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9215 HETEROTROPHIC PLATE COUNT

9215 A. Introduccin
Aplicaciones

El recuento de hetertrofos en placa (HPC), antes conocido como el recuento de placa estndar, es
un procedimiento para estimar el nmero de las bacterias heterotrficas en el agua y la medicin
de los cambios durante el tratamiento y distribucin de agua o en piscinas. Las colonias pueden
surgir a partir de pares, cadenas, grupos o clulas individuales, todos los cuales estn incluidos en
el trminoUnidades Formadoras De Colonias " (UFC). El recuento final tambin depende de la
interaccin entre el desarrollo de las colonias; elegir esa combinacin de procedimiento y medio.
Elegir el procedimiento y medio que cumpla con la aplicacin de la informacin. Para comparar los
datos, utilice el mismo procedimiento y medioue produce el mayor nmero de colonias dentro de
el tiempo de incubacin designado. Cuatro mtodos diferentes y cinco se describen diferentes
medios de comunicacin.
2. Seleccin del mtodo
a. Vertido en placa: el mtodo del vertido en placa (9215B) es fcil de realizar y pueden alojar
volmenes de muestra o muestra diluida que van de 0,1 a 2,0 ml. Las colonias producidas son
relativamente pequeas y compactas, que muestra menos tendencia a invadir el uno del otro que
los producidos por el crecimiento de superficie. Por otro lado, las colonias sumergidas a menudo
son de crecimiento ms lento y son difciles de transferir. Un bao de agua controlado por
termostato es esencial para templar el agar. El choque trmico a la bacteria de la exposicin
transitoria de la muestra hasta 45 a 46 c en el agar puede ocurrir.
b. Mtodo de extensin en placa: el mtodo de extensin en placa (9215C) no causa choque
trmico y todas las colonias estn en la superficie del agar en el que se pueden distinguir fcilmente
de las partculas y burbujas. Las colonias pueden ser transferidas de forma rpida y fcilmente en
comparacin con las descripciones publicadas. Sin embargo, este mtodo est limitado por el
pequeo volumen de muestra o muestra diluida que puede ser absorbido por el agar: 0,1 a 0,5 ml,
dependiendo del grado en que las placas se han secado. Para utilizar este procedimiento,
mantener un suministro de presecado adecuados, placas de agar absorbentes.
c. mtodo de filtro de membrana: El mtodo de filtro de membrana (9215D) permite pruebas de
grandes volmenes de agua de baja turbidez y es el mtodo de eleccin para aguas bajo recuento
(<1 a 10 UFC / ml). Este mtodo no produce choque trmico, pero aade el gasto del filtro de
membrana. Otras desventajas incluyen el rea de visualizacin ms pequeo, la necesidad para
detectar colonias por la luz reflejada sobre un fondo blanco si los filtros de colores o manchas de
contraste no se utilizan, posible dao a las clulas por presiones excesivas, y posible variaciones en
la calidad del filtro de membrana (ver Seccin 9020B.4k).
d. mtodo del sustrato de enzima para las bacterias hetertrofas: El mtodo de sustrato de la
enzima (9215E) se puede utilizar con muestras que tienen una amplia gama de concentraciones
bacterianas. El mtodo utiliza un medio a base de sustrato en el que los sustratos son hidrolizados
por enzimas microbianas causando la liberacin de 4-metilumbeliferona mximo despus de 48 h
de incubacin a 35 c. 4-metilumbeliferona fluoresce cuando se expone a longitud de onda larga
(365 nm) de luz ultravioleta. El nmero de pozos fluorescentes corresponde a un nmero ms
probable (NMP) de bacterias en la muestra original. La prueba puede ser utilizada para el anlisis
de muestras de agua potable de agua y fuente. Las colonias individuales no se pueden recuperar

directamente para su posterior anlisis. Este mtodo no produce ningn choque trmico a las
bacterias en las muestras. La prueba de sustrato de la enzima es comparable al mtodo de verter la
placa.
3. rea de Trabajo
Proporcionar una mesa o banco de nivel superior con una amplia zona en un lugar limpio, sin
corrientes de aire, habitacin bien iluminada o dentro de un flujo laminar horizontal cap. Utilice
mesa y banco tops tienen superficies no porosas y desinfectar antes de realizar cualquier anlisis.
4. Las muestras
Recoger el agua como se indica en la Seccin 9060A. Iniciar el anlisis tan pronto como sea posible
despus de la recogida para minimizar los cambios en la poblacin bacterial. El tiempo transcurrido
mxima recomendada entre la recogida y anlisis de muestras es de 8 h (mximo tiempo de
trnsito 6 h, tiempo de procesamiento mximo 2 h). Cuando el anlisis no puede comenzar dentro
de 8 h, mantener la muestra a una temperatura inferior a 4 C, pero no lo congele. No dejar que el
tiempo mximo transcurrido entre la recopilacin y el anlisis excedan 24 h.
5. Preparacin de la muestra
Marcar cada placa con nmero de muestra, la dilucin, la fecha, y cualquier otra informacin
necesaria antes del examen. Preparar al menos duplicados de placas para cada volumen de
muestra o de dilucin examinado. Para el vertido o mtodos de distribucin de la placa utilize
placas de Petri de vidrio estril (65 cm2) o (65 cm2) o de plstico desechable presterilizado (57 cm2).
Mezcle bien todas las muestras o diluciones haciendo rpidamente cerca de 25 movimientos
completos hacia arriba y hacia abajo (o hacia atrs y adelante). Opcionalmente, utilice un agitador
mecnico para agitar muestras o diluciones para \ 5 s.
6. medios
Comparar los nuevos lotes de medios con la porcin actual de uso de acuerdo a la Seccin 9020B.3
/ z.
a.
Agar de recuento en placa (agar triptona de levadura glucosa): Se utiliza para vertir difundir
mtodos de placas. Este agar alto contenido de nutrientes, ampliamente utilizado en el pasado, da
recuentos ms bajos que R2A o agar NWRI.
Triptona

5,0 g

Extracto de levadura

2,5 g

Glucosa

1,0 g

Agar

15,0 g

Agua de grado reactivo

1L

El pH debe ser 7,0 0,2 despus de tratamiento en autoclave a 121 C durante 15 min.

b. agar mm-HPC: uso de este medio de alto nutriente m-HPC slo para el mtodo de filtro de
membrana.
Peptona

20,0 g

Gelatina

25,0 g

Glicerol

10,0 ml

Agar

15,0 g

Agua de grado reactivo

1L

Por la procedencia del medio por ingredientes bsicos ajustar el pH a 7,2 con 1 N NaOH caliente
lentamente todos los ingredientes hasta disolver, aadir glicerol, y autoclave a 121 C durante 15
min. Comercialmente el medio preparado no requiere posterior esterilizacin, ajuste de pH; ver
(seccin 9020B.5j1). pH final es 7.1 0.2.

c. Agar R2A; Se utiliza para verter, placa extendido, y el filtro de membrana mtodos. Este agar bajo
contenido de nutrientes da conteos ms altos que los de alto formulaciones de nutrientes.
Extracto de levadura

0,5 g

Peptona proteasa No. 3 o polipeptona

0,5 g

Casaminocidos

0,5 g

Glucosa

0,5 g

Almidn soluble

0,5 g

Hidrgeno fosfato dipotsico, K 2 HP0

4 0,3 g

Sulfato de magnesio heptahidratado, MgS0 4 7H 2

0,05 g

Piruvato de sodio

0,3 g

Agar

15,0 g

Agua de grado reactivo

1L

Ajustar el pH a 7,2 con K2HP04 o KH2P04 antes de aadir agar. Caliente para disolver el agar y
esterilizar a 121 C durante 15 min. Comercialmente el medio preparado no requiere posterior
esterilizacin, ajuste de pH; ver (seccin 9020B.5j1). pH final es 7.2 0.2.

d. NWRI agar (HPCA): Se utiliza para verter, placa de diseminado y mtodos de filtro membrana.
Este medio es probable que produzca mayor los recuentos de colonias que los tres medios
descritos anteriormente. No puede estar disponible en forma deshidratada y puede requerir la
preparacin a partir de los ingredientes bsicos.

Peptona

3,0 g

Soluble casena

0,5 g

K 2 HP0 4

0,2 g

MgSO,

0,05 g

FECI,

0,001 g

Agar

15,0 g

Agua de grado reactivo

1L

Ajustar el pH a 7,2 antes de esterilizar durante 15 minutos a 121 C.

7. Incubacin
A efectos de control del cumplimiento en virtud Regla de Tratamiento de Agua superficial
estadounidenses de la EPA (40 CFR 141.74) el suministro de bacterias hetertrofas, se incuba a 35
C durante 48 h. De lo contrario, seleccionar entre los tiempos recomendados y temperaturas para
vigilar los cambios en la calidad del agua. Los recuentos ms altos tpicamente se obtienen a partir
de 5 a 7 das de incubacin a una temperatura de 20 a 28 C.
Durante la incubacin mantener la humedad dentro de la incubadora de modo que las placas no
tendrn la prdida de peso de humedad superior al 15%. Esto es especialmente importante si se
utiliza la incubacin prolongada. Un platillo de agua colocada en la parte inferior de la incubadora
puede ser suficiente, pero tenga en cuenta que para impedir la oxidacin o la oxidacin del interior
paredes y estanteras deben ser de acero inoxidable de alta calidad o de aluminio anodizado.
Durante mucho tiempo de incubacin en incubadoras no humificadas, selle las placas en bolsas de
plstico.

8. Recuento y grabacin
a. Verter y difundir en placas: Contar todas las colonias en las placas seleccionadas inmediatamente
despus de la incubacin. Si el conteo se debe retrasar temporalmente las placas, almacenarlas en
5 a 10 C durante no ms de 24 h, pero evite esta prctica como rutina. Registrar los resultados de
los controles de esterilidad en el informe para cada lote de muestras.
Para las muestras de cumplimiento, contar las colonias de forma manual utilizando un contador de
colonias campo oscuro, tales como la contador de colonia de Quebec. Si dicho equipo no se
encuentra disponible, para muestras no para fines de cumplimiento, utilice otro equipo, siempre
que este equipo proporciona magnificacin equivalente. Instrumentos automticos de conteo de
placas estn disponibles. Estos generalmente usan un escner de televisin acoplado a una lente de
aumento y un paquete electrnico. Su uso es aceptable si la evaluacin en paralelo con el conteo
manual da resultados comparables.
En placas preparadas, pipetear volmenes de muestra que sembraran de 30 a 300 colonias /
placa. El objetivo es tener al menos una dilucin dando recuentos de colonias dentro de estos
lmites, salvo lo dispuesto a continuacin.
Por lo general, no siembre ms de 2,0 ml de muestra; sin embargo, cuando el nmero total de
colonias en desarrollo de 2,0 ml est a menos de 30, no tener en cuenta la regla anterior y
resultado rcord observado. Con esta excepcin, consideran slo las placas que tienen de 30 a 300
colonias en la determinacin de la concentracin de grmenes. Calcule la cuenta bacteriana por
mililitro por la siguiente ecuacin:
UFC/mL=

colonias contadas
Volumen real de la muestra en placa, mL

Si no hay ninguna placa con 30 a 300 colonias, y uno o ms placas tienen ms de 300 colonias,
utilice la placa (s) que tiene un contar 300 colonias ms cercanas. Calcule el recuento que el
anterior e informar como UFC estimado por mililitro.
Si las placas de todas las diluciones de las muestras que no tienen colonias, reportar el recuento
como menos de uno (<1) dividido por el volumen de muestra ms grande correspondiente
utilizado. Por ejemplo, si no hay colonias desarrollarse a partir del volumen de muestra 0,01 ml,
reportar la cuenta como menos de 100 (<100) UFC / mL.
Si el nmero de colonias por placa excede 300, no hacer reportar el resultado como "demasiado
numerosos para contar" (TNTC). Si hay menos de 10 colonias / cm 2, colonias de conteo en 13
casillas (de la contador de colonias) que tiene la distribucin de colonia representativa. Si es
posible, seleccione siete plazas consecutivas horizontalmente a travs de la placa y seis cuadrados
consecutivos verticalmente, teniendo cuidado de no contar una plaza ms de una vez. Calcular
colonias estimadas por placa como sigue: Cuando las placas es de 65 cm2 (la zona tpica de una
placa de vidrio), multiplicar la suma del nmero de colonias en 13 centmetros cuadrados
representativos por 5; cuando la placa es de 57 cm2 (de la zona tpica de una placa de plstico),
multiplicar la suma del nmero de colonias en 19 centmetros cuadrados por 3. (Nota: el dimetro
nominal de las dos placas de vidrio desechables y no desechables 100 mm, sin embargo. , el
dimetro interno de platos desechables es ms cerca de 85 mm y que no desechables de placas
est cerca de 90 mm)
Cuando el recuento de bacterias en placas de hacinamiento son mayores que 100 colonias / cm 2,
el informe de resultado como mayor que (>) 6500 dividido por el volumen de muestra ms
pequeo niquelado para placas de vidrio o (>) 5700 dividido por el volumen de muestra ms
pequeo para chapado en placas de plstico. Reportar como unidades formadoras de colonias por
mililitro estimados.
Si se encuentran colonias de dispersin (esparcidores) en la placa (s) seleccionada, contar las
colonias en porciones representativas slo cuando colonias estn bien distribuidas en zonas
repartidoras libre y la zona cubierto por el esparcidor (s) no supere la mitad de la placa rea.
Cuando la difusin de las colonias debe ser contado, cuente cada uno de los siguientes tipos como
uno: una cadena de colonias que parece ser causada por la desintegracin de un grupo bacteriano
como agar y la muestra se mezclaron; un esparcidor que se desarrolla como una pelcula de
crecimiento entre el agar y la parte inferior de la placa de Petri; y una colonia que se forma en un
pelcula de agua en el borde o sobre la superficie del agar. Los dos ltimos tipos desarrollan en gran
medida debido a una acumulacin de humedad al punto desde el que se origina el esparcidor. Con
frecuencia cubrir ms de la mitad de la placa e interferir con la obtencin de un recuento en placa
fiable.

El recuento de las colonias individuales colonias de apariencia similar que crecen en las
proximidades pero sin tocar, a condicin de que la distancia entre ellos es por lo menos igual al
dimetro de la colonia ms pequea. Contar las colonias que inciden que difieren en apariencia,
como la morfologa o color, como colonias individuales.

Si las placas tienen un crecimiento excesivo esparcidor, informe como "esparcidores" (SPR). Cuando
las placas son incontables debido a la dilucin perdida, cada accidental, y la contaminacin, o las
placas de control indican que el material u otro medio estaba contaminada, informe como
"accidente de laboratorio" (LA).

b. Mtodo de filtro de membrana: Contar las colonias en filtro de membrana con un microscopio
estereoscpico a 10 hasta 15 x de magnificacin. Preferiblemente la placa Petri inclinada en un
ngulo de 45 en la platina del microscopio y ajustar la fuente de luz vertical para las colonias.
Colonia ptima densidad por filtro es de 20 a 200. Si las colonias son pequeas y no hay
hacinamiento, un lmite ms alto es aceptable.
Contar todas las colonias de la membrana cuando hay 2 colonias por cuadrado. Para 3 a 10
colonias por cuadrado contar 10 cuadrados y obtener recuento promedio por cuadrado. Por 10 a
20 colonias por conteo 5 cuadrados y obtener la media contar por cuadrado. Multiplique el
recuento medio por cuadrado por 100 y dividir por el volumen de la muestra para dar colonias por
100 ml. Si hay ms de 20 colonias por cuadrado registre como > 2000 dividido por el volumen de la
muestra. Informe el promedi como unidades formadoras de colonias estimadas. Hacer recuentos
estimados slo cuando son discretas, colonias separadas sin crucetas.

c. Mtodo de sustrato de la enzima: ver 9215E.6.

9. Calculo e Informes de recuentos


El trmino "unidades formadoras de colonias (UFC)" es descriptivo del mtodo utilizado; por lo
tanto, informar de todos los conteos como unidades formadoras de colonias. Incluir en el informe
el mtodo utilizado, la incubacin, temperatura, tiempo, y medio. Por ejemplo: UFC / ml, Vertido
en placa, 35 C / 48 h, agar recuento en placa.

Para calcular el recuento de heterotrfas en placa, la placa diseminada y mtodo de filtro de


membrana, UFC / ml, se divide el nmero total de colonias o nmero medio (si las placas
duplicadas de la misma dilucin) por placa por el volumen de muestra. Para el mtodo de sustrato
de la enzima, utilice el NMP obtiene a partir de las tablas de NMP, ajustados para las muestras de
dilucin. Volmenes de muestra de discos usados y el nmero de colonias en cada uno placa de
contado o estimado.
Cuando las colonias sobre placas duplicadas y / o diluciones consecutivas son contados y los
resultados se promedian antes de ser registrada, redondear el recuento de dos cifras significativas
slo al convertir a las unidades formadoras de colonias.
Evitar la creacin de precisin y exactitud ficticia al calcular las unidades formadoras de colonias
por registrar slo los dos primeros dgitos de la izquierda. Elevar el segundo dgito al siguiente
nmero ms alto cuando el tercer dgito de la izquierda es 5, 6, 7, 8, o 9; uso de ceros para cada
dgito sucesivas hacia la derecha a partir de la segunda cifra. Por ejemplo, el informe de un
recuento de 142 como de 140 y un recuento de 155 como 160, pero reportan un conteo de 35
como 35.

10. Sesgo Analtico


Evite imprecisiones en el conteo debido a la falta de cuidado, daado u ptica sucia que deterioran
la visin, o el fracaso para reconocer colonias. Los trabajadores de laboratorio que no pueden
duplicar sus propios conteos en la misma placa dentro del 5% y los condes de otros analistas dentro
10% debe descubrir la causa y corregir tales desacuerdos.

9215B. Pour Plate Method (Vertido en Placa)

1. Las muestras y preparacin de la muestra


Ver 9215A.4 y 5.
2. dilucin de la muestra
Preparar el agua utilizada para dilucin como se indica en la Seccin 9050C.

a. Seleccin de diluciones: Si es posible, por ejemplo, sobre la base de la informacin histrica,


seleccionar las diluciones de manera que al menos una placa en una serie contendr 30 y 300 UFC
(Figura 9215: 1). Por ejemplo, cuando una placa heterotrfica cuenta como alta 3000 como se
sospeche, preparar placas con dilucin 10 -2.
Para la mayora de las muestras de agua potable, placas adecuadas para el recuento se obtendr
mediante siembra 1 ml y 0,1 ml de muestra sin diluir y 1 ml de la dilucin 10 -2.

b- Medicin de las porciones de muestra: Utilice una pipeta estril para iniciar y transferir
posteriores a cada contenedor. Si la pipeta se llega a contaminar antes de que se complete las
transferencias, reemplazan con una pipeta estril. Utilice una pipeta estril diferente para las
transferencias de cada dilucin diferente. No prepare diluciones y verter en placas a luz solar
directa. Tenga cuidado al retirar pipetas estriles de el recipiente; para evitar la contaminacin, no
arrastre punta de la pipeta a travs de los extremos expuestos de las pipetas en el contenedor o a
travs de pipeta labios y cuellos de botellas de dilucin. Al extraer la muestra, hacer no inserte
pipetas ms de 2 a 3 cm por debajo de la superficie de la misma o dilucin.

c- Diluciones de medicin: cuando se descarga porciones de muestra, mantenga la pipeta en un


ngulo de aproximadamente 45 con la punta tocando el fondo de la placa Petri o en el interior del
cuello de la botella de dilucin. Levante la tapa de la placa Petri lo bastante alto como para insertar
la pipeta. Permita 2 a 4 seg. para que el lquido drene desde la marca de graduacin de 1 ml a la
punta de la pipeta. Si la pipeta no es un tipo de soplado, toque punta de pipeta una vez contra un
punto seco en la parte inferior placa de Petri. Menos preferiblemente, utilizar un tipo de pipeta de
estallido algodon-enchufado y una pipeta con y suavemente soplar volumen de dilucin de la
muestra restante. Cuando se miden las cantidades de 0,1 ml, dejar escurrir muestra diluida de la
graduacin de referencia elegido hasta 0,1 ml ha sido entregado. Retire la pipeta sin tocar la placa.
Pipetear 1 ml, 0,1 ml, u otro volumen adecuado en una placa Petri estril antes de aadir el medio
de cultivo derretido templado. Utilice diluciones decimales en la preparacin de los volmenes de

muestra de menos de 0,1 ml. En el examen de las aguas residuales o agua turbia, no mida 0.1 mL
de inculo de la muestra original, pero preparar una dilucin apropiada. Preparar al menos dos
placas replicadas para cada volumen de muestra o de dilucin examinado. Despus de depositar
porciones de ensayo para cada serie de placas, se vierte el medio de cultivo y mezclar con cuidado.
No permita que ms de 20 minutos transcurren entre el comienzo de pipeteado y verter placas.