MTODOS DIAGNSTICOS PARA PESQUISA DE HEMOPARASITAS

REVISO DE LITERATURA
Luiz Eduardo Ristow
Denise Oliveira Jcome
TECSA Laboratrios

ristow@tecsa.com.br

DIAGNOSTIC METHODS FOR RESEARCH OF HAEMOPARASITES a review

Resumo: Os hemoparasitas, parasitas intracelulares obrigatrios, so responsveis por causar uma srie de doenas em ces, a
nvel mundial. No Brasil, as que mais se destacam so a babesiose, a erliquiose e a hemobartonelose. Um dos maiores problemas
no controle dessas doenas o seu diagnstico pela identificao do agente etiolgico. A pesquisa de hemoparasitas no esfregao
sanguneo um mtodo subjetivo e de baixa sensibilidade, j que depende da experincia tcnica de quem a faz, de uma alta
parasitemia, de um intervalo de tempo que pode ser longo, entre outros fatores. Entretanto, j esto disponveis tcnicas sorolgicas
como a imunofluorescncia indireta (IFI), ELISA, dot-blot-elisa, western immunoblotting e tcnicas de biologia molecular como o
PCR que tm demonstrado uma melhor eficincia no diagnstico das hemoparasitoses, permitindo um tratamento bem sucedido
pela precocidade no diagnstico.
Unitermos: Diagnstico, babsia, erliquia, hemobartonela, ces.
Abstract: The haemoparasites, obligate intracelular parasites are responsable for a lot of diseases in dogs in the world. In Brazil, the
most important are babesiosis, erlichioses and haemobartonelosis. The biggest problem to control these diseases is the identification
of the etiologic agent. The detection of infected erythrocytes in blood smears is a subjetive method and have low sesitivity, because it
depends of the experience of the technician, high parasitemia, a long time of search, etc. However, there are sorologic technics
available, like the indirect fluorescent antibody test (IFA), ELISA, dot-blot-elisa, Western immunoblotting and PCR ( polymerase chain
reaction) that have been demonstrated a best efifciency at the diagnostic of haemoparasite diseases, for a successfull treatment by
a precocity diagnostic.
Key-words: Diagnostic, babesia, ehrlichia, haemobartonella, dogs.

As tcnicas de identificao
das hemoparasitoses vm
aumentando
significativamente
nos
ltimos anos, devido ao
maior conhecimento sobre
as doenas causadas por
elas, maior expanso
geogrfica
de
sua
ocorrncia e melhoria das
tcnicas de diagnstico.
Como na maioria dos casos
os animais acometidos por
hemoparasitas apresentam
sintomas inespecficos, o
diagnstico
atravs
do
exame clnico torna-se
limitado. Desta forma,
testes diagnsticos de alta
sensibilidade
e
especificidade, de fcil e

rpido manuseio e de baixo

custo, tornam- se essenciais
para melhorar a eficincia
da identificao de animais
portadores, j que a
pesquisa desses parasitas no
esfregao
sanguneo

demorada e de baixa
sensibilidade. No presente
artigo vamos abordar uma
reviso
das
principais
doenas
causadas
por
hemoparasitas em ces no
Brasil e as metodologias
mais adequadas para o seu
diagnstico.
BABESIOSE CANINA
A babesiose canina uma
doena de importncia

mundial. A babsia um
parasita intraeritrocitrio de
formato
piriforme,
pertencente

classe
Sporozoa,
ordem
Piroplasmida e famlia
Babesiida e est distribuda
desde o sudeste europeu,
frica,
sia
at
o
continente americano. Seus
vetores so o carrapato
Rhipicephalus sanguineus
(encontrado no Brasil),
Dermacentur reticulatus e
Haemaphysalis leachi.. H
73 espcies de babsias
identificadas, sendo que a
Babesia canis conhecida
por infectar naturalmente o
co 7.

Os sinais clnicos so em
geral inespecficos, com
presena
de
anorexia,
anemia, febre, letargia e at
anemia hemoltica, ictercia,
esplenomegalia e vmito na
fase aguda. No hemograma
observa-se
anemia,
trobocitopenia, leucocitose,
com aumento da contagem
de linfcitos e eosinfilos.
Na bioqumica acha-se uma
hiperbilirrubinemia como
reflexo da destruio dos
eritcitos
e
colestase
intraheptica. Na urinlise
podem
ser
vistos
bilirrubinria,
hemoglobinria, proteinria
e cilindros granulosos 7.
A babesiose canina requer
um diagnstico precoce e
uma tcnica diagnstica
com boa sensibilidade,
especificidade, acurcia e
valores preditivos positivos
e negativos 4.
O mtodo mais usual para
confirmar a suspeita de uma
babesiose aguda a
deteco de
eritrcitos
infectados em todo o
esfregao sanguneo, mas a
percentagem de clulas
infectadas pode ser bastante
varivel. A presena de
organismos
piriformes,
entre (2,4m x 5,0m) de
largura, em pares, so
indicativos de parasitemia
por Babesia canis. O
esfregao sanguneo fixado
na colorao de MayGrnwald-Giemsa um
mtodo simples e barato e
tem alta especificidade, no

entanto,
estudos
de
infeces experimentais tm
mostrado que a parasitemia
no constante e baixos
nmeros
de
eritrcitos
infectados podem requerer
uma avaliao microscpica
extensa. Esfregaos obtidos
do sangue capilar (ponta da
orelha e ponta da cauda)
tm uma maior percentagem
de clulas infectadas, mas
uma amostra recente e boas
tcnicas de esfregao no
so sempre possveis em um
procedimento
clnico.
Ocasionalmente se visualisa
no esfregao sanguneo a
babsia
dentro
de
neutrfilos, o que o
resultado da fagocitose
neutroflica do organismo
6,8
.
Em
um
estudo,
desenvolveu-se uma tcnica
de separao de babsias,
onde eritrcitos infectados
foram concentrados em um
gradiente discontnuo de
Percoll para otimizar o
diagnstico pelo exame
microscpico. Este estudo
demonstrou
que
o
isolamento eritrocitrio pelo
Percoll uma tcnica
precisa,
com
alta
especificidade, sensibilidade
(94%), acurcia (96%) e
valores preditivos negativos
(90%). Este mtodo tambm
produz
uma
alta
percentagem de clulas
infectadas (> 132 e > 34 x
mais concentrado que a
visualizao
central
e
perifrica do esfregao
sanguneo,
respectivamente), tornando-

se extremamente til no
diagnstico da babesiose
canina,
especialmente
naqueles casos onde a
parasitemia baixa e o
exame
do
esfregao
sanguneo demorado. Ele
tambm eficiente para
preservar uma suspenso
concentrada de parasitas
para futuras investigaes,
usando-se outras tcnicas,
como o PCR ( polymerase
chain reaction) 4.
Os mtodos sorolgicos tm
se mostrado eficientes em
detectar
parasitemias
ocultas e infeces crnicas.
O
teste
de
imunofluorescncia indireta
(IFI)

o
mais
frequentemente usado, mas
caro e deve ser
padronizado
para
a
interpretao dos resultados.
Alguns
autores
tm
demonstrado uma baixa
sensibilidade
da
imunofluorescncia
em
filhotes ou em ces no
incio do curso da doena,
devido a uma insuficiente
resposta imunolgica, se
positivando
apenas
no
estado de convalescncia.
Geralmente ttulos acima ou
iguais
a
1:80
so
considerados
positivos.
Ttulos
de
1:40
so
sugestivos de infeco e
ttulos menores que 1:40 so
considerados negativos. O
resultado positivo de uma
nica amostra parece ser
suficiente
para
o
diagnstico 7,8.

O teste de ELISA (enzymelinked

immunosorbent
assay) e a fixao de
complemento
so
disponveis, mas no muito
utilizados.
Tcnicas
sorolgicas no permitem
um diagnstico precoce,

porque a resposta de
produo de anticorpos no
demonstrvel at 8-10 dias
aps a infeco parasitria 7.
O teste de
dot-blotELISA
tem
sido
desenvolvido
para
o
diagnstico da babesiose

Agente
Babesia canis
Ehrlichia canis
Haemobartonella canis
Haemobartonella felis

ERLIQUIOSE CANINA
A erliquiose canina uma
importante
doena
infecciosa, cuja prevalncia
tem
aumentado
significativamente
em
vrias regies do Brasil. O
gnero Ehrlichia formado
por
Ricketsias
gram
negativas pertencentes
famlia Ehrlichiae e ordem
Rickettsiales, constituindose parasitos intracelulares
obrigatrios que parasitam
os leuccitos do hospedeiro,
causando trombocitopenia.
Vrias espcies do gnero
Erlichia causam infeces
clnicas e subclnicas em
ces, entre elas a Ehrlichia
canis, Ehrlichia platys,
Ehrlichia equi e Ehrlichia
risticii. Destas, a Ehrlichia
canis a maior causadora
de severas infeces em
ces. A E. canis e a E.
risticii
invadem
primeiramente os leuccitos
mononucleares

Classificao
Protozorio
Riqutisia
Riqutisia
Riqutisia

(predominantemente
moncitos) 8,9,10.
A infeco por Ehrlichia
canis frequentemente causa
um dilema diagnstico,
porque os sinais clnicos so
inespecficos.
Na fese
aguda observa-se febre,
secreo
oculonasal,
anorexia, depresso, perda
de peso, cianose, estertores
pulmonares, petquias, etc.
Os
sinais
clnicos
desaparecem na maioria dos
casos
sem
tratamento,
dentro de uma a quatro
semanas,
porm
o
hospedeiro permanece com
a infeco subclnica 8,10.
Na hematologia observa-se
uma anemia moderada,
trombocitopenia
com
aumento do nmero de
plaquetas
imaturas
circulantes e variaes na
contagem de leuccitos. As
alteraes bioqumicas na
fase
aguda
so
caracterizadas por uma
hiperproteinemia
(33%),

canina. Ele simples,

rpido e objetivo, podendo
se tornar muito til como
um teste de screening a
campo de ces suspeitos 7.

Clula parasitada
Hemcia
Leuccito
Hemcia
Hemcia

hiperglobulinemia (39%),
hipoalbuminemia
(43%),
ALT (43%), ALP (31%) e
hiperbilirrubinemia.
Proteinria e hematria
podem ser detectadas em
ces com ou sem azotemia
na fase crnica 8,9,10.
A identificao da mrula
de Ehrlichia canis no
esfregao sanguneo corado
pelo Giemsa demorada e
no
tem
resultado
satisfatrio, j que as
mrulas so encontradas
transientemente
e
em
pequeno nmero. A chance
de se identificar
um
leuccito infectado pode ser
aumentada pelo exame feito
sobre a fina camada de papa
de leuccitos ou pelo
esfregao feito do sangue
perifrico da ponta da
orelha ou cauda. Esfregaos
de amostras de bipsia e de
tecidos
aspirados
(especialmente de ndulos
linfticos, pulmes ou bao)

tm
sido
usados
na
visualizao de incluses
citoplasmticas, e assim
confirmar o diagnstico de
E. canis, mas estas tambm
so tcnicas diagnsticas de
pouca rentabilidade 8,9.
O tcnica da reao de
imunofluorescncia indireta
(IFI) vem sendo largamente
utilizada no diagnstico da
erliquiose desde 1972,
sendo aplicvel tanto para
estudos
de
infeces
experimentais, como para
estudos epidemiolgicos de
campo.
Os
antgenos
utilizados geralmente so
procedentes do cultivo de
clulas infectadas com E.
canis, havendo mnima
reao cruzada entre as
espcies, exceto entre a
Ehrlichia
canis
e
a
Ehrlichia equi. Em ces
infectados
experimentalmente,
o
perodo prvio para a
deteco de anticorpos se
inicia entre 8 a 24 dias,
embora alguns ces no se
apresentem soro positivos
at 28 dias ps infeco,
devido variao da
resposta individual de cada
animal. Os soros que
apresentam
reao
em
diluio igual ou maior a
1:10
podem
ser
considerados
positivos,
porm ttulos de 20 a 80 so
considerados relativamente
baixos. O ttulo do soro
pode variar de acordo com o
estgio da infeco, o
envolvimento imunolgico
com o agente patognico e a
raa do co. Assim, ttulos

de anticorpos de
alta
magnitude (ex. 1:163,840
ou
mais)
geralmente
refletem
uma
infeco
crnica 2,8,9. A persistncia
do ttulo de anticorpos na
IFI por perodos maiores
que
6
meses
aps
tratamento adequado, pode
indicar que o agente no foi
totalmente eliminado do
organismo animal, havendo
tambm a possibilidade do
co se reinfectar aps cessar
o
tratamento.
Tem-se
observado
um
rpido
decrscimo nos ttulos da
IFI, um pouco antes do
bito.
Estes
ces
frequentemente tm uma
severa depresso medular e
so
hipogamaglobulinmicos 8,9.
Resultados falso-negativos
podem ocorrer se o antgeno
no for de boa qualidade ou
se
o
tcnico
for
inexperiente, e resultados
falso-positivos podem ser
observados se a amostra de
soro estiver contaminada
por bactrias 9. Diferenas
no resultado do teste de IFI
podem ser achadas em
diferentes laboratrios e
dentro de um mesmo
laboratrio quando o teste
feito com o mesmo soro em
dias diferentes . Um ttulo
positivo pela IFI indica
somente que o animal foi
exposto, entretanto um
ttulo positivo associado a
uma
histria
clnica
compatvel,
a
achados
fsicos
e
a
testes
laboratoriais
adicionais,

ajudam substantivamente no
diagnstico clnico8. Para
que o sorodiagnstico seja
acurado para esta doena
necessrio
haver
uma
preparao adequada dos
reagentes, principalmente
da cultura de clulas dos
antgenos,
aliada

habilidade de se processar o
teste e interpretar os
resultados em conjuno
com a histria clnica. Estas
so uma das razes pelas
quais h tanta discrepncia
nos resultados de testes de
uma
mesma
amostra
sorolgica,
entre
laboratrios 2,9.
O Western Immunoblotting
uma tcnica quase to
sensvel quanto a IFI no
diagnstico da E. canis e
tem a grande vantagem da
objetividade da leitura (no
sofre
influncia
da
subjetividade do operador,
como ocorre na IFI). Porm,

uma
tcnica
cara,
consome tempo e necessita
de uma tecnologia mais
avanada que a IFI. Em um
estudo,
o
Western
immunoblotting foi capaz
de identificar anticorpos
anti-E. canis a partir do
quarto dia aps a infeco,
apresentando uma reao
mxima entre os dias 10 e
14 aps a infeco 2.
O teste de dot-blot enzyme
linked-immunoassay (dotblot-elisa) uma tcnica
sensvel para a deteco de
anticorpos no soro e
dispensa o emprego de

equipamentos caros. A
tcnica utiliza antgenos
purificados de cultura de
clulas DH 82 infectadas
com E. canis aderidos a
tiras
de
papel
de
nitrocelulose. Essas tiras so
incubadas com uma soluo
de bloqueio (leite em p a
5%) para reduzir reaes
inespecficas e podem ser
congeladas a 20C at o
momento do uso. Para a
execuo do teste, as tiras
so incubadas com o soro
teste e depois com soluo
de conjugado anti-IgGcanino-peroxidase.
Soros
sabidamente positivos e
negativos so empregados
como controles da tcnica.
O dot-blot-elisa to
sensvel e especfico quanto
a IFI. Uma vez feita a
sensibilizao
da
nitrocelulose, ela estvel

por pelo menos um ano. Os

resultados so de fcil
leitura por pessoal no
treinado e proporcionam um
registro permanente 2.
Existem kits comerciais
para o diagnstico da
erliquiose canina que se
baseiam no princpio do
dot-blot-elisa. Um desses
kits o ImmunocombBIOCAL,
capaz
de
determinar anticorpos do
tipo IgG especficos para o
parasito. O teste pode ser
realizado com sangue total
ou soro, de fcil execuo,
rpido e a leitura direta
observando-se a colorao
final da reao 2.
A
polymerase
chain
reaction (PCR) uma
tcnica sensvel e especfica
para a deteco de pequenas
quantidades de E. canis,
podendo ser empregada no

diagnstico a partir de
amostras de necrpsia e de
material de bipsia. Com a
utilizao dessa tcnica foi
possvel o isolamento de
DNA de E. canis de clulas
mononucleares de sangue e
tecidos (pulmes, bao,
linfonodos, rins, crebro e
olhos)
de
animais
infectados. A principal
vantagem da PCR que
permite identificar a espcie
de erliquia causadora da
infeco, o que nem sempre
possvel com outras
tcnicas. Porm uma
tcnica cara e para ser
empregada no diagnstico
de animais suspeitos de
serem portadores, deve-se
aumentar a sensibilidade
dos praimers (seqncia
alvo de DNA) 2.

HEMOBARTONELOSE
CANINA

A
maioria
dos
ces
infectados no desenvolvem
a doena clnica, por no
possurem
um
nmero
suficiente de parasitas no
sangue. Os animais que
apresentam um constante
nvel
de
parasitemia,
desenvolvem
anemia
rapidamente e os que
apresentam
episdios
repetidos de parasitemia a
desenvolvem de forma
gradual. Na fase aguda da
parasitemia observa-se no
hemograma reticulocitose,
policromasia, anisocitose,
corpsculos de Howell-Jolly
e aumento do nmero de
eritrcitos nucleados.

O mtodo mais usado para a

demonstrao da H. canis
a
colorao
do
tipo
Romanowsky
(Giemsa,
Wright, Leishaman e MayGrunwald-Giemsa).
Ateno deve ser dada na
preparao do esfregao
sanguneo e na colorao,
porque s vezes os parasitas
so to poucos que se torna
difcil a sua deteco. Devese ter o cuidado de saber
diferenciar
a
Hemobartonela
de
pontilhados basoflicos, de
outros
organismos,
de
corpsculos de Howell-Jolly
e de artefatos de tcnica. A
identificao do parasita
deve ser feita antes de se

A Haemobartonella canis
o agente causador da
hemobartonelose
canina.
Pertencente ao grupo das
riqutisias, ela um parasita
eritrocitrio obrigatrio, que
causa severas distores na
forma das hemcias. A
Haemobartonella
canis
difere
dos
outros
organismos do seu gnero
por formar cadeias atravs
da superfcie da hemcia
parasitada,
podendo
tambm
aparecer
individualmente na forma
de pequenos pontos, anis
ou basto 5,8.

iniciar a terapia, j que

muitos so destrudos aps
ela ser instalada. No h
testes sorolgicos para a
deteco de infeco por H.
canis 5, 8.
HEMOBARTONELOSE
FELINA
A Haemobartonella felis o
agente
causador
da
hemobartonelose felina O
mtodo mais eficiente para
identificar o parasita a
colorao do esfregao
sanguneo
pelo
MayGrunwald-Giemsa, porque
revela mais parasitas por

campo microscpico. O
maior problema na deteco
da H. felis
a sua
parasitemia cclica. Por isso
os esfregaos sanguneos
devem ser examinados em
dias consecutivos entre pelo
menos 10 a 14 dias. A H.
felis removida dos
eritrcitos
por
agentes
quelantes, como o EDTA
(cido tetra actico etileno
diamino).
Assim,
em
amostras
de
sangue
armazenadas com EDTA, o
nmero de eritrcitos com
H. felis decresce com o
tempo e em alguns casos
pode desaparecer em at 3

horas
aps
o
armazenamento.
Desta
forma os esfregaos devem
ser feitos sobre sangue
fresco,
para
evitar
resultados falso-negativos
5,8
.
No h nenhum sinal clnico
patognomnico ou achado
patolgico especfico para a
deteco
da
hemobartonelose canina e
felina.
O
diagnstico
especfico
da
infeco
requer a demonstrao de
hemcias parasitadas 8.

Referncias Bibliogrficas
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jan/fev, p. 25-28. 2001.

MTODO DO GRADIENTE DE PERCOL

Em um estudo, desenvolveu-se uma tcnica de separao de babsias pelo gradiente de Percoll,
onde eritrcitos infectados foram concentrados com um gradiente discontnuo de Percoll para
otimizar o diagnstico pelo exame microscpico. As amostras foram coletadas em tubos
contendo cido etilenodiaminotetraactico (EDTA), e aps fazer o esfregao e a colorao pelo
May-Grnwald-Giemsa, a alquota de sangue foi centrifugada a 150xg por 10 mintuos. O
plasma e a papa de leuccitos foram descartadas para remover a maior parte dos leuccitos e
ento uma alquota de eritrcitos foi suspensa em igual volume de soluo salina isotnica. A
soluo de Percoll (1.131 g/ml) foi diluda em duas densidades diferentes (1.085 g/ml, 1.102
g/ml) e a suspenso de eritrcitos foi colocada numa camada acima do gradiente descontnuo.
Aps centrifugao a 200xg, por 25 minutos, duas diferentes camadas de eritrcitos foram
detectadas: 1(camada acima) no topo da densidade menor de Percoll e a outra (camada
abaixo) na interface entre as duas densidades. Estas duas camadas foram lavadas com 10 ml
de soluo salina isotnica e o tubo centrifugado a 150 x por 10 minutos. Da o fluido
sobrenadante descartado. A papa de eritrcitos ento fixada pelo May-Grnwald-Giemsa.
A percentagem de clulas infectadas avaliada pelo esfregao de sangue na periferia e parte
central da lmina, aps o isolamento do percoll 4.
Ambos esfregaos sanguneos, como o isolamento das clulas tm altos valores de especificidade e
valor preditivo positivo, mas a sensibilidade, acurcia e valores preditivos negativos foram maiores
na periferia do esfregao sanguneo e muito maiores aps o isolamento de eritrcitos infectados. A
percentagem de clulas infectadas foram significativamente maiores nas clulas isoladas pelo
Percoll do que nas clulas do centro e da periferia do esfregao sanguneo 4.