PILARES DA CROMATOGRAFIA

Scientia Chromatographica Vol.2, N2, 5-9, 2010

Instituto Internacional de Cromatografia
ISSN 1984-4433

O Aperfeioamento da cromatografia em camada

delgada

Carol H. Collins
Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Qumica
13083-970 Campinas (SP)

Resumo

Este artigo sobre os Pilares de Cromatografia descreve os

aperfeioamentos da tcnica de cromatografia em camada delgada
desde a poca em que Stahl demonstrou a repetibilidade da tcnica
ao constatar que as espessuras das camadas das fases estacionrias
preparadas tornaram-se reprodutveis. Isso desencadeou vrias
modificaes que resultaram na cromatografia em camada delgada
de alta e, mais recentemente, de ultraeficincia e em sistemas que
pressurizam as fases mveis, permitindo desenvolvimentos mais
rpidos e uniformes.

Abstract

This chapter of Pillars of Chromatography describes

improvements in the technique of thin layer chromatography
that took place after Stahl had shown its repetibility when the
stationary phase layers were reproducible. This initiated other
modifications that resulted in high performance and, more recently,
ultra peformance stationary phases and in pressurized development
systems that provide more rapid and uniform development.

*e-mail: chc@iqm.unicamp.br

Palavras-chave
Histria da cromatografia;
Cromatografia em camada delgada;
Cromatografia em camada delgada
de alta eficincia; Cromatografia em
camada delgada de ultraeficincia;
Cromatografia em camada delgada
pressurizada.

Keywords
History of chromatography;
Thin layer chromatography;
High performance thin layer
chromatography; Ultra peformance
thin layer chromatography;
Pressurized thin layer
chromatography.

Scientia Chromatographica Vol.2, N2, 5-9, 2010

A cromatografia planar iniciou-se com os
desenhos que F.F. Runge desenvolveu em papel, na
metade do sculo dezenove. A cromatografia em papel
foi redescoberta por A. J. P. Martin e colaboradores
na metade do sculo vinte (1). Porm, as restries da
cromatografia em papel, especialmente relacionadas
s limitaes nos tipos de fase estacionria e
s dificuldades em se ter repetibilidade entre as
corridas, impulsionaram o desenvolvimento de uma
outra tcnica planar, a da cromatografia em camada
delgada (CCD), cujo incio data do fim do sculo
dezenove, e sua aceitao como tcnica til para
qumica, da metade do sculo vinte (2). Entretanto,
essa tcnica tambm apresentou diversos problemas
durante o seu incio, os quais foram resolvidos
com o passar do tempo. O primeiro avano foi o
uso de aderentes misturados s fases estacionrias
slidas, o que permitiu o fcil manuseio das placas.
O desenvolvimento por eluio, descrito por J. G.
Kirchner, e a produo das placas com espessuras
controladas e reprodutveis, utilizando os processos
descritos por E. Stahl, e rapidamente comercializadas,
permitiram que a cromatografia em camada delgada
assumisse um papel importante entre as tcnicas de
separaes, possibilitando comparaes rpidas,
porm qualitativas, entre diversas amostras a partir
da metade do sculo passado (2).

Uma vez aceito o conceito da CCD, vrios
fabricantes e pesquisadores trabalharam no sentido de
aperfeioar as separaes. Iniciou-se o uso de folhas
de plstico (3) ou de alumino que, junto com as placas
de vidro, foram confeccionadas com diversas fases
estacionrias, incluindo, alm da slica, celulose,
alumina, poliamida e trocadores de ons. A gipsita

foi substituda por amida, que apresentou melhor

uniformidade, e a espessura foi reduzida para 100
m, melhorando a resoluo e a detectabilidade (4).
A slica gel tipo Stahl para CCD e as outras
fases estacionrias disponibilizadas pelas diversas
firmas apresentavam uma larga faixa de tamanho de
partcula: 10 a 60 m, com mdia em torno de 20
m. Essa foi a faixa mais fina obtida ao se utilizarem
peneiras de malha para seleo de tamanho. Em 1968,
J.A. Thoma (5) props que partculas com tamanhos
menores e mais uniformes poderiam melhorar a
resoluo. Paralelamente, diversas firmas trabalharam
para preparar partculas com dimetros reduzidos
para o uso em cromatografia lquida de alta eficincia
(CLAE), sintetizando partculas com dimetros
mdios de 10 e 5 m. Com as pequenas partculas
disponveis, as firmas que produziam as placas com
fases estacionrias para CCD empenharam-se para
desenvolver processos que permitissem preparar
placas com essas novas partculas (6). Assim, nasceu
a cromatografia em camada delgada de alta eficincia
(CCDAE), que utiliza placas de 10 cm 10 cm e
partculas de 5 m, em vez das placas de 20 cm 20
cm com as partculas maiores. Essa nova modalidade
ainda permitiu a aplicao de um nmero maior de
manchas a serem separadas, com o desenvolvimento
da placa de somente 3-5 cm (Figura 1a), resultando em
dimetros menores e mais reprodutveis das manchas
desenvolvidas. As novas placas tambm permitiram
a aplicao e o subsequente desenvolvimento das
manchas com desenvolvimento circular (Figura 1b) e
de bandas de amostra (Figura 1c), que melhoraram a
deteco de quantidades pequenas.

Figura 1. Desenvolvimentos de uma mistura de tintas em placas de CCDAE. (a) desenvolvimento horizontal de manchas
aplicadas nos dois lados da placa; (b) desenvolvimento circular de manchas aplicadas em um crculo ao redor do centro, no qual
a fase mvel foi gotejada; (c) desenvolvimento de amostras aplicadas em bandas.

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Mais recentemente, placas com partculas
de 2 ou 3 m foram comercializadas, bem como
placas com uma camada de slica monoltica
com uma espessura de 10 m, macroporos de
1 2 m, mesoporos de 2 a 4 nm e uma rea superficial
especfica de ~350 m2/g. Tal modalidade chamada
por seu fabricante, Merck, de ultra peformance thin
layer chromatography (cromatografia em camada
delgada de ultraeficincia, CCDUE).
Tambm, paralelamente ao desenvolvimento
das fases estacionrias quimicamente ligadas para
CLAE, fases similares foram introduzidas nas placas
de CCDAE (7). Hoje, todas as fases estacionrias
para CLAE so disponveis para uso em CCDAE,
incluindo as fases normais (slica, amino e ciano),
reversas (C2, C8 e C18), hidroflicas, quirais, de troca
inica e de excluso por tamanho. Uma modificao
interessante so as placas bifsicas, com duas fases
estacionrias diferentes (Figura 2), que permitem uma
separao em duas dimenses ortogonais (CCDAE
CCDAE) (8).

Carol Collins

Para esse fim, foram desenvolvidos sistemas que

permitiram a aplicao mecnica das amostras em
volumes controlados, e a secagem das manchas por
um fluxo de gs, s vezes acompanhada por um leve
aquecimento do fundo da placa horizontal. O primeiro
desses sistemas foi comercializado em 1972 (9). Esses
melhoramentos reduziram significantemente os erros
inerentes aplicao manual e induziram a criao
de sistemas para desenvolvimentos mais repetitivos e
sistemas para quantificao das manchas obtidas nas
corridas.

Antes de as placas de CCDAE se tornarem
universalmente disponveis, Perry e colaboradores
(10-12) criaram um sistema para desenvolvimento
mltiplo programado, que conseguiu reduzir o
tamanho das manchas aps o desenvolvimento,
especialmente daquelas que percorreram distncias
maiores. A placa foi colocada no aparelho
(Figura 3) na posio vertical, 15 cm ao redor de
um refletor com duas lmpadas de aquecimento. As
manchas foram aplicadas na placa a 2,5 cm do seu
incio, e a fase mvel atingia uma altura de 1,5 a 2 cm
em um recipiente protegido do calor das lmpadas.
O processo implicou um desenvolvimento inicial
de alguns segundos (ou minutos) sem aquecimento.
Aps esse tempo, as lmpadas foram ligadas por
um perodo curto, com ou sem um fluxo simultneo
de gs inerte, para evaporar a fase mvel que
avanava na placa. As lmpadas foram desligadas, e
o desenvolvimento foi reiniciado; porm, dessa vez,
por um perodo maior antes que as lmpadas fossem
novamente ligadas.

Figura 2. Desenho de uma placa bifsica. A faixa menor

contm uma fase estacionria, e a maior, outra fase
estacionria. O desenvolvimento realizado em duas
dimenses.

O uso das placas de CCDAE requereu que

o volume de amostra a ser aplicado placa fosse
reduzido de uma ordem de grandeza (~200 nL).

Figura 3. Desenho do aparelho para desenvolvimento

mltiplo programado. Adaptado da referncia 11.

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Esse ciclo de desenvolvimento com a fase mvel
avanando, seguido por secagem aps um tempo
controlado, foi repetido at que se conseguisse a
separao desejada. A Figura 4 compara a separao
obtida, utilizando as mesmas fases estacionrias,
com uma corrida simples e com um desenvolvimento
mltiplo programado, sendo que o ltimo mostra
manchas com dimetros reduzidos. Esse o resultado
do decrscimo do desenvolvimento na direo
longitudinal, sendo que, em cada etapa do processo,
a fase mvel reencontra a parte da mancha mais perto
do recipiente da fase mvel e comea a elui-la antes
que fique em contato com o restante da mancha.
O aparelho pode ter at 99 ciclos e diferentes tipos de
programao.

componentes de volatilidades diferentes. Para resolver

tal problema, H. Kalsz e colaboradores (13,14)
construram sistemas para o desenvolvimento forado
em cromatografia em camada delgada (forced flow
thin layer chromatography, FFTLC) ou pressurizado
(over pressure thin layer chromatography, OPTLC)
nos modos linear (Figura 5) ou circular.

Figura 5. Desenho de um sistema para desenvolvimento de

CCD pressurizada.

Figura 4. Comparao do desenvolvimento simples de

uma amostra com desenvolvimento mltiplo programado
da mesma amostra.

O desenvolvimento das placas, tanto as de

20 cm x 20 cm quanto as de CCDAE, apresenta uma
desvantagem comum: as molculas da fase mvel
tm uma tendncia de evaporar da frente da fase
mvel durante o desenvolvimento devido ao fato de
a placa estar inicialmente seca e exposta atmosfera.
Alm disso, especialmente em desenvolvimento
ascendente, o avano da fase mvel depende da
distncia percorrida. Em outras palavras, o movimento
da frente da fase mvel se reduz proporcionalmente
sua distncia do recipiente da fase mvel. Ambos os
fatores sofrem complicaes maiores devido ao uso
rotineiro de fases mveis com dois, trs ou at mais

As amostras so aplicadas placa com fase

estacionria apropriada, e a placa colocada na
cmara do aparelho e coberta com uma membrana
impermevel, selada nos dois lados, para eliminar a
presena de uma atmosfera que permita volatilizao.
A membrana mantm-se fixa placa, eliminando a
atmosfera por uma presso aplicada, utilizando ar,
nitrognio ou gua. A fase mvel bombeada a uma
vazo constante para uma posio antes da linha de
aplicao por um perodo suficiente para realizar
o desenvolvimento desejado, visvel embaixo da
membrana. O uso desse tipo de sistema pressurizado
apresenta a vantagem de que o desenvolvimento da
placa ocorre na mesma velocidade durante toda a
separao, resultando em manchas mais uniformes
e reduzindo o tempo necessrio para realizar a
separao (Figura 6) (15). O uso de sistemas
pressurizados tambm permite selecionar a vazo
da fase mvel que providencia a melhor eficincia
(Figura 7) (14). Nesse tipo de sistema, o efeito da
presso empurrando a fase mvel, que apresenta uma
tendncia de ter forma convexa, compensado pelo
fato de que a frente da fase mvel est passando de
uma rea molhada para uma rea seca, que tende a
ser cncava. O resultado uma frente de fase mvel

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O Aperfeioamento da cromatografia em camada delgada

com tendncia mais linear, e com os cromatogramas
resultantes mais uniformes.

Carol Collins

fluorescncia, carga acoplada (charged coupled

detector) (16) e de radioatividade para quantificao,
aparelhos que eluem o contedo de cada mancha
ou banda para determinaes de estruturas por
ressonncia magntica nuclear ou espectrometria
de massas e at diversos processos que, hoje,
permitem injetar, sem vcuo, molculas espalhadas
da superfcie da placa diretamente em um sistema de
espectrometria de massas (17).

Referncias Bibliogrficas
Figura 6. Variao da distncia de desenvolvimento com
o tempo em (1) CCDAE pressurizada (ar a 0,28 MPa)
com vazo de fase mvel de 0,4 mL/min e (2) CCDAE
sem presso. Dimenses das placas: 20 cm x 20 cm; fase
estacionria: slica; fase mvel: CH2Cl2; distncia de
desenvolvimento para ambas as placas: 15 cm. Adaptado
da referncia 15.

Figura 7. Curvas de eficincia vs vazo da fase mvel

em um sistema de desenvolvimento pressurizado. Fase
estacionria: slica; fase mvel: clorofrmio:metanol:
tampo fosfato, pH 6,5 (7:5:1); Phe: fenilalanina; DOPA:
diidroxifenilalanina. Adaptado da referncia 14.

A partir desses desenvolvimentos, as

instrumentaes para CCD e CCDAE evoluram
consideravelmente, sendo comercializadas por
diversos fabricantes: aplicadores de manchas
ou bandas, sistemas para desenvolvimentos
pressurizados, detectores que utilizam cor,

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