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AVENTURAS
DEL PENSAMIENTO

DETERMINACIN DE
NIVELES DE COBRE

en una poblacin estudiantil de la

Facultad de Ciencias Qumicas por
espectrofotometra de absorcin atmica en flama

D. SOLTERO BAEZA, D. S. P ALAFOX GONZLEZ, I. R. HERRERA BAEZA,

A. DVILA SNCHEZ, J. M. CULLAR MIRAMONTES y M. O. GONZLEZ RANGEL
Facultad de Ciencias Qumicas/Universidad Autnoma de Chihuahua

l cobre es un elemento que

se encuentra en la naturaleza de forma natural y resulta indispensable para
la formacin y el buen funcionamiento
de todos los seres vivos. Se han descrito
una serie de patologas en las cuales se ve
involucrado este metal, por lo cual es de gran importancia clnica contar con mtodos eficaces para la determinacin srica. En la actualidad, el mtodo colorimtrico
es el ms utilizado; sin embargo, presenta una baja especificidad, adems de dar lugar a un sinnmero de posibles errores, por lo cual en este trabajo se utiliz el mtodo de
espectrofotometra de absorcin atmica en flama que demostr mayor sensibilidad para este tipo de determinaciones, as como la optimizacin del tiempo de lectura de las
muestras.
El estudio se realiz para determinar las concentraciones de cobre srico en una poblacin de estudiantes de la
Facultad de Ciencias Qumicas y los valores obtenidos fueron evaluados mediante el programa estadstico Minitab 13.2.

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Se concluy que los valores normales de cobre srico

para esta poblacin fluctan entre 1.038 y 1.086mg/L y se
encontr de igual forma que no existe una diferencia del
valor en cuanto al gnero. Se realiz una comparacin entre
los valores por el mtodo colormetro mencionados en la
bibliografa y los obtenidos por el mtodo de
espectrofotometra de absorcin atmica en flama, cuyos
resultados arrojaron una similitud; sin embargo, se observ
una mayor sensibilidad por este mtodo ya que su determinacin est detectando ppm, mientras que el calorimtrico
resulta sensible a cantidades de mg/dl, por lo que el mtodo
EAA en flama es ms confiable, ms sensible y con menor
rango de error.

Introduccin
A medida que la bioqumica explica la etiologa de las patologas, aparece la necesidad diagnstica de disponer de procedimientos precisos, reproducibles y rpidos para conocer
la mejor informacin acerca de los parmetros qumicos que
condicionan el estado de salud o de enfermedad de un individuo o de una poblacin. Precisamente, de esta necesidad
nace la qumica clnica como la aplicacin de la bioqumica y
otras disciplinas al diagnstico de la salud y enfermedad
humana.
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DEL PENSAMIENTO

El cobre es un oligoelemento esencial para el hombre.

Sus concentraciones en plasma no solo dependen del metabolismo endgeno sino que se ven afectadas tambin por
factores del ambiente, por lo que los valores normales dependern de la poblacin especfica a la que se refiera. En el
estado de Chihuahua no existen antecedentes de los valores
normales en esta poblacin, ni la referencia de este elemento
en plasma por el mtodo de espectroscopia de absorcin
atmica en flama (EAA en flama), tcnica mucho ms sensible. La determinacin de este elemento se hace necesaria en
algunas patologas como prueba de diagnstico clnico diferencial; por lo que se requiere contar con una tcnica
estandarizada para ello.
Este elemento se almacena preferentemente en el hgado, rin, msculo, corazn y cerebro. Se consideran valores anormales los inferiores a 0,7 microgramos/ml en el hombre y 0,8 microgramos/ml en la mujer. Su deficiencia produce
anemia, neutropenia y desmineralizacin sea, mientras que
la ingestin en exceso resulta txica.
Aunque no son frecuentes las intoxicaciones agudas
por este metal, dadas sus propiedades emticas y laxantes,
se caracterizan por nuseas, vmitos, dolor de cabeza y debilidad. Los casos ms graves cursan con taquicardia e
hipertensin que pueden ir seguidas por ictericia, anemia
hemoltica, uremia y muerte. Tras la absorcin por va
gastrointestinal de cantidades pequeas pero repetidas pueden presentarse nuseas, salivacin, dolor epigstrico,
diarreas, vrtigo, debilidad e ictericia. As, se han observado
vmitos y diarreas por consumo de t con 25ppm de cobre y
se han descrito tambin erupciones cutneas por ingestin
de agua con 7.6ppm de este metal.6,7,8
Los pacientes que presentan dficit de cobre por razones de disminucin en la ingesta o aumento de la prdida
tienen niveles bajos en sangre y muestran una serie de trastornos debidos a la alteracin de las funciones de las cuproenzimas.

Mtodos para la determinacin del cobre

En el siguiente cuadro se mencionarn las principales ventajas y desventajas de los diferentes mtodos que existen para
la determinacin del cobre:
Se han encontrado reportes de datos de niveles sricos
de cobre por el mtodo de espectrofotometra de absorcin
atmica en llama reportados en 1987 en un estudio
epidemiolgico en nios y adolescentes con el objetivo de
observar la relacin de estos niveles con los factores de
riesgo cardiovascular. 1

La determinacin de cobre en suero es importante en el

diagnstico de la enfermedad de Wilson, cuya incidencia se
estima en aproximadamente uno de cada 30,000 nios nacidos y el sndrome de Menkes, ambos errores innatos del
metabolismo del cobre. La cupremia se eleva en los estados
de infeccin, embarazo, leucemia y cnceres, las enfermedades del colgeno (reumatismo articular agudo, artritis
reumatoide), en las infecciones y especialmente en la tuberculosis, la hemacromatosis y el infarto miocrdico, el
hipertiroidismo y la anemia perniciosa.3
Para el diagnstico clnico de estos trastornos
metablicos, as como para la caracterizacin bioqumica de
las metaloprotenas y enzimas, es esencial un mtodo sensible y especfico para la determinacin de cobre. Sin embargo, el anlisis de cobre en suero y otros fluidos biolgicos
presenta ciertos obstculos debido a que el metal se encuentra en cantidades traza. El mtodo de referencia para su
anlisis es la espectrofotometra de absorcin atmica, el
cual requiere de equipo sofisticado, lo que aumenta los costos del anlisis. Adems, pocos laboratorios cuentan con
ese instrumental. De all la necesidad de implementar tcnicas menos costosas para esta determinacin, las cuales deben reunir los estndares de exactitud, simplicidad y conveniencia. Los mtodos espectrofotomtricos son los de eleccin para la determinacin de cobre y se han descrito una
serie de ellos. Sin embargo, un problema con las determinaciones colorimtricas es que muy pocos mtodos tienen alta
sensibilidad o pueden ser aplicados directamente a una muestra sin sufrir interferencias por detergentes, otros iones metlicos o variaciones en la estabilidad o dependencias del
pH. Otras metodologas presentan el inconveniente de utilizar reactivos txicos y difciles de adquirir. 2

Espectrofotometra de absorcin
atmica en flama
Los mtodos de AA estn claramente establecidos y las condiciones estandarizadas y protocolos de trabajo perfectamente establecidas para todos los elementos susceptibles
de ser determinados por AA.
La precisin es buena + 0.5% con 1% de error relativo.
La sensibilidad resulta igualmente buena (permite el anlisis a nivel de trazas).4,5
Los lmites de deteccin son relativamente altos, dado
que solo una porcin pequea de la muestra est presente
en la llama en un instante determinado. A la hora de plantearse la determinacin de un elemento hay que considerar la
longitud de onda (?) y ancho de rendija precisos; la sensibi-

Cuadro 1.
Mtodo
Colorimetra

Ventajas
Costos de determinacin ms bajos.

Espectrofotometra
de absorcin
atmica en flama

Mejor sensibilidad y exactitud a nivel de ppb para la mayor Es un equipo sofisticado, lo que
parte de los elementos (2% de precisin).
aumenta los costos del anlisis.
No sufre interferencias por detergentes, otros iones metlicos, variaciones en la estabilidad o dependencias del pH.

Desventajas
No tienen alta sensibilidad.

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lidad e intervalo de linealidad precisos; tipo de llama a seleccionar y mtodo de mezclado de muestra. El combustible ms
utilizado es acetileno; el aire o el xido nitroso se suelen usar
como oxidantes, ya que el N2 O tiene mayor poder calorfico,
pero tambin ms ruido.
En AA se utiliza tambin un sistema de correccin de
seal de fondo con chopper. Los sistemas de correccin utilizan una lmpara de deuterio adicional o bien hacen uso del
efecto Zeeman.
La espectrofotometra de absorcin atmica por flama es
el mtodo por el cual el elemento se determina mediante un
espectrmetro de absorcin atmica, usado en conjunto con
un sistema de nebulizacin y una fuente de atomizacin. La
fuente de atomizacin es un quemador que utiliza diferentes
mezclas de gases; las ms frecuentes, aire-acetileno y xido
nitroso-acetileno.

DEL PENSAMIENTO

3. Las muestras sanguneas fueron extradas en tubos

con EDTA.
4. Las muestras se centrifugaron a 3600rpm durante 5
minutos y el plasma obtenido se almacen en tubos
ependorf a -2C hasta el momento del anlisis.
B) Desproteinizacin
Pipetear en tubos de centrifuga:
Plasma (MP): 1.0mL.
Soluciones reductora (cido clorhdrico 1N): 1.0mL.
Mezclar y dejar en reposo durante 10 minutos a temperatura entre +15 y +25 C.
Solucin de cido tricloroactico al 20%: 1.0mL.
Mezclar y centrifugar el problema. Pipetear del sobrenadante
claro en tubos de ensaye secos.
Sobrenadante exento de protenas: 2.0mL.
Etiquetar y guardar las muestras en el refrigerador a -5 C.

Materiales y mtodos

Tubos de ensayo con tapones.

Matraces aforados de 100ml.
Centrifugas clnicas (FisherScientific y ClayAdams).
Pipetas serolgicas.
Vasos de precipitado.
Tubos eppendorf.
Matraz aforado de 250Ml y 500Ml.
Matraz volumtrico de 1000mL.
Tubos para muestras sanguneas (EDTA).
Pipetas de transferencia.
Espectrofotmetro de absorcin atmica modalidad Flama
Perkin Elmer Precisely AAnalyst 2000 Atomic Absorption
Spectrometer, con correccin de fondo con lmpara de
deuterio y lmpara de tuxten-iodide. La flama utilizada
fue de aire-acetileno con un flujo de aire de 10Lts por
minuto y 2.5Lts por minuto de acetileno.
Lmpara de ctodo hueco para cobre Hamamadsu trabajando a una intensidad de corriente de 15mA en la lnea
de 324.75nm y con un slipt de 2.7/0.8.
cido clorhdrico 1N (solucin reductora) 37.2%, PM
36.46, J.T. Baker.
cido ntrico 66.1% , PM 63.1 J.T. Baker.
cido tricloroactico al 20%.
Solucin patrn estndar de cobre 100PPM en 2% de
cido ntrico (certificado por el Cenam).
Neutrox Solucin Detergente (Densidad en Kg/L: 1.07;
pH: 7.00).
Agua tridestilada.
Agua des-ionizada (1.3s/cm).
Glicerol al 10%. 99.95%, PM 92.10, J.T. Baker.

A) Toma de muestra y obtencin del plasma

1. Se toma una muestra representativa de 100 alumnos (el
10% de la poblacin estudiantil, la cual es de 850 alumnos
del periodo escolar semestre 2005-01 aproximadamente,
redondeando a 100 muestras).
2. Se aplic una encuesta para evaluar el estado de salud
de las personas participantes en este proyecto.
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C) Preparacin de estndares
Solucin de glicerol al 10% (preparada a partir de 70mL de
glicerol concentrado y agua tridestilada para la obtencin
de la solucin deseada). Esta solucin necesaria para la
elaboracin de los estndares fue utilizada adems como
blanco de reactivo.
Estndares de 1, 2, 4, 6, 8, y 10 ppm preparados a partir
de la solucin patrn estndar de cobre de 100ppm en 2%
de cido ntrico certificado por el Cenam, aforando con
solucin de glicerol al 10%.
D) Lectura de las muestras
1. Se realiz la lectura del blanco y los estndares para la
obtencin de la curva de calibracin.
2. Se llevo a cabo la lectura de las muestras problemas
por duplicado, con un tiempo de lectura de 3 segundos.
Para asegurar la veracidad del las lecturas obtenidas,
se fueron alternando los estndares como si fueran
muestras problemas.
3. Los resultados obtenidos fueron analizados por medio
del programa Minitab, herramienta necesaria para la
elaboracin del estudio estadstico.

Resultados
Curva de calibracin de los estndares
En la siguiente figura se observa la curva de calibracin de
los estndares (estndar certificado por el Cenam para la
determinacin de cobre en plasma que cumple con la
linealidad requerida para una lectura adecuada de las
muestras con un coeficiente de correlacin de 0.9963, valor
indicativo de la confiabilidad del mtodo realizado.

Distribucin de la concentracin de
cobre srico en hombres y mujeres
A continuacin se muestra una grfica de puntos donde se
observan todas las mediciones tomadas y se hace una
comparacin entre hombres y mujeres. Se puede distinguir
3

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DEL PENSAMIENTO

Al realizar el estudio del anlisis estadstico vemos que

no hay diferencia en las concentraciones entre ambos gneros
de la muestra estudiada (P>0.05).
Como se observa en la grfica, el intervalo va de 1.03857
a 1.08656, con un promedio de 1.06254, donde se infiere que
la media de la poblacin de estudiantes de la Facultad de
Ciencias Qumicas se encuentra en estos rangos.
Grfico 1. Curva de calibracin para cobre en ppm.
una media similar donde se identifica una mayor dispersin
en las concentraciones de cobre en las muestras de las
mujeres que en las de los hombres..

Comparacin entre el mtodo

colorimtrico y el mtodo de EAA en
flama
En el cuadro siguiente se hace la comparacin en el grafico
del mtodo colorimtrico (representado por el color azul) y el
mtodo de espectrofotometra de absorcin atmica
modalidad flama (representado por el color rojo) mostrando
valores muy cercanos entre s. Ambos mtodos son similares
para la determinacin de este metal, ya que como se observa
en la grfica, la hiptesis alterna (Ha) es rechazada, por el
valor de P = 0.303. Sin embargo, el mtodo de EAA en flama
presenta una mayor sensibilidad, ya que las cantidades que
este detecta es de ppm, es decir, son mucho ms pequeas
que las utilizadas en el mtodo colorimtrico (mg/dl). Adems,
el mtodo colorimtrico puede sufrir interferencia por
detergentes utilizados, otros iones metlicos y algunos otros
complejos que se puedan formar al momento de la
manipulacin de la muestra, lo que arroja un mayor rango de
error en las lecturas.

Grfico 2. Grfica comparativa.

Grfico 3.
4

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Grfico 4. Comparacin entre el

mtodo colorimtrico y el EAA en flama.

Interpretacin de resultados y
conclusiones
Para la elaboracin de esta investigacin se tom la
poblacin de la Facultad de Ciencias Qumicas de la
UACH. La muestra consider 100 personas,
aproximadamente el 10% de la poblacin total, cantidad
estadsticamente aceptable.
Los estudiantes fueron seleccionados al azar. Sus
edades fluctan entre 18 y 26 aos (49 mujeres y 51
varones). Se les aplic una encuesta: un interrogatorio
para evaluar el estado de salud general y poder llevar de
este modo un mejor control. Posteriormente se les extrajo
una muestra sangunea y se obtuvo nuestro plasma
problema, que se congel a 2C hasta el momento del
anlisis.
En el inicio del estudio de las muestras se
desproteinizaron para lograr la liberacin del cobre unido
a la ceruloplasmina (protena transportadora de cobre),
utilizando como desproteinizador el HNO3 y HCl.
Posteriormente, se elaboraron los estndares para la
curva de calibracin con un estndar de cobre de 100ppm
en 2% de cido ntrico certificado por la Cenam, lo que
arroj un valor agregado a esta investigacin. Asimismo,
para monitorear el proceso, las lecturas se alternaron con
los estndares mencionados como si fueran muestras
problema, aportando una mayor confiabilidad de los
resultados.
Al momento de analizar las muestras por el mtodo
de EAA en horno de grafito, las concentraciones de cobre
obtenidas resultaron ser ms altas de lo esperado; por lo
tanto, se opt por cambiar el mtodo a modalidad flama
ya que este detecta concentraciones ms altas.
Una vez obtenidas las lecturas, se realiz un estudio
estadstico con el programa Minitab 13.2, principal
herramienta para el anlisis de los datos. Mediante el
mtodo de espectrofotometra de absorcin atmica en
flama se determin que los valores normales por este
mtodo oscilan entre 1.038ppm y 1.086ppm.
Posteriormente se compar el mtodo colorimtrico
con el EAA en flama. Los valores reportados en la
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DEL PENSAMIENTO

bibliografa de las concentraciones de cobre por colorimetra

son de 0.7ppm a 1.4ppm. Se realiz el anlisis estadstico
comparativo entre ambas tcnicas y se lleg a la conclusin de
que ambos mtodos resultan similares para la determinacin de
este metal, por el valor de P = 0.303. Sin embargo, el de EAA en
flama presenta una mayor sensibilidad, ya que las cantidades
que este detecta es de ppm; es decir, son mucho ms pequeas
que las utilizadas en el mtodo colorimtrico (mg/dl), adems de
las interferencias por otros agentes utilizados en el manejo de la
tcnica.
En el desarrollo de esta prueba piloto se encontraron otros
mtodos que pueden ser de utilidad en posteriores
investigaciones, como el de tecnologa de la teora de microondas
y la adicin de estndares conocidos.
Considerando que el cobre es un nutriente esencial, se
debera considerar su determinacin de manera ms exacta para
poderlo utilizar como un elemento ms para el diagnstico
diferencial de muchas enfermedades provocadas por la
deficiencia o el exceso de dicho metabolito como se mencion
anteriormente en los antecedentes de esta investigacin.
En el mundo de los elementos huella en particular y el de los
metales en general es un rea del conocimiento en pleno
desarrollo por sus implicaciones sobre la fisiopatologa del
hombre, en gran parte por descubrir.
Es importante el papel que los bioqumicos clnicos
desarrollan no solo para el diagnstico rpido y preciso de la
enfermedad en el individuo, sino tambin en el seguimiento y
control de los distintos factores nutricionales y medioambientales
que condicionan el presente y futuro de la comunidad.

Referencias
1

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