Chloroplast Transformation of Platymonas (Tetraselmis) subcordiformis with the bar

Gene as Selectable Marker

Objetivo: establecer una tcnica de transformacin de cloroplasto para Platymonas
(Tetraselmis) subcordiformis utilizando el gen gfp como gen reportero y el gen bar como
marcador selectivo.
Los vectores de transformacin de P. subcordiformis fueron construidos con fragmentos
endgenos rrn16S-trnl y trnA-rrn23S como sitios de recombinacin del genoma del
cloroplasto. Los plsmidos fueron transferidos al P. subcordiformis por bombardeo de
partculas. La microscopa de escaneo lser confocal indic que la protena verde
fluorescente estaba localizada en el cloroplasto P. subcordiformis confirmando la
actividad del promotor Chlamydomonas reinhardtii. Las clulas transformadas con el gen
bar fueron seleccionadas usando herbicida Basta. Las colonias resistentes fueron
analizadas por PCR y Southern blot. Los resultados indicaron que el gen bar fue
satisfactoriamente introducido al genoma del cloroplasto por recombinacin homloga.
La Platymonas (Tetraselmis) subcordiformis es un alga marina unicelular verde; es un
alimento muy utilizado en la acuicultura debido a sus altos niveles nutricionales.
En microalgas, el hidrgeno fotosinttico es catalizado por una hidrogensa con flujo
elctrico de la cadena de transporte de electrones de PSII en el cloroplasto, mientras que
la actividad de la hidrogenasa es inhibida por el oxgeno molecular de PSI. Una estrategia
para incrementar la produccin de hidrogenasa es regular PS I y PS II para mantener las
clulas anaerbicas mediante la manipulacin de genes que codifican protenas PS s
travs de la transformacin de cloroplastos.
La transformacin de cloroplastos tiene una gran ventaja sobre la transformacin nuclear
debido a sus altos niveles de expresin de genes forneos, integracin homloga de
genes forneos, la falta de silenciamiento y co-expresin de multigenes.
P. subcordiformis no es sensible a espectinomicina, estreptominica o kanamicina pero s al
herbicida Basta. Basta contiene un tripptido de resiudos Ala y un anlogo de Glu
llamado fosfinotricina (PPT). Despus de que 2 residuos Ala sean removidos por una
peptidasa intracelular, el PPT libre inhibe la actividad de la glutamina sintetasa (GS) dando
lugar a una rpida acumulacin de amoniaco intracelular lo que provoca la muerte
celular.
Hay dos isoformas de GS: GS1 localizado en el citoplasma y GS2 en cloroplastos y
mitocondria. La protena GS2 es normalmente codificada por un gen nuclear y expresado
especficamente en las hojas de la planta. Se encarga de re-asimilar el amonio liberado
por fotorespiracin en cloroplastos y mitocondria.
El gen bar que codifica PAT confiere resistencia a PPT. La interaccin de PPT, GS y PAT
puede ser utilizada para seleccionar las colonias positivas en la transformacin nuclear de
plantas y algas. En la transformacin nuclear, PAT est localizado en el citoplasma y
puede detener al inhibicin PPT de GS1, crucial para la asimilacin de amonio en la
clula. El GS1 recuperado puede asimilar amonio de la fotorespiracin en cloroplastos

antes de que los niveles de amonio de concentren e interrumpan la estructura de

cloroplastos que provoca muerte celular.
Las clulas de plantas contienen mltiples cloroplastos, usualmente hay un cloroplasto con
el gen forneo insertado en una copia del genoma. Al inicio de la seleccin, el nivel
expresado de PAT es mucho menor para desintoxicar PPT. El relativo nivel bajo de GS2 en
un cloroplasto comparado con GS1 no puede desintoxicar la inhibicin de PPT a GS1 en el
citoplasma y debido a los niveles de amoniaco, la clula muere.
Materiales y mtodos
Cepa, condiciones de crecimiento y medio
Platumonas subcodiformis cultivado en medio lquido f/2 o agar a 23C bajo una luz
intensa de 80-90umol fotones m-2s-1 con un fotoperiodo a 12h/12h (iluminado/oscuro)
Construccin del plsmido
El genoma del cloroplasto de otras 10 algas verdes fue utilizado para disear los primers
para aislar el fragmento de rrn16 (16S rRNA)-rrn23 (23S-rRNA) en P.subcodiformis. Basados
en la secuencia rrn16-rrn23 fue amplificado por primers especficos

Debido a la falta de informacin de la regulacin de la expresin gentica en el

cloroplasto de P.subcodiformis, el casette del gen forneo fue hecho amplificando una
regin sin trasladar 5 (UTR) de attpA y 3 UTR de rbcL de un plsmido transformado de
Chlamydomonas reinhardtii. Los dos fragmentos mostraron gran eficiencia en la
transformacin del cloroplasto C. reinhardtii. Mientras el gfp y el gen bar fueron clonados
de pEGFP-N1 y pSVB. Solo un sitio de restriccin se aadi a cada fragmento.
Los fragmentos resultantes fueron clonados en un vector pMD18-T con un kit de clonacin
TA. Despupes de la digestin de la enzima de restriccin, los fragmentos fueron insertados
en el plsmido Bluescript KS (+). El plsmido que contena el gen gfp fue nombrado pPSCGFP, y el que contena el gen bar pPSCB.
Bombardeo de micropartculas
Los plasmidos pPSC-GFP y pPSCB fueron utilizados para la transformacin de cloroplasto
de P.subcodiformis. Partculas de oro de .8-1,5um de dimetro fueron utilizados como
acarreadores de plsmido y 2-3ug de plsmido de ADN fue utilizado para cada
bombardeo siguiendo el protocolo de Bio-Rad. La presin de ruptura fue de 900psi a una
distancia de bombardeo de 6cm. Las clulas bombardeadas con partculas de oro se
establecieron como controles negativos. Todos los experimentos de realizaron en
triplicado
Anlisis de microscopa
Las clulas transformadas con pPSC-GFP fueron examinadas con un microscopio Nikon
Eclipse 50i con luz azul despus de 48h del bombardeo. Las clulas transformadas fueron
seleccionadas para comparar su intensidad de fluorescencia con el control negativo
usando FACS con 488 nm. La localizacin de GFP fue examinado con un microscopio de
escaneo lser (CLSM) a 488nm y 635 nm para GFP y fluorescencia cloroflica.
Seleccin del herbicida
Despus de 2 das, las clulas transformadas con pPSCB fueron transferidas a un medio
selectivo f/2 con 15ug ml-1 de Basta por un mes. Las clulas sobrevivientes fueron
esparcidas en un medio slido con 10ug ml-1 de Basta. Las colonias que aparecieron
despus de 2 semanas fueron seleccionadas y sembradas en agar con medio f/2 con 5ug

ml-1 de Basta. Despus de otras 2 semanas de cultivo, 40 colonias fueron seleccionadas y

cultivadas en medio lquido f/2 sin el herbicida.
Deteccin de los eventos de integracin
Despus de 3 semanas de cultivo, las clulas procedentes de las colonias resistentes
fueron cosechadas y el DNA genmico fue extrado usando un kit de DNA de planta
genmica. De acuerdo al mapa pPSCB y el genoma del cloroplasto construido de
P.subcodiformis, 4 pares de primers fueron designados para examinar el gen bar en las
colonias resistentes.

Un fragmento de 5 atpA-bar-3 rbcL fue amplificado del DNA genmico usando primers
p1 y p2 para confirmar la existencia del gen bar. Colonias con amplificacin positiva
fueron analizadas con PCR con primers p5, p6, p7 y p8 para examinar la integracin
homloga, y con los primers p3 y p4 se examin la integracin homoplsmica.
Las clulas con amplificacin positiva en todos los pasos de PCR fueron analizados con
Southern blott. El fragmento de pSVB amplificado con primers fue usado como sonda. El
ADN total (> 4ug) de cada muestra fue digerido con EcoR y BamH I.
Resultados
Plsmido
El primer fragmento clonado con P.subcodiformis tuvo 3729 bp de longitud. Los
fragmentos de rrn16-trnI y trnA-rrn23 fueron separados como las regiones homlogas para
los vectores de transformacin de los plsmidos. Dos vectores, pPSCB y pPSC-GFP de la
transformacin del cloroplasto P-subcodiformis fueron construidos.

El gen bar fue usado como marcador selectivo para conferir resistencia al herbicida Basta,
mientras el plsmido pPSC-GFP us el gen gfp como gen reportero. Los genes bar y gfp
fueron conducidos por los reguladores de cloroplasto de C. reinhardtii 5UTR de atpA y 3
UTR de rbcL. La expresin de casettes del gen bar y gfp en cada plsmido se encontraron
en los bordes de las regiones rrn16-trnI y trnA-rrn23, por lo que se llev a cabo la
recombinacin homloga de los genes forneos
Expresin GFP
Despus del bombardeo de pPSC-GFP, algunas clulas mostraron fluorescencia amarilloverde con la luz azul bajo el microscopio de fluorescencia, mientras los controles negativos
mostraron fluorescencia roja. Los resultados indican que GFP fue expresado en algunas
clulas

Las clulas transformadas con GFP mostraron mayor fluorescencia con 488nm que los
controles negativos. Se compararon cuantitativamente estas diferencias de fluorescencia
por FACS, y las clulas con mayor intensidad de fluorescencia fueron cultivadas para su
posterior anlisis con CLSM. Hubo una fraccin positiva de 4.95% de clulas transformadas.
Mediante la combinacin de imgenes de GFP y fluorescencia de clorofila en algunas
clulas por escaneos CLSM, se localiz GFP en cloroplastos de P. subcodiformis. Esto indic
la actividad de factores de regulacin de C. reinhardtii en cloroplastos de P.subcodiformis.
Deteccin de la integracin del gen Bar
La resistencia a herbicida fue examinada primero cultivando el alga bombardeada en
medio f/2 Basta. Las 40 colonias fueron escogidas para deteccin con PCR. 2 colonias
(PSB1 y PSB2) dieron positivo con los 4 pares de primer. Las bandas de 1700 bp con la
secuencia correcta indican la presencia del gen de expresin bar en P.subcodiformis. Las
bandas de 1300 bp indican la insercin homloga en el borde izquierdo, mientras que las
bandas de 1500 bp indican la insercin homloga en el borde derecho. Primers p3 y p4
pueden producir 3 resultados: una sola banda de 500 bp, que representan la colonia
original, una banda de 2000bp que representa la colonia homoplsmica o dos bandas de
500 bp y 2000 bp que representan una colonia no transformada homoplsmica. Ambas
colonias producen dos bandas con esos primer indicando que le gen bar fue insertado en
el genoma de cloroplasto. El alga verde C. reinhardtii y el alga roja Porphyridium
produjeron mutantes homoplsmicas despus de 6 meses demostrando que el gen bar
fue integrado al genoma del cloroplasto P.subcodiformis.