TEMA -18- ESTIMULACIN Y MEDIDA DE PROLIFERACIN Y

APOPTOSIS


PROLIFERACIN CELULAR:

Estimulacin del crecimiento celular:

Estimulacin policlonal: mitgenos: PHA, ConA, sterers de forbol
Estimulacin policlonal mediante anticuerpos monoclonales y microparticulas

Medida de crecimiento celular:

En bruto: (En bruto: medida en general, un promedio de lo que ocurre en cada
clula).
o Incorporacin de I-T
o Ensayo MTT
En clulas individuales
o Microscopia y contadores hematolgicos
o Anlisis del contenido de DNA

1.-ESTIMULACIN DEL CRECIMIENTO CELULAR

Tenemos unas clulas se aade un mitgeno y vemos si ste induce su proliferacin.
Mitgeno viene de mito (mitosis) y geno (gnesis), ser una sustancia que induce
mitosis, de manera que a todas las sustancias que induzcan la proliferacin celular se
las llamar mitgenos.

1.1 Estimulacin policlonal del crecimiento celular mediante molculas mitognicas
(sustancia que induce mitosis).

Fitohemaglutinina (PHA)/ concanavalina A (ConA): es una lectina, una protena, que
se une al TCR (receptor) del linfocito T y va a emular el encuentro antignico. Esto hace
que el linfocito prolifere. Estas sustancias estn sacadas de plantas y se usan mucho
para la induccin de la proliferacin.

Superantigenos bacterianos: Son producidos por bacterias, son unas protenas que lo
que van a hacer es unirse al TCR, y van a inducir su proliferacin. Estas protenas son
producidas por las bacterias para despistar al sistema inmune. Con estos se activa a
una gran cantidad de linfocitos T, agotando el sistema, se activa de manera policlonal a
todos los clones de los linfocitos. De esta manera crecern una gran cantidad de clones
no solo los especficos para la bacteria.

A todos estos se los denomina mitgenos (emulan el encuentro antignico)
policlonales (no son especficos de un clon de linfocitos T sino que activan a todos los
clones) de linfocitos T (solo estimulan a estos).

Forbol-12-miristato 13-acetato (PMA): Es un agonista de la PKC, esta ultima se activa
cuando el receptor de esa celula reconoce el ligando. Estaramos activando todas las
clulas del sistema inmune, de manera muy potente. Es liposoluble, pudiendo entrar
dentro de la clula y activando la PKC. Es un potente activador pero a su vez es muy
toxico, por lo que la dosis a la que estimula es crtica, y si se sobrepasa la dosis se
pueden matar todas las clulas.

Aunque estas formas de activar se usan son mas antiguas que las siguientes, en las que
utilizaremos anticuerpos monoclonales.

Estimulacin policlonal mediante anticuerpos monoclonales.

Los mas utilizados son:

Anticuerpos Anti-CD3 (mdulo de transmisin de seal del TCR): se unen al CD3
emulando el anticuerpo antignico y activando al linfocito T. Se pueden usar tanto
solubles como pegados a la placa de cultivo. Son mucho mas especficos.

2.-MEDIDAS DEL CRECIMIENTO CELULAR

En bruto:

En bruto: cuantificacin de la replicacin utilizando timidina tritiada (
3
H-T).

La contaminacin de la timidina tritiada es uno de sus problemas. El fundamento
consta de:

Tenemos unas clulas de la que quiero conocer su proliferacin. Aado la timidina
tritiada al medio en el que estn creciendo esas clulas. Espero unos das,
dependiendo de cmo sean las clulas. Si la clula se est dividiendo utilizar la
timidina con tritio que est en el medio incorporndola a su DNA. Despus se mide la
radiactividad que emite el DNA de las clulas. Si la clula no se divide no incorporar
nada. Cuantas mas veces se dividan las clulas mas tritio incorporaran. Por lo que la
cantidad de radiactividad ser directamente proporcional al nmero de veces que se
han dividido las clulas.

Para romper las clulas se congelan, se pasan a travs de un filtro, en ese filtro queda
retenido el DNA, y luego ser mide en un contador Beta la radiactividad.

Ventajas y desventajas:
Sensibilidad. Es su gran ventaja.
Correlaciona con la sntesis bruta de DNA, pero no con el crecimiento neto:
Puedo tener incorporacin de timidina tritiada, las clulas se dividen crecen e
incorporan la timidina tritiada, pero estas clulas pueden morir. Neto quiere
decir medir la radiactividad nicamente de las clulas vivas.
Muy eficiente en tiempo.
Utiliza istopos radiactivos.

En bruto: Ensayo MTT

Es un tpico ensayo bioqumico. Se va a medir la actividad de la deshidrogenasa
mitocondrial que nicamente va a estar presente en las clulas vivas. Es un ensayo
colorimtrico. Se utiliza un sustrato el MTT, que es soluble en agua. Este es
catabolizado por enzimas deshidrogenasas que se encuentran en mitocondrias de
clula vivas, se cataliza y se forma formazn, que es una sustancia que tiene color y es
insoluble, por lo que precipita. Esto es lo que finalmente se ve.

La cantidad de color ser directamente proporcional al nmero de clulas
metablicamente activas.

Ms moderno es el ensayo XTT pero de funcionamiento simjilar.

Ventajas: puedo hacer cientos de medidas con l.
Ensayo frecuentemente utilizado in vitro.
Rpido, verstil, cuantitativo y reproducible.
Adaptable al screening a gran escala, pertinente para la mayora de tipos
celulares.
Sensible.

Desventajas:
La ms grande es que es menos efectivo cuando hay muy poco crecimiento
celular.
No cuantifica el nmero de clulas individuales que se han dividido sino que
hace un promedio.

*Que tenga el doble de clulas no quiere decir que las que tenga se hayan dividido una
vez, sino que hay una gran variedad de eventos que pueden haber ocurrido. Algunas
pueden haberse dividido ms de una vez, otras pueden haber sufrido apoptosis

*Por qu hay que matar una clula para marcarla? Hay una tcnica que mide la
cantidad de DNA que miden las cluas, y para ello hay que fijar y permeabilizar, para
que la sonda que se utiliza para marcar el DNA entre dentro de la clula, por eso hay
que matarlas.

*La ICD (muerte celular inducida por activacin). A veces la clula tras ser inducida su
proliferacin, se sobreestimula activando un programa de muerte celular.

*Una clula que ha entrado en apoptosis podra dejar de seguir en apoptosis? Si una
clula ha fragmentado su DNA, no hay vuelta atrs, ya que este es uno de los objetivos
finales de la apoptosis. En estadios ms iniciales de la apoptosis es posible revertir el
inicio de muerte celular, debido a que hay mecanismos de control que inhiben el
proceso de apoptosis como la protena PCL-2, P53 (aparece mutada en los tumores
humanos, es el guardin del genoma. De esta manera se acumulan mutaciones en el
DNA sin que se ejecute el programa de muerte. Es antiapopttica.).

Siempre que hay un mecanismo activador, tiene que haber uno inhibidor.

En clulas individuales:

En clulas individuales: Microscopia. Cmara de contaje:

Cmara de contaje con azul tripn:
Se suele utilizar una sonda que entra en las clulas no viables, muertas, y es
excluida por las clulas vivas. De manera que podemos medir a medida que
contamos la viabilidad celular.
Mtodo automatizado para la determinacin ptima del nmero de clulas y
viabilidad por azul tripn:
o Innovatis
En clulas individuales: microscopia o contadores hematolgicos:
Desventajas:
o Problema las clulas se cultivan a densidades muy bajas
o Impreciso y tedioso.

Anlisis del contenido de DNA:

Cantidad de DNA en clulas individuales:

Cuando las clulas estn quiescentes o G1, estn en diplodie. En fase de sntesis
tretaploide o diploide, y en G0 o S, en tetraploide.

1. Marcar la cantidad de DNA:
Yoduro de propidio (PI): Sonda fluorescente, que adems es un agente
intercalante del DNA. Cuando entra dentro de la clula se va a fijar al DNA,
pero no entra en clulas viables, por lo que hay que fijar y permeabilizar las
clulas generando poros en las clulas que permiten la penetracin del
yoduro y la unin de este con el DNA.
Si una celula est en 2n va a emitir una determinada cantidad de
fluorescencia, si esta duplica su cantidad de DNA tendr el doble de DNA y
por tanto el doble de sonda fluorescente unida a su DNA, por lo que emitir
el doble de fluorescencia.
Imagen de ciclo celular:
o Pico de menor intensidad: Clulas en G0-G1.
o Pico ms a la derecha: Clulas en mitosis.
o Clulas entre ambos picos: Clulas que se encuentran en fase S, con
un contenido intermedio de fluorescencia.

*La eleccin de los mtodos depende de los aparatos de los que se disponga, del
dinero y de la sensibilidad que se necesite.

*Las tcnicas ms utilizadas dependen tambin, el dinero tambin depende, una
tcnica puede comprarse o bien fabricar el kit en casa (los ensayos colorimtricos son
bastante baratos, al contrario que los anticuerpos monoclonales); y el tiempo que se
tardara tambin depende, hay mtodos ms largos.

*Normalmente se analiza sangre perifrica de determinados perifrica con alguna
patologa y se compara con sangre de los controles sanos. As se ve que por ejemplo
los pacientes con esclerosis mltiple tienen menos apoptosis que los controles sanos.

APOPTOSIS

1.-INDUCCIN DE APOPTOSIS

Inhibicin de la sntesis de protenas

Hay cientos de molculas que inducen apoptosis. Los dos ms famosos son:
o La cicloheximida, inhibe la sntesis de protenas.
o La estaurosporina inhibe la PKC, de manera que la clula tambin entra en
apoptosis. Induce apoptosis especficamente y vale para prcticamente todos
los tipos celulares.

Interferencia con el ciclo celular

o Etoposido induce apoptosis en fase S. Es un inhibidor de la topoisomerasa II.
Quimioterapia.
o Radiacin en S y G
2
/Mitosis. Se puede utilizar luz UV, tambin se puede utilizar
radiacin gamma.

2.-MEDIDA DE APOPTOSIS

La apoptosis consta de tres fases: iniciacin, ejecucin y finalizacin. Pudiendo utilizar
distintos aparatos para medir cada una de las fases.

Lo que se hace para medir un determinado fenmeno, primero se conocen las
caractersticas que definen ese fenmeno biolgico y despus se utilizan para medirlo.

La cromatina se condensa, se produce deshidratacin celular, emisin de cuerpos
apoptticos, activacin de endonucleasas, y se altera la integridad estructural y
funcional de la membrana, y tambin se pierde la asimetra de los fosfolpidos.

En bruto.

Electroforesis: patrn en escalera

Las endonucleasas en el estadio final de la apoptosis van a cortar el DNA. Tenemos
clulas en cultivo, extraemos el DNA y hacemos una electroforesis con ese DNA. Al
patrn de escalera se le llamaba sello distintivo de apoptosis, ya que solo cuando la
clula se est muriendo por apoptosis aparece un patrn en escalera.

Si se hace una electroforesis, vamos a tener una banda que son fragmentos de 200 pb,
pero tambin puede haber fragmentos de 400, 600, 800, 1000 pb, de manera que nos
queda un aspecto de escalera.

Western blot, protemica, ELISA y PCR

o Ofrece gran cantidad de informacin.
o Balance de protenas no bien comprendido todava. Errores en la
interpretacin.

Si una clula tiene ms cantidad de protenas supresoras de apoptosis vive, mientras
que si tiene ms cantidad de protenas proapoptticas va a entrar en un programa de
muerte. Con este mtodo se puede hacer un balance entre protenas proapoptticas y
antiapoptticas.

En clulas individuales:

Comet assay

La propiedad de las clulas apoptticas que utiliza es la fragmentacin del DNA.
Combina una electroforesis, se pone una clula en un sitio del gel de electroforesis,
otra en otro, y as, y se hace una electroforesis con clulas embebidas en el gel. Esas
clulas previamente han sido permeabilizadas. Si esa clula tiene todo su DNA ntegro,
cuando ponga la diferencia de potencial en la electroforesis, como el DNA est todo
entero y adems dentro de la clula, no se va a mover. En cambio, si esa celula ha
sufrido apoptosis, va a tener parte del DNA ntegro pero parte va a estar fragmentado
en fragmentos de 200 pb. Cuando eso lo pongo en electroforesis migrarn por la
diferencia de potencial y es lo que le da el aspecto de cola de cometa (comet assay).

Estudio del DNA fragmentado: TUNEL (TdT-mediated dUTP-biotin Nick end labelling).

Aado desoxinucleotidos marcados con un fluorocromo y una enzima que haga que
esos nucletidos marcados fluorescentemente se unan al DNA. De esa manera se
marcan los extremos libres de DNA que han sido cortado por la endonucleasa. Las
clulas viables apenas tienen extremos terminales, pero clulas que han fragmentado
su DNA van a dar seal.

Esta tcnica se usa mucho, en microscopia de fluorescencia, confocal y citometra de
flujo. Es un marcaje intracelular.

Permeabilidad a sondas fluorescentes que se unen al DNA
o PI (yoduro de propidio)
o 7AAD (7 aminoactinomicina D)

Son dos sondas que tienen 3 propiedades:
o Fluorescentes: para poderlas detectar.
o Agente intercalante del DNA.
o Vital. (como el azul de tripn, salvo que estas emiten luz visible).

Las clulas excluyen la sonda porque sta ltima no puede pasar a travs de la
membrana porque son sondas catinicas, son sondas que estn cargadas .Si la clula
mantiene el potencial de membrana, al estar cargadas son repelidas; cuando la clula
pierda el potencial de membrana podrn penetrar. Esto recibe el nombre de prdida
de integridad estructural y funcional de la membrana plasmtica.

Las clulas negativas para la sonda sern las viables, y las positivas para la sonda sern
las no viables.

Desventajas:
o Detecta apoptosis tarda
o No discrimina necrticas

Ventajas:
o Fcil
o Barato
o Rpido

La muerte por apoptosis es fisiolgica, la muerte por necrosis es una muerte por
estrs, por un dao externo, no es una muerte programada. Por ejemplo, en un infarto
de miocardio cunado hay anoxia al haber un trombo, las clulas se mueren por
necrosis ya que no les llega oxgeno. Cuando sta se muere por necrosis, revienta y
vierte su contenido al medio donde est, produciendo ms dao en el tejido. Las
clulas del miocardio que estn ms alejadas del miocardio sufren hipoxia, y morirn
por apoptosis. La clula al detectar que hay un problema de falta de oxgeno la clula
programa su muerte, es un proceso silencioso y produce antiinflamacin.

Cambios en la composicin lipdica: aumento de PS

o Translocacin de la PS durante la apoptosis.
o La translocacin es universal y especfica.
o Anexina V reconoce especficamente PS.
o Combinacin con sondas vitales (7AAD).

Se vio que durante la apoptosis haba una translocacin desde la cara interna a la
externa de la membrana plasmtica de la fosfatidil serina. Por ejemplo, las flipasas se
activan en la apoptosis. Esta translocacin es universal porque ocurre en todos los
tipos celulares, y es especifica de apoptosis, y ocurre solo en muertes por apoptosis. .

La anexina V es una protena que reconoce especficamente fosfatidil serina.

En clulas viables la fosfatidil serina est en la cara interna, y la anexina no la
reconoce. En los estadios tempranos de la apoptosis, la fosfatidil serina transloca a la
cara externa donde que da expuesta y es reconocida por la anexina V. Como es
apoptosis temprana todava se mantiene la integridad de la membrana plasmtica y el
yoduro de propidio no penetra en la membrana plasmtica.

En un estadio ms tardo se pierde la integridad de la membrana, y el yoduro de
propidio puede penetrar.

La poblacin positiva para anexina V ser no viable, y la negativa para la anexina V
sern viables. Las necrticas son negativas para la anexina V. Todo lo que es anexina V
es apopttico, y lo negativo sern clulas viables y necrticas.

La ventaja de esta tcnica radica cuando se combina con la permeabilidad a sondas
vitales.

Puede tener aplicacin a estudios de coinmunoprecipitacin. Se puede hacer unido a
bolas de agarosa, electroforesis en gel, e identificamos las bandas.