INFORME DE LABORATORIO

BIOLOGIA CELULAR
ESPECTROFOTOMETRIA

AUTORES

PROFESOR

UNIVERSIDAD DE XXX
FACULTAD DE XXX

INSTRUMENTACION QUIRURGICA
AGOSTO DE XXX

TABLA DE CONTENIDO

MARCO TERICO................................................................................................................................ 4
ESPECTROFOTOMETRIA ............................................................................................................. 4
ESPECTRO ...................................................................................................................................... 4
ABSORBANCIA ................................................................................................................................ 4
ABSORBANCIA UV Y VISIBLE .............................................................................................. 4
ABSORBANCIA DE LA RADIACION INFRARROJA ...................................................... 5
TRANSMITANCIA .......................................................................................................................... 6
LEY DE BEER LAMBERT ............................................................................................................. 6
ESPECTROFOTOMETRIA VISIBLE Y UV ........................................................................... 7
ESPECTOMETRIA DE INFRARROJOS ................................................................................ 8
ESPECTROFOTOMETRIA CONVENCIONAL ..................................................................... 9
FICHAS DE BIOSEGURIDAD ....................................................................................................... 10
OBJETIVOS ......................................................................................................................................... 11
MATERIALES, PROCEDIMIENTOS Y METODOLOGAS ................................................... 12
RESULTADOS ..................................................................................................................................... 15
CALCULOS............................................................................................................................................ 19
ANALISIS............................................................................................................................................ 21
CONCLUSIONES ...............................................................................................................................23
BIBLIOGRAFIA ..................................................................................................................................24

MARCO TERICO

ESPECTROFOTOMETRIA

ESPECTRO
En un tomo los electrones se hallan dispuestos alrededor del ncleo en orbitas
de diferente energa; mientras los electrones permanecen en sus orbitas
particulares la energa del tomo permanece constante, pero si un electrn
cambia de orbita, cambia tambin la energa del tomo. La energa de un tomo
cambiara si absorbe o emite radiacin.
A temperaturas normales los tomos de un gas monoatmico se encuentran
mayormente en el estado de mnima energa. Si el gas se calienta fuertemente
o si se hace saltar una descarga elctrica atreves del gas, pueden excitarse
algunos electrones y moverse a orbitas de mayor energa. Estos tomos
excitados no son estables y retornan al estado fundamental emitiendo energa
en forma de radiacin electromagntica.
El espectro de absorcin se observa cuando se pasa a travs de una sustancia
una radiacin de una gama de frecuencias. Se absorben aquellas frecuencias
que son capaces de producir excitacin electrnica.

ABSORBANCIA

ABSORBANCIA UV Y VISIBLE
Proporcionar informacin cualitativa y cuantitativa sobre molculas orgnicas
inorgnicas y bioqumicas. Se puede clasificar en:
Absorcin por los compuestos orgnicos: la absorcin de la radiacin se debe a
dos tipos de electrones: los electrones compartidos por varios tomos y que

participan directamente en los enlaces y los electrones externos no

compartidos, que se localizan principalmente en los tomos de oxigeno,
halogenuros, azufre y nitrgeno. La longitud de onda en que absorbe una
molcula orgnica va a depender de la fuerza con la que se sujeten los
electrones.
Muchas de las molculas que no absorben la radiacin UV pueden reaccionar
con grupos funcionales orgnicos y formar especies que absorben en estas
regiones.
Absorcin por especies inorgnicas: en general absorben bandas amplias de
radiacin visible, por lo menos en uno de sus estados de oxidacin, por
consiguiente son coloreados. La absorcin de la radiacin implica una serie de
transiciones entre los orbitales d llenos y vacios del ion metlico, con energas
que dependen de la naturaleza de los enlazados. El mximo nivel de absorbencia
depender de la ubicacin en la tabla peridica del elemento, y de su estado de
oxidacin.
Absorcin por transferencia de carga: es importante en el anlisis cuantitativo,
ya que las absortividades molares son particularmente grandes y se logra una
alta sensibilidad. Se componen de un grupo donador de electrones enlazados, a
otro que los acepta, al absorber la radiacin se transfiere un electrn del
donador a un orbital que est asociado al aceptor.
En la mayora de los complejos de transferencia de carga, el metal es el que
acta como aceptor del electrn, aunque tambin existen algunos complejos en
los que el metal es el donador.
ABSORBANCIA DE LA RADIACION INFRARROJA
Es una tcnica tambin usada en la qumica analtica, puede dar informacin
acerca de la naturaleza de los compuestos, de la existencia o no de grupos
funcionales y de la estructura de las molculas. Aunque tiene menos
aplicaciones en el anlisis cuantitativo que la absorcin UV o visible.
Con excepcin de las molculas diatmicas mononucleares; todas las molculas
orgnicas e inorgnicas absorben la radiacin infrarroja. La absorcin de la
radiacin infrarroja lleva a una serie de transiciones entre los niveles de
energa de vibracin de los estados energticos electrnicos, con la ms baja

excitacin. La forma en que puede vibrar una molcula est relacionada con el
nmero de sus enlaces y por tanto, con el nmero de tomos que la componen.
TRANSMITANCIA
La transmitancia es la cantidad de energa que atraviesa un cuerpo en
determinada cantidad de tiempo. Existen diferentes clases de transmitancia,
pero nos centraremos en la transmitancia ptica.
Transmitancia ptica: se refiere a la cantidad de luz que atraviesa un cuerpo,
en una determinada longitud de onda. Cuando un haz de luz incide sobre un
cuerpo traslcido, una parte de esa luz es absorbida por el mismo, y otra
fraccin de ese haz de luz atravesar el cuerpo, segn su transmitancia.
Esta cifra puede estar expresada tambin en porcentaje.

LEY DE BEER LAMBERT

Es una relacin emprica, que relaciona, la absorcin de la luz con las
propiedades del material atravesado.
La forma original de esta ecuacin fue la ley de Lambert, que se refiere a la
absorcin de la luz por slidos homogneos. La suposicin que se hace es que
cada incremento igual de solido, a travs del cual pasa la luz, absorbe la misma
fraccin de luz.

Esta frmula tambin se podra explicar de la siguiente manera:

A = k.c.l
La ley de Beer es una modificacin de la ley de Lambert para hacer aplicable a
las soluciones. Beer encontr que al aumentar la concentracin del soluto
absorbente de luz en la disolucin, se obtena el mismo efecto que si hubiera un
aumento proporcional en el espesor absorbente de luz. Un aumento del soluto
en el mismo volumen de solucin aumentara el espesor efectivo de la capa
absorbente de luz en el mismo factor.

La reduccin de intensidad, dl, que se produce cuando la luz atraviesa una capa
de espesor dl que contiene una especie absorbente J a una concentracin molar
J es proporcional al espesor de la capa, a la concentracin de J y a la
intensidad I, incidente de la capa (pues la velocidad de absorcin es
proporcional a la intensidad)
La ley de Beer Lambert implica que la intensidad de la radiacin
electromagntica transmitida a travs de una muestra a un nmero de onda
dado, disminuye en forma exponencial en funcin del espesor de la muestra de
la concentracin molar.
Coeficiente de absorcin o extensin molar: El coeficiente de extensin molar
depende de la frecuencia de la radiacin incidente y es mayor donde la
absorcin es ms intensa. El valor mximo de del coeficiente de absorcin
molar, es un ndice de la intensidad de una transicin. Sin embargo dado que
las bandas de absorcin se esparcen sobre un intervalo de nmeros de onda, la
estimacin del coeficiente de absorcin para un nmero de onda nico no dara
un verdadero ndice de la intensidad de la transicin.
ESPECTROFOTOMETRIA VISIBLE Y UV
La espectroscopia de absorcin molecular en la regin UV y visible tiene su
principal aplicacin en el anlisis cuantitativo y es uno de los mtodos
preferidos en los laboratorios clnicos y qumicos. La radiacin
electromagntica que podemos percibir como luz visible oscila entre 400 y
750 nanmetros. Por debajo de esta cifra est la radiacin UV, y por encima el
infrarrojo. Una absorcin de luz UV (200 400 nm) corresponde a incrementos
de energa de 70 140 Kcal mol; estos valores son intermedios entre las
energas superiores, requeridas para la fotoionizacin de un enlace covalente
simple, y las energas menores precisas para las transiciones vibratorias y
rotatorias. La absorcin de luz en el UV prximo implica el desplazamiento de
electrones mviles.
Cuanto ms mvil sea el sistema de electrones, su desplazamiento ocurrir con
mayor facilidad, y por lo tanto se requiere menos energa para estas
transiciones electrnicas. Es decir los sistemas mviles de electrones
absorbern luz de menor frecuencia y por tanto, de mayor longitud de onda. La

movilidad de los electrones aumenta cuando dos o ms centros no saturados se

conjugan.
El grupo responsable de la absorcin de luz en una molcula se denomina
cromoforo, y aquello grupos que aumentan la movilidad del sistema electrnico,
aunque no absorben por s mismos, se llaman auxocromos.
La conjugacin de un grupo cromoforo con otro, no solo produce un
desplazamiento bato crmico (corrimiento de una banda de absorcin a
longitudes de onda mayores) sino que en general aumenta la absorcin, y,
cuando los grupos cromoforos no se conjugan, su absorcin es aditiva. Cuando
el numero de enlaces dobles conjugados aumenta continua el desplazamiento
bato crmico, hasta que, la absorcin tiene lugar en regin visible del espectro
es decir entre 400 y 750 nm.
Las estructuras absorbentes ms importantes son los compuestos aromticos y
los bencnicos. Aqu la disposicin de los orbitales proporciona un sistema muy
mvil, que con mucha facilidad est influenciado por la presencia de grupos
funcionales ligados al ncleo.
ESPECTOMETRIA DE INFRARROJOS
La radiacin infrarroja usada ms frecuentemente es espectrometra abarca
el intervalo 2 15 u. la energa de dicha radiacin, cuando se absorbe
corresponde a 5 Kcal mol, por lo que es demasiado pequea para promover
trnsitos electrnicos; pero bastante grande para originar las transiciones
vibratorias en el estado fundamental de la molcula. Esto significa que las
curvas de absorcin de infrarrojos son mucho ms especficas que las de las
regiones UV y visibles.
Los tomos de una molcula estn vibrando constantemente con una frecuencia
definida, absorbindose energa radiante de tales frecuencias con cualquier
vibracin que perturbe el equilibrio dipolar de la molcula.
El estudio de las vibraciones por medio de la ley de Hooke supone que el
sistema de enlaces es independiente del resto de la molcula; esto puede ser
cierto para los enlaces en que participa el hidrogeno, o otros tomos
monovalentes, pero no ocurre lo mismo en los enlaces que constituyen el
esqueleto de una molcula compleja. Por esto el espectro de infrarrojo puede
dividirse en dos regiones:

De 7 11 u (1350 900 cm). Esta es la regin de identificacin de huellas

dactilares. Puede utilizarse para caracterizar un compuesto muy especfico.
De 2.5 7 y 11-15 u. en estas regiones pueden reconocerse muchos grupos
funcionales.
Se utiliza sobre todo para anlisis cualitativos, (tiene mayor utilidad cuando se
aplica en un compuesto puro).
Pero tambin se realizan anlisis cuantitativos en el infrarrojo, ya que los
espectros vibratorios obedecen la ley de Beer.
ESPECTROFOTOMETRIA CONVENCIONAL
En los mtodos espectrofotomtricos convencionales, se mide directamente la
absorbancia del analito, o despus de que ha reaccionado con un reactivo y se
forma un producto capaz de absorber la radiacin. Las separaciones previas en
ocasiones ayudan a eliminar las especies que pueden absorber e interferir con
la determinacin espectrofotomtrica del analito.
Tambin es frecuente tratar la muestra con un reactivo selectivo de modo que
en la reaccin se forme una especie que absorba en una regin donde no haya
interferencias. Otras veces se puede separar el producto por extraccin o con
otro mtodo de separacin.

FICHAS DE BIOSEGURIDAD

Naranja de metilo (C14H14N3NaO3S)

Es un colorante azoderivado, con cambio de color de rojo a naranja-amarillo
entre pH 3,1 y 4,4.
Temperatura de Ebullicin: No reportado; temperatura de Fusin: > 300C
Densidad (Agua1):1.0 kg/L a 20C; Presin de Vapor; No reportado; Densidad
de Vapor (Aire1): 11.3.
DL50 (oral-rata): 60 mg/kg.
Causa irritaciones por inhalacin, contacto con la piel y ojos, por ingestin
causa vomito, diarrea y irritaciones en el tracto gastrointestinal.
Las medidas de proteccin que se deben de utilizar son: Guantes, bata (manga
larga) y calzado cerrado. Aunque cabe nombrar que para una mejor proteccin
se recomienda tambin utilizar lentes protectores.
Agua destilada
Agua osmotizada.
No existe ningn riesgo para las personas ni para el medio ambiente.
Para su manejo no se requiere utilizar ninguna indumentaria de proteccin.
Punto. De ebullicin: 100C
Punto. de fusin: 0C
Densidad relativa: 1g/cm3

10

OBJETIVOS

Interactuar con la absorbancia de algunos compuestos.

Alcanzar el punto mximo de absorbancia segn la longitud, de una mezcla

estable.

Adquirir conocimiento de la absorcin de luz en algunos compuestos junto al

manejo del espectrofotmetro.

11

MATERIALES, PROCEDIMIENTOS Y METODOLOGAS

Los materiales utilizados en el laboratorio de espectrofotometra fueron:

Cinco tubos de ensayo para examinar cinco soluciones
de concentraciones distintas, adems de un tubo
adicional que contena una muestra problema que fue
utilizada en la tercera prctica del laboratorio y sus
respectivas etiquetas enumeradas.

Dos pipetas graduadas a mililitros, las cuales

permitan la correcta medicin de soluto y solvente
utilizado dentro de las soluciones trabajadas.

Un pipeteador automtico, que permita la captacin

de la cantidad indicada de soluto o solvente dentro
del proceso del laboratorio.

Un recipiente que contena agua destilada, la cual fue usada

como solvente para la sustancia que se trabaj.

Un recipiente adicional que sirvi como contenedor del

soluto trabajado en el laboratorio, el cual en el caso
particular del presente grupo fue naranja de metilo
(327.34 g/mol) a 100 mg/mL.

Un espectrofotmetro con dos cubetas de cuarzo,

instrumentos principales en el laboratorio de
espectrofotometra, puesto que su utilizacin

12

ayud a la cuantificacin de las sustancias a partir de la longitud de onda con

las que se trabaj.

Procedimientos:
El procedimiento consisti, en primera estancia, en determinar el punto mximo
de absorbancia de la sustancia correspondiente a cada grupo, en el caso
particular del presente grupo de informantes, fue, como antes se mencion, el
naranja de metilo (327.34 g/mol) a 100 mg/mL. Al principio de esta primer
prctica se calibr el espectrofotmetro a cero, con el Blanco (solucin con
todos los componentes de la solucin menos la sustancia trabajada, esto es, sin
el colorante, es decir, agua destilada), con una solucin de 5 mL de agua
destilada y 5 mL de naranja de metilo, luego se procede a hallar las
absorbancias a diferentes longitudes de onda, y como punto mximo de
absorbancia, en el caso particular, se obtuvo, a una longitud de onda de 460
nanmetros, una absorbancia de 0.145.
En segunda estancia, pasamos a elaborar una curva de calibracin del naranja
de metilo en diferentes concentraciones, como acto primordial a esta prctica,
se elaboraron cinco soluciones a diferentes concentraciones, luego, en el
espectrofotmetro, fueron medidas las absorbancias de cada una de ellas,
teniendo en cuenta el punto mximo de absorbancia de la prctica anterior,
entonces, como resultado, se obtuvo una tabla con valores ascendentes, de la
cual derivara una grfica concentracin versus absorbancia con una lnea
ascendente.
Por ltimo, pasamos a determinar la concentracin de una muestra problema, la
cual nos fue asignada por uno de los monitores del laboratorio, entonces,
puesto que de la solucin se desconoca su concentracin, se procedi a
averiguarla por dos medios, uno de ellos era una interpolacin, esto es, una
comparacin en la grfica elaborada a partir de la curva de calibracin. El otro
medio era por una frmula que contiene la absorbancia y la concentracin
estndares, que se tenan identificadas gracias a los puntos anteriores, y la

13

absorbancia y concentracin problemas o desconocidas, de las cuales se poda

conocer la absorbancia y poder despejar la concentracin de manera efectiva.
Metodologa:
La metodologa utilizada fue la de una gua preestablecida y una delimitacin
terica respecto a los procedimientos a trabajar antes de comenzar con la
actividad, una breve presentacin de los monitores y la ejecucin de la prctica
de laboratorio, con la ayuda de los mencionados tutores y el profesor a cargo
del ejercicio, se desarrollaron las prcticas propuestas en funcin de
demostrar y aplicar la ley de Lambert-Beer.

14

RESULTADOS

Determinacin del espectro de absorcin de un colorante dado.

Para

determinar

C14H14N3NaO3S

el

400nm

0.092

420nm

0.118

440nm

0.136

460nm

0.145

480nm

0.130

500nm

0.090

520nm

0.045

540nm

0.013

560nm

0.0

espectro

de

absorcin

se

utiliz

metil-naranja

con una concentracin estndar 100mg/ml

a diferentes

longitudes de onda () y se encontr que a la longitud de onda de 460nm la

sustancia presenta la mxima Absorbancia ya que como se muestra en la tabla
tenemos valores inferiores de (A) con longitudes de onda mayores o menores.

15

0.16
0.14
0.12

0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0

200

400

600

Curva de calibracin del colorante asignado. La sustancia antes de los 460nm la

cantidad de energa radiante o flujo radiante que es absorbido como funcin
de la longitud de onda de dicha energa presenta una Absorbancia menor y
despus de los 460nm la Absorbancia vuelve a caer

Tubo N
SLN Colorante
Agua Destilada
Absorbancia

1
1ml
9ml
0,025

2
2ml
8ml
0,052

16

3
3ml
7ml
0,080

4
4ml
6ml
0,122

5
5ml
5ml
O,145

Ubicamos la () en 460nm que es la mxima Absorbancia y variamos la

concentracin en cinco tubos como podemos ver en la tabla. Para obtener la
siguiente curva.
A
0.2
0.18
0.16
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0

0,03

0.06

0,15
Concentracin (M)

Determinacin de la concentracin de la muestra problema.

17

0,09

0,12

Se entrega una muestra problema de metil naranja a la que se le mide la

Absorbancia esta es: 0,134 medida tambin con una longitud de onda de 460nm
al igual que la muestra estndar que utilizamos con una Absorbancia 0,145 y
con una concentracin conocida y calculada de 0,15M.

Utilizando la ecuacin que relaciona Absorbancia y concentracin se calculo una

concentracin de la muestra problema de 0,138M.

Extrapolando en la curva de calibracin:

0,01 0,03

0.06 0,09 0,12 0,15

Concentracin (M)
La extrapolacin arroja un dato alejado al clculo de: 0,0125

18

CALCULOS

Para los clculos en la curva de Absorbancia se requiri hallar la concentracin

en Molaridad:
1)

1mol de metil naranja -------------x-----------327,34g

0,0003moles

2)

<----------------------- O,1g } 100mg/mltubo 1

1mol de metil naranja ------------x-----------0,0006moles -------------------------------0,2g} tubo 2

3)

1mol de metil naranja ------------x-----------0,0009moles -------------------------------0,3g} tubo 3

4)

1mol de metil naranja ------------x-----------0,0012moles ---------------------------------0,4g } tubo 4

5)

1mol de metil naranja ------------x-----------0,0015moles--------------------------------0,5g } tubo 5

0,0003 moles
1)

M=-------------------= 0,03

0,0006moles
2)

M=--------------------------=0,06

0,01l

0,01l

0,0009moles

0,0012moles

3) M=-----------------------= 0,09

4) M= -----------------------=0,12

0,01l

0,01l

19

0,0015moles
4) M=----------------------------=0,15
0,01l

20

[?] de metil naranja

= 460nm
A=0,134
Aplicando la ecuacin: Ae/Ce=Ap/Cp
Ae= 0,145= Absorbancia estndar.
Ap= 0,134 Absorbancia problema.

Ce= 0,15 concentracin del estndar.

Cp=concentracin del problema.

Ae/Ce=Ap/Cp

0,145

0,134

---------------= -----------------0,15M

0,134 . 0,15M
X=------------------------= 0,138
0,145

21

ANALISIS

El espectro de absorcin del colorante asignado muestra una creciente al

comenzar porque la concentracin es muy parecida a la del blanco, entonces
comienza a separarse poco a poco del rango inicial y alcanza su punto mximo
de absorbancia, para as, entonces, permitir asegurar que la concentracin es la
que juega el papel ms importante dentro de la solucin, puesto que si tiene
muy poca, va a ser una absorbancia baja, porque se absorben aquellas
frecuencias que son capaces de producir excitacin electrnica, pero luego
desciende debido a que ya no existe un equilibrio en la solucin que le permita
al colorante absorber la intensidad incidente optimizando la transmitancia
mucho ms que la absorbancia.
La absorbancia es directamente proporcional a la concentracin, por tanto,
siempre que la concentracin de colorante se aumente, la absorbancia aumenta
tambin.
Toda vez que exista una grfica interpolable, ser posible, por medios grficos
determinar la concentracin de las sustancias problema pero debido a que es
un medio grfico, arroja un margen de error considerable, adems, el
espectrofotmetro presenta falencias para determinar la absorbancia.

22

CONCLUSIONES

La absorbancia es la capacidad que tiene algunos compuestos para absorber la

radiacin electromagntica, pudimos observar cmo, dependiendo de la
concentracin y la longitud a la cual se le aplique un rayo, puede alcanzar un
punto mximo de absorcin.
Segn esto la longitud y la absorbancia son proporcionales hasta alcanzar el
punto mximo y de all empieza a descender.
Segn la concentracin varia la absorbancia del compuesto.
Variando la cantidad de solvente (Siendo agua destilada) se puede disminuir la
absorbancia.

23

BIBLIOGRAFIA

BARNARD, J.A. y CHAYEN, R. Mtodos modernos de anlisis qumico, capitulo

3 (pg. 57, 62, 68, 69, 70, 75) Espaa, 1970, ediciones urmo
ATKINS, P. Qumica fsica, capitulo 13 (pg. 432 434) China, 2008, Editorial
panamericana.
DOUGLAS, A. Qumica analtica, capitulo 23 (pg. 614 620) 3ra edicin,
Mxico, 2005, international Thompson editores S.A

24