INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA

LABORATORIO DE BIOCONVERSIONES

INGENIERA BIOTECNOLGICA

PRCTICA 7
PRODUCCIN DE ENZIMA (INVERTASA) A PARTIR DE
Saccharomyces cerevisiae LIBRE E INMOVILIZADA EN UN
BIORREACTOR A NIVEL LABORATORIO.
OBJETIVOS:
El alumno determinar la actividad enzimtica de la invertasa producida por
Saccharomyces cerevisiae en estado libre e inmovilizado en esferas de
alginato de sodio, durante una fermentacin en un biorreactor a nivel
laboratorio.
Especficos:
- El alumno disear y construir un biorreactor nivel laboratorio para la
produccin de enzimas a partir de levadura en estado libre e
inmovilizado.
- El alumno inmovilizar clulas de S. cerevisiae en alginato de sodio.
- El alumno preparar el medio de cultivo para el crecimiento de la
levadura y la produccin de la enzima.
- El alumno llevar a cabo el seguimiento de la cintica de crecimiento de
la levadura en estado libre e inmovilizado.
- El alumno monitorear la produccin de protena en las clulas (en
estado libre e inmovilizado) durante el tiempo de proceso.
- El alumno determinar la actividad enzimtica y la actividad enzimtica
especifica de la invertasa producida por las clulas en estado libre e
inmovilizado.

MARCO TERICO
Inmovilizacin de clulas: La inmovilizacin celular se define como la
localizacin de clulas en una regin definida en el espacio con la preservacin
de las funciones celulares. Esta regin de inmovilizacin debe ser una fase
slida que permita el intercambio de sustratos y productos con el medio
exterior, no debe ser txica para las clulas y debo ser fcilmente manipulable.
La inmovilizacin en soportes naturales y sintticos ha mostrado por un
lado, estabilidad en las funciones celulares, por otro lado, permite alcanzar altas
concentraciones de microorganismos en volmenes reducidos y permite la
reutilizacin del biocatalizador y la implantacin de sistemas continuos da
produccin, facilitando las etapas de separacin.

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Los procesos biotecnolgicos pueden ser sustancialmente optimizados

utilizando microorganismos inmovilizados en comparacin con los procesos
que utilizan clulas libres.
La utilizacin de la inmovilizacin celular permite:

Facilitar las etapas de separacin de biomasa y producto.

La reutilizacin del biocatalizador microorganismos o
clulas vegetales o animales.
Facilitar la implantacin de sistemas continuos de
produccin.
Prolongar la actividad metablica de los
microorganismos o clulas vegetales o animales.
Prolonga el ciclo de vida de los microorganismos o clulas vegetales
o animales.
Aumentar la tolerancia de las clulas a sustancias txicas.

Mtodos de inmovilizacin: Las diferentes tcnicas que se utilizan para la

inmovilizacin celular pueden ser clasificadas de la siguiente manera: adsorcin
fsica y enlaces covalentes, micro encapsulacin, agregacin, y atrapamiento o
inclusin celular.
- Adsorcin y enlaces covalentes.
Las tcnicas de adsorcin y por enlaces covalentes se llevan acabo en los
espacios libres de los poros del soporte, en donde existen grandes
superficies. En este tipo de inmovilizacin, una gran parte de la superficie de la
clula est en contacto directo con el medio, en contraste con la encapsulacin
o tcnicas de atrapamiento, en donde un fragmento grande de las clulas es
capturado y las limitaciones de transferencia de masa pueden estar presentes.
- Adsorcin.
Las clulas pueden anclarse naturalmente a una superficie, las clulas se
anclan al soporte por atracciones electrostticas (fuerzas de Van der Walls,
inicas y de puentes de hidrgeno). El crecimiento produce una biopelcula en
la superficie del soporte y las limitaciones de transferencia de masa tienen
lugar dentro de esta biopelcula.
Los soportes incluyen trozos de madera, arena, resinas de intercambio
inico y materiales orgnicos corno la celulosa y carbn activado.
- Enlace covalente.
En este tipo de inmovilizacin el fuerte enlace de la clula-soporte reduce la
prdida celular. La unin directa de las clulas a un soporte activado es posible
por la modificacin qumica de la matriz por medio de la utilizacin de sustancias
que sirvan de puente de unin qumica. El glutaraldehdo es usado para tal fin, sin
embargo, el riesgo del dao celular, debido a los enlaces covalentes alrededor de
la membrana celular, puede ser una limitante.
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- Micro-encapsulacin.
La micro-encapsulacin se usa en el rea farmacutica o en el campo de
medicina para produccin de frmacos e inmovilizacin de enzimas. Una
microcpsula consiste en una semi-membrana permeable, esfrica, delgada y
fuerte que rodea un centro liquido, con un dimetro que varia de unas mieras a
1mm. La membrana sin/e como una barrera semipermeable permitiendo la
entrada ce sustrato y la salida de metabolitos, pero no permite el paso de clulas.
- Atrapamiento o inclusin.
De entre los mtodos de inmovilizacin de clulas, el mtodo de inclusin celular
ha mostrado ser el que permite un mejor control de la inmovilizacin y es el que
preserva mejor las funciones celulares. Este mtodo consiste en atrapar las
clulas en una red tridimensional rgida de hidrogel; los soportes de
inmovilizacin pueden ser sintticos (por ejemplo la poliacrilamida, el
poliuretano) o naturales, (por ejemplo el agar, la gelatina, el alginato y la
carragenina). Una de las caractersticas particulares del mtodo de inclusin
o atrapamiento celular est
relacionada
con
las
condiciones de
gelificacin del soporte y la reversibilidad del proceso de gelificacin. La
gelificacin se realiza por cambios en la temperatura o por la presencia de
iones. Adems, la gelificacin es reversible, as, bajo ciertas condiciones
fsicas se cuenta con una suspensin celular que puede ser gelificada,
quedando las clulas atrapadas; posteriormente se puede volver a liberar las
clulas aumentando la temperatura o retirando los iones. Uno de ios materiales
ms empleados para realizar la inmovilizacin por inclusin celular es la Kcarragenina.
a) Kapa-carragenina.
La K-carragenina es un polisacrido no txico, de fcil adquisicin, aislado a partir
de algas marinas. Es ampliamente usado en las industrias cosmtica y alimentaria
como agente gelificante, espesante y estabilizante. Es un polmero, el cual esta
constituido por una estructura unitaria de sulfato de -D galactosa y 3,6-anhidro-- Dgalactosa.
La K-carragenina gelifica al enfriarse o al contacto con una solucin de algn
agente inductor del gel, tales corno iones potasio o calcio.
Una ventaja al emplear K-carragenina es, que la inmovilizacin puede efectuarse
bajo condiciones muy suaves, sin el uso de qumicos que puedan inhibir la
actividad enzimtica de las clulas.
Invertasa: la invertasa (-D-fructofuranosidasa, -D-fructofuransido fructohidrolasa,
EC 3.2.1.26), cataliza la hidrlisis de restos terminales no reductores -Dfructofuranosdicos de fructofuransidos. Entre los sustratos sobre los que acta el ms
significado es, sin duda, la sacarosa, de ah que el enzima se designe con el nombre
de sacarasa. La denominacin trivial de invertasa, con la que tambin se conoce, hace
referencia al hecho de que los productos de la reaccin son conocidos desde antiguo
como azcar invertido ya que mientras la sacarosa es dextrorrotatoria, la mezcla
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equimolecular de glucosa y fructosa que resulta de su hidrlisis es levorrotatoria, por lo

que en el proceso se origina un cambio de signo (de positivo a negativo) del valor de
rotacin ptica.
Sacarosa ([]D= +66,5) + H2O D-glucosa ([]D= +52,5) + D-fructosa ([]D= -92)
La invertasa es un enzima ampliamente distribuido, estando presente tanto en
microorganismos como en animales y vegetales, jugando un papel importante en el
catabolismo de fructanos y ms especficamente en el de la sacarosa, en especial en
aquellos organismos en los que dichos azcares son utilizados como fuente de
carbono y energa. El estudio de la actividad invertasa presenta un gran inters tanto
desde un punto de vista acadmico como de investigacin aplicada, siendo uno de los
enzimas ms conocidos.
La invertasa es una enzima de inters industrial utilizada en la hidrlisis de sacarosa
para la obtencin de jarabes fructosados (JF), los cuales son empleados ampliamente
en la industria de alimentos como la industria refresquera, la de conservas, lcteos,
pastelera y confitera.
Aplicacin biotecnolgica y biorreactores con clulas inmovilizadas.
Los biorreactores ms comunes usados con clulas inmovilizadas son: tanque
agitado, lecho fluidizado, columna empacada, y reactor air-lift (Fig. 1). El tipo de
biorreactor a utilizar depende del mtodo de inmovilizacin empleado, del
metabolismo las clulas y del requerimiento de transferencia de masa

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Salida de aire

Alimentacin

Clulas
inmovilizadas

Aspersor de aire
Productos

Productos

Productos

Clulas
inmovilizadas

Alimentacin

Alimentacin

Figura 1. Biorreactores con clulas inmovilizadas A, Tanque agitado; B, air lift; C,

Columna empacada; y D, Lecho fluidizado.
Material, Equipo y Reactivos

Probetas.
Termmetro
Autoclave
Bao Mara
Potencimetro.
Microscopio ptico
Centrfuga
Balanza analtica
Espectrofotmetro UV-VIS
Campana de flujo laminar
Tubos Falcn
Tubos Eppendorf estriles (150
aprox.)
Portaobjetos
Asa bacteriolgica
Lmpara de alcohol
Mechero de Bunsen

Micropipetas
Encendedor
Portaobjetos
Puntas para micropipetas
Tiras de medicin de pH
Charolas de aluminio secas
Soluciones para realizar tincin de
Gram
o Cristal Violeta
o Lugol
o Alcohol-cetona
o Safranina
Reactivo DNS
Reactivo de Bradford
Solucin de sacarosa al 30%
Agua destilada
Buffer pH 4
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Buffer pH 7
Aceite de inmersin
Solucin de anthrona
Alcohol al 70 %
Solucin de sacarosa
Pinzas
Charolas de aluminio
Bao de hielo
Sacarosa
Extracto de levadura
Vasos de precipitado de diferentes
volmenes
Barras magnticas para agitacin
(mosca)
Jeringa de 10 ml con punta roma
Manguera de silicn de 2 mm de
dimetro para bomba peristltica
Agar nutritivo.
Parrilla de agitacin y
calentamiento
Soporte Universal
Solucin estril de cloruro de calcio
al 1%.
Solucin de alginato al 2%
Pipetas de 1 y 10 mL

1 colador de cocina metlico

Primera parte:
Cada equipo debe disear un reactor, considerando material que sea factible de
conseguir, que est en el laboratorio o bien matraces, frascos de vidrio, probetas,
tubera etc. El reactor diseado deber garantizar la esterilidad del cultivo, adems de
proveer un sistema de agitacin homogneo, ya sea por medio de inyeccin de aire o
con barras magnticas. El volumen total de operacin del reactor no deber ser mayor
a 1 L.
Prueba de del biorrecator diseado, funcionamiento y esterilidad:
Preparar medio de cultivo agar nutritivo (el volumen depender del tamao del reactor
diseado) y colocarlo en el reactor. Cerrar el reactor y someterlo a esterilizacin en
autoclave, a 125 C por 15 minutos. Posteriormente verificar que no se halla daado el
rector o sus partes durante el proceso y dejar funcionando durante 24 h. Al da
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siguiente, comprobar por medio de turbidez y cuenta en placa que no haya crecimiento
en el reactor.
Segunda parte
Medio a utilizar en toda la prctica, composicin por L de medio: sacarosa, 20 g;
KH2PO4, 5 g; (NH4)2SO4, 7 g; NaCl, 0.5 g; MgSO 4 7H2O, 0.5 g, CaCl2 2H2O, 0.25 g;
extracto de levadura, 5.0 g
Ajustar el pH a 5 con H 2SO4 y NaOH 0.1 N, esterilizar a 120 oC y 1.5 Kg/cm2 durante
15 minutos.
Preparar, un da antes de iniciar el experimento en el birreactor, un inculo de S.
cerevisiae en cuatro matraces de 500 mL con 250mL de medio estril, pH 5. El
profesor proporcionar un cultivo en caja de petri de la cepa Saccharomyces
cerevisiae. De forma asptica, tomar con el asa una porcin de una colonia del cultivo
slido proporcionado e introducirla en el medio de cultivo estril del matraz. Incubar a
35C, con agitacin de 120 rpm y durante 14 a 16 horas (toda la noche). Verificar la
pureza del cultivo por tincin de gram
Inmovilizacin de clulas.
TODO el material donde se trabajar debe estar estril, y manipular en la
campana hasta que est montado en reactor. Prever tener todo el material estril,
pipetas, coladores, matraces, mangueras, etc.
Centrifigar 500 mL de medio a 5000 rpm, 15 min en tubos estriles y recuperar la
pastilla celular, (eliminar sobrenadante), posteriormente resuspender la biomasa
en 100 mL de solucin isotnica estril.
1. Contar el No de clulas por mL del inculo, por cuenta en cmara de
Neubauer.
2. Adicionar a un matraz de 500 0 1000 mL que contiene 400 mL de alginato
de calcio al 2.5% a 40-45 C, la biomasa contenida en los 100 ml del
inculo (biomasa resuspendida).
3. Agita con una barra magntica para homogenizar la suspensin.
4. La suspensin se bombea por medio de una bomba peristltica que
opera a 12 rpm y a travs de una aguja hacia una solucin de cloruro de
calcio al 1% (estril) en forma de gotas.
5. Las gotas al ponerse en contacto con la solucin de cloruro de calcio
solidifican instantneamente formndose as esferas de aproximadamente
3 mm de dimetro.
6. La solucin debe estar con agitacin mnima (60 rpm), para evitar que las
esferas se peguen entre ellas al momento de caer. Las esferas formadas
permanecen en la solucin de cloruro de calcio con agitacin durante
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30 min.
7. Posteriormente son retiradas de forma estril (con un colador de
cocina metlico estril) e introducidas al biorreactor diseado. Todo ello
se realiza dentro de la campana de flujo laminar en condiciones de
esterilidad.
8. Tomar una muestra de esferas para determinar el volumen y peso de
la misma y establecer el nmero de clulas por esfera.
9. Tomar una muestra del cloruro de calcio para determinar las clulas no
inmovilizadas, por cuenta en cmara de Neubauer.
Una vez obtenidas la clulas inmovilizadas montar los dos reactores diseados, uno
para clulas libres (inocularlo al 10 %) y otro para inmovilizadas. Tener listo la cantidad
de medio de cultivo estril necesario para los reactores, tener preparado ms de lo
necesario para el caso de cualquier contingencia y los blancos.

La cintica se seguir por 24 h, tomando 5 o 6 mL de medio en cada tiempo para

anlisis; Monitoreando los siguientes parmetros en el sobrenadante:
1.
2.
3.
4.

Densidad ptica (biomasa)

(Volumen de muestra 1 mL mximo)
Cuenta en placa*
(Volumen de muestra 0.1 mL)
Cuneta directa en cmara de Neubauer
(Volumen de muestra 0.1 mL)
Tincin de Gram
(Volumen de muestra 0.1 mL)

*Cuenta en placa se realizar al inicio, tiempo cero, un tiempo intermedio y tiempo final,
por triplicado y tres diluciones, en medio para levaduras con 15 g/L de agar, inoculando
con 0.1 mL de la dilucin correspondiente (10 0 a 10-9 y extendiendo con varilla en L.
(Se requieren de 54 cajas por equipo, puntas estriles de 1000 y 100 L, para las
diluciones: 30 tubos eppendorf estriles, solucin isotnica estril)
En sobrenadante centrifugado a 5000 rpm 15 min determinar:
5.
6.
7.
8.
9.

Protena por Bradford

Azcares reductores
Azcares totales
pH
Actividad enzimtica:

(Volumen de muestra 0.75 mL)

(Volumen de muestra 0.3 mL)
(Volumen de muestra 0.6 mL)
((Volumen de muestra 1 mL)
(Volumen de muestra 250 L)

De cada muestra centrifugada, tomar 0.05 mL del sobrenadante y se transferir a

un microtubo. Adicionar 0.95 mL de solucin de sacarosa 30 g/L y mezclar.
Inmediatamente y a los 5 min., tomar 0.1 mL del tubo y transferir a otro tubo
con 0.1 mL de reactivo de DNS. Los tubos se colocan en agua hirviente durante
5 minutos y luego en hielo. Adicionar 1 mL de agua destilada y medir
absorbancia a 540 nm.
Notas:
IMPORTANTE, la nica muestra que debe permanecer sin contaminar (tomada y
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manipulada en condiciones de esterilidad) es la usada para cuenta en placa.

Tiempos recomendados: en funcin de los horarios de la clase, establecer el programa de
muestreo, la principal actividad se lleva a cabo en las primeras 12-18 horas, por lo que dejar
al inicio toda la noche el sistema puede hacer que se pierdan los puntos ms interesantes.
Se recomienda dejar todo listo, enfriar e iniciar en la maana.
Las muestras pueden ser tomadas y guardadas en refrigeracin para el posterior anlisis.
Se recomienda hacer de forma inmediata la cuanta en placa y Tincin de Gram (esta ltima
para asegurar que no hay contaminacin).

Resultados y anlisis de resultados

1.- Establecer el porcentaje de inmovilizacin de clulas
2.- Comparar la actividad y eficiencia de los dos reactores
3.- Establecer relaciones y correlaciones de los parmetros determinados. Curvas de
crecimiento, degradacin, actividad enzimtica, consumos de sustrato, etc.
4.- Discutir los resultados obtenidos

BIBLIOGRAFA
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