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TALLER DE BIOMOLCULAS-ENZIMAS

SILVIA JULIANA GUTIRREZ RUEDA


2113694
KELLY JOHANNA PRADA CAAS
2113701
WALTER JESS RIVERA MORAD
2113690
JUAN SEBASTIN ROA PINTO
2113253

MABEL JULIANA QUINTERO

BUCARAMANGA-SANTANDER
UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER
ESCUELA DE INGENIERIA QUMICA
05 DE FEBRERO DEL 2014

1. Para verificar la comprensin que se ha desarrollado durante esta


segunda unidad, elabore un diagrama circular sobre biomolculas en
donde describa la definicin, clasificacin y las principales
caractersticas de cada una.
DIAGRAMA EN ANEXO 1
2. Qu son las bases de Schiff y cmo se forman? En qu ensayos de
laboratorio se utiliza este fundamento? (Explique)
Las bases de Schiff son productos formados en la condensacin de un
grupo carbonilo y una amina primaria.1 Los aldehdos y cetonas bajo
condiciones adecuadas son capaces de reaccionar con el amoniaco y
las aminas primarias dando lugar a la formacin de las iminas o bases
de Schiff. 2 Estos compuestos son los equivalentes nitrogenados de los
aldehdos y cetonas donde el grupo C=O es reemplazado por el grupo
C=N 3 La reaccin general sera:

Las bases de Schiff intervienen como intermediarios en cierto nmero de


reacciones enzimticas en las que se registran la accin mutua de la
enzima con grupo amino o carbonilo de sustrato, por ejemplo en el
laboratorio las bases de Schiff Son intermediarios en la sntesis de la
amina como preparar W-amina-azcar por reduccin de la base de
Schiff procedente de la condensacin de un aldehdo con amoniaco.
Ensayos en el laboratorio:
En el laboratorio se utiliza este mecanismo en pruebas con
hemoglobina. La hemoglobina glicosilada (HBA1C) se forma de modo no
enzimtico mediante una reaccin de dos pasos: la primera, es rpida y
produce una Aldimina lbil o base de Schiff; a continuacin, la aldimina
experimenta lentamente una reorganizacin de Amadori y se convierte
en una Cetoamina ms estable, dando lugar a la hemoglobina
glicosilada. La mayora de estas pruebas miden la Cetoamina estable y
no el producto ms labil, que es ms para el tratamiento de la diabetes
utilizando la Hemoglobina.

3. Los compuestos que tienen grupos hidroxilo en carbonos adyacentes


sufren una escisin en el enlace C-C, cuando se tratan con Peryodato
(IO4.) cmo podra utilizarse esta reaccin para diferenciar los
compuestos Piransicos de los Furansicos?
La oxidacin por peryodato, ha sido muy empleada en el estudio de
estructuras de hidratos de carbono como por ejemplo en la
determinacin del tamao del anillo de las formas hemiacetales o
hemicetales.
El peryodato acta rompiendo enlaces carbono-carbono y oxidando en
un nivel de oxidacin los grupos funcionales unidos a ellos. Para que un
carbono sea oxidable por peryodato requiere entonces poseer en grupos
adyacentes, grupos susceptibles de oxidacin. Para establecer la
estructura del compuesto en estudio, resulta de importancia la
cuantificacin y determinacin de algunos productos de oxidacin. Son
de especial utilidad el formaldehido y el cido frmico.
En definitiva, un piransico reacciona con dos molculas de peryodato,
uno de los productos es el formiato. Un furansico reacciona solamente
con una molcula de peryodato, no se produce formiato, y esta es la
razn por la que, mediante esta reaccin se pueden diferenciar estos
dos tipos de compuestos.
4. Cules son los principales anlisis que se utilizan para realizar
determinaciones de aceites y grasas, y cules son los principales
mtodos de extraccin de los mismos?
Los principales anlisis de grasas y aceites se resumen en varias
determinaciones:
a) Grado de acidez: los cidos grasos se expresan por la acidez (en
solucin de etanol y ter)
b) Determinacin del contenido de esteroles por cromatografa de gases
c) Analizar la solubilidad
d) Determinacin de las mezclas de grasas o aceites
e) Determinacin de activos (Glucolpidos)
f) Analizar la densidad

MTODOS DE EXTRACCIN
1. Mtodo de extraccin con solventes
Es una tcnica de tratamiento que consiste en usar un solvente para
separar o retirar compuestos de una fase homognea. Se podrn
obtener aceites y grasas a partir de muestras vegetales y animales
utilizando tcnicas de extraccin slido lquido. Y lquido-lquido. La
eficiencia de estos mtodos depende tanto del pre-tratamiento de la
muestra como de la seleccin del disolvente.
La preparacin de la muestra depende del tipo de alimento y el tipo y
naturaleza de los lpidos que contiene.
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)

Deben evaporarse rpido y no dejar residuo.


Deben tener un bajo punto de ebullicin.
No deben ser inflamables
No deben ser txicos en estados lquidos y de vapor.
Deben penetrar a las partculas de la muestra inmediatamente
Deben evitar el fraccionamiento
Deben ser econmicos y no higroscpicos.

2. Extraccin hmeda sin solventes

Mtodo de Gerber:
Se utiliza para determinar el contenido de grasa de la leche y
otras sustancias dentro de un recipiente medidor, llamado
Butirmetro, y medir el volumen expresando el resultado en tanto
por ciento en masa. Est usa cido sulfrico y alcohol amlico.

Mtodo de Rose-Gottlieb:
En este mtodo la separacin de la grasa es lograda por
amoniaco y etanol con un posterior efecto de deshidratacin
sobre los fosfolpidos. Este mtodo es particular para leche fresca
que no contiene cidos grasos libres, los cuales en disolucin
alcalina forman sales de amonio y esto es insoluble en ter.

3. Extraccin por solubilizacin


Los lpidos asociados pueden ser liberados si la muestra del
alimento se disuelve completamente antes de hacer la extraccin con
disolventes polares. La disolucin del alimento se puede lograr por
hidrlisis cida o alcalina.

En el mtodo cido (proceso de Werner-Schmidt) el material es


calentado en bao de agua hirviente con cido clorhdrico para
romper las protenas y separar la grasa como una capa que flota
sobre el lquido cido. En la disolucin usando lcali (mtodo de
Rose-Gottlieb), el material se trata con amonaco y alcohol en fro y la
grasa se extrae con una mezcla de ter y petrleo ligero. El alcohol
precipita las protenas que se disuelven en el amonaco; entonces las
grasas pueden ser extradas con ter.
5. Suponer que una protena posee seis sitios posibles de N-glicosilacin.
Cuantas protenas diferentes se podra generar, segn cuales sean los
sitios glicosilados? No tener en cuenta el efecto producido por la
diversidad de carbohidratos aadidos.
La glicosilacin de protenas es un proceso por el cual se aaden
carbohidratos a la misma. La glicosilacin funciona como una etiqueta
que le permite a un organismo distinguir a protenas ajenas de las
propias. La N-glicosilacin es un proceso muy complejo que sucede en
el retculo endoplsmico y aparato de Golgi, e involucra a decenas de
enzimas.
FALTA ESPECIFICAR LA PROBABILIDAD DE OBTENER
PROTEINAS DISTINTAS CON 6 SITIOS DE N-GLICOSILACION

6. Escribir la estructura anionica predominante en cada uno de los


siguientes aminocidos: Glicina, Treonina, Aspartato, Lisina, Serina,
Prolina

Glicina:

Treonina:

Aspartato:

Serina:

Lisina:

Prolina:

7. Cul es la carga neta a Ph =7,0, cul sera el PL del siguiente pptido:


Phe-Lys-His-Leu-Lys-Thr-Glu-Ala-Glu-Met-Lys-Ala-Ser-Glu-Asp.

De la tabla (ANEXO 2) se tomaron los datos de los Pka de los siguientes


aminocidos y su respectiva carga:
a).

Aminoacido Phe Lys His Leu Lys Thr Glu Ala Glu Ala Glu Met Lys Ala Ser Glu Asp carga neta
PKa predominante 9.31 10.5 6.04
10.5
4.07
4.07
10.5
10.5
4.07 1.99
Carga
1 1 -1 0 1 0 -1 0 -1 0 -1 0 1 0 0 -1 -2 -3

b) cul sera el Pl del pptido?


Para encontrar el PI, promediamos los dos valores en cualquier sitio en
forma neutral de nuestro pptido.
(

Lys
Glu

Pka1
2.16
2.1

Pka2
9.06
9.47

8. La digestin de un pptido que contiene 25 residuos con BrCN genera el


siguiente juego de pptidos:
1)
2)
3)
4)
5)

Lys-Asp-Arg-Gln-HSl
Phe-Asp-Trp-Ser-Ala
Asn-Arg-Ile-Glu-HSl
Trp-Val-Arg-Leu-HSL
Asp-Glu-Try-Lys-HSL

Cul sera la carga neta de cada pptido a PH=7.0 y que pasos deberamos
tomar para determinar la secuencia del pptido original?
a). Por medio de las tablas (ANEXO 2) obtenemos las cargas para cada
aminocido, haciendo las respectivas sumas tenemos que:
1) Lys-Asp-Arg-Gln-HSl

Para el PH=7.0 la carga neta es +2


2) Phe-Asp-Trp-Ser-Ala

Para el PH=7.0 la carga neta es -1


3) Asn-Arg-Ile-Glu-HSl

Para el PH=7.0 la carga neta es +1


4) Trp-Val-Arg-Leu-HSL

Para el PH=7.0 la carga neta es +2


5) Asp-Glu-Try-Lys-HSL

Para el PH=7.0 la carga neta es 0

b). pasos para determinar la secuencia de un pptido


Primero que todo debemos tener en cuenta que la secuencia de un pptido es:

Caracterstica para cada uno

Es una forma de informacin gentica

PASOS
1. Aislamiento y purificacin de una protena: sta se puede realizar por
varias tcnicas, entre ellas la dilisis o la ultra centrifugacin.
2. Determinacin de la masa molecular (MM): uno de los mtodos ms
directos es la espectrometra de masas, aunque tambin se pueden
utilizar la electroforesis.
3. Comprobar si posee ms de una cadena y determinar su nmero:
consiste en la identificacin del grupo N-terminal, este paso se puede
realizar con diferentes reactivos entre ellos estn: reactivo de Edman,
entre otros.
4. Separacin de las cadenas: sta se puede llevar a cabo con PH
extremos, alta concentracin de sales, urea 8M, entre otros. Aqu
tambin se da la rotura de puentes di sulfuro, sta se puede realizar con
Ditioteitol, la ruptura de atracciones electrostticas, sta se hace con
cromatografa de intercambio inico, y por ultima la ruptura de
interacciones
hidrofbicas
que
se
realiza
con
agentes
desnaturalizantes.
5. Escisin de las cadenas en pptidos ms pequeos: Enzimas
especficas que cortan las cadenas peptdicas.
6. Determinacin de la secuencia de stos pptidos ms pequeos: aqu
tambin se aplica el reactivo de Edman.
7. Hidrlisis total: se da para determinar la composicin de aminocidos
presentes: se realiza una hidrlisis total con CIH 6M
9. Un pptido tiene la siguiente composicin de amino cido: Ala, Arg, Asp2,
Glu2, Gly3, Leu, Val3. Los siguientes pptidos se aislaron despus de una
hidrolisis acida parcial y se determin su secuencia:

Asp-Glu-Val-Gly-Gly-Glu-Ala
Val-Asp-Val-Asp-Glu
Val-Asp-Val
Glu-Ala-Leu-Gly-Arg
Val-Gly-Gly-Glu-Ala-Leu-Gly-Arg
Leu-Gly-Arg

Cul es la secuencia de aminocidos del pptido inicial?

RTA:
Val-Asp-Val-Asp-Glu-Val-Gly-Gly-Glu-Ala-Leu-Gly-Arg

10. La Fumarasa cataliza la reaccin de hidratacin que transforma el


fumarato en L-malato. Cuando se utiliz como sustrato el fumarato, una
concentracin de enzima 2x10-6 M y se midi la velocidad inicial de la
reaccin de hidratacin a pH 5,7 y a 25 C se obtuvieron los siguientes
datos:
Velocidad de formacin del
producto
(Mmol.litro-1min-1)
2,5
3,1
3,6
4,2

Fumarato
2,0
3,3
5,0
10,0

)( )
[ ]

( )

En forma de la ecuacin de la recta tenemos:

Concentracin de la enzima:

Fumarato=sustrato
S

1/S

velocidad de
formacin del
producto

1/V0

0.5

2.5

0.4

3.3

0.303

3.1

0.322

0.2

3.6

0.277

10

0.1

4.2

0.238

Haciendo una regresin lineal con 1/S y 1/V0 se obtiene

Teniendo en cuenta la ecuacin (1) tenemos que:

11. Se mide la cintica de una enzima como funcin de la concentracin de


sustrato en presencia y ausencia de inhibidor (I), concentracin a 2nM

(S)
M
3
5
10
30
90

Velocidad (mol/min)
Sin inhibidor
Con inhibidor
10,4
4,1
14,5
6,4
22,5
11,4
33,8
22,6
40,5
33,8

a. Calcule los valores de Km y Vmax en ausencia y presencia del inhibidor


Usando la ecuacin establecida por Lineweaver-Burke tenemos que:

)(

Dnde:

[ ]

[ ]

SIN INHIBIDOR
x

1/3

1/10,4

1/5

1/14,5

1/10

1/22,5

1/30

1/33,8

1/90

1/40,5

Usando la regresin de la
calculadora se obtiene que:

CON INHIBIDOR
x

1/3

1/4,1

1/5

1/6,4

1/10

1/11,3

1/30

1/22,6

1/90

1/33,9

Usando la regresin de la
calculadora se obtiene que

b. De qu tipo de inhibicin se trata


Con los datos obtenidos se puede concluir que el inhibidor es del tipo
competitivo, debido a que la velocidad mxima no es afectada en la inhibicin
competitiva. El intercepto obtenido en la ecuacin de Lineweaver-Burk (
idntico

para

todas

las

concentraciones

del

) es

inhibidor

12. El sitio activo de la lisozima contiene dos residuos de aminocidos


esenciales para la catlisis Glu35 y Asp52 el Pk para el grupo carboxilo son 5,9 y
4,5. Cul es el estado de ionizacin para cada residuo a pH 5,2 (pH ptimo)?
Cmo puede el estado de ionizacin de estos residuos explicar el perfil de
actividad-pH de la lisozima?

A un pH medio entre los dos valores de pK (pH 5.2), el grupo carboxilo de la


cadena lateral de Asp52, con el pK inferior (4.5), pierde electrones,
principalmente (-COO), mientras que Glu35, con el pK ms alto (5.9; la base
ms fuerte) est protonado (-COOH). A valores de pH por debajo de 5.2, Asp52
se convierte en protonado y la actividad disminuye. Del mismo modo, a valores
de pH por encima de 5.2, Glu35 se convierte en desprotonado y la actividad
tambin disminuye. El perfil de actividad pH sugiere que la actividad cataltica
mxima tiene lugar a un pH a mitad de camino entre los valores de pK de los
dos grupos cidos, cuando Glu35 es protona y Asp52 se desprotona

ANEXO 2 TABLAS