Rol del Grupo B antgeno de Streptococcus agalactiae: peptidoglicano-Anclado

polisacrido involucrados en la biognesis de la pared celular

Abstract
Streptococcus agalactiae (grupo B streptococcus, GBS) es una importante causa de
infecciones en neonatos y un emergente patgeno en adultos. El carbohidrato
Lancefiel grupo B (GBC) es un antgeno peptidoglicano-anclado que define esta
especie como un Streptococcus grupo B. Aqu, inactivamos el gen gbcO (gen dentro
del GBC) que codifica un putativo UDP-N-acetilglucosamina-1-fosfato: lpido fosfato
transferasa pensado para catalizar la primera etapa de la sntesis de GBC. En efecto,
el gbcO mutante era incapaz de sintetizar el polmero GBC, y se observ un
importante defecto de crecimiento in vitro. Estudio de microscopa electrnica de la
cepa de GBC-carente de S. agalactiae, revel una serie de anomalas relacionadas
con el crecimiento: colocacin aleatoria de los septos, defectuosos proceso de divisin
y separacin celular, y aberrante morfologa celular. Adems, el etiquetado
vancomicina y anlisis de la estructura de peptidoglicano demostraron que, en
ausencia de GBC, las clulas fracasan en iniciar la normal sntesis de PG y no pueden
completar la polimerizacin del sculo de murena. Finalmente, la localizacin celular
de la PG hidrolasa PCSB, que tiene un papel crtico en la divisin de celular de los
streptococos, se alter en el gbcO mutante. En conjunto, estos hallazgos muestran
que GBC es un componente esencial para la pared celular de S. agalactiae cuya
funcin es reminiscente de la de los cidos teicoicos de una pared convencional
encontrados en Staphylococcus aureus o Bacilus subtilis. Adems, nuestros hallazgos
aumentan la posibilidad que GBC-like molculas desempeen un papel importante en
el crecimiento de la mayora, sino todos , los beta-hemolyticstreptococci.
Introduccin
El Streptococcus agalactiae = patgeno que causa la mastitis veterinaria en el
ganado y las infecciones neonatales graves en humanos
Si bien sigue siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad en recin
nacidos, S.agalactiae es un comensal humano que coloniza el recto y la mucosa
vaginal de 15 a 30% de las mujeres [3,5]. Rebecca Lancefield defini originalmente
dos antgenos de carbohidratos de la pared celular en S.agalactiae: el grupo B
antgeno especfico (GBC), comn a todas las cepas y el antgeno capsular que define
actualmente 10 serotipos diferentes (Ia, Ib, II a IX) [6] . La compleja estructura
multiantenaria de GBC en base a la disposicin de cuatro oligosacridos diferentes
(ramnosa, galactosa, N-acetilglucosamina, y glucitol) (Figura 1A) se resolvi en una
serie de estudios seminales.[7,8]. Ms recientemente , el polisacrido capsular y el
hidrato de carbono del grupo B mostraron ser unida covalentemente al peptidoglicano
(PG) en sitios separados, es decir, N-acetilglucosamina y cido N-acetilmurmico
respectivamente [9]. Sobre la base de una prediccin inicial realizado a partir del
anlisis del genoma [10], una completa reconstruccin en silico de la ruta biosinttica
de GBC fue propuesta recientemente por Sutcliffe y sus colaboradores [10,11]. A
pesar de la importancia de GBC en la microbiologa mdica, el papel biolgico de este

polisacrido de superficie es desconocida y la base gentica de su biosntesis no se

abord experimentalmente.
En las bacterias Gram-positivas, la envoltura celular contiene polmeros aninicos
basados en carbohidratos juegan papel importante en las interacciones extracelulares
y como andamios para las enzimas necesarias en el metabolismo de la pared celular
[12,13]. Las dos clases principales de polmeros aninicos son los cidos lipoteicoicos
(LTA) asociados a la membrana plasmtica y los cidos teicoicos de la pared (WTA)
covalentemente anclados al PG.
WTA, que se han estudiado ampliamente en Bacillus subtilis y Staphylococcus
aureus, se inform que es esencial para la correcta divisin celular y la morfologa
[14,15]. WTA estn hechas de cadenas lineales de fosfato de glicerol en B. subtilis, o
ribitol-fosfato en S. aureus, que se unen a la C-6 de los residuos MurNAc de PG a
travs de una unidad de enlace de azcar que contiene la edad [16]. Curiosamente,
no hay ningn informe de la presencia de tipo similar de poli fosfato de alditol WTA
(pAdo P-WTA) en la pared celular de los estreptococos incluyendo S.agalactiae
[9.17.18].
Consistentemente, el anlisis del genoma de S.agalactiae no revel la presencia de
genes ortlogos tagABDEF o tarABFKL implicados en la biosntesis de pAdoP-WTA
en B. subtilis o de S. aureus, respectivamente. Sin embargo, hemos identificado un
gen TagO / TarO ortlogos en todas las cepas de GBS secuenciados (gbs0136 en el
NEM316 cepa) que podra codificar una enzima que cataliza la transferencia de Nacetilglucosamina-1-fosfato a bactoprenil fosfato, en el primer paso la ruta biosinttica
de la WTA.
Presencia de Gen que codifica un ortlogo de Taro en GBS genoma ( gbcO) sugiere
que un glicoconjugado de la pared celular ligado se sintetiza en GBS
hiptesis de una relacin entre gbcO y la biosntesis del antgeno del grupo B .
Aqu, se presenta el anlisis detallado de un mutante de delecin gbcO de S.
agalactiae como la primera cepa carente-GBC de S.agalactiae. El mutante Delta gbcO
muestra la morfologa celular aberrante y los principales defectos de la divisin celular
debido a i) una distribucin anormal de los sitios de sntesis de PG activo, ii) una
marcada disminucin de reticulacin peptidoglicano, y iii) una localizacin inadecuada
de PCSB, un importante hidrolasa PG estreptoccica . En conclusin, nuestros
resultados demuestran que GBC juega un papel esencial en la morfologa
estreptoccica y el crecimiento bacteriano y sugieren fuertemente que este ramnosa
rica en polisacrido aninico PG-anclado debe ser considerado como un homlogo
funcional de la WTA
Results/Discussion
GbcO se requiere para la biosntesis de la pared celular anclado-gen GBC
antgeno
El GEN gbcO del S.agalactiae NEM316 de tipo salvaje (WT) cepa, que codifica un
ortlogo de TagO / tarO (Figura S1), se inactiv para investigar su papel en la
biosntesis de GBC (Figura 1B). Como todos los intentos de construir un marco de
supresin mutante de gbcO no tuvieron xito, hemos suprimido un reemplazo allico

con un promotor y terminador inferior marcador kanamicina [20,21]. Gracias a la

utilizacin de este sistema de seleccin positiva, la cepa NEM2772 (Delta gbcO) que
lleva un gen gbcO inactivado se aisl y una cepa complementadaria (Delta gbcOpTCV
omega gbcO) se construy mediante la reintroduccin de un gen funcional gbcO
clonado en plsmido de nmero de copia bajo. Para validar el papel de gbcO en la
biosntesis de GBC, S.agalactiae NEM316 WT, el mutante Delta gbcO isognica, y la
cepa complementaria con el plsmido fue probada en un anticuerpo policlonal antiGBC de conejo [22]. El anlisis de Microscopa de inmunofluorescencia (IFM)
utilizando Germen de Trigo Agglutinina etiqueta en el conjunto de las bacterias y el
antisuero especfico GBC revel la presencia de GBC en la superficie de la cepa WT y
su ausencia en la Delta gbcO mutante (Figura 2A). Este defecto se complement en el
mutante Delta gbcO transformada con el plsmido pTCV omega gbcO. Este resultado
demuestra que gbcO restaura la exposicin de GBC en la superficie de la bacteriana
La cuantificacin de los datos de inmunofluorescencia de citometra de flujo de uso
sencillo immunoetiquetado con el GBC antisuero indica diferencias significativas entre
la naturaleza y tipo complementa las cepas (datos no presentados).
El papel esencial de GbcO en la sntesis de GBC fue confirmada por experimentos de
microscopa electrnica de transmisin de inmunooro (TEM) (Figura 2B). Las
micrografas electrnicas de inmunoetiquetado muestrar la presencia de GBC (puntos
negros) en la periferia y septos de clulas de WT y complementa las cepas, mientras
que no se detectaron partculas de oro en las clulas mutantes gbcO. Para demostrar
que la molcula inmunoreactivada se asoci a PG, como se esperaba para el
antgeno de superficie del GBC [9] y que el suero anti-GBC no reacciona de forma
cruzada con las protenas, se trataron extractos de mutanolisina con pronasa, se
separ en SDS-PAGE, se transfirieron en nitrocelulosa, y probaron con el suero antiGBC. Como se muestra en la Figura 2C, la seal de GBC aparece como una sola
banda en WT y extractos Delta gbcOpTCV omega gbcO que en la muestra Delta
gbcO estaba ausente. Esta serie de experimentos proporcionan evidencias
inmunolgicas de que GBC estaba ausente de la superficie de la mutante Delta gbcO,
restaurada en la cepa complementada, y que el antisuero GBC especficamente
reconoce un material no protenico asociado a la PG.
Como se ha mencionado anteriormente (vase la Figura 1A), la molcula GBC tiene
un alto contenido de fosfato y ramnosa y es probable que la mayor fuente de estos
dos compuestos en sobre S. agalactiae. Por lo tanto, al confirmar la ausencia de GBC
en el mutante Delta gbcO por una alternativa enfoque, se realiz un anlisis
cuantitativo de ramnosa y fosfato presente en las fracciones de pared celular
insolubles (asociado-PG) de NEM316 WT, Delta gbcO, y las cepas complementarias.
Tambin se midi en las mismas muestras del contenido cido murmico procedentes
de la cadena de glicano del PG. El resultado ms sorprendente de estos anlisis fue
la desaparicin de ramnosa en la pared celular del Delta gbcO mientras que el nivel
WT fue restaurado en la cepa complementaria (Figura 2D). En la muestra Delta gbcO,
tambin se observ un disminucin fuerte (85%) en el contenido de fosfato,
mostrando que GBC es una fuente de fosfato importante en este compartimento
celular. Como la misma masa se analiz para las tres cepas, se determin que la
ausencia de GBC en la pared celular del Delta gbcO aument la cantidad relativa de
peptidoglicano (medido como un aumento en cido murmico) en la muestra
analizada. El aumento del cido murmico en NEM2772 muestra (Delta gbcO) mostr

que GBC es un importante constituyente de la pared celular de S. agalactiae que

representa ms de 60% del peso seco de PG en la pared celular WT, un valor en
buen acuerdo con el anlisis anterior [17]. Curiosamente, estos valores estn en buen
acuerdo con la cantidad de WTA presente en la pared celular de B. subtilis o de S.
aureus [15]. Tomados en conjunto, estos datos inmunolgicos y bioqumicos sugieren
fuertemente que GbcO cataliza la primera etapa enzimtica de la sntesis de GBC.

Figura 1: Estructura del GBC y propuesto esquema de sntesis GBC. (A) El

multiantenarios GBC est demostrado vinculado a una fraccin de N-acetilmurmico
(NAM), un componente de la PG. (B) La figura representa los primeros pasos de la
sntesis GBC donde GbcO es propuesto para catalizar la transferencia de UDPGlcNAc a un portador de fosfato lpidos.

GbcO es un UDP-GlcNAC:Transferasa de fosfato de lpidos y un homlogo

funcional de TarO en S. aureus.
La mutacin gbcO de GBS tiene una constante de velocidad de crecimiento
exponencial lento en el cultivo de TH en comparacin con NEM316 WT (Figura 3A). El
tiempo de generacin estimado fue de 48 minutos para la cepa de WT v/s 138
minutos para la mutacin gbcO, mientras que el de las copas complementarias fue
restablecido al valor de WT. Para determinar si GbcO realmente codifica a
UDP.GlcNAC: transferasa de fosfato de lpidos, medimos el crecimiento de las tres
cepas en presencia de tunicamicina, un inhibidor especfico de UDP-GlcNAc para
transferasas carriers de fosfato de lpidos. Nuestra hiptesis era que la tunicamicina
deba inhibir el crecimiento de las cepas que expresan GbcO pero no la cepa
defefctuosa para GbcO. La tasa de crecimiento mxima fue medida en cultivos de TH
en presencia de concentraciones cada vez mayores de tunicamicina.
Consistentemente observamos que la tasa de crecimiento relativa de NEM316 WT y
las cepas complementarias de gbcO disminuyen por sobre el 70% mientras que la
mutacin gbcO permaneca inalterada en el rango de concentraciones de antibitico
probadas (Figura 3B). La tunicamicina fue recientemente usada para inhibir la sintesis
de WTA en S. aureus y el impacto de la droga en la tasa de crecimiento fue en el
mismo orden de magnitud que el observado para S. agalactiae. Una examinacin
microscpica del crecimiento de clulas de NEM316 WT en presencia de tunicamicina
mostr cambios morfolgicos similares a los resultantes de la delecin de gbcO
(Figura S2). Estos resultados son totalmente compatibles con el GbcO actuando como
un UDP-GlcNAC: transferasa de fosfato de lpidos involucrada en la primera etapa de
la sntesis de GBC.
La secuencia homloga entre las protenas del estreptococo GbcO y el estreptococo
TarO sugiere que ellas catalizan la misma reaccin enzimtica (Figura S1). Para
comprobar esta hiptesis, se introdujo el plsmido complementario
pTCV(omega)gbcO en la mutacin RN4220tarO en S. aureus. Este experimento
complementario revel que la morfologa y los defectos en la tincin de GRAM en la
mutacin tarO de S.aureus eran corregidos por la expresin del gen gbcO de
estreptococos. (Figura 4A). Para probar que la complementacin heterologa del tarO
era completamente funcional, realizamos la extraccin y el analisis del WTA en tres
cepas de estreptococos siguiendo los protocolos establecidos. Los resultados
mostrados en la figura 4B inequvocamente demuestran que la produccin de WTA en
RN422 WT y en tarOTCV(omega)gbcO se complementan pero no en la mutacin de
RN4220tarO. El hecho que el GbcO pueda funcionalmente complementar a TarO
provee apoyo adicional para la hiptesis que GbcO es un UDP-GlNAC : transferasa
de fosfato de lpidos. Estos resultados demuestran que, a pesar de que los polimeros
anionicos de la pared celular GBC y poliribitol WTA , estructural y genticamente no
estn relacionados, el primer paso de su sntesis involucra la misma reaccin
enzimtica.
Sorprendentemente, la tincin GRAM del gbcO en S. agalactiae como la tarO en
S. aureus fue anormal, un fenotipo que fue corregido en las cepas complementarias
(Figura 4A). Esta observacin mostr que GBC y WTA, estn directa o indirectamente
involucradas en la retencin del complejo cristal violeta-yodado en el citoplasma
bacterial y sugiere que la presencia de un glicopolimero cargado en la pared celular

de una bacteria GRAM-positiva es un mejor determinante del procedimiento de tincin

de GRAM que el espesor del peptidoglicano.

Figura 2. GbcO se requiere para la sntesis de GBC. (A) IFM de bacterias recogidas
en fase estacionaria y etiquetados con suero anti-GBC y Aglutinina de germen de trigo
de lectina para detectar GBC (rojo) o PG (verde), respectivamente. Las vistas
representativos muestran el antgeno GBC expuesta en la superficie de NEM316 WT
y complementadas (Delta gbcOpTCV omega gbcO) cepas, pero no en la superficie del
mutante Delta gbcO. (B) la microscopa inmunoelectrnica (IEM) de NEM316 WT,
Delta gbcO mutantes y complementadas (Delta gbcO pTCV omega gbcO) cepas. La
localizacin subcelular de GBC se analiz utilizando IEM sobre delgada secciones
(menor a 100 nm) de clulas congeladas; marcado con suero anti-GBC y revelado con
partculas coloidales de oro (puntos negros). Los puntos negros son claramente
visibles en la periferia y los tabiques de las clulas de las cepas WT y
complementados; no etiquetado puede ser detectado con la cepa Delta gbcO. (C) La
inmunodeteccin de GBC en extractos de pared celular mutanolisina obtenidos a
partir de cultivos cosechados en la fase estacionaria. Extractos de pared celular se
trataron con pronasa, separados en SDS-PAGE, se transfirieron sobre nitrocelulosa y

la membrana se incub con suero anti-GBC. En este experimento, la seal asociadaGBC apareci como un nica banda que era indetectable en los extractos de pared
celular de Delta gbcO. Como control de carga, extractos de la pared celular antes del
tratamiento pronasa se probaron con la lectina biotinilada Malii. (D) Anlisis de cido
murmico, fosfato, y el contenido de ramnosa de la pared celular de WT (barras
negras), Delta gbcO (barras de color gris claro), y complementarias (barras grises
oscuros) de las cepas recolectadas en la fase estacionaria (vase el texto S1 en la
informacin de apoyo). Para cada compuesto la GC-MS resultado del anlisis se
presenta como un porcentaje del valor de WT. Ramnosa, el azcar principal GBC, no
se detect en la pared celular de la cepa Delta gbcO. Las barras de error representan
Ms o menos S.E. de dos experimentos independientes.
La morfologa celular, ubicacin de membranas y separacin celular se ven
afectadas en la mutacin de GBC agotado.
En antiguas culturas, las cepas de mutaciones gbcO tienden a flocular rapidamente
(Figura 5A) y observaciones de microscopa de contraste de fases revelaron la
presencia de agregados celulares largos de pequeas cadenas tipicas de ovococci
(Figura 5B). Una examinacin exhaustiva de los racimos celulares de gbcO (Figura
5B) sugiere que cada uno es originado de una unica cadena. Para confirmar esta
observacin, seguimos el crecimiento de las celulas mutagenas de gbcO en
experimentos por lapsus de tiempo bajo la luz del microscopio. Este experimento
revel que los racimos de clulas mutagenicas de gbcO surgen del crecimiento de
una cadena que no se quiebra, mientras que las cepas de WT forman cadenas
individuales cortas (Ver Video S1 para NEM316 WT y video S2 para informacin
anexa de gbcO). Esta observacin indica que el proceso de separacin celular del
S. agalactiae fue fuertemente alterando en la ausencia de GBC. La clula y la
morfologa de cadena de WT, de la mutacin y de las cepas complementarias fueron
entonces examinados por microscopa de escaner electronico (SEM) y microscopa de
transmisin electronica (TEM). Como era esperado, el NEM316 WT y las cepas
complementarias muestran un tamao regular y fueron montadas en una tipica
cadena de ovococci, con membranas formado en sucesivos planos pararelos
perpendiculares al eje de la cadena (Ver Figura 6A, 6B y Figura S3). En contraste,
patrones no regulares de divisin pueden ser observados por la mutacin gbcO: las
celulas eran heterogeneas en tamao y forma y la ubicacin de la membrana pareca
ocurrir aleatoriamente (Figura 6A, 6B, S3). Adems, en las cepas mutantes, el
proceso de membranizacin (?) fue incompleto y las celular fueron pobremente
individualizadas explicando el anormal modo de crecimiento observado en los
experimentos en lapsus de tiempo.
Como en muchos estreptococos, WT y las cepas complementarias muestran una
zona de densidad electrnica periferica (principal grosor, 6,03+/- 1,07 nm) que no fue
observada en las clulas gbcO (ver flechas en figura 6C). Esta estructura no debe
ser confundida con la capsula de polisacaridos de la S.agalactiae que no puede ser
detectada por el procedimiento convencional de tincin de metales pesados usado
aqu. Esta estructura de pared celular, de la cual se desconoce la funcin, fue
nombrada pellicle en Lactococus lactis y, aunque su composicin no fue
formalmente establecida, presenta correlacin con la sintesis de un polisacarido de
superficie. As parece que, como se muestra en L. lactis, el agotamiento de un

polisacarido asociado a una pared celular en S.agalactiae permite la desaparicin del

pellicle.
Finalmente, como fue observado con los estreptococos, GBS WT y las cepas
complementarias a gbcO exhiben anillos ecuatoriales (EqR), es decir, una pared
celular consecuencia de una asociacin con una subyacente invaginacin de la
membrana (Ver triangulos en Figura 4C) donde la divisin celular (Proteinas Fts) y los
mecanismos de sntesis de peptidoglicano (proteinas de unin a penicilina) se
ensamblan para preparar el montaje de una pared nueva. Esta estructura nunca fue
observada en la mutacin gbcO sugiriendo que la estructura de peptidoglicano
puede ser alterada en ausencia de GBC.

Figura 3. Disminucin de la tasa de crecimiento y la falta de sensibilidad a

tunicamicina (antibiotico) de DgbcO mutante. (A) Curvas de crecimiento de cepas
NEM316 WT (cuadrados slidos), DgbcO mutante (crculos) y DgbcOpTCVgbcO
(cuadrados vacos). Los cultivos se realizaron en medio TH sin antibiticos en 37C en
96 placas por triplicado. Las densidades pticas se registraron a 600 nm en un
aparato de Tecan M200 con 5 segundos de agitacin antes de ser medidas. Los
valores promedio del experimento estn presentados. (B) Curva del efecto de diversas
concentraciones de tunicamicina sobre la tasa de crecimiento de cepas WT
(cuadrados slidos), DgbcO (crculos negros) y DgbcOpTCVVgbcO (cuadrados
vacos). La tunicamicina, un inhibidor general de UDP-GlcNAc: actividad transferasa
portadora de fosfato lpidos, inhibe el crecimiento de las cepas WT y complementados
pero no el de DgbcO mutante, lo que sugiere que GbcO realiza esta actividad. Los
experimentos se realizaron en triplicado y los resultados se reportan como un
porcentaje de la tasa de crecimiento en ausencia de tunicamicina. Las barras de error
representan el 6 S.E. por triplicado de experimentos.

Figura 4: GbcO complementa funcionalmente TarO de S. aureus. (A) Cepas de S.

agalactiae DgbcO o de S. aureus DtarO no toman la tincin de Gram. en ambas
especies, la tincin de Gram y los fenotipos morfolgicos se restauran mediante la
introduccin del plsmido a pTCVVgbcO que lleva un gen gbcO funcional de S.
agalactiae. (B) El anlisis PAGE de WTA extrada de S. aureus es visualizado con el
protocolo de tincin azul-plata alcyan. El gel muestra la produccin de WTA en
RN4220WT (primer carril), la ausencia de WTA en la cepa de S. aureus TarO
(segundo carril) y la restauracin de la sntesis WTA cuando la deficiencia de TarO es
complementada en trans con el gen gbcO estreptoccico (tercer carril). La punta de la
flecha indica el frente de migracion de bromofenol azul.

Figura 5. floculacin y agregacin de fenotipos de DgbcO mutante. (A) cultivos de una

noche muestran la no floculacin NEM316 WT y cepa complementada
(DgbcOpTCVVgbcO) y la floculacin de mutante DgbcO. (B) vistas de contraste de
fase que ilustran el cambio morfolgico de pequeas cadenas individuales a grandes
grupos de bacterias propias de DgbcO mutante (barra de escala, 5 mm).

Figura 6. Imgenes de microscopia electrnica de cepas NEM316 WT, DgbcO

mutante, y complementarias. Las bacterias fueron cultivadas en fase semi-log (OD
600 nm = 0,5), fijadas, y preparadas como se describe en el apartado de Materiales y
Mtodos (vase el texto S1). (A) vistas representativas de anlisis de microscopia
electrnica de barrido muestran las alteraciones morfolgicas (anomalas tamao,
forma, y la divisin celular) debido a la inactivacin de gbcO. (B, C) Imgenes de
microscopia de transmisin electrnica de delgadas criosecciones teidas con acetato de
uranilo, en dos aumentos (ver barras de escala). La presencia de la pelcula (capa externa
densa en electrones) en la superficie de cepas WT y complementarias observadas en el mayor
aumento se resalta con flechas negras. Un tringulo blanco representa el anillo ecuatorial
(EQR), una zona activa de la sntesis del peptidoglicano se ve en casi todas las clulas WT y
complementarias, pero ausente en las clulas mutantes DgbcO.
Se requiere en la pared de la clula anclado GBC para la estructura normal de
PG y el correcto posicionamiento de los sitios de sntesis de PG
En lnea con esta ltima hiptesis, se observ consistentemente que el mutante GBS
DgbcO era ms susceptible a la lisis inducida por mutanolisina que las clulas WT,
mientras que su sensibilidad a la lisozima no se ve afectada (Figura 7A y 7B). Para
probar esta hiptesis, Se hizo una Separacin RP-HPLC de los muropeptidos
derivados de PG , para WT, DgbcO mutante, y complementa.
. Ms de 50 picos se analizaron por MALDI-TOF espectrometra de masas para
deducir la estructura de los muropeptides separados (Figura 7C). Los cromatogramas
revelaron que mientras que las formas monomricas de PG fueron ms abundantes
en los extractos de la cepa mutante en comparacin con el WT (Figura 7C medio fila),
la cantidad de las categoras restantes (dmeros, y no resueltos oligmeros de alto
peso molecular) fue menor (Figura 7C fila superior). El anlisis cuantitativo de los
cromatogramas confirm esta observacin y revel que el ndice de reticulacin se

desplom de 34% (cepas WT y complementarias) a 24% (DgbcO mutante) (vase la

Tabla S3 en el apoyo de informacin del fichero Texto S1). Los componentes PG
altamente reticulado acumulados en un pico no resuelto que eluye entre 180-220 min.
Como el rea de el pico se redujo fuertemente en el mutante DgbcO, la disminucin
del PG entrecruzamiento fue probablemente subestimada. Para corroborar la
hiptesis de una incorporacin anormal de precursores PG en la pared celular de los
mutantes DgbcO, una bacterias que creca exponencialmente se tio con
vancomicina fluorescente para etiquetar la zona activa de la sntesis de PG [30,31].
Como ya se ha observado en S. pneumoniae R6 [31], la tincin de la vancomicina se
limitaba principalmente a las regiones ecuatoriales y septal de NEM316 WT y
complementado clulas (Figura 7D y la Figura S4 superior e inferior filas). En
contraste, se observ una tincin uniforme de baja intensidad sobre toda la superficie
de las clulas DgbcO (Figura 7D y la Figura S4 filas mediana). La falta de EQR (vase
la Figura 6C) junto con la desaparicin de la vancomicina indicado que, en ausencia
de GBC, la maquinaria de biosntesis de la pared celular no estaba correctamente
situado llevando a un modo disperso de la sntesis de PG y a una reticulacion dePG.
Defectuosa.
GBC privacin conduce a una mislocalization de la hidrolasa putativa PG PCSB
Las consecuencias de la inactivacin del gen gbcO en la morfologa celular y la
divisin recordaban a los observados para un mutante PCSB-nula de S. agalactiae
cepa 6313 [32,33]. PCSB (protena necesaria para la separacin de la pared celular)
es una superficie celular situado putativo hidrolasa PG que tiene ortlogos en
todas las especies de la familia Streptococcaceae. Esta protena posee un
dominio de cistena-histidina-dependiente de la amidohidrolasa-peptidasa (CHAP) y
se requiere para la sntesis de la pared celular y eficiente de separacin de clulas en
S. agalactiae y otros estreptococos [31,33-35], lo que sugiere que est implicado en
remodelacin PG. Por lo tanto, la hiptesis de que la privacin GBC podra afectar la
localizacin de PCSB y la actividad asociada hidrolasa PG. Para probar esta
hiptesis, se realizaron experimentos de MFI para localizar PCSB en la superficie de
clulas bacterianas recolectadas en la fase exponencial de crecimiento (Figura 8).
Una seal de PCSB-especfico ubicado en la zona ecuatorial de las clulas en divisin
que corresponde al sitio de la sntesis de PG activo se observ en NEM316 WT y
complementa las cepas. Esta localizacin se observ recientemente para la protena
PCSB ortlogos en Streptococcus pneumoniae [36]. Por el contrario, ningn patrn
regular de etiquetado se puede distinguir en DgbcO mutante y seales
PcsBassociated se distribuye de forma desigual en la superficie celular y en algunos
casos acumulados en los focos. Este resultado indica que GBC est implicado en la
localizacin adecuada de PCSB, una protena de la pared celular bacteriana implicada
en la divisin bacterial y la biosntesis de PG. Estos resultados pueden ser paralelas a
las que inform recientemente en B. anthracis. En esta especie, un gen Tago est
implicado en la unin del polisacrido pyruvylated de la pared celular (SCWP) a la
superficie y el tratamiento de las culturas de tunicamicina de B. anthracis alterando la
morfologa celular y des localizando la sntesis de PG deslocaliza [25]. Este fenotipo
se puede correlacionar con un mislocalization de BslO, una autolisina que participan
en la separacin celular, y cuya localizacin de la pared celular es SCWP dependiente
[37].

Observaciones finales
La pared celular de S. agalactiae contiene dos polisacridos PG anclados: la cpsula,
un importante factor de virulencia de GBS [3840], y el GBC, los cuales nos revelan
una importante funcin biolgica vinculada a la biosntesis de PG y a la divisin
celular. Mutantes S.agalactiae no encapsulados pueden ser fcilmente construidos in
vitro and que no muestran ningn crecimiento o defectos morfolgicos mientras es
severamente afectado por la virulencia en el modelo de ratn [40]. Por otra parte,
GBC pareca ser crucial para la organizacin de la pared celular de S. agalactiae y su
ausencia fue asociada con una prdida sustancial de fitness (aptitud). En este estudio,
proporcionamos la primera evidencia gentica de que la sntesis de GBC es iniciada
por la transferencia de fosfato GlcNAc a un lpido portador de fosfato a travs de la
actividad de GbcO, un cercano homlogo de las enzimas (TagO/TarO) catalizan el
primer paso de la sntesis de WTA en B. subtilis o S. aureus (Figure 1B). El
crecimiento, morfolgico, y defectos de divisin del mutante GbcO-null S. agalactiae
eran una reminiscencia de los reportados B. subtilis [41-43] y S. aureus [24] WTAcarentes. Adems, la disminucin de PG cross-linking medido en la cepa NEM2772
(gbcO) era tambin observado recientemente en mutantes TarO-null S.aureus [1213]. En S. aureus, el agotamiento de WTA fue asociado con la deslocalizacin de dos
protenas involucradas en el metabolismo de PG: la protena PBP4 penicilinavinculante involucrada en la reaccin de transpeptidacin [13] y la autolisina Atl [12].
Del mismo modo, se demuestra que el agotamiento de GBC causa la deslocalizacin
de PcsB, una importante enzima de la pared celular (Figure 8). GBC puede, por lo
tanto, ser considerada como un equivalente funcional de la convencional WTA
encontrada en B. subtilis o S.aureus. Aunque la ramificada estructura polisacrida rica
en rhamnose de GBC es totalmente diferente de la de pAdoP-WTA presente en B.
subtilis y S. aureus, estos polmeros compartes dos importantes propiedades: primero,
ambos presentan un carcter aninico conferido por su alto contenido en fosfato;
segundo,que estn anclados covalentemente a la PG que sugiere una estrecha
coordinacin de su sntesis con el de PG. Es importante destacar que la aptitud del
mutante GBC-carente se redujo drsticamente in vitro y observamos que la aptitud de
la cepa WT se redujo similarmente a cuando GbcO fue inhibido con tunicamycin.
Estos hallazgos indican que la ruta de biosntesis GBC podra constituir un objetivo
valioso para el desarrollo de nuevos antibiticos.
La precisa estructura del antgeno Lancefiel se ha determinado para GBC solamente.
Sin embargo, anlisis inmunoqumicos y de composicin de Grupo A, C, E y G de
glicopolmeros de la pared celular han puesto de manifiesto de manera similar un alto
contenido de ramnosa 4448]. En estas especies de estreptococos, las rutas
biosintticas y funciones biolgicas de los glicopolmeros de la pared celular no han
sido investigados an. Un examen cuidadoso de los genomas de especies
representativas de los principales linajes filogenticos estreptoccidas (el llamado
pigenos, bovis, salivarius, mutans, mitis y anginosus grupos) revel la presencia de
un gbcO ortlogo junto con loci que se cree participan en la sntesis de un
exopolisacrido contenedor de ramnosa. Mientras que ortlogos genes de la
convencional WTA sintetizadora no fueron detectados.
Este anlisis suguiere que polisacaridos ricos en ramnosa anclados a PG estan muy
extendidos entre los estreptococos inlcuyendo importantes patogenos humanos
estreptococal (como S. galactiae y S. pyogenes). Es probable que su funcin es

similar a la de GBC y la inactivacin de los ortlogos gbcO estreptoccicas constituye

un enfoque simple y directo para validar esta hiptesis.

Figura 7. Alteraciones de las propiedades del sculo de murena y de la sntesis

de PG en clulas GBC-carentes. (A,B) Ensayos de lisis celular: clulas de
crecimiento exponencial se recogieron y se resuspendieron en buffer PBS (DO600 nm
= 1) que contiene (A) 1 mg / ml de lisozima o (B) 20 unidades / ml mutanolisina. La
lisis de cepas de NEM316 WT (crculos negros),gbcO mutante (cuadrados blancos)
y gbcO pTCV gbcO complementadas (diamantes negros) fue grabada por
espectrofotometra a 600 nm. Las barras de erros representan S.E de tres
experimentos independientes (C) El anlisis comparativo de los muropeptides
resultantes de peptidoglicano mutanolisina-digerido (vase el texto S1) de NEM316

WT (panel superior), DgbcO (panel medio), y complementados (panel inferior) de las

cepas. Muropeptides se separaron por RP-HPLC y los picos se recogieron y se
analizaron por MALDI-TOF. (D) tincin fluorescente vancomicina de crecimiento
exponencial NEM316 WT, DgbcO mutante y complementa las cepas. Vancomicina
fluorescente (2 mg / ml) se aadi a los cultivos en fase exponencial durante 10 min a
37uC. Se recogieron las clulas, se transfirieron a portaobjetos de vidrio, se fijaron, y
se observaron por microscopa de fluorescencia como se describe en Materiales y
Mtodos de apoyo (vase el texto S1).
Materiales y metodos
Las cepas bacterianas, medios de comunicacion y condiciones de crecimiento
Las cepas bacterianas utilizadas estan listadas en las tablas S1 en el texto S1. S.
agalactiae NEM316 es una cepa serotipo III ST-23 cuyo genoma ha sido secuenciado
[10]. S. agalactiae fue cultivado en Todd-Hewitt (TH) broth (frascos llenos
permanentes) o agar (laboratorios Difco, Detroit, MI) en 37uC. Escherichia coli DH5a
(invitrogen) usado para clonar experimentos crecieron en Luria-Bertani (LB) medio. La
eritromicina fue usada a 150 mg/ml para E. coli y 10 mg/ml para S. agalactiae. Las
cepas de E. coli crecieron en Luria-Bertani (LB)-broth o en LB-agar. Todas las
incubaciones estaban a 37uC. La Kanamicina fue usada a concentraciones de 20
mg/ml y 500 mg/ml para E. coli y S. galactiae, respectivamente. Las cepas Gram
fueron realizadas usando el kit bioMrieux sepas gram segn las instrucciones de los
fabricantes.
Los ensayos de las detecciones por microscopia de inmunofluorescencia (IFM)
del GBC y PcsB
Los cultivos recolectados en exponencial (OD600=0.5) o fase estacionaria (cultivos de
6-horas, OD600=1.5) como se indica en las leyendas de las cifras se volvieron a
suspender en PBS a OD600=1 luego de tres lavados PBS. La suspencion bacterial
(50 microlitros) fue aplicado en cubreobjetos de vidrio recubierto de polilisina por 5
minutos a temperatura ambbiente, lavado dos veces con PBS y fijados por 15 minutos
con 3% de paraformaldehido.Para la deteccion de GBS, las celulas bacteriales fueron
recolectados en fase exponencial e incubados con suero de raton levantados contra
PcsB (1:100) obtenidos como se describe en el texto S1. Luego de 3 lavados con
PBS, los cubreobjetos fueron incubados por Alexa fluor A488-conjugados goat antirabbit (GBC) o goat anti rabbit (PcsB) inmunoglobulina G (IgG) (invitrogeno) (1/5000) y
DAPI (invitrogeno) (1/5000).

Figura 8. inmunolocalizacin fluorescente de la hidrolasa putativa PCSB

peptidoglicano. Crecimiento exponencial NEM316 WT, DgbcO mutante y las cepas
DgbcOpTCVVgbcO complementados fueron cosechadas, transferido a portaobjetos
de vidrio, y se fija. MFI con anti-suero PCSB y tincin DAPI se realizaron como se
describe en Materiales y Mtodos.
GBC inmunodeteccin despus de SDS-PAGE y transferencia de nitrocelulosa
Extractos de pared celular mutanolisina se prepararon a partir de cultivos en fase
estacionaria.
Sedimento bacteriano se lavaron dos veces en PBS y se resuspendieron a una
OD600 final = 100 nm en 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) que contiene sacarosa (1 M),
mutanolisina (200 U / ml) (Sigma), y se incubaron durante 60 min a 37C.
La suspensin se centrifug a 5000 g durante 15 min a 4C.
Se recogi el sobrenadante correspondiente a la extracto de pared celular.
Para mejorar la resolucin de la banda de GBC, los extractos de la pared celular se
trataron con pronasa a 2 mg / ml durante 90 min a 60C. Veinte microlitros (OD, 2
unidades) fueron cargados en un 12% SDS-PAGE para electroforesis. La
transferencia se realiz en membrana de nitrocelulosa en una clula de transferencia
electrofortica semiseca (Bio-Rad) a 20 V durante 20 min en 48 mM Tris, glicina 39
mM, 20% de etanol, pH 9.2. La membrana se incub con suero anti-GBC (1/1000)
durante una hora y luego con IgG de AlexaA488 conjugado y cabra anti-conejo

(1/10000). Las membranas fueron digitalizadas en un FLA-3000 sistema de imagen

fluorescente Fuji.
Tincin de Vancomicina
Para la tincin, una mezcla 1: 1 de vancomicina y BODIPY FL vancomicina (gen
invitro) a una concentracin final de 2 mg / ml fue aadido a cultivos crecientes
exponencialmente de S.agalactiae durante 10 min, como se describe [31]. Las
bacterias se recogieron y se lavaron tres veces con PBS y despus se resuspendieron
en PBS a DO600 = 1. La suspensin bacteriana se aplic en cubreobjetos y se trat
como se describe anteriormente
Las condiciones de crecimiento para las muestras de microscopa electrnica
Cultivos de una noche de S. agalactiae se diluyeron (1/100) en TH y se cultiv a 37
C hasta DO600 nm <0,5. Las muestras se prepararon entonces para TEM, SEM, y
IEM como se describe en el apoyo de informacin del fichero de texto S1.
Ensayos de lisis bacteriana
Las bacterias se cosecharon en la fase exponencial (OD600 = 0,5) y se lavaron dos
veces con PBS. Las clulas se resuspendieron a DO600 = 1 en PBS y se incubaron a
37 C en presencia de lisozima (1 mg / ml) o mutanolisina (20 unidades / ml). La lisis
fue seguida por cambios en la densidad ptica a 600 nm en los tiempos indicados.
Curvas de crecimiento en presencia de tunicamicina
Crecimiento de cepas de S. agalactiae en la presencia de tunicamicina (Sigma) se
ensay en TH a 37 C en las siguientes concentraciones finales: 0, 0,1, 0,25, 0,5, y 2
mg / ml. El crecimiento se registr por triplicado en placas de 96 pocillos en un lector
de placas TECAN M200 a 600 nm. Tasas de crecimiento mximas se calcularon e
informaron sobre la grfica como un porcentaje de la tasa de crecimiento en ausencia
de tunicamicina.
Extraction and native PAGE analysis of S. aureus WTA
La preparacin de material insoluble de la pared celular mediante el procedimiento
SDS-de ebullicin, seguido por la digestin proteoltica y catalizada por una base
(NaOH) WTA, la escisin se realiz esencialmente como se describe [25], exepto la
proteinasa K que fue reemplazada por pronasa (2 mg / ml). El anlisis PAGE nativa en
el sistema de gel de C6% T20% se ejecut como se describe [25]. Las bandas de la
WTA se tieron con el protocolo de tincin azul-plata alcyan utilizando el kit de tincin
de plata de Bio-Rad como se describe [25].
Anlisis de la composicin de las paredes celulares por cromatografa de gases
acoplada a espectrometra de masas
Las paredes celulares de los cultivos de la fase estacionaria fueron preparados como
se describieron para L. lactis [49] sin HF y tratamientos TCA para preservar los
polisacaridos anclados a la pared celular. La hidrolisis de los ejemplos de la pared
celular fueron realizados por tratamiento en 4 M TFA a 110C por 3 horas, en
presencia de xylose adicionado como un estandar adicional. Luego del secado, los
productos de la hidrolisis del TFA fueron resuspendidos en piridina y derivado con Nmetil-N-(trimetil-sylil) trifluorocetamida (MSTFA) por 30 minutos a 25C. Las muestras

fueron analizadas por cromatografia de gas junto a espectrometria de masa (GC-MS)

con un sistema Agilent (GC 6890+ y MS 5973 N, tecnologias Agilent). Las muestras
fueron inyectadas con un inyectador automatico (Gerstel PAL). La cromatografia de
gas fue realizado en una columna ZB-50 de 30m con 0.55 mm de diametro interno y
0,5um de espesor de pelicula (phenomenex). El helio fue usado como el gas cargador
y fue puesto con una velocidad de flujo constante de 1.5 ml/min. La temperatura
programada era de calefaccion isotermal de 5 min a 80C, seguido por una rampa de
temperatura de horno de 20C/min a 300C, y un final de calefaccion de 3min a 300C.
Los componentes fueron indentificados por el tiempo de retencion y la comparacion
de sus perfiles de espectro de masa de ionizacion de electron con sus NIST 05 libreria
masa espectral (servicios cientificos instrumentales, Ringoes, NJ, USA). La
cuantificacion fue hecha usando unas curvas de calibracion estandar externo para
cada molecula (2.5-25 nm inyectado) establecidos con el area peak de on especifico y
expresao en nmol/mg pared celular. Para el proposito de claridad, los resutados
fueron expresados para cada componente como porcentaje de valores wild-type
(figura 2B). El promedio NEM316 valores wild-type fueron: 518,8 nmol/mg para
fosfato, 459.5nmol/mg para rhamnosa 215.7 nmol/mg para acido muramico.
Purificacin y anlisis estructural de PG
Paredes celulares de S. agalactiae se prepararon a partir de cultivos en fase
exponencial (DO600 = 0,5) como se describe previamente para Lactococcus lactis
[49] y Lactobacillus plantarum [50] con la siguiente modificacin: se realiz un
tratamiento cido con TCA al 5% (24 h a 4 C) antes de que el tratamiento con cido
fluorhdrico, para eliminar el polisacrido capsular [17,51].
PG purificado se digiri con mutanolisina se analizaron (300 U / mg PG) a partir de
Streptomyces globisporus (Sigma-Aldrich) y las muropeptides resultantes despus de
la reduccin NaBH4 por RP-HPLC y MALDI-TOF espectrometra de masas, como se
inform anteriormente [52]. Se recogieron fracciones y se analizaron 1 ml de los que
contienen los principales picos por MALDI-TOF espectrometra de masas con un
espectrmetro de masas Voyager DE STR (Applied Biosystems) y un-ciano-4hidroxicinmico.
La estructura de PG de S. agalactiae pertenece al grupo A3a con L-Ala-D-iGln-L-LysD-Ala-D-Ala como pptido tallo y los dipptidos L-Ala-L-Ala o L-Ala-L-Ser como
puentes interpeptdicos que conectan L-Lys de un pptido de vstago a la D-Ala en la
posicin 4 de la subunidad vecina [53]. Se calcularon las masas tericas de los
muropeptides con las posibles variaciones estructurales esperados. Las masas
determinadas por MALDI-TOF se compararon con las masas tericas de clasificar los
muropeptides HPLC separados como monmeros (m / z, 1568), dmeros (1803, m / z,
2647) o trmeros (0.2647). ndice de reticulacin (Cl) se calcul con la frmula de
acuerdo con Glauner (1988) [54]: Cl = (media Sdimers + 3.2 Strimers) / S todos
muropeptides.
Informacion de apoyo
Figura S1 Mltiples secuencia de alineamiento putativo UDPN-GlcNAc: transferasas
undecaprenilo-fosfato (PNUD) GlcNAc-1-fosfato. Las protenas de Swiss-Prot fueron
Tago de B. subtlis 168 (O34753), Taro de S. aureus N315 (Q7A6R9) y sus ortlogos
GbcO (Gbs0136) de S. agalactiae NEM316 (Q8E7L8), RgpG de S. pyogenes SF370 /
M1 (Q9A1G6), y RgpG de S. mutans UA159 (Q8CZF2). Las cajas negras y grises con

carta blanca: 100% y el 80% de identidad de secuencia, respectivamente; caja gris

con la letra negro, el 60% de identidad de secuencia. (TIF)
Figura S2 aberraciones morfolgicas inducidas por tunicamicina. Cepa de S.
agalactiae NEM316 WT (fila superior) se cultiv en TH en 37uC con las
concentraciones indicadas de tunicamicina. La microscopa ptica de formacin de
imgenes se realiz en clulas vivas en fase estacionaria. Fila inferior muestra una
imagen de NEM2772 (DgbcO) que pone de relieve las similitudes morfolgicas con las
clulas WT tunicamycin cultivada. Barra de escala: 1 mm. (TIF)
Figura S3 de exploracin vistas de microscopa electrnica de S.agalactiae NEM316
WT, DgbcO mutante y complementa las cepas. Las bacterias se cultivaron en TH en
37uC y se cosechan en la fase exponencial (DO600 nm = 0,5). Los diferentes campos
en tres escalas diferentes (ver barras de escala) revelaron que la mutante DgbcO ya
no mostrar cadenas tpicas de ovococci. (TIF)
Figura tincin fluorescente S4 vancomicina. Contraste de fase y de imagen de
epifluorescencia de bacterias que crecen exponencialmente etiquetados con DAPI
(marcador de ADN) y vancomicina fluorescente (marcador de sitios de sntesis de PG)
como se indica en Materiales de apoyo y mtodos (vase el texto S1). (Las barras de
escala 1 mm). El etiquetado vancomicina regular se pierde en la cepa DgbcO. (TIF)