Universidad de las Fuerzas Armadas- ESPE

2014-07-10

DETECCIN DE ANTICUERPOS CONTRA BRUCELOSIS USANDO

FLUJO LATERAL, TEST DE ROSA DE BENGALA EN PLACA Y ANILLO
COLOREADO EN LECHE.
AYALA, Christian. FREIRE, Viviana. TORRES, Jorge

RESUMEN.
La brucelosis es una enfermedad bacteriana que tiene un gran impacto econmico debido
a los problemas reproductivos que origina en los animales. Es causada por bacterias del
gnero Brucella, las ms comunes son B. abortus, B. melitensis y B. suis. Deben ser
manejadas con cuidado pues pueden transmitirse a los seres humanos. El diagnstico de
brucelosis se hace mediante ensayos serolgicos. La prueba ms utilizada para este fin es
el test de rosa de bengala en placa. Este test permite identificar anticuerpos contra
brucelosis usando un antgeno de B. abortus. Otro tes muy usado es el test de anillo
coloreado en leche que permite identificar anticuerpos en la leche y es usado para
examinar hatos enteros. En esta prctica se realiz un ensayo de flujo lateral que consiste
en agregar una gota de suero en la ventana para muestra de una cmara de flujo lateral,
inclinarla e incubarla por 10 minutos. Se realiz el test de rosa de bengala para 15
muestras de suero que incluan dos muestras positivas. Y por ltimo se elabor el test de
anillo coloreado en leche usando muestras de leche de vaca. Como era de esperarse el
flujo lateral fue negativo, pues era para deteccin de tuberculosis. Se encontr que 7 de
las muestras fueron positivas con el test de rosa de bengala, y con el test de anillo
coloreado en leche no se encontr ninguna muestra positiva para brucelosis.
Debido a que estas tambin son capaces
de infectar al ser humano, el manejo de
material contaminado debe realizarse con
sumo cuidado (OIE, 2008).

INTRODUCCIN.
La brucelosis es una enfermedad
zoontica de origen bacteriano que tiene
un gran impacto econmico ya que es
capaz de causar grandes prdidas
reproductivas en los animales. Suele
ocasionar abortos, placentitis, epididimitis,
orquitis, entre otros (CFSPH, 2009).

Para diagnosticar esta enfermedad se

suelen usar mtodos serolgicos y
bacterianos.
Aunque
los
mtodos
serolgicos pueden brindar un fuente
diagnstico predictivo, es necesario una
identificacin
bacteriana
para
un
diagnstico definitivo (AHA, 2005).

Es causada por diversas bacterias del

gnero de Brucella. En el caso de los
bovinos generalmente esta enfermedad es
causada por Brucella abortus, aunque
tambin puede encontrarse en menor
medida Brucella melitensis y Brucella suis.

La deteccin de inmunoglobulinas para

brucelosis es identificada generalmente
mediante el uso del test de rosa de
bengala en placa, test de fijacin del
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complemento y test de aglutinacin del

suero (Sareyypoglu, et al., 2010).

El objetivo de esta prctica de laboratorio

es la aplicacin de diversas tcnicas de
diagnstico de brucelosis en muestras de
suero y leche, a fin de conocer su
funcionamiento, alcance y las ventajas y
desventajas que presentan cada una de
ellas

El test de rosa de bengala, es un test de

aglutinacin que utiliza rosa de bengala
como colorante. Al igual que casi todos los
dems test de aglutinacin para brucelosis
utiliza como antgeno al parsito completo
de Brucella abortus, debido a que existe
reaccin cruzada de los lipopolisacridos
(LPS) de B. abortus, B. melitensis y B.
suis, un solo antgeno permite hacer el
diagnstico para cualquiera de las tres
variedades (Nielsen y Yu, 2010).

MATERIALES Y MTODOS.
1. Diagnstico en cmara de flujo
lateral
Para esta prueba se coloc dos gotas de
suero, proveniente de una vaca positiva
para brucelosis, en la ventana para
muestra de una cmara de flujo lateral
para identificacin de tuberculosis.

Otro test ampliamente usado es el test del

anillo coloreado de leche (Milk Ring Test
MRT). Este test sirve para diagnosticar la
enfermedad mediante la deteccin de
anticuerpos de Brucella abortus en la
leche. Este mtodo puede ser usado para
detectar hatos infectados (Bulk MIlk Ring
Test) o para el diagnstico diario individual
de los animales (Al-Mariri y Haj-Mahmoud,
2009).

Despus la cmara se coloc en forma

inclinada y se esper durante 30 minutos,
para observar resultados.
La lectura de la cmara se realiz como
se muestra en la tabla 1, donde la prueba
es positiva si aparecen tanto la lnea de
test y de control, negativo si solo existe la
lnea de control y no interpretable en
cualquier otro caso.

Los test de flujo lateral son cada vez ms

usados para realizar monitoreos o anlisis
en condiciones de campo. Estos test se
contienen tiras sobre las cuales se
encuentran los reactivos secos, los
cuales se activan al momento que se
coloca la muestra. Una variedad de estos
test son los inmunoensayos de flujo lateral
los cuales tienen la ventaja de que usan
un
sistema
de
reconocimiento
inmunolgico lo cual permite su uso para
el diagnstico de enfermedades mediante
el reconocimiento de antgenos o
anticuerpos (Geertruida, et al., 2009).

Tabla 1. Lectura de la cmara de flujo

TEST
X
X

CONTROL
X
X

RESULTADO
Positivo
Negativo
No
interpretable

X= representa la banda coloreada.

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2. Prueba de aglutinacin con rosa

de Bengala

3. Anillo coloreado en leche

En esta prueba se utilizaron 6 frascos con
muestras de leche. Se tom 1 ml de cada
frasco y se coloc en un tubo de ensayo.
Despus en cada tubo se aadi 2 gotas
de antgeno coloreado con hematoxilina.
Se mezcl y se llev a incubar a 38 C
durante una hora.
La presencia de un anillo en la parte
superior o media del tubo, o la formacin
de un precipitado en el fondo indican un
resultado positivo.
Si no existe la formacin de anillo la
prueba es negativa y si existe coagulacin
el resultado no es interpretable.

Para esta prueba se utiliz 15 muestras

de suero de vacas, de las cuales dos se
saban que eran positivas para brucelosis.
La nomenclatura usada es la misma
encontrada en el frasco de cada muestra
se indica en la tabla 2.
Utilizando una pipeta se tom 30 l de
suero de cada muestra y se coloc en un
aglutinoscopio. Despus se aadi una
gota de rosa de bengala junto a la gota de
suero, y se procedi a homogenizar
ambos con fuerza.
Luego de cuatro minutos se reportarn
como positivas las muestras que
presenten aglutinacin evidente.

RESULTADOS.
1. Diagnstico en cmara de flujo
lateral

Tabla 2. Nomenclatura de los muestras de

suero.

Orden de muestra
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15

Como se observa en la figura 1, el

marcaje despus de 30 minutos solo se
observa en la ventana de control, por lo
tanto la prueba es negativa.

Nomenclatura
6
1
8
8
151
+
11
+
10
A
2
14
13
13
151

Figura 1. Resultado negativo de la

prueba de flujo lateral.

2. Prueba de aglutinacin con rosa

de Bengala
En la tabla 3 se observa los resultados de
la prueba de aglutinacin rpida, de las 15
muestras 7 presentan aglutinacin,

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correspondientes a las muestras: 6, 8, 11,

10, 2, 14 y 13.
Las ocho muestras restantes son
negativas, dentro de estas se incluyen los
dos frascos que haban sido reportados
como positivos.
Tabla
3.
Resultados
prueba
aglutinacin con rosa de bengala.

Nomenclatura
6
1
8
8
151
+
11
+
10
A
2
14
13
13
151

de

Resultado
+
+
+
+
+
+
+
-

Figura 2. Prueba de aglutinacin con

rosa de bengala.

3. Anillo coloreado en leche

No se observ la formacin de un anillo ni
precipitado en ninguno de los tubos por lo
tanto todas las muestras son negativas.
Figura 3.

En la figura 2, se observa la aglutinacin

en las muestras 10,2 y 14, a diferencia de
la A que no presenta aglutinacin.

Figura 3. Resultados negativos, no

presentan la formacin de anillo.

En el otro grupo si se observaron

muestras positivas para brucelosis,
por lo tanto se observan la presencia

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de un anillo en la parte superior del

tubo. Figura 4.

la sensibilidad de la prueba se debe, en

gran parte, a la afinidad del anticuerpo
por un antgeno especifico. En esta
ocasin debido a que la prueba
utilizada era para el diagnstico de
tuberculosis y no de brucelosis, el
resultado fue negativo tal y como se
esperaba, pues en el suero sanguneo
que
fue
analizado
no
exista
anticuerpos capaces de reaccionar con
antgenos de tuberculosis (Koterwas, et
al, 2009).
La prueba de aglutinacin con Rosa de
Bengala se caracteriza por ser rpida,
fcil de realizar y permite el tratamiento
de varias muestras a la vez (acha y
Szyfres, 2001). Sin embargo se
encontr que los controles positivos
analizados dieron un resultado negativo
para la enfermedad.

Figura 4. Comparacin de un resultado

positivo (derecha) y un negativo
(izquierda).

DISCUSIN.
En el inmunoensayo de flujo lateral
para la deteccin de Brucella la parte
ms importante del sistema de prueba
es la membrana (Geertruida, et al.,
2008), que normalmente est formada
por nitrocelulosa.

En la Brucelosis aguda, la principal

inmunoglobulina presente es la IgM, y
es esta la estructura que se detecta
mediante este anlisis (Yohannes, et
al., 2012).

Como utilizamos suero bovino en la

determinacin de Brucelosis, esta
membrana
debe
contener
una
porosidad especfica, que determina el
tiempo que le toma al fluido viajar
desde el punto de recepcin de
muestra
hasta
la
almohadilla
absorbente, tomando en cuenta la
viscosidad del fluido (Geertruida, et al.,
2008). El tiempo que toma esta prueba
es de 30 minutos.

Se piensa que el resultado encontrado

en los controles positivos, se debe a
una reduccin en la cantidad de IgM
dentro de la muestra, dando lugar a un
falso negativo. Se recomienda utilizar
pruebas
complementarias
para
corroborar los resultados.
La prueba del anillo coloreado en leche
se basa en la capacidad de los glbulos
grasos
para
absorber
partculas
pequeas, que en este caso son
inmunoglobulinas que se unen por la
parte Fc del anticuerpo (Padilla, et al.,

La prueba dio un resultado negativo,

pues solo se coloreo la barra C
(control), lo cual indica que la prueba
fue valida. Hay que tener en cuenta que
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2010). Al aadir antgenos teidos con

hematoxilina, se forma el complejo
aglutinina (anticuerpo) antgeno que
se eleva junto con los glbulos grasos
(Harrigan, 1998).

La prueba de anillo coloreado en leche

permite la identificacin de Brucella en
muestras de leche. Es muy usada para
examinar hatos enteros.
Esta prueba fue negativa para todas las
muestras analizadas.

La prueba result negativa pues no se

dio la formacin del anillo, es decir la
muestra no contena aglutininas
(anticuerpos) especficos para la
Brucella. Se piensa que las muestras
provienen de ganado sexualmente
inmaduro pues este presenta ms
resistencia a la enfermedad, y se
vuelve ms susceptibles con la edad
(Mohamad, et al, 2014).

BIBLIOGRAFA
Acha, P. Szyfres, B. (2001). Brucellosis.
En P. Acha, B. Szyfres, Zoonoses
Volume 1 (pgs. 56-57). Washington,
D.C: Pan American Sanitary Bureau.
AHA. (2005). Disease Strategy. Bovine
Brucellosis. AUSVETPLAN. Primary
Industries Ministeral Council.

Adems otra razn por la cual la

formacin del anillo pudo no haberse
dado, fue debido a un tiempo de
incubacin insuficiente, pues la muestra
estuvo en la estufa alrededor de 35
minutos y no la 1 hora completa que el
protocolo amerita (Harrigan, 1998).

Al-Mariri, A. Haj-Mahmoud. Detection of

Brucella abortus in Bovine Milk by
Polymerase Chain Reaction. Acta Vet
Brno, 79, 277-280.

CONCLUSIONES

CFSPH. (2009). Brucelosis. Iowa State

Institute. Institute For International
Cooperation in Animal Biologics.

El test de flujo lateral, es una prueba

que gracias a su rapidez y al hecho de
que puede ser utilizada en campo
puede llegar a ser muy utilizada en
estudios epidemiolgicos.

Geertruida, A. Korf, J. Van Amerogen,

A. (2008). Lateral flow (immuno)assay:
its strengths, weaknesses, opportunities
and threats. A literature survey.
Hanzeplein , Holanda.

El test de rosa de bengala es la prueba

ms utilizada para el diagnstico de
brucelosis
debido
a
su
alta
especificidad.

Harrigan, W. (1998). The Ring Milk Test

for Brucella Abortus and BR. Melitensis.
En W. Harrigan, Laboratory Methods in
Food Microbiology (pgs. 133-134). San
Diego: Gulf Professional Publishing.

De las 15 muestras analizadas, 7

fueron determinadas como positivas
para brucelosis usando el test rosa de
bengala.

Koterwas, B. Land, F. Handel, I. Tucker,

J. Morgan, K. (2009). Comparison of a
Flow Assay for Brucellosis Antibodies

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with the Reference cELISA Test in West

African Bos indicus. PLoS ONE.
Mohamand,
N.
Gunaseelan,
L.
Sukumar, B. Porteen, K. (2014). Milk
Ring Test for spot identification of
Brucella abortus infection in single cow
herds. Journal of Advanced Veterinary
and Animal Research , 70-72.
Nielsen, K. Yu, W. (2010). Serological
diagnosis for Brucelosis. Sec. Biol. Med.
Sci., 31, 65-89.
OIE. (2008). Brucelosis bovina. Manual
de la OIE sobre los animals terrestres.
Padilla, F. Nielsen, K. Samartino, L.
Ling,
W.
(2010).
Diagnosis
of
Brucellosis. The Open Veterinary
Science Journal , 46-60.
Sareyypoglu, B. Cantekin, Z. Mustal,
H. (2010). Investigation of Brucella
antibodies in bovine sera by rose Bengal
plate test (RBPT), serum agglutination
test (SAT), microagglutination test (MAT
and
2-mercapto
ethanolmicroagglutination test (2-ME-MAT),
Ankara Univ Vet Fak Deg, 57, 157-160.
Yohannes, M. Gill, J. Ghatak, S. Singh,
D. Tolosa, T. (2012). Comparative
evaluation of the Rose Bengal plate test,
standard tube agglutination test and
complement fixation test for the
diagnosis of brucellosis . Ludhiana,
India.

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ANEXO 1
VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL USO DE LA PRUEBA DE FLUJO
LATERAL.
VENTAJAS
1. Son fciles y rpidos de utilizar,
2. Su lectura e interpretacin es sencilla.
3. Pueden permanecer almacenados durante tiempos considerables sin
perder su especificidad y sensibilidad.
4. Pueden ser usados en los lugares clave, es decir no requieren de estar en
un laboratorio para su realizacin.
5. Son de bajo costo.
DESVENTAJAS
1. Se venden como kits, y por lo tanto estn diseados para funcionar de una
nica forma y no pueden ser modificados a conveniencia del investigador.
2. Son tests cualitativos. A fin de realizar una semi-cuantificacin se requieren
de pasos adicionales, que son ms costosos.
3. Si el personal no es entrenado en el uso de este equipo una mala
colocacin de la muestra puede afectar el resultado.
4. Tienen problemas de sensibilidad debido a diversos factores como son: el
tipo de anticuerpo seleccionado y el grueso de la membrana.
5. Son difciles de automatizar.
VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL USO
AGLUTINACIN CON ROSA DE BENGALA.

DE

UNA

PRUEBA

DE

VENTAJAS
1. Rosa de bengala es una prueba que generalmente usa un antgeno
obtenido de Brucella abortus, pero debido a la reactividad cruzada ente los
LPS de los tres tipos de Brucella ms comunes: B. abortus, B. melitensis y
B. suis esta prueba es capaz de detectar la presencia de anticuerpos para
cualquiera de los tres.
2. Es una prueba rpida rpida y econmica por lo tanto es utilizada en la
vigilancia y control de la enfermedad.
3. Buena especificidad y sensibilidad.
4. Es fcil de realizar y de leer, por lo tanto no necesita de personal altamente
capacitado para su elaboracin.

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5. Puede ser realizada por laboratorios de bajos recursos pues no requiere de

maquinaria especializada.
DESVENTAJAS
1. No es una prueba cuantitativa, nicamente cualitativa.
2. No es una prueba adecuada para todas las situaciones epidemiolgicas,
por lo tanto los resultaos positivos deben ser confirmados utilizando una
prueba complementaria.
3. No puede detectar la enfermedad en la fase aguda ya que est diseada
para la deteccin de IgG no de IgM.
4. Si no se lee al momento indicado puede dar lugar a la formacin de falsos
positivos.
5. No permite discriminar que especie de Brucella es la causante de la
infeccin.
VENTAJAS Y DESVENTAJAS
COLOREADO DE LECHE.

DEL

USO

DE

LA

PRUEBA

ANILLO

VENTAJAS
1. La prueba es relativamente barata y til para el control de rebaos lecheros.
2. Las muestras utilizadas (leche) en esta prueba son ms fciles de extraer
que otras muestras requeridas, como por ejemplo muestras de sangre.
3. Si la reaccin de la prueba es suficientemente fuerte, es ms probable el
aislamiento de la Brucella en un cultivo.
4. La muestra permite la deteccin rpida de B. abortus justo despus del
parto en vacas que pueden llevar a la infeccin en humanos por consumo
de carne o leche.
5. La prueba tiene una sensibilidad de hasta el 89% y con una especificidad
de hasta el 95%.
DESVENTAJAS
1. La sensibilidad de la prueba disminuye con grandes rebaos ( >100 vacas
lactantes)
2. Pueden darse Falsos Positivos debido a vacas vacunadas en menos de 4
meses antes de la prueba.
3. Pueden darse Falsos Positivos en muestras recolectadas enseguida del
parto, al final de la lactacin y en vacas con mastitis.
4. No se recomienda el uso de la prueba en pequeas granjas.

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5. Es recomendable utilizar ms pruebas serolgicas para confirmar la

presencia de Brucelosis, para eliminar un posible falso positivo,
consecuentemente esto toma ms tiempo y recursos.

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