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Investigacin
Abstract. Nalidixic and oxolinic acids are pharmaceutical compounds that belong to the quinolone family. They are used in the treatment of skin, urinary tract and respiratory tract infections. Since
they have very low water solubility, they are rapidly excreted.
Physico-chemical properties of both quinolones may be modified by
insertion of the organic molecule in the cavity of a cyclodextrin.
In this work, the formation of complexes of these acids with - and cyclodextrins was studied by fluorescence spectroscopy to evaluate
the equilibrium constants in order to determine if it is possible to
encapsulate oxolinic and nalidixic acids in cyclodextrins and improve
their pharmacological properties. The experimental results showed
that both cyclodextrins form inclusion complex with these acids.
However, nalidixic and oxolinic acids form stronger complexes with
-cyclodextrin.
Key words: Nalidixic acid, oxolinic acid, quinolones, cyclodextrins,
inclusion complex.
Introduccin
190
Fig. 2. Estructura del cido nalidxico (1) y estructura del cido oxolnico (2)
Estudio de los complejos de inclusin de cido nalidxico y cido oxolnico con ciclodextrinas
191
Parte experimental
Los cidos nalidxico y oxolnico se obtuvieron de SigmaAldrich. Las ciclodextrinas ( y ) fueron donadas por la compaa Cerestar. Los estudios de fluorescencia se hicieron en
un espectrofotmetro de fluorescencia Photon Technology
International. El estudio de la formacin de complejos de
inclusin de cido nalidxico con -ciclodextrina se hizo a
partir de una solucin estndar del cido (5 10-4 M) en HCl
al 25 % en volumen con agua desionizada y una solucin
acuosa de -ciclodextrina (1 10-2 M). Para preparar las mezclas de reaccin se miden 0.2 mL de la solucin de cido nalidxico (5 10-4 M) y se colocan en un matraz volumtrico de
10 mL al que se le aade un volumen predeterminado (2, 4, 6,
8, 9 mL) de la solucin de -ciclodextrina (1 10-2 M). El
matraz se afora con agua desionizada hasta la marca de 10
mL. De esta forma se preparan soluciones que tienen una concentracin fija de cido nalidxico (1 10-5 M) y diferentes
concentraciones de -ciclodextrina (2 10-3, 4 10-3, 6 103, 8 10-3 o 9 10-3 M).
Cada una de las mezclas se deja reaccionar a temperatura
constante de 25 C por 10 minutos para promover la formacin del complejo de inclusin.
El estudio de formacin de complejos de cido nalidxico
con -ciclodextrina se lleva a cabo de la misma manera. Se
utilizan soluciones estndar de cido nalidxico (5 10-4 M) y
-ciclodextrina (1 10-2 M). En este caso, se miden 2, 4, 5 6
mL de la solucin de -ciclodextrina y se mezclan con 0.2 mL
de la solucin de cido nalidxico en matraces volumtricos de
10 ml para preparar mezclas de reaccin con una concentracin fija del cido (1 10-5 M) y diferentes concentraciones
de -ciclodextrina (2 10-3, 4 10-3, 5 10-3 o 6 10-3 M).
El estudio de la formacin de los complejos de cido oxolnico con -ciclodextrina y -ciclodextrina se lleva a cabo
repitiendo el procedimiento anterior, solo se sustituye la solucin estndar de cido nalidixico por una solucin estndar de
cido oxolnico con la misma concentracin (1 10-5 M).
Resultados y discusin
La asociacin de las molculas de sustrato y ligando, as como
la disociacin del complejo formado estn gobernados por un
equilibrio termodinmico que se representa como una constante de asociacin Ka [25] de la reaccin que se describe en
la Figura 3. El complejo molecular tiene una estequiometra
definida en donde las molculas de sustrato y ligando se
encuentran unidas por efectos fisicoqumicos.
Generalmente, las molculas de ciclodextrinas pueden
contener una sola molcula de sustrato dentro de su cavidad
(complejo 1:1). En casos especiales, las molculas de ciclodextrina pueden contener dos molculas de sustrato para formar un complejo 2:1. Sin embargo, la relacin ms frecuente
es 1:1; sta es la esencia del encapsulamiento molecular.
La formacin de complejos de inclusin ha sido estudiada
por medio de una gran variedad de mtodos espectroscpicos
(2)
Donde kS, kSL y kL representan las constantes de proporcionalidad que relacionan las intensidades de los espectros de
fluorescencia y las concentraciones de las especies S, L y SL
192
respectivamente. Dado que la ciclodextrina no presenta fluorescencia, la intensidad del espectro en cualquier momento
est dada por la siguiente ecuacin:
(3)
Al inicio de los experimentos, el sustrato no se ha combinado con la ciclodextrina y la intensidad inicial del espectro se
describe por una ecuacin simplificada.
(4)
Donde St es la concentracin total del sustrato. El valor de
la variable St se puede calcular por medio de un balance de
materia para el sustrato:
(5)
El valor de SL se obtiene a partir de la constante de equilibrio de la reaccin representada en la Figura 3.
(6)
Al combinar las ecuaciones anteriores se obtiene una
expresin que describe la isoterma de asociacin de un complejo 1:1 en trminos de la concentracin total de sustrato y de
la concentracin de ligando libre.
(7)
(10)
En la Figura 4 se muestran los espectros por fluorescencia
de la formacin de complejo entre el cido nalidxico y la ciclodextrina. Para el cido nalidxico se utiliz una longitud
de onda de excitacin de 320 nm y una longitud de onda de
emisin de 357 nm. Como podemos apreciar en el espectro, la
intensidad de fluorescencia del espectro del cido nalidxico
disminuye al aumentar la concentracin del ligando, como
efecto del encapsulamiento molcular.
Tambin se obtuvieron los espectros de la formacin de
los complejos del cido nalidxico con -ciclodextrina y del
cido oxolnico con - y -ciclodextrina. Los datos de los
espectros de fluorescencia sirven para obtener las isotermas de
asociacin que son las grficas de F = Fo-F como funcin de
la concentracin de la ciclodextrina o ligando L.
Dichos datos se encuentran en las tablas 1, 2, 3 y 4. Dado
que las constantes de asociacin se calcularon por medio de la
ecuacin (10), en las tablas mencionadas anteriormente tambin se incluyen columnas con los valores de 1/F y con los
valores de 1/L.
En las Figuras 5 y 6 se muestran las isotermas de asociacin de la formacin de complejos del cido nalidxico y
del cido oxolnico respectivamente con Beta-ciclodextrina
y Gama-ciclodextrina. Cabe mencionar que la lnea que
pasa por los puntos es generada mediante la ecuacin de
Benesi-Hildebrand con los valores de las constantes obtenidas, slo para indicar la tendencia de los datos. Como se
puede apreciar, la formacin del complejo de inclusin es
mayor para ambos cidos con Beta-ciclodextrina. En las
Figuras 7 y 8 se muestran las grficas de la ecuacin de
Benesi-Hildebrand para obtener las constantes de asociacin
del cido nalidxico y cido oxolnico con - y -ciclodextrina.
(8)
Al sustituir los valores de kS y kSL obtenidos a partir de
las ecuaciones (4) y (8) en la ecuacin (7) se obtiene la isoterma de asociacin en trminos de la concentracin de ligando
libre y de las intensidades de los espectros de fluorescencia.
(9)
El doble recproco de esta ecuacin es conocida como la
ecuacin de Benesi-Hildebrand (10), cuyos parmetros nos
permiten calcular la constante de asociacin del complejo K11:
Estudio de los complejos de inclusin de cido nalidxico y cido oxolnico con ciclodextrinas
193
Tabla 1. Intensidad mxima de los espectros de fluorescencia como funcin de la concentracin de ligando
para la reaccin de cido nalidxico (1 10-5 M) con Beta-ciclodextrina.
Muestra
Conc. de CD
(M)
Fluorescencia
(cuentas/s)
1
2
3
4
5
6
0
2.000 10-3
4.000 10-3
6.000 10-3
8.000 10-3
9.000 10-3
1.3123 106
1.2503 106
1.2133 106
1.2056 106
1.1786 106
1.1761 106
F=-(F-Fo)
1/F
1/L
6.200 104
9.900 104
1.067 105
1.337 105
1.362 105
1.613 10-5
1.010 10-5
9.372 10-6
7.479 10-6
7.342 10-6
5.000 102
2.500 102
1.667 102
1.250 102
1.111 102
Tabla 2. Intensidad mxima de los espectros de fluorescencia como funcin de la concentracin de ligando
para la reaccin de cido nalidxico (1 10-5 M) con Gama-ciclodextrina.
Muestra
Conc. de CD
(M)
Fluorescencia
(cuentas/s)
1
2
3
4
5
0
2.000 10-3
4.000 10-3
6.000 10-3
8.000 10-3
1.3901 106
1.3715 106
1.3658 106
1.3574 106
1.3344 106
F=-(F-Fo)
1/F
1/L
1.860 104
2.430 104
3.270 104
5.570 104
5.376 10-5
4.115 10-5
3.058 10-5
1.795 10-5
5.000 102
2.500 102
1.667 102
1.250 102
Tabla 3. Intensidad mxima de los espectros de fluorescencia como funcin de la concentracin de ligando
para la reaccin de cido oxolnico (1 10-5 M) con Beta-ciclodextrina.
Muestra
1
2
3
4
5
6
Conc. de CD
(M)
Fluorescencia
(cuentas/s)
0
2.000 10-3
4.000 10-3
6.000 10-3
8.000 10-3
9.000 10-3
1.1946 106
1.1184 106
1.0974 106
1.0888 106
1.0782 106
1.0753 106
F=-(F-Fo)
1/F
1/L
7.620 104
9.720 104
1.058 105
1.164 105
1.193 105
1.312 10-5
1.029 10-5
9.452 10-6
8.591 10-6
8.382 10-6
5.000 102
2.500 102
1.667 102
1.250 102
1.111 102
Tabla 4. Intensidad mxima de los espectros de fluorescencia como funcin de la concentracin de ligando
para la reaccin de cido oxolnico (1 10-5 M) con Gama-ciclodextrina.
Muestra
1
2
3
4
5
Conc. de CD
(M)
Fluorescencia
(cuentas/s)
0
2.000 10-3
4.000 10-3
6.000 10-3
8.000 10-3
9.5671 105
9.4988 105
9.4724 105
9.4589 105
9.4105 105
F=-(F-Fo)
1/F
1/L
6.830 103
9.470 103
1.082 104
1.566 104
1.464 10-4
1.056 10-4
9.242 10-5
6.385 10-5
5.000 102
2.500 102
1.667 102
1.250 102
194
Fig. 7. Grfica de la ecuacin de Hildebrand para la reaccin de formacin del cido nalidxico con -ciclodextrina y -ciclodextrina.
Fig. 8. Grfica de la ecuacin de Hildebrand para la reaccin de formacin del cido oxolnico con -ciclodextrina y -ciclodextrina.
Conclusiones
un aumento en las fuerzas de atraccin. Valero y col. [28] calcularon la constante dielctrica de la cavidad de -, - y ciclodextrina y encontraron que la cavidad de la -ciclodextrina es la ms hidrofbica de las tres. Esto puede conducir a la
formacin de un complejo mas fuerte en el caso de la -ciclodextrina ya que se logra una mayor penetracin de la molcula
del cido nalidxico u oxolnico en la cavidad. Nuestros resultados confirman que la constante de asociacin es mayor para
los complejos de la -ciclodextrina a pesar de que la cavidad
es de menor tamao que la cavidad de la -ciclodextrina. En el
caso de cido nalidxico y oxolnico es de esperarse que los
grupos carboxlicos se acomoden en un ambiente hidroflico
mientras que la regin aromtica se acomode en una regin
hidrofbica. Por lo tanto, se puede proponer en ambos casos la
formacin de complejos con la estructura que se muestra en la
Figura 9. En un estudio reciente, se propone esta misma topologa para los complejos de cido nalidxico con -ciclodextrina basndose en estudios de mnima energa conformacional
[23].
Para determinar las constantes de asociacin del cido nalidxico y oxolnico con las ciclodextrinas se determin el cambio
en el espectro de fluorescencia de estos cidos al agregar una
cantidad de la ciclodextrina correspondiente. En general, se
observ un decremento en la intensidad de fluorescencia. Para
el cido nalidxico se obtuvo una constante de asociacin de
223.26 M-1 con -CD y de 163.85 M-1 con -CD. Para el caso
del cido oxolnico se obtuvieron constantes de asociacin de
603.75 M-1 con -CD y 257.93 M-1 con -CD. Estos valores
indican que ambas ciclodextrinas pueden acomodar a las
molculas del cido nalidxico y cido oxolnico en su cavidad. Sin embargo, los resultados experimentales indican que
se forma un complejo ms fuerte entre estos cidos y la cavidad de la -ciclodextrina. En los complejos formados con
ambas ciclodextrinas existen las mismas fuerzas de atraccin,
sin embargo en el caso de -ciclodextrina debe existir una
mejor relacin entre el sustrato y la ciclodextrina que ocasiona
Estudio de los complejos de inclusin de cido nalidxico y cido oxolnico con ciclodextrinas
195
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Agradecimientos
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa por el proyecto
de investigacin Ref. 31338U, al Sistema de Investigacin
Miguel Hidalgo (SIGHO) No. Ref. 20000206022. Gracias a
Cerestar por la donacin de las ciclodextrinas.
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