
3
-
Quitosano
HEMA:AMPS
El monmero HEMA ha sido descrito en numerosas ocasiones como
hemocompatible, debido a su capacidad para formar hidrogeles de bajo tensin
superficial y por el balance hidroflico/hidrofbico de su superficie que forma
microdominios permitiendo la adecuada organizacin de las protenas plasmticas en su
superficie
28
. Sin embargo, en esta ocasin no se produce la adhesin de protenas sobre
la superficie, indicando que la organizacin en microdominios se rompe con la
presencia del AMPS en las cadenas macromoleculares. Se forma un complejo
polielectroltico hidroflico que repele la adhesin tanto de la albmina como del
fibringeno en todas las formulaciones ensayadas.

3.2 Sistema quitosano-DMAA:AMPS

Los complejos quitosano-poli(DMAA-co-AMPS) presentan un comportamiento
diferente frente a la adhesin de albmina y fibringeno. Alencar de Queiroz et al.
29

estudiaron la adhesin de protenas plasmticas sobre superficies modificadas de PTFE
injertadas con cadenas de PDMAA. Observaron la disminucin de la adsorcin de
fibringeno y un aumento en la adsorcin de albmina para polmeros y copolmeros
injertados que incorporaban DMAA en sus cadenas. Estos resultados concuerdan con
las interacciones registradas por SPR de la BSA y fibringeno con el quitosano tratado
con PDMAA (Figura 6.9).

y ngulo fijo de las interacciones de las
protenas plasmticas BSA y fibringeno
con el complejo quitosano-PDMAA .
Figura 6.10: Diagrama de SPR a tiempo
real y ngulo fijo de las interacciones de las
protenas plasmticas BSA y fibringeno
con el complejo quitosano-PAMPS .
1000 1500 2000 2500 3000 3500
6,2
6,3
6,4
6,5
6,6
6,7
6,8
6,9
7,0
7,1
7,2
BSA [1mg/mL]
Fibringeno
[1mg/mL]
V

(
V
)
Tiempo (s)
4000 4200 4400 4600 4800 5000 5200 5400 5600 5800
6,55
6,60
6,65
6,70
6,75
6,80
6,85
6,90 Fibringeno
[1mg/mL]
BSA [1mg/mL]
V

(
V
)
Tiempo (s)
1000 1500 2000 2500 3000 3500
6,2
6,3
6,4
6,5
6,6
6,7
6,8
6,9
7,0
7,1
7,2
BSA [1mg/mL]
Fibringeno
[1mg/mL]
V

(
V
)
Tiempo (s)
4000 4200 4400 4600 4800 5000 5200 5400 5600 5800
6,55
6,60
6,65
6,70
6,75
6,80
6,85
6,90 Fibringeno
[1mg/mL]
BSA [1mg/mL]
V

(
V
)
Tiempo (s)
Por otro lado, ha sido descrita la formacin del complejo BSA-PAMPS
30
.
Mattison et al. demostraron que a pesar de que la carga global de la protena es negativa
(pI
BSA
=4,9), interacciona fuertemente con el AMPS. Este comportamiento se da en la
naturaleza en numerosas ocasiones, y se debe a que las protenas poseen heterogeneidad
de carga, presentando regiones positivas y regiones negativas. Si existen sitios de unin
en aquellas zonas de carga opuesta a la carga global la protena interaccionar con un
sustrato del mismo signo que ella, de aqu su interaccin con el AMPS. Esta interaccin
ha sido confirmada haciendo pasar una disolucin de BSA sobre el complejo quitosano-
PAMPS (Figura 6.10). Como puede apreciarse, la BSA se adhiere sobre la superficie,
sin embargo el fibringeno no lo hace. Mediante la unin quitosano-PAMPS se
consigue una interaccin selectiva de la BSA frente al fibringeno.

Los complejos quitosano-poli(DMAA-co-AMPS) sintetizados en esta seccin
presentan un comportamiento parecido al descrito por Alencar de Queiroz et al., ya que
estos materiales inhiben la adhesin del fibringeno, mientras que la albmina sigue
interaccionando con su superficie (Figura 6.12).

Figura 6.11: Diagrama de la
respuesta de SPR a tiempo real de
la interaccin macromolecular
entre quitosano y el copolmero
DA30

Figura 6.12: Diagrama de SPR a
tiempo real y ngulo fijo de las
interacciones del quitosano-DA30
con las protenas plasmticas BSA
y fibringeno.

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
4,8
5,2
5,6
6,0
6,4
6,8
7,2
7,6
8,0
8,4
5.78V
5.11V agua
agua
PBS [10mM]
DA30 [1x10
-2
M]
Quitosano
[1x10
-2
M]
DA30 [1x10
-2
M]
V

(
V
)
tiempo (s)
3500 4000 4500 5000 5500 6000 6500 7000
7,8
8,0
8,2
8,4
8,6
Fibringeno
[1mg/mL]
BSA [1mg/mL]
V

(
V
)
Tiempo (s)
Mediante la SPR se ha monitorizado la formacin de complejos
polielectrolticos a tiempo real y se ha diferenciado entre interacciones estables e
interacciones dbiles e inespecficas entre dos molculas por cambio en las condiciones
del medio (variacin del pH, la fuerza inica...). Adems se han monitorizado la
interaccin de protenas plasmticas con la superficie de biomateriales sin necesidad de
marcajes, ni complicados ensayos de derivatizacin.

Se ha conseguido toda una gama de recubrimientos polimricos homogneos
que podran mejorar la hemocompatibilidad del quitosano, conservando por otra parte,
todas sus buenas propiedades. Los complejos a base de quitosano y poli(HEMA-co-
AMPS) inhibe la adhesin de BSA y fibringeno. Y lo que es ms interesante en cuanto
a hemocompatibilidad se refiere, los recubrimientos quitosano-poli(DMAA-co-AMPS),
adhieren BSA, pero evitan la adhesin de fibringeno.

4 BIBLIOGRAFA

1)Abraham G.A., Queiroz A. A. A., San Romn J . Biomaterials 2001, 22, 1971-1985.
2)Green R.J ., Davies M. C., Roberts C.J ., Tendler S.J .B. Biomaterials 1999, 20, 385-
391.
3)Green R.J ., Frazier R. A., Shakesheff K.M., Davies M.C., Roberts C.J ., Tendler S.J .B.
Biomaterials 2000, 21, 1823-1835.
4)Park W.H., Ha W. S., Ito H., Miyamoto T., Inagaki H., Noishiki Y. Fibers and
Polymers 2001, 2 (2), 58-63.
6)Horbett T.A. Cardiovasc Pathol 1993, 2, 137s-148s.
7)Chinn J .A., Horbett T. A., Ratner B.D. Thromb Haemost 1991, 65, 608-617.
8)Amiji M.M., Park K. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition 1993, 4 (3),
217-234.
9)Singh D., Ray A. R. J.M.S.- Rev Macromol Chem Phys 2000, C40 (1), 69-83.
10)Gupta K.C., Ravi Kumar M. N. V. J.M.S.-Rev Macromol Chem Phys 2000, C40 (4),
273-308.
11)Brown C., Hoffman A. S. Modification of natural polymers: chitosan, 2001, pp 565-
574.
12)Ravi Kumar M.N.V. Chitin and chitosan drug delivery systems homepage, 2001;
Vol. 2001.
13)Muzzarelli R., Baldesarre V., Conti F., Ferrara P., Biagini G., Gazzanelli G., Vasi V.
Biomaterials 1988.
14)Minami S., Suzuki H., Okamoto Y., Fujinaga T., Shigemasa Y. Carbohydrate
Polymers 1998, 36, 151-155.
15)Brandenberg G., Leibrock L. G., Shuman R., Malette W.G., Quigley H.
Neurosurgery 1984, 15, 9-13.
16)Benesh J ., Tengvall P. Biomaterials 2002, 23, 2561-2568.
17)Yong Lee K., Shik H. W., Ho Park W. Biomaterials 1995, 16, 1211-1216.
19)Garbassi F., N. M., Occhiello E. Biomedical materials; Wiley & Sons: New York,
1994, pp 395-416.
1987-1994.
21)Clarke S., Davies M. C., Roberts C.J ., Tendler S.J .B., Williams P.M., OByrne V.,
Lewis A.L., Russell J . Langmuir 2000, 16, 5116-5122.
22)Corneillie S., Ngok Lan. P., Schacht E., Davies M., Shard A., Green R., Denyer S.,
Wassall M., Whitfield H., Choong S. Polymer International 1998, 46, 251-259.
23)J ung L.S., Campbell C. T., Chinowsky T.M., Mar M.N., Yee S.S. Langmuir 1998,
14, 5636-5648.
24)Frazier R.A., Davies M. C., Matthij G., et al. Langmuir 1997, 13, 7115-7120.
25)Kooyman R.P.H., Bruijn H. E., Eenink R.G., Greve J . Journal of Molecular
Structure 1990, 218, 345-350.
26)Lechuga L.M., Calle A., Prieti F. Qumica Analtica 2000, 19 [Suppl 1], 54-60.
27)Sigal G.B., Mrksich M., Whitesides G.M. Langmuir 1997, 13, 2749-2755.
28)Peppas N.A. Hydrogels in medicine and pharmacy; CRC Press: Boca Ratn, Florida,
1987.
29)Alencar de Queiroz A.A., Castro S. C., Higa O.Z. Journal of Biomaterial Science,
Polymer Edition 1997, 8 (5), 335-347.
30)Mattison K.W., Dubin P. L., Brittain J . J Phys Chem B 1998, 102, 3820-3836.

CONCLUSIONES

CONCLUSIONES 197
CONCLUSIONES

1. Se han sintetizado polmeros inicos que incorporan cido 2-acrilamido-2-metil-
propanosulfnico en su estructura. Este monmero se ha combinado 2-hidroxietil-
metacrilato (HEMA), N,N-dimetilacrilamida (DMAA) y el derivado metacrlico
portador del Triflusal (THEMA), obteniendose materiales con propiedades muy
diferentes. Los sistemas HEMA-AMPS y DMAA-AMPS son solubles en medio
acuso, mientras que las formulaciones ricas en monmero THEMA son insolubles.

2. Se han desarrollado dos nuevas y sencillas metodologas para determinar las
relaciones de reactividad de sistemas copolimricos que se ajusten al modelo
terminal. Para ello, se monitoriza por RMN-
1
H in situ la disminucin de la
concentracin de los monmeros y se relaciona con la solucin integrada exacta de
la ecuacin de copolimerizacin.

3. Se ha demostrado la capacidad de la electrocromatografa cintica micelar (MEKC)
para caracterizar reacciones de copolimerizacin en las que intervienen especies
inicas. La tcnica aprovecha dos factores opuestos que influyen en el tiempo de
anlisis, la carga de la molcula y su hidrofobicidad, en el estudio de los sistemas
HEMA-AMPS y DMAA-AMPS, su evolucin con la conversin, as como la
formacin de especies de bajo peso molecular.

4. Se han sintetizado formulaciones del sistema poli(THEMA-co-AMPS) ricas en el
monmero THEMA con el fin de obtener polmeros insolubles con propiedades
antiagregantes, para el recubrimiento de prtesis vasculares de pequeo dimetro.
Estos materiales poseen actividad en su forma macromolecular y son capaces de
mantener cinticas de liberacin de Triflusal de orden cero durante largos periodos
de tiempo. Las formulaciones presentaron una buena adhesin a las prtesis y buena
biocompatibilidad in vitro.

CONCLUSIONES

198
5. Se han sintetizado complejos polielectrolticos (PEC) en presencia de quitosano
como plantilla (template polymerization) obteniendo como resultado hidrogeles
dbilmente entrecruzados sensibles a las condiciones del medio. Los PEC
responden la pH del medio dependiendo del grado de ionizacin de los monmeros
ionizables, de la composicin molar de sus componentes y de la densidad de puntos
de entrecruzamiento tanto fsico como qumico entre las macromolculas. Han sido
estudiados como dispositivos de liberacin controlada de teofilina, obteniendo
perfiles de liberacin muy prometedores, ya que se ajustan a los requerimientos del
organismo para este frmaco.

6. Se ha estudiado la citotoxicidad in vitro de los PEC sintetizados por template
observando que los materiales, despus de un exhaustivo lavado, no liberan
sustancias txicas al medio. Las clulas osteoblsticas no se adhieren a la superficie
de los hidrogeles previamente hidratados. Sus propiedades les hacen muy
interesantes en el campo de la liberacin controlada de frmacos.

7. Se ha monitorizado mediante Resonancia de Plasmn Superficial (SPR) la
formacin in situ de PEC por interaccin directa de macromolculas con grupos
inicos complementarios. Adems, se ha estudiado la interaccin de estos
complejos con protenas plasmticos de inters biomdico. Los PEC sintetizados
presentaron una disminucin de la adhesin proteica (sistema quitosano-
poli(HEMA-co-AMPS) o lo que es ms interesante en cuanto a recubrimientos
hemocompatibles se refiere, una selectividad en la adhesin proteica (sistema
quitosano-poli(DMAA-co-AMPS)

8. Por ltimo, se presenta el desarrollo del programa CONVERSIN para la
prediccin de la evolucin de las reacciones de copolimerizacin radical (que sigan
el modelo terminal) con la conversin, de gran cantidad de parmetros, como son:
las fracciones molares instantneas y acumuladas en el copolmero, fracciones
molares de cualquier tipo de secuencia o la longitud media de bloques de uno y otro
componente
CONCLUSIONES 199

APNDICE

DESARROLLO DEL PROGRAMA
CONVERSION PARA LA PREDICCIN DE
LA EVOLUCIN DE LA REACCIN DE
COPOLIMERIZACIN (MODELO TERMINAL)
CON LA CONVERSIN

APNDICE 1: CONVERSION 201
APNDICE 1: Desarrollo del programa CONVERSIN para la
prediccin de la evolucin de la reaccin de copolimerizacin [modelo
terminal] con la conversin.

La ecuacin de Mayo-Lewis
1
(Ecuacin A.1) gobierna la adicin de monmeros
en copolimerizacin radical para el modelo terminal. Sin embargo, si se quiere describir
la evolucin de la reaccin con la conversin bajo este modelo terminal o de primer
orden de Markov, se debe recurrir a una de las formas integradas de la ecuacin de
copolimerizacin, siendo la aproximacin ms comnmente utilizada la de Skeist
2
. En
este apartado se desarrolla un algoritmo que permite emplear la solucin integrada
exacta de la ecuacin diferencial (Ecuacin A.2), para predecir tericamente y sin llevar
a cabo ninguna aproximacin, la evolucin con la fraccin inicial en alimentacin y con
la conversin de diferentes parmetros, como las fracciones molares promedio e
instantnea en el copolmero, la distribucin de secuencias, la longitud media de las
mismas, etc.

[ ]
[ ]
[ ] [ ][ ]
[ ] [ ][ ]
2 1
2
2 2
2 1
2
1 1
2
1
2 1 2 2
2 1 1 1
2
1
F F F r
F F F r
f
f
molares fracciones en o
M M M r
M M M r
M d
M d
+
+
=
+
+
=
Ecuacin A.1: Ecuacin de Mayo Lewis. [M
i
] =concentracin molar del monmero i. F
i
=
fraccin molar en la alimentacin. f
i
=fraccin molar en el copolmero. r
1
y r
2
=relaciones de
reactividad
[ ]
[ ]
[ ][ ]
[ ][ ]
( )
[ ]
[ ]
( )
[ ]
[ ]
( )( )
2 1
2 1
2
2
1 1
1
2
20
10
1
2
2
1
1
1
2 10
1 20
20
2
1 1
1 1
r r
r r
r
r
r
M
M
r
r
M
M
r
M M
M M
M
M

=
Ecuacin A.2: Solucin integrada de la Ecuacin A.1, [M
i0
]=concentracin inicial del monmero
i y [M
i
]=concentracin del monmero i a un tiempo t.

El algoritmo desarrollado ha sido programado en BASIC (el programa se ha
llamado CONVERSION) y tiene carcter general, es decir, predice el desarrollo de una
reaccin dada para cualquier valor de r
1
y r
2
, es decir, para cualquier pareja
copolimrica. En trminos de reactividades diferenciales entre los componentes 1 y 2 de
una pareja copolimrica, hay cuatro posibles reacciones, tal y como se ha representado
en los diagramas de composicin de la Figura A.1.

Figura A.1: Diagramas de composicin correspondientes a los cuatro tipos posibles de
reacciones de copolimerizacin. a: r
1
<1 y r
2
>1; b: r
1
>1 y r
2
<1; c: r
1
<1 y r
2
<1 y d: r
1
>1 y r
2
>1

Si el diagrama queda por debajo de la diagonal en todo el rango de fracciones
molares (ocurre cuando r
1
1 y r
2
1), la alimentacin se va enriqueciendo en el
monmero 1 (menos reactivo), con el resultado de que la reaccin evoluciona con la
conversin hacia la formacin de sistemas progresivamente ms ricos en 1. El caso
opuesto, cuando r
2
1 y r
1
1, se representa por un diagrama situado por encima de la
diagonal. En este caso la reaccin evoluciona con la conversin hacia la formacin de
sistemas progresivamente ms ricos en el componente menos reactivo, 2. A estos dos
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
PAZ
r1=0.1
r2=0.1
azetropo 1

f

c
o
p
o
l
m
e
r
o
F alimentacin
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
PAZ
r1=10
r2=10
azetropo 2

f

c
o
p
o
l
m
e
r
o
F alimentacin
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
r1=0.1
r2=10

f

c
o
p
o
l
m
e
r
o
F alimentacin
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
r1=10
r2=0.1

f

c
o
p
o
l
m
e
r
o
F alimentacin
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
PAZ
r1=0.1
r2=0.1
azetropo 1

f

c
o
p
o
l
m
e
r
o
F alimentacin
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
PAZ
r1=10
r2=10
azetropo 2

f

c
o
p
o
l
m
e
r
o
F alimentacin
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
PAZ
r1=0.1
r2=0.1
azetropo 1

f

c
o
p
o
l
m
e
r
o
F alimentacin
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
PAZ
r1=10
r2=10
azetropo 2

f

c
o
p
o
l
m
e
r
o
F alimentacin
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
r1=0.1
r2=10

f

c
o
p
o
l
m
e
r
o
F alimentacin
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
r1=10
r2=0.1

f

c
o
p
o
l
m
e
r
o
F alimentacin
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
r1=0.1
r2=10

f

c
o
p
o
l
m
e
r
o
F alimentacin
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
r1=10
r2=0.1

f

c
o
p
o
l
m
e
r
o
F alimentacin
a
b
c d
casos (que en realidad son el mismo, considerando 1 como 2 y viceversa), hay que
sumarles los dos posible sistemas azeotrpicos (SAZ). En estos casos hay dos regiones
diferenciadas en el diagrama de composicin: aquellas separadas por el punto
azeotrpico (PAZ). En el PAZ, la fraccin en el copolmero no vara con la conversin
porque es igual a la fraccin molar en alimentacin. En el primer tipo de SAZ, cuando r
1

y r
2
son menores de la unidad, las reacciones evolucionan con la conversin hacia los
homopolmeros. Es decir, reacciones con fracciones molares en alimentacin menores
que el PAZ, consumen preferentemente monmero 1, de forma que las cadenas
macromoleculares que se van formando a lo largo de la reaccin se enriquecen
progresivamente en monmero 2; y reacciones con fracciones molares mayores que el
PAZ tienen la tendencia opuesta. Finalmente, el segundo tipo de SAZ (cuando r
1
y r
2

son mayores de la unidad) muestra un comportamiento bien diferente. En este caso las
reacciones no tienden hacia los homopolmeros sino hacia el PAZ. La regin de
fracciones molares por debajo del PAZ consume preferentemente monmero 2, de
forma que las cadenas macromoleculares que se van formando a lo largo de la reaccin
se enriquecen progresivamente en monmero 1. La regin por encima del PAZ, en
cambio, consume preferentemente monmero 1 y la reaccin evoluciona hacia sistemas
ms ricos en el componente 2. Este tipo de comportamiento no es, en cualquier caso,
muy relevante, pues no se da en la prctica.

La Figura A.2 muestra un esquema simplificado del algoritmo utilizado y la
Figura A.3 las lneas ms representativas de CONVERSION. El programa discrimina
en primer lugar entre los cuatro tipos mencionados de copolimerizacin y define un
paso positivo o negativo dependiendo de si el medio de reaccin consume
preferentemente uno u otro monmero. A continuacin el programa se direcciona a la
rutina comn generadora de puntos (lneas 10000 en adelante), donde se inicia un
barrido en todo el rango de fracciones molares iniciales en alimentacin, con la ayuda
de un contador. Cada uno de estos puntos es considerado como inicio de una reaccin y
la rutina escribe primero los puntos a conversin cero (generando el diagrama de
composicin). Posteriormente predice la evolucin con la conversin (para esta
fraccin inicial definida por el contador) utilizando las Ecuaciones A.1 y A.2. El
programa da por terminada la reaccin cuando la conversin es superior a 0.9999,
pasando a predecir la siguiente. En el caso de los azetropos, hay una redefinicin del
signo del paso en el punto azeotrpico tal y como se explica en la Figura A.3.

Figura A.2: Representacin esquemtica del desarrollo del algoritmo CONVERSIN.
entrada r
1
y r
2
r
1
<1 y r
2
<1
(azetropo 1)
r
1
<=1 y r
2
>=1
r
1
>=1 y r
2
<=1
r
1
>1 y r
2
>1
(azetropo 2)
clculo de la fraccin
molar del punto
azeotrpico
FAZ=(r
2
-1)/(r
1
+r
2
-2)
clculo de la fraccin
molar del punto
azeotrpico
FAZ=(r
2
-1)/(r
1
+r
2
-2)
step=-0.1 step=+0.1
step=+0.1 step=-0.1
contador =1
contador =100?
s
fin del programa
[M
1
]
0
=contador, [M
2
]
0
=100-contador
fraccin inicial en alimentacin, F
0
=M1/(M1+M2)
Aplicacin de Mayo Lewis, ec. 1
determinacin de la fraccin instantnea inicial
en el copolmero, f
0

no
M
1
/M
2
=(1+step)M
1
/M
2
clculo F (alimentacin)
en caso de sistema azeotrpico
F<FAZ?
si
no, azetropo 2 no, azetropo 1
step=-0.1
step =+0.1
aplicacin de la ecuacin integrada, ec. 2
clculo de [M
1
]
clculo de la conversin
contador=contador +1
clculo de la fraccin acumulada del copolmero
aplicacin de Mayo Lewis, ec. 1
determinacin de f (copolmero)
clculo de la distribucin de secuencias instantnea
s
fin del programa
no
salida
F
0
, f
0
M
1
=M
10
, M
2
=M
20
salida
conversin
salida F
f, secuencias
conversin >0.9999?
Figura A.3: Lneas ms significativas del programa CONVERSIN.

CONVERSION
10 INPUT sistema , SIS$
20 INPUT r1 , R1
30 INPUT r2 , R2
40 OPEN O, #1, C:+SIS$+.dat
90 IF (R1<1 AND R2<1) THEN GOSUB 1000
100 IF (R1>1 AND R2>1) THEN GOSUB 2000
110 IF (R11 AND R21) THEN GOSUB 3000
120 IF (R11 AND R21) THEN GOSUB 4000
130 CLOSE
140 END
1000 FAZEOTROPO=(R2-1)/(R1+R2-2)
1010XAZEOTROPO=FAZEOTROPO/(1-
FAZEOTROPO)
1050 PASO=-0.1
1060 LIMITEINFERIOR=0
1070 LIMITESUPERIOR=XAZEOTROPO
1080 GOSUB 10000
1090 PASO=+0.1
1100 LIMITEINFERIOR=XAZEOTROPO
1110 LIMITESUPERIOR=1
1120 GOSUB 10000
[2000-2120]igual que [1000-1120] pero con pasos de
signo contrario.
3000 PASO=+0.1
3010 LIMITEINFERIOR=0
3020 LIMITESUPERIOR=1
3030 GOSUB 10000
3040 RETURN
[4000-4040] IGUAL QUE [3000-3040] pero con paso
de signo contrario.
10000 FOR N=1 TO 99
10010 M10=N
10020 M20=100-N
10030 X0=M10/M20
10040 F0=M10/(M10+M20)
10050 CONSTANTE=((F0)^2)*R1+F0*(1-F0)+R2*((1-
10060 F0)^2))
10070 FC0=CONSTANTE/(1+CONSTANTE)
10080 PRINT #1, F0, 0, FC0
10090 X=X0
10100 X=X+PASO*X
10110 IF X?LIMITEINFERIOR THEN GOTO 10210
10120 IF X?LIMITESUPERIOR THEN GOTO 10210
10130 M2=M20*((X/X0)^(R2/(1-R2)))*(((1-R2+(R1-
1)*X)/(1-R2+(R1-1)*X0))^((R1*R2-1)/((1-R1)*(1-R2))))
10140 M1=X*M2
10150 F=M1/(M1+M2)
10160 CONSTANTE=((F)^2)*R1+F*(1-F)+R2*((1-
F)^2))
10170 FC=CONSTANTE/(1+CONSTANTE)
10180 CONVERSION=(M10+M20-M1-
M2)/(M10+M20)
10190 PRINT #1, F0, CONVERSION, FC
10200 IF CONVERSION <0.9999 GOTO 10100
10210 NEXT
10220 RETURN

Entrada de r1 y r2

Discriminacin de los sistemas. Hay cuatro
posibilidades, tal y como se muestra en la figura 1

Ejemplo de sistema azeotrpico 1, cuando r1 y r2 son
menores de 1. En este caso hay que considerar dos
regiones a la hora de generar los puntos tericos:
fracciones iniciales en alimentacin menores del punto
azeotrpico que consumen ms rpidamente el
monmero 1 y evolucionan hacia su agotamiento, y
fracciones iniciales en alimentacin mayores del punto
azeotrpico que consumen preferentemente el
monmero 2 y evolucionan hacia su agotamiento. Por
ello se define un paso negativo o positivo. Este paso
es el que usa posteriormente la rutina comn (a partir
de la lnea 10000) para generar puntos con la
conversin. Una reaccin que consuma
preferentemente el monmero 1 necesita un paso
negativo puesto que a medida que avanza la
polimerizacin, la fraccin molar de este monmero 1
disminuye. Por ello la lnea 3000 define un paso
negativo (r11 y r21, es decir, consumo preferente de
2) mientras que la 4000 lo define positivo antes de
redireccionar al programa a la rutina comn en 1000

Rutina de aplicacin de la ecuacin integrada y de la
ecuacin de Mayo Lewis. Generacin de los puntos
fraccin instantnea en el copolmero (FC) en funcin
de la conversin y de la fraccin inicial en la
alimentacin (F0). Si en necesario se pueden
incorporar las lneas necesarias que generen las
fracciones molares acumuladas en el copolmero (a
partir de M10-M1 y de M20-M2), las fracciones
molares de diferentes secuencias (a partir de las
ecuaciones que definen las probabilidades
condicionales p11, p12, p22 y p21) o la longitud media
de bloques.

Como ejemplo, se ha aplicado a los cuatro sistemas modelo utilizados en la
Figura A.1 para las cuatro parejas de valores de r
1
y r
2
de 0.1 y 10. Los puntos
obtenidos, fraccin instantnea en el copolmero frente a la conversin y a la fraccin
inicial en la alimentacin, han sido representados con la ayuda del programa SURFER
dando lugar a las cuatro superficies de la Figura A.4. Las superficies tridimensionales
obtenidas son muy similares a las construidas por el mtodo clsico, es decir,
empleando la aproximacin de Skeist
3,4
.

Figura A.4: Dependencia de la composicin instantnea del copolmero (f) en funcin de la
composicin inicial en alimentacin y la conversin, para los cuatro sistemas anteriormente
mencionados. a: r
1
<1 y r
2
>1; b: r
1
>1 y r
2
<1; c: r
1
<1 y r
2
<1 y d: r
1
>1 y r
2
>1. Las lneas gruesas
corresponden al curso de las reacciones comenzadas en fracciones molares en alimentacin de 0,7 y
0,3 tomadas como ejemplo.

r1=0.1, r2=0.1
azet ropo 1
r1=10, r2=10
azet ropo 2
r 1=0.1, r 2=10
r1=10, r2=0.1
r1=0.1, r2=0.1
azet ropo 1
r1=10, r2=10
azet ropo 2
r1=0.1, r2=0.1
azet ropo 1
r1=10, r2=10
azet ropo 2
r 1=0.1, r 2=10
r1=10, r2=0.1
r 1=0.1, r 2=10
r1=10, r2=0.1 a
b
c d

Una caracterstica de estas superficies tridimensionales es que su corte con
conversin cero da lugar al diagrama de composicin de la Figura A.1. Para facilitar la
discusin, se han dibujado para cada sistema los caminos de reaccin correspondientes
a copolimerizaciones con fracciones molares iniciales en alimentacin de 0.3 y 0.7. Se
aprecia claramente el carcter altamente heterogneo de la mayora de las reacciones, el
cual est relacionado, obviamente, con una eleccin de relaciones de reactividad
alejadas de uno (0.1 y 10). En el caso de parejas copolimricas con valores de estos
parmetros r
1
y r
2
cercanas a 1, las reacciones de copolimerizacin tienen lugar de una
manera mucho ms homognea, tal y como se describi para el sistema DMAA-AMPS
en los Captulos 2 y 3. Sin embargo, para sistemas con una alta reactividad diferencial
de los dos componentes (como son los ejemplos de la Figura A.1), esta prediccin
terica puede tener gran importancia.

Mientras que las reacciones del ejemplo de azetropo d, que tienden con la
conversin hacia el punto azeotrpico, transcurren relativamente homogneamente, las
reacciones del ejemplo de azetropo c, que tienden hacia los homopolmeros, muestran
un comportamiento muy interesante. Ambas reacciones forman inicialmente
copolmeros con una composicin cercana a la azeotrpica, pero a partir de
conversiones superiores al 50 %, toman caminos divergentes, de forma que por debajo
del PAZ las composiciones finales de las cadenas son muy ricas en 2, mientras que por
encima del PAZ, se forman cadenas muy ricas en 1. Los ejemplos a y b son en realidad
la misma copolimerizacin donde los componentes son 1 y 2 2 y 1 respectivamente.
Se aprecia en ambos casos, la formacin de dos especies a lo largo de la reaccin.
Inicialmente se forman cadenas ricas en el componente ms reactivo, y una vez
consumido una gran parte del mismo, se forman macromolculas cada vez ms ricas en
el componente menos reactivo. Un anlisis global de la reaccin, sin embargo, no nos
ofrece esta valiosa informacin. En este sentido, la Figura A.5 muestra
comparativamente las fracciones molares instantnea y acumulada para el ejemplo a (r
1
=0.1 y r
2
=10). La composicin media se incrementa lentamente hasta alcanzar
lgicamente la composicin inicial en alimentacin. Esta tendencia no refleja, sin
embrago, la distribucin real, altamente heterognea, de las composiciones en las
cadenas, que tendr cierta influencia en las propiedades de los materiales.


Figura A.5: Fraccin molar acumulada (izquierda) e instantnea (derecha) en el copolmero en
funcin de la fraccin molar en alimentacin y la conversin, para el sistema r
1
=0,1 y r
2
=10.
Las lneas gruesas representan el curso de las reacciones empezandas en fracciones molares en
alimentacin de 0,3 y 0,7 tomadas como ejemplo.

Adems de la fraccin instantnea (o la acumulada) en el copolmero, el
programa puede predecir la evolucin con la conversin de otros parmetros o aspectos
de la reaccin como son las fracciones molares de secuencias o la longitud media de
cadenas. Como ejemplo en la Figura A.6 se muestran las fracciones molares centradas
en 1 y 2 para uno de los sistemas modelo (r
1
=0.1 y r
2
=10). Las fracciones molares
obtenidas estn de acuerdo con la discusin previa y con el carcter altamente
heterogneo de la reaccin que da lugar a la formacin de dos especies predominantes,
cada una de ellas rica en uno de los componentes. En este caso, el componente 2 es
mucho ms reactivo que 1 y a bajas conversiones y altas composiciones iniciales de 2,
se forman preferentemente triadas 222, mientras que a altas conversiones y altas
composiciones iniciales de 1, se forman triadas 111. Las heterotriadas (112+211, 212,
221+122 o 121) se forman en pequea proporcin a los largo de la diagonal que separa
la formacin de las dos especies predominantes.

Figura A.6: Fracciones molares de las triadas centradas en uno (arriba) y en dos (abajo) para el
sistema r
1
=0,1 y r
2
=10

En conclusin, se ha desarrollado un programa [CONVERSION] capaz de
predecir, para una reaccin de copolimerizacin binaria que se ajuste al modelo
terminal, la evolucin con la conversin de gran cantidad de parmetros, como son:
fracciones molares instantneas y acumuladas en el copolmero, fracciones molares de
cualquier tipo de secuencia, o longitud media de bloques de uno u otro componente.
BIBLIOGRAFA

2)Skeist I. J Am Chem Soc 1946, 68, 1781.
3)Gallardo A., Lemus R., San Romn J ., Cifuentes A., Dez-Masa J .C. Macromolecules
1999, 32, 610-617.
4)Aguilar M.R., Gallardo A., San Romn J ., Cifuentes A. Macromolecules 2002, 36.

INTRODUCCIN

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