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"asa?"
SUPERFOLICULACION EN OVEJAS EN
ANESTRO ESTACIONAL
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:
MAESTRO EN CIENCIAS EN PRODUCCION
ANIMAL
PRESENTA:
JOSE HORACIO GARCIA QUEZADA
MARIN, N. L
t3
c.l
1080062388
< q p r.
i c U U i
Bfcfofeca Cotral
MKBt&idand
T-tvs'-T
PONDO
MACCTRIA
^-P-L
"SUPERFOLICULACION EN OVEJAS
ENANESTRO ESTACIONAL "
TESIS
SOMETIDA AL COMITE PARTICULAR COMO REQUISITO
PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRO EN CIENCIAS
Febrero de 1995
Dedicatoria
A mis padres:
Sr. Isidro Garca Barragn
Sra. Ma. Teresa Quezada Alvarez
Por el amor y apoyo que siempre me han brindado en cada una
de las etapas de mi vida.
A mis hermanos:
Cuauhtmoc, Leonor Alejandrina y Mariana Gabriela
Por todo el cario que nos une, que nos alienta, y nos permite
seguir siempre adelante, para alcanzar nuevas metas.
A t, Alva
Con todo mi amor, por todo lo que me has dado
y me manifiestas da a da.
Agradecimientos
Al Ph. D. Javier Garca Cant, por su siempre incondicional e invaluable
cooperacin, durante todo el desarrollo de ta maestra y de la tesis de grado.
brindada como
Al Ph. D. Emilio
Olivares
Senz,
INDICE
Captulo
Pgina
RESUMEN
"
SUMMARY
I
3
I INTRODUCCION
2.3. ESTACIONALE)AD
10
10
2.4.1. Progesterona
13
2.4.2. Prostaglandina
15
17
19
21
22
DONADORAS
2.5.1. Gonadotropina del suero de la yegua preada (PMSG)
24
26
26
28
29
31
32
32
^
33
3.2.1. Ensayo 1
33
38
A) Obtencin de la muestra
40
41
B. 1 Marcacin de la protena
41
B.2 Inmunoreactividad
41
41
41
45
47
47
54
V. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
62
VI. BIBLIOGRAFIA
65
VII. APENDICE
70
70
71
All. Inmunoactividad
72
76
INDICE DE CUADROS
Cuadro 1
^
Dosis utilizadas de hormonas gonadotrcas en algunas especies
animales para inducir la superovulacin en las hembras.
Pgina
27
Cuadro 2
Condiciones de temperatura y precipitacin en Marn, N.L.
prevalecientes durante el desarrollo del experimento.
32
Cuadro 3
Distribucin de tratamientos de sincronizadores en la prueba de
superfoliculacin de ovejas en anestro estacional realizada en
junio de 1993 en el Campo de Marn, N.L.
34
Cuadro 4
Distribucin de los tratamientos de foliculadores en la prueba de
superfoliculacin de ovejas en anestro estacional realizada en
junio de 1993, en el Campo de Marn, N.L.
35
Cuadro 5
Programa de aplicacin de la hormona FSH en la prueba de
superfoliculacin de ovejas en anestro estacional realizada en
junio de 1993 en el Campo Experimental de Marn, N.L:
36
Cuadro 6
Programa de aplicacin de la hormona PMSG en la prueba de
superfoliculacin, de ovejas en anestro estacional realizada en
junio de 1993 en el Campo Experimental de Marn, N.L.
36
Cuadro 7
Tratamientos y dosis usados en la prueba para la determinacin de
LH en, suero ovino.
38
Cuadro 8
Programa de actividades para la determinacin de concentracin
hormonal de LH en plasma sanguneo de ovejas sincronizadas con
prostaglandinas f 2 a realizado en el campo experimental de Marn,
N.L.
39
Cuadro 9
Calendarizacin para la obtencin de muestras para la prueba de
determinacin de LH.
40
Cuadro 10
Nmero de mu es treos realizados en la prueba-para determinar los
niveles de LH, en el suero sanguneo.
42
Cuadro 11
Protocolo realizado para conocer la dilucin del 1 e r anticuerpo
(anti-gLH) en la determinacin de LH por el mtodo del RIA.
43
Cuadro 12
Protocolo utilizado para realizar la curva estndar en el anlisis
del RIA.
44
Cuadro 13
Efecto del MPA en dosis de 50 y 60 mg durante la estacin
anestro y actividad sexual.
48
Cuadro 14
Valores esperados de los datos del Cuadro 13 que se refiere al
efecto del MPA en la estacin anestro y actividad sexual.
48
Cuadro 15
Efecto del NGT en dosis de 1.5 y 2.0 mg durante la estacin
anestro y actividad sexual.
48
Cuadro 16
Valores esperados de los datos del Cuadro 15 que se refiere al
efecto del NGT en la estacin anestro y actividad sexual.
48
Cuadro 17
Efecto del sincronizador (MPA NGT) durante la estacin
anestro y actividad sexual.
49
Cuadro 18
Valores esperados de los datos del Cuadro 17 que se refiere al
efecto del sincronizador durante la estacin anestro y actividad
sexual.
49
vi i
Cuadro 19
Efecto del sincronizador MPA (Acetato de medroxiprogesterona),
aplicado con esponja durante la etapa de superfoliculacin.
50
Cuadro 20
Efecto del sincronizador NGT (Norgestomet), aplicado en
implante durante la etapa de superfoliculacin.
51
Cuadro 21
Concentracin de datos del sincronizador (MPA o'NGT) con los
foliculadores FSH y PMSG.
52
Cuadro 22
Efecto del foliculador (FSH o' PMSG) durante la estacin anestro
y actividad sexual.
52
Cuadro 23
Valores esperados del Cuadro 22 que se refiere al efecto del
foliculador durante la estacin anestro y actividad sexual.
53
Cuadro 24
Efecto del foliculador (FSH o' PMSG) en el nmero de cuerpos
lteos presentes, en ovejas
en las cuales se practic la
laparatoma.
53
Cuadro 25
Valores esperados del Cuadro 24 que se refiere al efecto del
foliculador en el nmero de cuerpos lteos.
53
Cuadro 26
Parmetros de la
inmunoreactividad.
56
curva
estndar, para
el
anlisis
de
Cuadro 27
Comportamiento en la ovulacin de las borregas tratadas con
naloxona, HCG y testigo.
61
Cuadro 28 (Apndice)
Datos de la oveja 3A (0471).
76
Cuadro 28 A (Apndice)
Anlisis de varianza de la oveja 3A (0471).
76
Vili
Cuadro 28 B (Apndice)
Resultados de la comparacin de medias de la oveja 3A (0471).
76
Cuadro 29 (Apndice)
Datos de la oveja 3G (9213).
76
^
Cuadro 29 A (Apndice)
Anlisis de varianza de la oveja 3G (9213).
76
77
Cuadro 30 (Apndice)
Datos de la oveja 3H (92109).
77
Cuadro 30 A (Apndice)
Anlisis de varianza de la oveja 3H (92109).
77
Cuadro 30 B (Apndice)
Resultados de la comparacin de medias de la oveja 3H (92109).
77
Cuadro 31 (Apndice)
Datos de la oveja 3B (2-125).
77
Cuadro 31 A (Apndice)
Anlisis de varianza de la oveja 3B (2-125).
78
Cuadro 31 B (Apndice)
Cuadro de medias de la oveja 3B (2-125).
78
Cuadro 32 (Apndice)
Datos de la oveja 3C (92-70).
78
Cuadro 32 A (Apndice)
Anlisis de varianza de la oveja 3C (92-70),
78
Cuadro 32 B (Apndice)
Cuadro de medias de la oveja 3C (92-70).
78
Cuadro 33 (Apndice)
Datos de la oveja 3F (2-66).
79
Cuadro 33 A (Apndice)
Anlisis de varianza de la oveja 3F (2-66).
79
Cuadro 33 B (Apndice)
Cuadro de medias de la oveja 3F (2-66).
79
Cuadro 34 (Apndice)
Datos de la oveja 31 (92152).
79
Cuadro 34 A (Apndice)
Anlisis de varianza de la oveja 31 (92152).
79
Cuadro 34 B (Apndice)
Cuadro de medias de la oveja 31 (92152).
80
Cuadro 35 (Apndice)
80
80
Cuadro 35 B (Apndice)
Cuadro de medias de la oveja 3D (9296).
80
Cuadro 36 (Apndice)
Datos de la oveja 3E (2130).
80
Cuadro 36 A (Apndice)
Anlisis de varianza de la oveja 3E (2130).
81
Cuadro 36 B (Apndice)
Cuadro de medias de la oveja 3E (2130).
81
Cuadro 37 (Apndice)
Datos de la oveja 3J (9289).
81
Cuadro 37 A (Apndice)
Anlisis de varianza de la oveja 3 J (9289).
81
Cuadro 37 B (Apndice)
Resultados de la comparacin de medias de la oveja 3J (9289).
81
INDICE DE FIGURAS
Figura 1
Eficiencia de marcacin, actividad especfica-y yodo incorporado
de la LH marcada, para determinar su concentracin en el suero
sanguneo.
Pgina
55
Figura 2
Comportamiento de las fracciones 7, 8, y 9 y su determinacin de
la dilucin a usar de acuerdo al % de unin mxima cercano al
50%.
55
Figura 3
Comportamiento de la concentracin de la LH antes y despus del
estmulo de las ovejas usadas como grupo testigo.
58
Figura 4
Comportamiento de la concentacin de la LH antes y despus del
estimulo de las ovejas tratadas con HCG.
59
Figura 5
Comportamiento de la concentacin de la LH antes y despus del
estmulo de las ovejas tratadas con Naloxona.
60
RESUMEN
del tipo de sincronizador usado. A la observacin del ovario por laparatoma, se observ
un promedio de cuerpos lteos de 10 y 11, para ovejas tratadas con FSH y PMSG,
respectivamente.
de naloxona, testigo y
gonadotropina
corinica
humana
(HCG),
respectivamente. Muestras de sangre fueron colectadas cada seis horas durante los
perodos de proestro y de estro hasta la aplicacin de los tratamientos, la sangre se
centrifug a 2500 rpm durante diez minutos. El suero fu vertido en microtubos de 1.5
mi y congelado a -196C para su posterior anlisis; las muestras se analizaron para la
concentracin de la hormona luteinizante (LH) por el mtodo de radioinmunoensayo
(RIA). Una de las ovejas tratadas con naloxona mostr un nivel de 38.5 ng de LH/ml las
dos restantes no mostraron incremento de LH post tratamiento, en el grupo tratado con
HCG y en en el grupo testigo no se observaron niveles de LH que induzcan la
ovulacin. Los resultados de este estudio, sugieren un efecto de naloxona en el
incremento de LH durante el estro en ovejas.
SUMMARY
respectively.
24 h before and
48 h after
(MPA
Forty eight there after 3, 3 and 4 ewes were treated with clorhydrate of naloxone,
control and human corionic gonadotrophin, respectively. Blood samples were collected
every 6 h during proestrous period and until treatment applications, blood samples were
centrifugated at 2500 rpm during ten minutes. Serum was decanted and storaged
in
liquid nitrogen (-196 C) in a 1.5 ml microtubes. Serum samples were tawed and
analyzed by RIA in order to determine LH concentration. One of three ewes treated
with Naloxone clorhydrate showed a 38.5 mg LH/ml Ewes treated with HCG and the
control group did not observe LH concentration response to assume ovulation. Results
of these survey suggested a naloxone effect on LH during induced estrous.
CAPITULO I
INTRODUCCION
que posee gran actividad folculo estimulante pero, que carece de capacidad ovulatoria
en la mayor parte de las especies. Consecuentemente, es necesaria la administracin de
la hormona luteinizante (LH) un anlogo como la gonadotropina corionica humana
(HGC) que posee muchas cualidades de tipo LH. Con la combinacin de estas dos
hormonas generalmente puede inducirse el desarrollo folicular y la ovulacin.
El objetivo de este estudio es establecer un protocolo para la foliculizacin y
ovulacin en ovejas pelibuey (Ovis aries).
Definicin de objetivos parciales.
1 - Comparar diferentes sincronizadores de celo.
2.- Comparar diferentes foliculadores.
3.- Comparar diferentes ovuladores en hembras superfoliculadas.
CAPITULO II
REVISION DE LITERATURA
exacta
slo
se
puede
garantizar
en
casos
de
alimentacin
individualizada.
3.-Aplicacin diaria de! gestgeno disuelto en dimetilosulfxido (DMSO) sobre la piel o
sobre una mucosa. El DMSO penetra a travs de la piel y actuando como substancia
transportadora facilita el ingreso de los gestgenos.
4.-Colocacin transitoria en la vagina del animal o en el conducto auditivo de torundas
esponjosas impregnadas con el correspondiente gestgeno; el gestgeno ser
absorvido entonces desde la torunda.
5.-Empleo de un depsito subcutneo de gestgenos, por ejemplo envuelto en una
cpsula plstica permeable, a partir de la cual puede ser reabsorbido el gestgeno.
En la sincronizacin del celo, en ovejas y en cabras, debido a que la aparicin
del estro depende entre otras cosas, de la duracin de la luz diurna, existe la posibilidad,
que mediante la programacin de
Derivaux (1976) menciona que en los grandes rebaos es posible que entren
simultneamente en celo un nmero suficiente de animales por lo cual se pueden
encontrar sin tratamiento, donantes y receptoras suficientes.
La
administracin
continua
de
progetgenos
inhibe
la
secrecin
de
2.4.1. Progesterona.
Pregn-4-ene-3, 20-diona; hormona del cuerpo lteo; lutehormona; corlutina;
gestona.C2iH3o0 2 ; PM 314.45. La progesterona es el pricipio activo del cuerpo lteo,
secretado durante la mitad final del ciclo menstrual. Si la preez sobreviene, la
secrecin continua. Ejerce un efecto antiovulatorio cuando es administrada durante los
das 5 a 25 del ciclo menstrual normal (Budavari ei al, 1989).
CHI
La progesterona es secretada por las clulas luteales del cuerpo lteo, por la
placenta y las glndulas suprarrenales (adrenales). La progesterona es transportada en la
sangre por una globulina enlazadora de andrgenos y progestgenos, la secrecin de
progesterona es estimulada en principio por la LH. La progesterona prepara el
endometrio para la implatacin y mantenimiento de la preez, al incrementar la
actividad de las glndulas uterinas e inhibir la motilidad del miometrio. La progesterona
acta en sinergismo con estrgeno para inducir el comportamiento estrual. Desarrolla el
tejido secretor (alvolos) de la glndula mamaria. Altos niveles de progesterona inhiben
el pico ovulatorio de la LH de este modo la progesterona es importante en la regulacin
del ciclo estrual (Hafez, 1993).
Las tcnicas hormonales para la sincronizacin se basan en estos dos eventos: la
observacin de la ovulacin inhibida por la progesterona y el retiro provocado de sta.
Los diferentes anlogos de la progesterona, con un efecto progestativo, se han empleado
para el control del estro y ovulacin en borregas y cabras. Cada una de stas, con un
modo particular de administracin, requiere de experimentos largos y precisos para
determinar la dosis efectiva y las condiciones de uso. Adems, existen diferencias
significativas en la crianza para un progestgeno dado, liberado en un modo de
administracin determinado (Chemineau, 1991).
La inyeccin diaria de 5 a 10 mg de progesterona durante 12 a 14 das o de 20
mg cada dos das van seguidas de manifestaciones estrales en los 3 a 6 das que siguen
al cese del tratamiento (Derivaux, 1976).
2.4.2. Prostaglandina.
Acido 9,ll,15-trihidroxiprosta-5,13 dien-l-ico. Dinoprost; U-14583; Enzaprost
F; Glandina; Prostahormona F.
La prostaglandina F 2 a es una de las ms estudiadas, biolgicamente, por su
estrecha relacin a la prostaglandina E2(X (PGE^a) ya que ambas prostaglandinas son
sintetizadas de los mismos precursores de tal modo que la PGF2ct es el producto
sinttico de la reduccin de la PGE20L Las causas de la vasoconstriccin y la exhibicin
de su actividad luteoltica es, ms comunmente asociada con su papel en la preez. Es
oxitxico, causante de aborto (Budavari e al, 1989).
HO
\
\
\
prosolvin, Intervet) pueden ser dados con un intervalo de 10-14 das de separacin a fin
de sincronizar la mayora de las hembras del hato. En borregas la entrada del estro
ocurre 36-48 hs despus de la inyeccin; en cabras esta ocurre 72-96 hs despus de la
inyeccin. Existe una amplia variabilidad en los datos de fertilidad obtenidos en el estro
inducido pero, generalmente, la tasa de fertilidad es ms bajo que despus de un
tratamiento con esponjas. Otra desventaja importante del uso de prostaglandinas para el
control del estro son aquellas que no pueden usarse en hembras no ciclando durante
perodos no ovulatorios.
En condiciones de rutina las prostaglandinas son usadas satisfactoriamente con
un tratamiento corto de progestgeno (11 das) y con PMSG para sincronizar el estro
en cabras y borregas en lactancia.
Para evitar los efectos dainos de la repeticin del tratamiento progestgenoPMSG en borregas no preadas, los anlogos de la prostaglandina se han ensayado
intensivamente en los hatos durante la estacin de crianza. La inyeccin de
prostaglandina se administra el da 28 despus de eliminar la esponja en borregas que se
presumen
(10 vs 56%)
CH
c= o
OA 6
todas las pocas. Las esponjas AMP contienen 60 mg y pueden ser usadas para todos los
fines.
El tratamiento de progestgeno es administrado para 10 o 12 das en la estacin
de no crianza o de 12 a 14 das en la estacin de crianza en borregos, y de 17 a 21 das
cuando se usa sola o 11 das cuando se usa con PGF2OC. Cada esponja puede ser tratada
con un antibitico fuerte antes de ser insertada en la vagina.
En borregas, los estudios comparativos mostraron que las esponjas AMP y la
AFG dan iguales resultados cuando el apareamiento se da en forma natural pero se
encontr una ventaja significativa para esponjas de 30 mg de AFG cuando se us
inseminacin artificial en un tiempo determinado despus de la remocin de la esponja
(55 1 horas). La explicacin ms probable de este resultado es que la sincronozacin
del estro es mas exacto posterior al uso de esponjas de AFG, o que la regulacin del
tiempo de la I.A. no es adaptada a tratamiento AMP (Chemineau, 1991).
La Medroxiprogesterona acetato (MPA), incorporada al alimento, en dosis de 60
mg durante 14 das, produce un buen control del estro y de la ovulacin. La
administracin de progestgenos por va vaginal es cada da ms fcil de aplicar y
parece el mtodo del porvenir. La cronolona, cuya actividad es de 20 a 25 veces
superior a la progesterona, es la ms empleada; el producto se incorpora a la esponja en
dosis de 30 mg dejndola en su lugar durante 16 a 17 das. Las esponjas a base de
M.A.P., en dosis de 60 a 80 mg son recomendadas por algunos autores (Derivaux 1976).
La aplicacin de progestgenos tiene la ventaja de que el celo se presenta muy
bien agrupado; induce el celo en animales en anestro, y no producen abortos en
animales gestantes tratados accidentalmente (Odde, 1990).
CH3
c=o
potente,
despus del Norgestomet (55 hs) que despus de las esponjas AFG (62 hs). Los
promedios de alumbramiento (Nmero de borregos nacidos por hembra inseminada)
obtenidos despus de una inseminacin artificial por hembra (51 hs para Norgestomet,
55 hrs para las esponjas AFG) son similares a los 2 tratamientos de progestgenos
(Chemineau, 1991).
B)-estra-l,3,5
(10)-triene-3,17
diol,
17
valerato;
Dihidroxiestrina;
ICH
2)3-0H3
<
2.5. METODO DE SUPERFOLICULACION DE HEMBRAS DONADORAS.
O
iS
-i
y
Estudios sobre ovejas y vacas (Greg et al., 1986) han demostrado que existen
opioides en el hipotlamo del bovino en vecindad de neuronas hipofisiotrficas que -'jj
regulan la secrecin de hormona luteinizante (Malvan et al., 1986; Leishin et al., 1988).
endocrina y
reproductiva.
Encontrando que este alcaloide era capaz de estimular la secrecin de STH y prolactina
y suprimir la secrecin de LH.
En estudios realizados por Guilln (1981), citado por Guerra (1988), utiliz un
extracto hormonal purificado de FSH y LH y un sincronizador PGF2(x , en siete
sola inyeccin. Los resultados estn en funcin de la dosis empleada, del intervalo entre
el momento de la inyeccin y la aparicin de los calores y del grado de actividad
funcional del cuerpo lteo (Derivaux, 1976).
En la oveja una dosis de 700 a 1300 U.I. de P.M.S. produce un aumento en el
nmero de vulos de 3 a 9 la dosis ejerce un efecto sobre el nmero de ovulaciones; la
inyeccin de P.M.S. se realiza al 12 da del ciclo, o ms o menos venticuatro horas
antes o despus del tratamiento dde sincronizacin (Derivaux, 1976).
1983;
Moore, 1987).
En cabras, una inyeccin intramuscular ci (PMSG) al final del tratamiento de
progestgeno (despus de eliminar las esponjas de la hembra y 48 hrs antes de la
remocin de stas, fuera de la estacin de lactancia) incrementa el crecimiento folicular,
la duracin del estro, el promedio de ovulacin y los avances a la entrada del estro en
hembras tratadas. Siguiendo el tratamiento progestgeno-PMSG, se increment sobre 4
el nmero de ovulaciones, el tamao de la cra y la proporcin de borreguitos , sin
embargo, los promedios de ovulacin altos son indeseables. El nivel de dosis de PMSG
inyectada en una esponja removida tiene que ser exactamente ajustada a una crianza en
particular, la poca del ao y el estado fisiolgico de la hembra.
La prolificidad y las crianzas no estacionales son, generalmente, ms sensibles a
PMSG y los resultados obtenidos con Romanov y Finnish Landrace en borregas criollas
no indican ventajas usando mas de 250 U.I. en borregas no lactantes y borregas adultas,
o ms de 400 U.I. en borregas lactantes (Chemineau, 1991).
Se utilizan gonadotrofinas hipofisiarias (combinacin FSH-LH), as como
PMSG y HCG.
Numerosos trabajos han demostrado que las sustancias gonadotrpicas son
capaces de provocar la liberacin de un nmero ms o menos elevado de vulos
fertilizables.
Se pueden lograr ovulaciones de 10 a 12 huevos en bovinos y en cerdas hasta 50
huevos con tratamientos de PMSG-HCG.
se basa en inyectar
hormonas
gonadotrcas a las hembras algunos das antes del celo, para conseguir, debido a su
accin foliculoestimulante, una cuota de ovulacin superior a la natural por el nmero
de vulos llevados a maduracin y ovulacin. Se utilizan gonadotrofinas hipofsiarias
(combinacin FSH-LH), as como PMSG y HCG. A continuacin se mencionan algunos
ejemplos en los que se ha usado la superovulacin en animales zootcnicos mediante
gonadotrofinas.
PMSG
HCG
2000 U.I
5000 U.I
Vacas (adultas)
1000 U.I
4000 U.I
Ovejas
1250-2000
Vacas (novillas de
12-14 semanas)
U.I
Cerdas
1200 U.I
500 U.I
Epoxi-3,14-dihidroxi-17-(2
propenil)morfinan6-ona;C j 9 H 2 1 N O 4 ;
PM
i0
Ct = C H 2
*J
vara entre 1 y 4 hs. El antagonismo de los efectos opioides que presenta la naloxona, a
menudo est acompaado de un fenmeno de "rebote excesivo" ("overshoot")
(Goodman etal., 1991).
La administracin de naloxona; antgonico de los opioides, incrementa la
liberacin de la LH en varas especies, para que esto ocurra se requiere la presencia del
pptido opioide endgeno capaz de inhibir la liberacin de la LH y el receptor opioide
funcional de la ruta matablica para la liberacin de la LH (Weesner e al., 1989).
Gregg et al,
enfermedad trofoblastico o' embrinica testicular o' tumores ovaricos. HCG, junto con
la LH, FSH y TSH comprenden la familia hormonal de las glicoprotenas. Todas son
dimricas y contienen subunidades a y B. Dentro de unas especies, las porciones
peptdicas de la subunidad a son esencialmente idnticas entre las cuatro hormonas,
mientras que las subunidades B aunque muestran Varios grados de homologa, son nicas
y se cree que son las responsables de la especificidad biolgica de las hormonas
individuales. Los suplementos de la hipfisis en el mantenimiento del crecimiento del
cuerpo lteo, durante la preez desaparecen de la circulacin maternal despus de
liberar la placenta. Estimula el tejido Leydig en los machos, que resulta en la secrecin
de andrgenos (Budavari et al., 1989).
La estructura qumica de la HCG (Gonadotropina Crionica Humana, no tiene
una secuencia de aminocidos an definida; solamente se sabe que tiene dos cadenas de
aminocidos (AA), una a (con 32 AA) y otra B (145 AA), teniendo adems un peso
molcular (PM) de 38.600 (Goodman et al, 1991).
Las principales gonadotropinas son la HCG y la PMSG. Estas hormonas
polipeptdicas tienen efectos FSH y LH sobre las gnadas, de tal manera que la HCG
ejercer un primer efecto luteinizante, aunque tambin lo tiene folculo estimulante
(Sumano y Ocampo, 1988).
La fuente de LH ms comunmente disponible es la gonadotropina corinica
humana (HCG) que posee muchas cualidades de tipo LH (Me Donald, 1971).
La HCG se obtena de la orina de mujeres preadas, pero en la actualidad se
obtiene sobre todo de la orina de primates preados, donde las concentraciones son
mucho mayores (Sumano y Ocampo, 1988).
Me Donald (1971) menciona que se puede lograr ovulaciones de 10 a 12 huevos
en bovinos y en cerdas hasta 50 huevos con tratamientos de PMSG-HCG.
Derivaux 1976 Menciona que la inyeccin de 250 a 500 U.I de HCG 48 horas
CAPITULO III
MATERIALES Y METODOS
CONDICIONES AMBIENTALE
Temperatura mxima extrema
42 C
19 C
33 C
21.7 C
28 C
Precipitacin total
333 .6 mm.
JULIO
Temperatura mxima extrema
39 OC
21 C
35 C
23 C
29 C
Precipitacin total
5.0 mm
3.2. METODOLOGA.
Este trabajo consisti en dos pruebas las cuales se realizaron por separado en
diferente fecha y con diferentes animales tal como se describe a continuacin.
3.2.1. Ensayo I:
Este ensayo se realiz en los meses de junio y julio de 1993. Para desarrollar
este trabajo se utilizaron treinta y seis borregas las que fueron previamente
suplementadas, vitaminadas y desparasitadas de acuerdo al calendario de la regin. Para
la etapa de sincronizacin se utilizaron diez y ocho de las treinta y seis ovejas para ser
tratadas con esponjas intravaginales (ver Apndice 1), las esponjas esterilizadas se
impregnaron con 50 y 60 mg de acetato de medroxiprogesterona diluida en aceite de
maz (a 9 borregas para cada dosis, respectivamente); la vulva se limpi aspticamente
con una gasa con yodo diluido al 5% previo a ia introduccin del espculo (lubricado),
para despus colocar la esponja previamente remojada con aceite vegetal con el fin de
evitar adherencia, y mezclado con antibitico (Clamoxil) para evitar infeccin. El
segundo grupo de diez y ocho ovejas (dos subgrupos de nueve ovejas cada uno) fu
tratado con implantes subcutneos de hidron, un polmero hidroflico, los que contenan
2 y 1.5 mg de norgestomet, ste se aplic en forma subcutnea en la oreja con una
pistola para implantar, aplicando azul de metileno despus de la implantacin.
Tanto las ovejas del tratamiento con esponja, como las del implante recibieron
una dosis de 0.5 mi de una mezcla de 15 mg de acetato de progesterona y 25 mg
Tipo de
Identificacin
animales
tratamiento
TI
2.0 mg (NGT)
Total de
collar rojo
9 borregas
collar azul
9 borregas
collar amarillo
9 borregas
collar negro
9 borregas
implante
T2
1.5 mg (NGT)
implante
T3
50 mg (MPA)
esponja
T4
60 mg (MPA)
esponja
Del grupo de ovejas tratado con esponjas se seleccionaron cuatro de cada dosis,
de estas cuatro dos ovejas fueron superfol i culadas con FSH y las restantes con PMSG.
Del mismo modo, fueron tratadas las ovejas del grupo con implante, quedando como lo
describe el Cuadro 4.
Dosis
sincronizador
Implante
2 mg
superfoli culadas
Tratamiento
2 FSH
2 PMSG
Implante
1.5 mg
2 FSH
2 PMSG
Esponja
50 mg
2 FSH
2 PMSG
Esponja
60 mg
2 FSH
2 PMSG
Das
|
|
10
12
Maana
2mg
2mg
1.5 mg
Tarde
2mg
2mg
1.5 mg
13
1 mg
***
**
* Se aplica prostaglandina
** Se retira el implante o esponja
*** Se aplica naloxona y se proporciona el macho
13
15
14
PMSG
16
***
1000 U.I
*
**
* Se aplica prostaglandina
** Se retira el implante o esponja
* * * Se aplica naloxona y se proporciona el macho
Las montas se realizaron por espacio de 3 das seguidos hasta el momento en que
las hembras no permitieran acercarse al macho.
monta, las ovejas se trasladaron a jaulas individuales, aislndolas, con el fin de dietarlas,
para esto se dej a los animales que consumieran aproximadamente 200 g de
concentrado y agua ad libium en el primer da de dieta y, el segundo da de la dieta se
mantuvo al animal solamente con agua fresca, para someterlas a una laparatoma ventral
con objeto de observar el nmero de cuerpos lteos.
Al momento de la intervencin se procedi a lavar el rea ventral de las ovejas
con agua y jabn seguido de una solucin de yodo al 10%, posteriormente se elimin el
pelo del rea a tratar para realizar la incisin.
La ciruga se inici con la aplicacin de 1 mi de anestsico general va
intravenosa (rompun) en forma lenta seguida de 2 mi de sulfato de atropina va
intramuscular para evitarle un "shock" al animal, posteriormente se suministraron 10 mi
de xilocana va subcutnea, como anestsico local en el rea de incisin; cuando el
animal se encontraba totalmente anestesiado se procedi a sujetarlo de las extremidades
sobre una mesa de ciruga; con un bistur se realiz el corte (tratando de que con un solo
corte atraviese la piel) de las diferentes capas del vientre procurando no lesionar los
intestinos, para esto primero se cort la piel, el tejido conectivo y luego con mayor
precaucin el peritoneo; con la ayuda de un espculo introducido por la vagina hasta el
cervix, se procedi a localizar el aparato reproductor introduciendo la mano con un
guante de ltex en el vientre abierto, para posteriormente exponerlo en la regin
ventroabdominal, exponiendo principalmente tero y ovarios; seguidamente se efectu
el conteo de los cuerpos lteos en cada ovario, que concuerdan con datos previos, donde
los ovarios izquierdo y derecho promediaron 9 y 11 cuerpos lteos, respectivamente,
(Fernndez, 1993), finalmente se procedi a un lavado de toda el rea de la herida tanto
interna como externamente con una solucin salina con antibitico y se sutur al animal
en forma continua en el peritoneo y tejido conectivo, y discontinua en la piel, despus se
aplic Topazone, y azul de metileno como desinfectantes y antibitico
va
intramuscular.
Los animales fueron trasladados a las jaulas individuales para su recuperacin
aplicando antibitico cada 24 hs durante un perodo de 4 das y proporcionndoles agua
Este ensayo se realiz de diciembre de 1993 a enero de 1994. Para esta etapa se
seleccionaron 10 ovejas de acuerdo a sus caractersticas fsicas (peso y edad) y de 2 o
parto, estas fueron identificadas con pintura, formando 2 grupos de 3 ovejas cada uno;
un grupo se trat con una inyeccin intramuscular de naloxona (0.4 mg) y otro se
consider como grupo testigo; un tercer grupo de 4 ovejas fu tratado con HCG
(gonadotropina corinica humana 1000 U.I) que se aplic en forma de inyeccin
intramuscular, los tratamientos se muestran en el Cuadro 7.
Total de
sincronizador
Ovejas
Naloxona
PGF2ct (5mg)
Testigo
PGF 2 a 5mg).
HCG
PGF 2 a (5mg)
Tratamiento
Dosis
0.4 mg
1000 U.I.
Diciembre de 1993
25
26
27 28 29 30 31
PGF 2 a celo celo
(1 mi)
Enero de 1994
6
3
5
4
PGF 2 a
Naloxona,
HCG
(1 mi)
t
0
testigo
12
Horas
18
24
10*
12
18
24
11
12
18
24
12
12
18**
20
22
24
muestreo
Proestro
muestreo
Proestro
muestreo
Estro
muestreo
Estro
A) Obtencin de la muestra:
Para la obtencin de las muestras se identifican los tubos "vacutainer" (tubo
sellado al vaco que al momento de hacer la puncin succiona la sangre), con el nmero
de muestra, tipo de tratamiento y nmero de animal. Una vez identificados se les coloc
una cinta adhesiva transparente sobre la identificacin, con el fin de que la humedad no
daara los datos de identificacin; despus de sto se procedi a tomar 3 mi
aproximadamente de las muestras por la vena yugular, para obtener de 1 a 1.5 mi de
suero sanguneo, estas muestras se refrigeraron para posteriormente centrifugarlas por
10 minutos a 2500 rpm; al cabo de este tiempo, se separ el suero del resto del tejido y
se deposit en tubos eppendorf (de 1.5ml) previamente identificados, para conservarlos
en congelacin en nitrgeno lquido, hasta procesarse en el Instituto de Investigaciones
Biomdicas por el mtodo del RIA. El nmero de muestras sanguneas obtenidas en esta
prueba se muestran en el Cuadro 10.
anticuerpo (Ab) (50% Bo) se procedi al montaje de la curva estndar, utilizando para
ello el mismo antgeno no marcado. El protocolo para llevar a cabo lo antes mencionado
se resume en el Cuadro 12.
Fecha
3/enero/94
No de muestfa
I a muestra
a
Hora
5:00 PM
9:40 AM
4:00 PM
+
4/enero/94
2 muestra
4/enero/94
3a muestra
4/enero/94
4a muestra
5/enero/94
5a muestra
6:00 AM
5/enero/94
6a muestra
10:30 AM
5/enero/94
5/enero/94
2 a aplicacin de
PGF2ct
10:00 PM
4:00 PM
10:00 PM
4:00 AM
7 muestra
8 muestra
6/enero/94
9 muestra
6/enero/94
10a muestra
6/enero/94
11a muestra
11:00 AM
6:00 PM
+
aplicacin de
Naloxona o' HCG
6/enero/94
12a muestra
8:00 PM
6/enero/94
6/enero/94
10:00 PM
12:00 PM
13 muestra
14 muestra
1er
2o
H*
Ab
CT
50
PEG
Ab
Nt.
UNE
300
50
100
1000
1:100
250
100
50
100
1000
Centrifugacin
1:1000
250
100
50
Incubacin
100
Incubacin
1000
1:2000
250
100
50
por
100
por
1000
3000 rpm
1:4000
250
100
50
24 horas
100
24 horas
1000
por
1:8000
250
100
50
100
1000
30 min
1:16000
250
100
50
4C
100
1000
1:32000
250
100
50
1000
4C
CT = Cuentas totales
UNE = Unin no especfica
Ab = Anticuerpo
H* = Hormona marcada
PEG = Polietilenglicol
Nota: Los nmeros corresponden a microlitros.
100
4C
jer
Ab
H*
2
Ab
50
PEG
UNE
350
50
100
1000
Bo
250
100
50
100
1000
ST
32 (50)
200
100
50
100
1000
16(50)
200
100
50
100
1000
Centrifugacin
Incubacin
8(50)
200
100
50
4(50)
200
100
50
2 (50)
200
100
50
1 (50)
200
100
50
0.5 (50)
200
100
50
0.25
(50)
200
100
50
0.10
(50)
0.05
(50)
Incubacin
1000
100
por
24 horas
100
100
por
24 horas
1000
4o C
4C
3000 rpm
1000
1000
1000
por
30 min
1000
a
200
100
50
1000
200
100
50
1000
200
100
50
1000
0.025
(50)
CT = Cuentas totales
UNE = Unin no especfica
Bo = Unin mxima
St
= Estndar de referencia
Ab = Anticuerpo
H* = Hormona marcada
PEG = Polietilenglicol
Nota: Los nmeros corresponden a microlitros.
4C
2gj/_(Qy-y)2_(on-gii)2
i J
Eij
eu
(ou-eu)2
eic
ehc
Donde:
Oij = # de observaciones en la i-sima hilera y j-sima columna de la tabla de
contingencia.
Eij = valor esperado en esta categora.
h = # de hileras.
c = # de columnas.
Siendo el valor esperado:
n..
CAPITULO IV
RESULTADOS Y DISCUSION
Cuadro 13. Efecto del MPA en dosis de 50 y 60 mg, durante la estacin anestro y
actividad sexual.
Dosis
MPA
No. de ovejas
en estro
No. de ovejas
en anestro
Total
50 mg
60 mg
13
18
Cuadro 14. Valores esperados de los datos del Cuadro 13, que se refiere al efecto
del MPA en la estacin anestro y actividad sexual.
Estro
Anestro
50 mg
6.5
2.5
60 mg
6.5
2.5
Cuadro 15. Efecto del NGT en dosis de 1.5 y 2.0 mg, durante la estacin anestro y
actividad sexual.
No. de ovejas No. de ovejas
en estro
en anestro
Dosis
NGT
Total
1.5 mg
2.0 mg
15
18
Cuadro 16. Valores esperados de los datos del Cuadro 15, que se refiere al efecto
del NGT en la estacin anestro y actividad sexual.
Estro
Anestro |
1.5 mg
7.5
1.5
2.0 mg
7.5
1.5
X cal=
0.38
n.s.
Cuadro 17. Efecto del sincronizador (MPA NGT) durante la estacin anestro y
actividad sexual.
Estro
Anestro
total
MPA
13
18
NGT
15
18
total
28
36
Cuadro 18. Valores esperados de los datos del Cuadro 17 que se refiere al efecto
del sincronizador durante la estacin anestro y actividad sexual.
Estro
Anestro
MPA
14
NGT
14
Foliculadas
No
foliculadas
Total
FSH
50
FSH
60
PMSG
50
PMSG
60
Los resultados obtenidos para el sincronizador NGT, fueron que, las hembras
tratadas con la dosis mayor del sincronizador, las dos que se sometieron al foliculador
FSH, ambas presentaron el estado de superfoliculacin; mientras a las que se les aplic
la dosis menor de NGT que fueron tratadas para el mismo foliculador, una hembra
respondi positivamente al tratamiento. En el caso del foliculador PMSG, del grupo de
las dos hembras pertenecientes a la dosis mayor de NGT, el total fu capaz de
superfolicular; y de las seleccionadas (dos) en la dosis menor de NGT, para PMSG, el
50% de ellas presentaron el efecto del tratamiento. El nmero de muestras no soporta la
prueba estadstica, sin embargo, la tendencia que observamos en estos tratamientos es
que el efecto de ambos superfoliculadores est determinado, por la dosis mayor del
sincronizador. En el Cuadro 20 se muestran los resultados comparativos antes descritos.
No
Total 1
foliculadas
(mg)
FSH
1.5
FSH
2.0
PMSG
1.5
PMSG
2.0
Cuadro 21. Concentracin de datos del sincronizador (MPA o* NGT) con los
foliculadores FSB y PMSG.
1
NGT
MPA
\w
FSH
PMSG
Con el fin de validar los datos obtenidos del efecto conjunto de sincronizadorfoliculador (Cuadros 17, 19 y 20) se llev a cabo un anlisis estadstico y el resultado
obtenido muestra que el 62.5% de las hembras sometidas al foliculador FSH mostraron
estro y el resto no tuvieron efecto del foliculador, mientras que del
100% de las
hembras tratadas con PMSG respondi al efecto del foliculador un 75% y el 25% no
present efecto del foliculador; al llevarse a cabo una prueba de independencia, se
observ que los resultados obtenidos no dependen del tipo de foliculador usado
(p>
0.05).
Cuadro 22. Efecto del foliculador (FSH o* PMSG) durante la estacin anestro y
actividad sexual.
FSH
PMSG
total
Estro
'5
11
Anestro
total
16
Cuadro 23. Valores esperados del Cuadro 22 que se refiere al efecto del
foliculador durante la estacin anestro y actividad sexual.
Estro
FSH
PMSG
5.5
5.5
2.5
Anestro
X 2 c a l = 0.29 n.s.
Ovario
izquierdo
Ovario
derecho
Cuerpos lteos
totales
FSH
11
PMSG
12
PMSG
10
14
19
33
Cuadro 25. Valores esperados del Cuadro 24, que se refiere al efecto del
foliculador en el nmero de cuerpos lteos.
I Foliculador
Ovario
izquierdo
Ovario
derecho
FSH
4.6
6.33
PMSG
5.09
6.90
PMSG
X cal = 0.075 n.s.
4.24
5.75
c o c
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VALORES + D.S.
14305 609
41.5 2.06
1.9 0.48
-0.77 + 0.05
98.4 0.05
0.075 0.016
0.445 0.057
2.73 0.33
11.70 1.82
No.
5 se
representa
el
grupo
al
que
se
le
aplic
la
naloxona,
en este grupo una oveja respondi al estmulo de la naloxona y aunque la muestra que
representa el aumento es en el preciso momento del estmulo hace pensar que el tiempo
transcurrido entre la aplicacin y la toma de muestra fu el suficiente para reportar el
incremento de LH en el anlisis, dado que como se tuvieron que muestrear otros
animales antes en este tiempo, tuvo su efecto el estmulo llegando a reportar un mximo
de concentracin de LH de 35 .8 ng de LH/ml
O)
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**
**
**
CO
CM
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Bu
6)
iZ
OBSERVACIONES
3 A (0471)
3G (9213)
3H (92109)
2 TESTIGO HCG
3B (2-125)
3C (92-70)
3F (2-66)
31 (92152)
NALOXONA
3D (9296)
3E (2130)
3J (9289)
CAPITULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Dado las circunstancias y caractersticas en las que se realizaron los dos ensayos
se concluye y se recomienda lo siguiente:
- Tambin es conveniente
usar
realicen
CAPITULO VI
BIBLIOGRAFIA
so
Armstrong, D. T. and Evans, G., 1983. Factors affecting success of embryo transfer in
sheep and goat.
M
T
<
<5
Budavari, S., O'Neil, M.J., Smith, A., Heckelman, P. (edit.), 1989. The Merck Index
^
r-"
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Yamane, T., 1967. Statistics an introductory analysis 2a Ed. Harper & Row, Publishers.
U.S.A. pp. 625-631.
CAPITULO VII
APENDICE
180 mi
50 mi
162 mi
38 mi
50 mi
500 mi
Checar el pH
Utilizacin
1. Hinchar el Sephadex
200 mi
Checar el pH
Utilizacin
2. Equilibrar columna
l. Amortiguador madre
3. Preparar cloro y
PBS 0.05 M
4. Buffer de corrida
metasulfito.
PB 0.05 M + NaCl 0.14M
(1000 mi + 8.18 g )
PBS-EDTA
PBS+ EDTA 0.02 M
Utilizacin
(1000 mi + 7.6 g)
1. Preparar el PEG 6%
2. Preparar el 2o Ab
Utilizacin
1. Preparar el 1er. Ab
2. Preparar el SNC
PBS-BSA
PBS + BSA 1%
(100 ml + 1 g)
PBS + BSA
PBS + BSA 0.1%
(100 m i + 0.1 g)
Utilizacin
1. Amortiguador del ensayo
2. Diluir los estndares
Utilizacin
1. Diluir las fracciones obtenidas en la marcacin
Relacin
1er anticuerpo
PBS-EDTA
total
1:1000
200 micros
100 micros
1700
2 mi
1:2000
100 micros
100 micros
1800
2 mi
1:4000
100 micros
200 micros
3700
4 mi
1:8000
100 micros
400 micros
7500
8 mi
1:16000
50 micros
400 micros
7550
8 mi
1:32000
25 micros
400 micros
7575
8 mi
SNC
del frasco
NOTA: El SNC (Suero Normal de Conejo) se usa cuando existe poca proteina en el
tubo de ensayo lo que provoca una reaccin muy inestable, asi que el SNC estabiliza la
reaccin; es decir, ayuda a los componentes del sistema.
La secuencia seguida en
er
<
I
&
PROTOCOLO
PBS-BSA
1'
H*
Ab
10
1. C T 3
2o
PEG
Ab
6%
0
3 UNE
5. 1:1000
700
500
Centrifugacin
10
Incubac
200 10
200
1000
0
7. 1:2000
500
200 10
por
200
por
1000
a 4C
0
9. 1:4000
500
200 10
200
1000
0
11. 1:8000
500
200 10
24 horas
200
24 horas
1000
por 30 min.
0
13. 1:16000
500
200 10
200
1000
200
1000
0
15. 1:32000
500
200 10
0
NOTA: Los 200 p.1 del 2 a nticuerpo se aplican dentro del cuarto fro, se le aplicarn a
cada tubo puesto a incubar, anteriormente. ! !Los tubos no se sacan del cuarto fro! !.
0.8
0.8
0J8
v. 1.4
Estro-metaestro
2.2
2.4
2.0
3.0
1.8
1.6
P>F
1.6
GL
SC
CM
Tratamiento
3.324678
3.324678
Error
1.737144
0.193016
Total
10
C.V. = 26.26 %
5.061823
17.2249
0.003
Repeticiones
media
Estro-metaestro
2.400000 a
Diestro-proestro
1.257143
0.2
Estro-metaestro
0.8
0.2
0.4
0.2
GL
SC
CM
Tratamiento
0.242000
0.242000
Error
0.030000
0.010000
0.272000
Total
C.V. = 27.78 %
F
24.2000
P>F
0.014
Tratamiento
media
Estro-metaestro
0.80 a
Diestro-pro estro
0.25
1.0
1.4
0.8
1.6
Estro-metaestro
0.6
08
1.2
0.8
1.2
1.2
P>F
1.4
GL
SC
CM
Tratamiento
0.364804
0.364804
Error
0.624289
0.069365
10
0.989093
Total
C.V. = 24.14%
0.046
5.2592
Repeticiones
media
Diestro-proestro
1.228571 a
Estro-metaestro
0.850000
Diestro-
proestro
B Estro-metaestro
0.4
1.0
1.0
0.6
0.4
0.8
0.4
0.8
0.8
0.6
GL
SC
CM
Tratamiento
0.027429
0.027429
Error
0.468571
0.058571
0.496000
Total
C.V. = 35.59 %
P>F
0.4683
0.518
repeticin
media
0.714286
3
Estro-metaestro
No hay diferencia significativa
0.600000
Diestro-proestro
0.6
0.4
0.6
0.4
0.4
0.2
0.2
0.2
0.4
0.2
proestro
Estrometaestro
GL
SC
CM
Tratamiento
0.080667
0.080667
Error
0.143333
0.017917
0.224000
Total
C.V. = 37.18%
F
4.5023
repeticin
media
0.4333
4
Estro-metaestro
No hay diferencia significativa
0.2500
Diestro-proestro
P>F
0.065
0.8
1.8
0.2
2.0
Estro-metaestro
1.6
1.0
0.4
0.8
1.0
1.8
7.0
GL
SC
CM
Tratamiento
3.283247
3.283247
Error
31.458576
3.495397
Total
10
C.V. = 111.77%
34.741823
P>F
0.9393
0.640
Tratamiento
Diestro-proestro
media
2.080
4
Estro-metaestro
0.950
* Aunque no existe diferencia significativa entre tratamientos, el valor de la media del
tratamiento 1 indica un nivel adecuado de concentracin de LtL, para inducir a la
ovulacin.
0.4
0.6
0.4
0.4
Estro-metaestro
0.4
0.4
0.2-
0.2
0.6
0.2
1.0
GL
SC
CM
0.106667
0.106667
10
0.440000
0.044000
11
0.546667
F
2.4242
P>F
0.148
0.4
repeticin
media
0.5
Estro-metaestro
4
No hay diferencia significativa.
0.3
Diestro-proestro
1.4
1.6
2.2
1.0
Estro-metaestro
0.8
1.2
1.0
1.4
2.2
3.4
2.0
GL
SC
CM
Tratamiento
1.932987
1.932987
Error
3.754288
0.417143
10
5.687275
Total
C.V. = 39.04%
F
4.6339
P>F
0.058
repeticin
Diestro-proestro
media
1.971429
Estro-metaestro
4
1.100000
* Aunque no existe diferencia significativa entre tratamientos, el valor de la media del
tratamiento 1 indica un nivel adecuado de concentracin de LH, para inducir a la
ovulacin.
0.6
0.8
0.4
0.8
1.2
0.8
1.6
1.0
Estro-metaestro
0.2
0.4
1.4
0.2
* Aunque no existi diferencia significativa entre medias de tratamientos, el nivel de 1.6
en la concentracin de LH en una de las repeticiones del tratamiento 1 permiten la
ovulacin de la unidad experimental.
GL
Tratamiento
Error
Total
C.V. = 56.37%
SC
CM
0.326668
0.326668
10
1.949999
0.195000
11
2.276667
F
1.6752
p>F
0.223
Tratamiento
media
0.90
4
Estro-metaestro
No hay diferencia significativa.
0.55
Diestro-proestro
1.2
1.0
0.8
0.6
Estro-metaestro
35.8
29.8
10.2
4.2
0.8
1.2
0.6
P>F
1.6
SC
CM
965.201599
965.201599
10
692.195068
69.219505
Total
11
C.V. = 113.71 %
1657.396667
Tratamiento
Error
GL
1
13.9441
0.004
| Repeticiones
media
Estro-metaestro
19.999 a
Diestro-proestro
0.9750 b
xool