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MUTACIN
En gran medida la gentica es el estudio de las diferencias heredadas. Pero adems, el
anlisis gentico no es posible sin el estudio de variantes organismos que presentan
diferencias en uno o varios caracteres particulares - . Como se originan stas variantes?
La respuesta es que el DNA o el material gentico no es considerado estable de manera
absoluta; cada base de ste exhibe cierta posibilidad de sufrir un cambio. Ese cambio se
denomina Mutacin. Estos cambios heredables cubren un amplio rango de clases de
cambios diferentes. En este curso nos enfocaremos a los eventos que tiene lugar en los
genes. mutaciones genticas.
Examinaremos las clases de alteraciones genticas que ocurren en la molcula del
DNA y las consecuencias de estos cambios en la estructura gentica y su funcin.
Estos eventos pueden ser tan simples como el cambio de una base por otra. O bien
una mutacin puede implicar el cambio en el nmero de copias de una secuencia
repetida (i.e. AGCAGCAGC que se cambia a: AGCAGCAGCAGCAGCAGC
AGCAGCAGC). Adems otras mutaciones son debidas a la integracin de DNA
que ha evolucionado especficamente con la capacidad de integrarse en algn sitio
en el genoma y por lo tanto se llaman elementos genticos mviles o elementos
transponibles
Tambin estudiaremos por cul mecanismo molecular las mutaciones se originan?
Consideraremos los mecanismos moleculares de ciertos agentes mutagnicos, que
aumentan la frecuencia de las mutaciones.
CATEGORAS MOLECULARES DE LAS MUTACIONES GNICAS
Consideraremos clases diferentes de mutaciones gnicas:
Mutaciones que afectan un simple cambio de una base. Llamadas mutaciones
puntuales _cambio de una sola letra del libro de DNA_. Las dos clases de
mutaciones puntuales son:
Mutaciones en el cual la base es cambiada por otra y se denomina mutacin
sentido errneo, y mutacin sin sentido, o bien
Mutaciones en las cuales un base extra se inserta, o una base se elimina (deleta).
Mutaciones alterando el nmero de copias de una secuencia pequea repetida en el
gene.
Mutaciones con un bloque grande de DNA que se incorpora a la secuencia normal
del DNA de un gene.
MUTACIONES PUNTUALES.
Las posibilidades en que una sola base puede cambiar es muy grande y varia de acuerdo a
la estructura y secuencia particular del gene. Su origen se dividen en mutaciones inducidas
y son aquellas que se originaron por el tratamiento con agentes mutagnicos, que se
conocen que aumentan la frecuencia de la mutacin. Mutaciones espontneas que se
originan en ausencia de un agente mutagnico conocido. Son las responsables de la
frecuencia basal de mutacin y presumiblemente la fuente ltima de variacin gentica en
las poblaciones. La frecuencia a la cual una mutacin espontnea se presenta es baja,
generalmente en el rango de 10-5-10-8 . Por lo tanto, si un nmero significativo de
mutaciones son necesarias para realizar un anlisis gentico, las mutaciones debern
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CH3
O N N
H2C5-O-S-CH3
C N
EMS
NO2
NG
Estos agentes adicionan grupos metilo y etilo a las bases por ejemplo en el o-6 de la G para
dar la etil-G. La alquilacin conduce a un apareamiento errneo con la T, dando como
resultado en la siguiente ronda de replicacin transiciones de G . C
A . T. Los
agentes tambin pueden alquilar una base que se incorpore al DNA durante la replicacin.
Intercaladores. Los agentes que se intercalan en el DNA como la proflavina, naranja de
acridina y una clase de compuestos llamados ICR. Son molculas planas que imitan el
apareamiento de bases y son capaces de intercalarse entre las bases del DNA; al hacer esto
desestabilizan la doble hlice. Y al momento de la replicacin la DNApol introduce o
elimina un par de bases provocando deleciones o inserciones y alteran la fase abierta de
lectura.
Agentes que daan al DNA, ejemplos de stos tenemos a los rayos UV. Los cuales generan
un nmero de fotoproductos en el DNA, cuando ocurren dos pirimidinas adyacentes se
forman dmeros que distorsionan la estructura de la doble hlice. El resultado final es una
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Secuencias
Reguladoras
regin codificante
de la protena
Gene
Inicio de
la transcripcin
termino
de transcripcin
Elementos de insercin
IS
Presencia en E. coli
Longitud
Invertidas repetidas
(pb)
(pb)
_________________________________________________________________________
IS1
IS2
IS3
IS4
Transposones Estos elementos fueron descritos por vez primera en la bacteria patgena
Shigella. Esta bacteria antes de los aos 50s del siglo pasado era sensible a los antibiticos
de eleccin para su tratamiento. Sin embargo, en hospitales de Japn, los pacientes con
disentera bacilar presentaban una Shigella resistente a muchos de los antibiticos
empleados corrientemente, que inclua a: penicilina, tetraciclina, estreptomicina
sulfonamidas y cloranfenicol. Este fenotipo de multirresistencia fue trasferido en conjunto a
una cepa de laboratorio y a otra cepa sensible de Shigella pero, tambin a varias cepas de
bacterias relacionadas. Desde el punto de vista gentico este evento original hasta entonces,
representaba una situacin muy interesante. El vector que portaba este fenotipo result ser
un plsmido similar al factor F. Este factor R (por resistencia) se encontr ser el primero
de muchos otros que posteriormente se han descrito. Estudios posteriores mostraron la
naturaleza gentica y fsica de este elemento mvil, el cual est constituido de elementos
mviles que portan los determinantes de resistencia y unas secuencias de DNA que lo
flanquean llamadas secuencias invertidas repetidas (IR) . Como un ejemplo est la
secuencia IS10, que lleva la resistencia a la tetraciclina. Las secuencias IR junto con los
genes que portan se denominan transposones (Tn) . Los transposones son por lo tanto, ms
largos que las IS. Aunque los elementos IS y los transposones son elementos encontrados
en procariotes, sus propiedades son tpicas de elementos encontrados tambin en eucariotes.
Los transposones pueden saltar de un plsmido a otro e inclusive a otro cromosoma. Cmo
ocurre la transposicin?
MECANISMOS DE TRANSPOSICIN
Varios mecanismos son empleados por los elementos mviles de procariotes. En E. coli se
han identificado dos mecanismos de transposicin: la replicativa y la conservativa (no
replicativa). En la replicativa, se genera una copia nueva del elemento durante el evento de
transposicin El resultado es que una copia se localiza en el sitio nuevo donde se alojar el
transposn y otra permanece en el sitio original. En la va conservativa el elemento se
escinde del plsmido o cromosoma original y se integra en su sitio nuevo.
Transposicin replicativa Cuando la transposicin de un locus a otro implica la replicacin
del elemento transponible, en estos casos la transposicin est asociada a la replicacin del
elemento. Este evento es mediado por una enzima denominada transposasa, la cual es
codificada por el elemento. Estudios genticos indica que una mutacin en el gene que
codifica para la transposasa es recesiva. Un transposn replicativo es el Tn3. La transposasa
acta participando en la integracin replicativa del Tn y se origina una forma intermediaria
llamada cointegrado. El crculo combinado est constituido por los dos genomas (el que
portaba originalmente el transposn y el que lo recibir). El cointegrado se resuelve por
evento de recombinacin que separa los dos genomas. El resultado final ser la obtencin
de dos genomas con una copia cada uno del Tn, uno localizado en su sitio original y el otro
en el nuevo sitio. Mutaciones en el gene de la enzima que resuelve el integrado, o en el
sitio donde se lleva a cabo la recombinacin llamado sitio interno de resolucin (IRS) ,
hacen que el cointegrado sea estable. El hallazgo de la estructura del cointegrado facilit la
comprensin del mecanismo de transposicin en estos elementos.
Transposicin conservativa. Algunos transposones como el Tn10, se escinden del
cromosoma o plsmido y se integran en el genoma blanco. En estos casos, el elemento no
se replica, y se pierde del sitio original.
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Mecanismos de transposicin
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El mapa de restriccin resultante del DNA de varias clonas puede usarse para determinar el
camino ms eficiente a emplear en la etapa siguiente del caminado en el cromosoma. Una
vez que se tiene el mapa de restriccin de varias clonas se decidir la clona a secuenciar.
Adems el orden y se establece el grado de traslape, y el final del fragmento de la clona que
contiene la continuacin en se determina y de hecho se podr utilizar como sonda en la
siguiente etapa. As estas etapas se prolongarn tanto como sea posible. Es importante
destacar que el caminado en el cromosoma es una de las muchas aplicaciones del mapeo
con las endonucleasas de restriccin. En este sentido el mapa es una secuencia parcial de un
segmento de DNA, ya que cada sitio de restriccin es una secuencia determinada
dependiendo de la enzima que se trate. Adems, la tarea de la construccin de clonas para
un segmento particular se facilita si se conoce el mapa y pueden escogerse para emplearse
en ensayos subsecuentes.
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ETIQUETADO DE GENES
El etiquetado de genes es una estrategia muy empleada que permite obtener un gene a partir
de una mutacin del mismo. Para lo cual se emplean los transposones, los cuales se insertan
en el DNA interrumpiendo su funcin. La mutacin se selecciona y posteriormente,
podemos aislar secuencias del gene que flanquean a la resistencia portada por el transposn,
al utilizarla como sonda. La estrategia se explica en la fig. correspondiente. Se prepara una
librera de la mutacin.
Casi siempre se obtiene un evento de insercin. Se infiere que la clona seleccionada que
contiene la insercin lleva secuencias del gene que flanquean al cartucho de antibitico u
otro marcador gentico. El segmento de DNA puede ser clonado directamente en un vector
de secuencia y a partir de iniciadores diseados de las terminales del cartucho de Km por
ejemplo secuenciar los segmentos flanqueantes y definir el gene alterado.
Ejemplo:
Supongamos que deseamos clonar el gene A del hongo Aspergillus, por otra parte tenemos
clonas del gene x+, que emplearemos como la etiqueta. Por transformacin de DNA se
transforma Aspergillus x- en clulas x+. Muchas de las transformantes sern clulas
mutadas en donde x+, se ha insertado al azar. Si se generaron muchas mutantes podremos
encontrar algunas clulas que tengan el gene A mutado por la insercin de x+, en A el gene
que nos interesa clonar, y cuyo fenotipo ahora ser A-. El siguiente paso ser cruzar las
clulas de Aspergillus con clulas x- A+ para determinar si A- y x+, cosegregan. Si es as,
entonces la mutacin A- es causada por la integracin de x+,en el gene. Una librera
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La secuencia de nucletidos ser examinada para encontrar el gene o los genes que
contenga. La secuencia es analizada en la computadora, la cual entonces hace un recorrido
en las bases emplendo un algoritmo basado en seis posibles fases abierta de lectura: tres en
una direcccin y tres en la otra, con el fin de encontrar las regiones posibles de
codificacin para una protena, con el codn de inciacin ATG, el final con el codn de
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