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Ministre de la Sant

et de la Prvention Mdicale

RNL

SN

Rpublique
du
Sngal

Rseau National de
Laboratoires du Sngal

MANUEL DE PROCEDURES DES


TECHNIQUES DE LABORATOIRES
DANALYSES MEDICALES

1re Edition
Rdaction : Janvier 2004
Rvision : Novembre 2008

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 1)

REPUBLIQUE DU SENEGAL
MINISTERE DE LA SANTE ET DE LA PREVENTION
RESEAU NATIONAL DE LABORATOIRES

MANUEL DE PROCEDURES DES


TECHNIQUES DE LABORATOIRES
DANALYSES MEDICALES

1re Edition
Rdaction : Janvier 2004
Rvision : Novembre 2008

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 2)

REPUBLIQUE DU SENEGAL
MINISTERE DE LA1 SANTE ET DE LA PREVENTION
RESEAU NATIONAL DE LABORATOIRES

MANUEL DE PROCEDURES TECNIQUES


DE LABORATOIRES DANALYSES MEDICALES
Coordonnateur :
Professeur Ahmad Iyane Sow,
Coordonnateur du Rseau National de Laboratoires
Equipe de Rdaction :
Pr. Moussa Fafa Ciss :
Mdecin-Chef des Laboratoires, CHNU Albert Royer
Pr. Jean Marie Dangou :
Laboratoire dAnatomie Pathologique, FMPOS
Dr. Abdoulaye Sga Diallo :
Laboratoire de Cyto-Gntique, FMPOS
Pr. Assatou Gaye Diallo :
Laboratoire de Bactriologie, CHNU Le Dantec
Dr. Ousmane Diop :
Laboratoire de Virologie, Institut Pasteur de Dakar
Pr. Saliou Diop :
Centre National de Transfusion, Service dHmatologie
Pr. Ymou Dieng :
Laboratoire de Parasitologie, CHNU de Fann
Dr. Roughyatou Ka :
laboratoire de Bactriologie, CHNU de Fann
Dr. Abibatou Sall :
Laboratoire de Biologie, CHNU A. Le Dantec
Pr. Niama Diop Sall :
Laboratoire de Biochimie CHNU A. Le Dantec
Ont particip latelier de validation :
Saliou T all (CNTS)
Adama Coly (CHU de Fann)
Dr Khadidiatou Sye Guye (CHR Kaolack)
Dr Jeanne Guye Sarr (DPL)
Dr Ibrahima Ndir (Centre de Sant Baudoin)
Dr Abba Sow (Rgion Mdicale de Fatick)
Dr Rokhaya Diagne (CHU de Fann)
Dr Mariane Ciss (Labo Rgional Kaolack)
Dr Oumar Kant (CHR Ziguinchor)
Magatte Sy Gaye (CHU de Fann)
Binta Gassama Gaye (CHU de Fann)
Mamour Faye (CHR Tambacounda)
Dr Roughyatou Ka (CHU de Fann)
Dr Awa Ndour Seck (CHR de Louga)
Dr Marime Kane (CHR de This)
Dr Lam Toro M. Seck (CHR Ourossogui)
Samba Ngom (Labo SLAP This)
Benot Chevalier (Hpital Principal)
Thierno Samb (CHU de Fann)
Pr Jean Marie Dangou (Fac. Mdecine)
Pr Omar Faye (Fac. Mdecine)
Dr Moctar Dieng (CHU Le Dantec)

Dr El H. Mokhtar Mboup (CHR Kolda)


Hawa Thioube (CHU Le Dantec)
Dr Mamadou Ngom (OMS, Dakar)
Ndye Adjaratou M. Diop (CS Ouakam)
Farma Thiam (CHU de Fann)
Pr Moussa Fafa Ciss (CHU Albert Royer)
Abdou Guye (Centre de Sant de Rufisque)
Bousso Fall (CHU de Fann)
Dr Arame Diop (CS Garpard Kamara)
Pr Iyane Sow (RNL)
Dr Aminata Tour (HOGGY)
Dr Oumou Barry Kane (Direction de la Sant)
Dr Fatou Diallo (CHU Le Dantec)
Dr Acha M. Sarr (CHU Le Dantec)
Aly Fall (Centre de Sant Sicap Mbao)
Pr Omar Ndir (Fac. Mdecine, Pharmacie)
Dr Aliou Thiam (Labo Rgional ST-Louis)
Pr Ymou Dieng (CHU de Fann)
Dr Ousmane M. Diop (Institut Pasteur)
Dr Katy Ndong Ndiaye (CHR Diourbel)
Dr Oumarou Foly Diallo (CHR ST-Louis)
RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 3)

AVANT PROPOS
La mise en place dun manuel de procdures techniques constitue un
besoin qui sest fait sentir trs tt au sein du Rseau National de Laboratoires,
dune part pour renforcer les capacits des techniciens des laboratoires
danalyses mdicales, dautre part pour rpondre un souci dharmonisation
des techniques utilises dans ces laboratoires. Par ailleurs, ce manuel vient
accompagner la mise en place de la dmarche qualit dans nos laboratoires et
constitue un outil de paillasse pour que chaque analyse soit effectue de la
mme manire partout au Sngal.
Le Rseau National de Laboratoires du Sngal est n avec la stratgie
dintgration prne par lOMS, ce qui justifie la multidisciplinarit de ce
document. Seules les techniques danalyses biochimiques manquent encore du
fait de leur diversit ; nous esprons pouvoir procder au meilleur choix lors
de la prochaine rvision. Cest pour nous loccasion de remercier
chaleureusement tous les collgues des diffrentes disciplines biologiques qui
nont mnag aucun effort pour rdiger cet ouvrage, ainsi que ceux qui ont
procd sa correction et tous les participants latelier de validation.
Le prsent manuel de procdures comprend trois parties :
Le paquet minimum dactivits par niveau que chaque laboratoire doit
tre en mesure de raliser,
Lquipement minimal ncessaire pour la ralisation de ce paquet
minimum dactivits,
Les procdures techniques par analyse.
Le manuel de procdures est un outil commun que le Rseau National de
Laboratoires met la disposition de tous les laboratoires. Son utilisation est
indispensable pour atteindre lobjectif dharmonisation des techniques ; cest
pourquoi le Rseau National de Laboratoires en appelle la vigilance de tous
les biologistes chefs de laboratoires et de tous les personnels de laboratoires.
Nous attendons un retour de linformation la pratique pour amliorer
en continu ce document. Les suggestions des utilisateurs sont galement les
bienvenues pour la rvision du manuel.
Professeur Ahmad Iyane Sow
Coordonnateur du RNL du Sngal
RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 4)

Sommaire
Chapitre 1 : Paquet minimum dactivits :
1.1 Laboratoire de niveau priphrique :
Pour les maladies potentiel pidmique
En Hmatologie
En Parasitologie
En Bactriologie
En Biochimie
En Anatomie et Cytologie Pathologiques
1.2. Laboratoire de niveau intermdiaire :
Pour les maladies potentiel pidmique
En Hmatologie
En Parasitologie
En Bactriologie
En Biochimie
En Anatomie et Cytologie Pathologiques
1.3. Laboratoire de niveau National :
Pour les maladies potentiel pidmique
En Hmatologie
En Parasitologie
En Bactriologie
En Biochimie
En Anatomie et Cytologie Pathologiques

P. 2
P. 3
P. 3
P. 3
P. 4
P. 4
P. 4
P. 5
P. 5
P. 5
P. 6
P. 6
P. 7
P. 7
P. 8
P. 8
P. 8
P. 9
P. 9
P. 10
P. 11

Chapitre 2 : Equipements et matriels ncessaires : P. 12


2.1. Laboratoire de niveau priphrique

P. 13

2.2. Laboratoire de niveau intermdiaire

P. 14

2.3. Laboratoire de niveau National

P. 15

Chapitre 3 : Procdures techniques et ractifs :


3.1. Pour les maladies potentiel pidmique
3.2. En Hmatologie
3.3. En Parasitologie
3.4. En Bactriologie
3.5. Antibiogramme
3.6. En Anatomie et Cytologie Pathologiques

P. 17
P. 18
P. 24
P. 58
P. 69
P. 84
P. 95

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 5)

Chapitre 1

PAQUET MINIMUM
DACTIVITES PAR NIVEAU

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 6)

1.1. Laboratoire de niveau priphrique :


1.1.1. Pour les maladies potentiel pidmique :
Cholra :
Examen macroscopique
Examen microscopique
Ensemencement de milieu de transport (EPHA, Cary Blair)
Mningite crbro-spinale :
Examen macroscopique
Examen microscopique
Recherche dantignes solubles (agglutination au latex)
Ensemencement de milieu de transport (Trans-Isolate, )
Shigellose :
Examen macroscopique
Examen microscopique
Ensemencement de milieu de transport (Cary Blair)
Fivre jaune et autres fivres hmorragiques :
Conditionnement des chantillons prlevs
Acheminement au Laboratoire National de Rfrence

1.1.2. En Hmatologie
Hmogramme
Vitesse de sdimentation
Test dEmmel
Taux des rticulocytes
Temps de saignement
Temps de Quick (Taux de prothrombine et INR)
Temps de cphaline active (TCA)
Dosage du fibrinogne
Groupage sanguin dans les systmes ABO et Rhsus

1.1.3. En Parasitologie
Dans le sang :
Recherche directe dhmatozoaires : goutte paisse et frottis sanguin
Recherche indirecte dhmatozoaires : Test dimmunochromatographie ICT, Optimal, Paracheck
etc
Recherche directe de Trypanosomes et de microfilaires
Dans les urines
Recherche directe de Schistosoma haematobium, de Trichomonas vaginalis,
de microfilaires, de levures.
Dans les selles :
Recherche des kystes, amibes, ufs et parasites par un examen direct
Identification macroscopique de vers intestinaux
Dans le LCR :
Recherche de cryptocoque lencre de chine.

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 7)

1.1.4. En Bactriologie
Dans les urines :
Examen macroscopique
Examen microscopique
Dans le pus :
Examen macroscopique
Examen microscopique
Dans les scrtions broncho-pulmonaires :
Examen macroscopique
Examen microscopique
Dans les scrtions ORL :
Examen macroscopique
Examen microscopique
Scrtions gnitales (voir manuel du programme de lutte contre les IST)
Examen macroscopique
Examen microscopique

1.1.5. En Biochimie
Dans le sang :
- Glycmie
- Azotmie
- Cholestrol total
- Cratininmie
- Ionogramme (Na, K, Cl)
- Protidmie
- Albuminmie
- Bilirubinmie
- Transaminases (ASAT, ALAT)
Dans les urines :
- Albumine
- Sucre
- Corps ctoniques

1.1.6. En Anatomie et Cytologie Pathologiques


Frottis cervico-vaginal de dpistage
Liquides biologiques
Ponction laiguille fine de masses palpables
Biopsies et pices opratoires (si le Centre de sant est dot dun bloc opratoire)

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 8)

1.2. Laboratoire de niveau intermdiaire :


1.2.1. Pour les maladies potentiel pidmique
Cholra :
Examen macroscopique
Examen microscopique
Isolement et Identification
Antibiogramme
Acheminement des souches au Laboratoire National de Rfrence
Mningite crbro-spinale :
Examen macroscopique
Examen microscopique
Recherche dantignes solubles (agglutination au latex)
Isolement et Identification
Antibiogramme
Acheminement des souches au Laboratoire National de Rfrence
Shigellose :
Examen macroscopique
Examen microscopique
Isolement et Identification
Antibiogramme
Acheminement des souches au Laboratoire National de Rfrence
Fivre jaune et autres fivres hmorragiques :
Conditionnement des chantillons prlevs
Acheminement au Laboratoire National de Rfrence

1.2.2. En Hmatologie
Hmogramme
Vitesse de sdimentation
Test dEmmel
Taux des rticulocytes
Temps de saignement
Temps de Quick (Taux de prothrombine et INR)
Temps de cphaline active (TCA)
Dosage du fibrinogne
Dosage des PDF
Dosage du D-Dimre
Groupage sanguin dans les systmes ABO et Rhsus
Recherche de lantigne D faible
Test de Coombs direct
Test de Coombs indirect
Test de compatibilit au laboratoire entre poche de sang et receveur
Dpistage et identification des agglutinines irrgulires

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 9)

1.2.3. En Parasitologie
Dans le sang :
Recherche directe dhmatozoaires : goutte paisse et frottis sanguin
Recherche indirecte dhmatozoaires : Test dimmunochromatographie: ICT, Optimal, Paracheck
etc
Recherche directe de Trypanosomes et de microfilaires
Recherche des parasites sanguicoles par des techniques de concentration : leucoconcentration
la saponine (microfilaires), triple centrifugation (trypanosomes)
Dtermination de la parasitmie.
Dans les urines
Recherche directe de Schistosoma haematobium, de Trichomonas vaginalis,
de microfilaires, de levures.
Dtermination de la charge parasitaire
Dans les selles :
Recherche des kystes, amibes, ufs et parasites par un examen direct
Identification macroscopique de vers intestinaux
Recherche des kystes et ufs aprs une technique de concentration
Recherche spciale dufs doxyure et de taenia
Dans le LCR :
Recherche de cryptocoque lencre de chine.

1.2.4. En Bactriologie
Urines :
Examen macroscopique
Examen microscopique
Dnombrement des germes urinaires
Identification
Antibiogramme
Pus :
Examen macroscopique
Examen microscopique
Isolement, identification
Antibiogramme
Scrtions broncho-pulmonaires :
Examen macroscopique
Examen microscopique
Isolement, identification
Antibiogramme
Scrtions ORL :
Examen macroscopique
Examen microscopique
Isolement, identification
Antibiogramme

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 10)

Scrtions gnitales (voir manuel du programme de lutte contre les IST)


Examen macroscopique
Examen microscopique
Isolement, identification
Antibiogramme
Sang : Hmoculture
Srologies :
Srodiagnostic de Widal et Flix
Srodiagnostic des streptococcies : ASLO, ASDOR-B
Srologie syphilitique (voir manuel du programme de lutte contre les IST)
Srodiagnostic des infections VIH (voir manuel du programme VIH)

1.2.5. En Biochimie
Dans le sang :
- Glycmie
- Azotmie
- Cholestrol total
- Cholestrol HDL
- Triglycrides
- Cratininmie
- Ionogramme (Na, K, Cl)
- Protidmie
- Bilirubinmie
- Transaminases (ASAT, ALAT)
- Amylasmie
- Calcmie
- Magnsmie
- Phosphormie
- Phosphatases alcalines
- Fer srique
- Electrophorse des protines
- Electrophorse de lhmoglobine
Dans les urines :
- Albumine
- Sucre
- Corps ctoniques

1.2.6. En Anatomie et Cytologie Pathologiques


Frottis cervico-vaginal de dpistage
Liquides biologiques
Ponction laiguille fine de masses palpables
Biopsies et pices opratoires
Procdures de coloration des Frottis cervico-vaginaux :
Coloration de Papanicolaou
Coloration de Harris Shorr
Screening des Frottis cervico-vaginaux
RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 11)

1.3. Laboratoire de niveau National :


1.3.1. Pour les maladies potentiel pidmique
Cholra :
Examen macroscopique
Examen microscopique
Isolement et Identification
Antibiogramme
Acheminement des souches au Laboratoire National de Rfrence
Mningite crbro-spinale :
Examen macroscopique
Examen microscopique
Recherche dantignes solubles (agglutination au latex)
Isolement et Identification
Antibiogramme
Acheminement des souches au Laboratoire National de Rfrence
Shigellose :
Examen macroscopique
Examen microscopique
Isolement et Identification
Antibiogramme
Acheminement des souches au Laboratoire National de Rfrence

1.3.2. En Hmatologie
Hmogramme (NFS)
Vitesse de sdimentation
Test dEmmel
Taux des rticulocytes
Electrophorse de lhmoglobine
Dosage de lHb F
Dosage de lHb A2
Adnogramme
Mylogramme
Temps de saignement
Temps de Quick (Taux de prothrombine et INR)
Temps de cphaline active (TCA)
Temps de thrombine
Dosage du fibrinogne
Dosage des D-Dimre
Dosage des facteurs de la coagulation
Dosage du facteur Willebrand
Dosage des protines S, C et de lantithrombine
Dtermination des anticorps anti phospholipides (LA et APA)
Groupage sanguin dans les systmes ABO et Rhsus
Recherche de lantigne D faible
Phnotypage tendu
Test de Coombs direct
Test de Coombs indirect
Test de compatibilit au laboratoire entre poche de sang et receveur
Dpistage et identification des agglutinines irrgulires
RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 12)

1.3.3. En Parasitologie
Dans le sang :
Recherche directe dhmatozoaires : goutte paisse et frottis sanguin
Recherche indirecte dhmatozoaires : Test dimmunochromatographie : ICT, Optimal, Paracheck
etc
Recherche directe de Trypanosomes et de microfilaires
Recherche des parasites sanguicoles par des techniques de concentration : leucoconcentration
la saponine (microfilaires), triple centrifugation (trypanosomes)
Dtermination de la parasitmie.
Identification des microfilaires
Srologie parasitaire et mycologique
Recherche et culture de Leishmanies
Dans les urines :
Recherche directe de Schistosoma haematobium, de Trichomonas vaginalis,
de microfilaires, de levures.
Dtermination de la charge parasitaire
Test dclosion des ufs de schistosomes
Dans les selles :
Recherche des kystes, amibes, ufs et parasites par un examen direct
Identification macroscopique de vers intestinaux
Recherche des kystes et ufs aprs une technique de concentration
Recherche spciale dufs doxyure et de taenia
Recherche spciale des larves danguillule
Recherche des Cryptosporidies
Recherche des Microsporidies
Recherche dIsospora belli, de Cyclospora
Dans le LCR :
Recherche de cryptocoque lencre de chine.
Prlvements divers
Recherche de parasites.
Recherche de champignon par examen direct, culture et antifongigramme.
Recherche de Pneumocystis carinii

1.3.4. En Bactriologie
Urines :
Examen macroscopique
Examen microscopique
Dnombrement des germes urinaires
Identification
Antibiogramme
Pus :
Examen macroscopique
Examen microscopique
Isolement, identification
Antibiogramme

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 13)

Scrtions broncho-pulmonaires :
Examen macroscopique
Examen microscopique
Isolement, identification
Antibiogramme
Scrtions ORL :
Examen macroscopique
Examen microscopique
Isolement, identification
Antibiogramme
Scrtions gnitales (voir manuel du programme de lutte contre les IST)
Examen macroscopique
Examen microscopique
Isolement, identification
Antibiogramme
Sang : Hmoculture
Srologies :
Srodiagnostic de Widal et Flix
Srodiagnostic des streptococcies : ASLO, ASDOR-B
Srologie syphilitique (voir manuel du programme de lutte contre les IST)
Srodiagnostic des infections VIH (voir manuel du programme VIH)
Antibiogramme

1.3.5. En Biochimie
Dans le sang :
- Glycmie
- Azotmie
- Cratininmie
- Cholestrol total
- Cholestrol HDL
- Triglycrides
- Ionogramme (Na, K, Cl)
- Gaz du sang (pH, PaCO2, PaO2, HCO3)
- Protidmie
- Bilirubinmie
- Transaminases (ASAT, ALAT)
- Phosphatases alcalines
- Gamma GT
- Amylasmie
- Calcmie
- Magnsmie
- Phosphormie
- Fer srique
- Ferritine
- Transferrine
RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 14)

Electrophorse des protines


Electrophorse de lhmoglobine
Hormones Thyrodiennes (T3, T4, TSH)
Fertilit (FSH, LH, Prolactine)
Hormones sexuelles (Testostrone, Oestradiol, Progestrone)
Marqueurs tumoraux (PSA, CA 125, CA 15-3)

Dans les urines :


- Albumine
- Sucre
- Corps ctoniques
- Densit
- pH

1.3.6. En Anatomie et Cytologie Pathologiques


Frottis cervico-vaginal de dpistage
Liquides biologiques
Ponction laiguille fine de masses palpables
Biopsies et pices opratoires
Procdures de coloration des Frottis cervico-vaginaux
Coloration de Papanicolaou
Coloration de Harris Shorr
Screening des Frottis cervico-vaginaux

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 15)

Chapitre 2
EQUIPEMENTS ET MATERIELS
NECESSAIRES PAR NIVEAU

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 16)

2.1. Laboratoire de niveau priphrique : centres de sant des Districts

Equipement / Matriel
Agitateur type vortex

Quantit minimale
1

Appareil semi automatique dhmostase


Armoire rfrigre type banque de sang
Automate de numration et approche de formule sanguine
Bac de coloration

1
1
1
2

Balance portable (porte 5000 g)


Bain marie thermostat
Bec Bunsen

1
1
2

Centrifugeuse de paillasse
Dminralisateur

1
1

Distillateur deau
Egouttoir
Glacire et accumulateurs de froid
Microscopes optiques

1
2
2
2

Micropipettes volume variable 0 1000 l


Minuterie
Rfrigrateur avec conglateur
Spectrophotomtre UV-VIS

2 de chaque
2
1
1

Cet quipement est complter par le matriel consommable et les ractifs

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 17)

2.2. Laboratoire de niveau rgional : Hpitaux rgionaux, labo rgionaux


Equipement / Matriel
Agitateur de plaques
Agitateur type vortex
Agitateur magntique
Appareil semi automatique dhmostase
Armoire rfrigre type banque de sang
Autoclave vertical (150 litres ou plus)
Automate de numration et approche de formule sanguine
Automate de biochimie environ 100 tests/heure
Bac de coloration
Balance portable (porte 5000 g)
Bain marie thermostat
Bec Bunsen
Centrifugeuse de paillasse
Centrifugeuse sur pied
Centrifugeuse rfrigre
Chane Elisa (Laveur + incubateur + lecteur)
Chane dlectrophorse
Dminralisateur
Densitomtre
Dispositif complet dlectrophorse
Distillateur deau
Etuves bactriologiques
Glacire et accumulateurs de froid
Micropipettes volume variable 0 1000 l
Microscopes optiques
Minuterie
Rfrigrateur avec conglateur
Rotateur
Spectrophotomtre
Spectrophotomtre UV-VIS

Quantit minimale
1
2
1
1
1
1
1
1
2
1
1
4
2
1
1
1
1
1
1
1
1
2
4
2 de chaque
3
2
3
1
1
2

Cet quipement est complter par le matriel consommable et les ractifs

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 18)

2.3. Laboratoire de niveau national : Hpitaux nationaux, laboratoires de


rfrence des programmes de lutte contre les maladies prioritaires
Equipement / Matriel
Quantit minimale
Agitateur de plaques
1
Agitateur type vortex
2
Agitateur magntique
2
Armoires de rangements de lames et de blocs
2
Automate dhmostase
1
Automate denrobage la paraffine
1
Automate de dshydratation
1
Automate de coloration
1
Armoire rfrigre type banque de sang
1
Autoclave vertical (150 litres ou plus)
1
Automate dhmatologie en formule complte
1
Automates de numration et approche de formule sanguine
1
Automate de biochimie environ 150 tests/heure
1
Bac de coloration
2
Bain marie thermostat
1
Balance portable (porte 5000 g)
1
Bec Bunsen
4
Bouteille de transport dazote liquide
2
Centrifugeuse de paillasse
2
Centrifugeuse rfrigre
1
Centrifugeuse sur pied
2
Chane Elisa (Laveur + incubateur + lecteur)
1
Chane dlectrophorse
1
Conglateur -80C
1
Cryomicrotome
1
Cytocentrifugeuse
1
Dminralisateur
1
Densitomtre
1
Dispositif complet dlectrophorse
1
Distillateur deau
1
Etuves bactriologiques
2
Four micro-ondes
1
Gazomtre
1
Glacire et accumulateurs de froid
4
Incinrateur (accessibilit)
Micropipettes volume variable 0 1000 l
2 de chaque
Microscopes optiques
4
Microscopes de recherche
1
Microscope observateurs multiples
1
Microtome
2
RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 19)

Minuterie
Platine chauffante
Photomicroscope
Rfrigrateur avec conglateur
Rotateur
Spectrophotomtre
Spectrophotomtre UV-VIS

2
1
1
3
2
1
2

Trocarts de Mallarm pour mylogramme

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 20)

Chapitre 3
PROCEDURES TECHNIQUES

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 21)

3.1. MALADIES A POTENTIEL EPIDEMIQUE


3.1.1. Cholra :
Prlvement
En cas de suspicion de cholra, les selles sont prleves chez le patient conscient, dans un pot propre
hermtiquement ferm.
Chez le malade fatigu ou avec des troubles de la conscience, un couvillonnage rectal est effectu.

Pot de coproculture
Transport
Le prlvement est immdiatement achemin au laboratoire ; si le transport est diffr, les selles doivent
tre ensemences dans un milieu Cary Blair.
a) Examen macroscopique :
Lexamen macroscopique apprcie lil nu laspect des selles qui, dans les cas typiques, sont liquidiennes,
ressemblant de leau de riz.
Dautres aspects sont cependant possibles.
b) Examen microscopique :
Il sagit surtout dun examen ltat frais (une goutte de selles entre lame et lamelle observe lobjectif x
40) pour rechercher essentiellement une mobilit suspecte des bactries, savoir des bacilles trs mobiles
grce une ciliature polaire, compars des toiles filantes.
Une coloration de Gram peut tre effectue : les vibrions se prsentent alors sous forme de bacilles
Gram ngatif incurvs (en virgule).

Aspect en virgule des vibrions aprs coloration de Gram


RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 22)

NB : Les laboratoires priphriques qui ne peuvent pas procder la culture :


- rendent les rsultats obtenus aux deux premires tapes (examens macroscopique et microscopique)
- ensemencent un milieu de transport (Cary Blair) qui sera envoy au laboratoire rgional ou national
le plus proche.

Milieu de Cary Blair (glose semi solide)


c) Isolement :
La culture des selles la recherche de Vibrio cholerae est effectue sur deux sortes de milieux :
/ Le milieu denrichissement qui est un bouillon permettant une culture abondante et rapide des vibrions :
lEau Peptone Hypersale Alcaline (EPHA) est utilise en gnral. Aprs ensemencement, ce milieu est
incub 37C pendant 4 h puis repiqu sur milieu disolement.
/ Les milieux disolement, qui peuvent tre slectifs ou non, permettent dobtenir des colonies caractristiques :
- Sur glose nutritive alcaline (GNA), les colonies de vibrions sont de taille moyenne, surface
lisse, transparentes, avec des contours rguliers.
- Sur glose TCBS (Thiosulfate, Citrate, Bile, Saccharose), les colonies sont moyennes grosses,
lisses, contours rguliers, de couleur jaune du fait de la fermentation du saccharose.

Aspect des colonies de V. cholerae sur GNA ( droite) et sur TCBS ( gauche)

d) Identification
Lidentification est ralise en deux tapes sur les colonies suspectes aprs vrification de leur morphologie
et de leur mobilit lexamen microscopique (bacilles trs mobiles par ciliature polaire, Gram ngatif
incurvs) :
RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 23)

/ Identification biochimique dabord qui est effectue grce :


- au test loxydase qui est positif
- lensemencement dune galerie didentification minimale (Kligler-Hajna, Mannitol-Mobilit, Citrate
de Simmons, Ure-Indole, Eau peptone sans indole, Eau peptone nitrate).
Les principaux caractres biochimiques de Vibrio cholerae sont les suivants : Glucose (+) ferment sans
gaz, Lactose (-) ou lent avec test lONPG (+), SH2 (-), urase (-), indole (+), nitrate rductase (+),
catalase (+), oxydase (+). La classique sensibilit au compos O/129 nest plus un test spcifique cause
de la circulation de plus en plus frquente, de souches rsistantes.
/ Identification immunologique par agglutination sur lame grce un test au latex pour dterminer
le srogroupe et le srotype. Les srogroupes O1 et O139 sont responsables dpidmies ; le srogroupe
O1 compte trois srotypes : Ogawa, Inaba et Hikojima.

Test dagglutination sur lame pour le srogroupage


(positif gauche, ngatif droite) [Source : A. Dodin]
NB : En cas dpidmie, une dmarche plus rapide (ci-dessous dcrite) est adopte et lorsque
lpidmie est confirme les analyses de selles sont ralises chez 1 malade sur 10.
-

Aprs les examens macroscopique et microscopique, un milieu denrichissement est ensemenc


et incub pendant 3 heures.
Le 1er tube est repiqu sur un 2e contenant de lEPHA et risol paralllement sur milieux disolement
(GNA, TCBS).
Au bout de trois autres heures, la mme opration est rpte partir du 2e tube dEPHA.
- Aprs 16 18 heures, les tests suivants sont raliss sur colonies suspectes isoles sur GNA : examen
microscopique, test loxydase et tests dagglutinations.
NB : dfaut de GNA, on peut utiliser la glose Mueller Hinton
le test dagglutination ne doit pas tre effectu sur les colonies de TCBS
d) Antibiogramme :
Il est ralis sur glose Mueller Hinton (MH) selon la technique dcrite plus loin.
Les antibiotiques suivants doivent tre tests pour les besoins de la surveillance comme du traitement :
amoxicilline, ttracycline, doxycycline, chloramphnicol, cotrimoxazole, furazolidone, rythromycine,
norfloxacine.
e) Acheminement des souches au Laboratoire National de Rfrence :
Les souches identifies et isoles en culture pure seront envoyes au Laboratoire National de Rfrence
sur milieu de conservation qui sera mis la disposition des laboratoires du Rseau, et conformment aux
rgles dexpdition des chantillons infectieux.

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 24)

3.1.2. Mningite crbro-spinale :


a) Prlvement
Le prlvement du LCR se fait par ponction lombaire qui est un acte mdical (doit tre effectu par un
mdecin).
Le recueil se fait dans trois tubes striles dont un destin ltude bactriologique.
b) Transport
Le LCR doit tre achemin rapidement au laboratoire car les bactries responsables gnralement de
mningites sont fragiles.
Au laboratoire, le tube peut tre conserv 37C en attendant dtre trait
c) Examen macroscopique :
Laspect du liquide cphalorachidien (LCR) est not ds larrive de lchantillon.
Il peut tre clair louche, trouble, purulent, hmatique, xanthochromique. Un LCR clair nexclut pas une
mningite : cest les cas des mningites purulentes au dbut ou dcapites par une antibiothrapie pralable,
cest aussi le cas des mningites tuberculeuses, virales, parasitaires
d) Examen microscopique :
Il permet une tude cytologique et bactriologique :
/ La cytologie quantitative est effectue sur le LCR total par dnombrement sur cellule de Malassez ou de
Nageotte qui permet de dterminer le nombre de cellule par millimtre cube de LCR. Ce nombre est gal
1 3 / mm3 dans un LCR normal.
/ La cytologie qualitative, ralise sur le culot de centrifugation, prcise la nature des cellules prsentes
(polynuclaires, lymphocytes )
/ Un frottis est ralis partir du culot de centrifugation pour une coloration de Gram. Lexamen au
microscope peut mettre en vidence des bactries
Exemples : . diplocoques Gram ngatif en grain de caf
. diplocoques Gram positif lancols, encapsuls
. bacilles Gram ngatif polymorphes,
e) Recherche dantignes solubles (agglutination au latex) :
Elle permet un diagnostic rapide de la mningite grce un test dagglutination effectu sur le surnageant de
centrifugation. (suivre les directives formules par le fabricant du kit utilis).
NB : Pour les laboratoires ne disposant pas de plateau technique pour faire plus, les rsultats obtenus sont
rendus (examens macroscopique, cytologie quantitative et qualitative, test dagglutination) et le reste de
lchantillon de LCR est mis dans un milieu de transport comme le Trans-Isolate qui sera achemin au
Laboratoire rgional ou national le plus proche.
f) Culture
Ds larrive du LCR, il est ensemenc sur milieux enrichis qui seront incubs sous atmosphre enrichie en
CO2.
g) Isolement et Identification de Neisseria meningitidis (agent de mningite pidmique):
La culture est ralise avec le LCR total sur des milieux riches : Mueller Hinton et Glose au sang cuit
additionne de mlange polyvitaminique.
Aprs isolement, un test loxydase est ralis sur les colonies suspectes puis une galerie didentification
ensemence (Galerie API NH, Galerie Neisseria 4 heures).
RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 25)

Les principaux caractres didentification de Neisseria meningitidis sont les suivants : diplocoques
Gram ngatif, arobie stricte, oxydase (+), Maltose (+), Glucose (+).
Les tests dagglutination permettront la confirmation, en prcisant le srogroupe.
g) Antibiogramme : La sensibilit des souches aux antibiotiques suivants sera particulirement surveille :
chloramphnicol, cotrimoxazole, aminopnicilline, cphalosporines de 3e gnration.
h) Acheminement des souches au Laboratoire National de Rfrence :
Les souches identifies et isoles en culture pure seront envoyes au Laboratoire National de Rfrence
sur milieu de conservation qui sera mis la disposition des laboratoires du Rseau, et conformment aux
rgles dexpdition des chantillons infectieux.

3.1.3. Shigellose :
a) Prlvement :
Les selles sont recueillies dans des pots propres.
b) Transport :
Le prlvement est immdiatement achemin au laboratoire ; si le transport est diffr, les selles doivent
tre ensemences dans un milieu Cary Blair.
c) Examen macroscopique :
Il vrifie la consistance des selles, la prsence de glaire, de sang de mucus.

Selles sanglantes, suspectes de shigellose


d) Examen microscopique :
En cas de shigellose, on note la prsence de nombreux polynuclaires et un dsquilibre de la flore avec
prdominance de bacilles immobiles.
En outre, cet examen permet dcarter la prsence damibe.
NB : Les laboratoires priphriques qui ne peuvent pas procder la culture rendent les rsultats obtenus
aux deux premires tapes, puis ensemencent un milieu de transport (Cary Blair) qui sera envoy au
laboratoire rgional ou national le plus proche.
e) Isolement et Identification :
Lensemencement est ralis sur milieux slectifs (exemples :glose Hektoen, glose SS (Salmonella Shigella) qui sont incubs 37C. Au bout de 24 heures, les colonies suspectes (Lactose -, SH2 -) sont
ensemences sur milieu Ure Indole.
RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 26)

Culture sur glose Hektoen


Aprs 18 24 heures dincubation, les souches urase (-) sont mises en culture sur une galerie didentification
en tubes (kligler hajna, mannitol mobilit).
Les principaux caractres des shigelles sont : bacilles Gram ngatif, immobiles, AAF, catalase (+) sauf
S. dysenteriae-1, urase (-), fermentent le glucose sans production de gaz, H2S (-), Citrate de Simmons
(-). Les caractres diffrentiels des espces sont rsums dans le tableau ci-dessous.
Shigella dysenteriae est la seule espce renfermant un srotype pidmiogne, Shigella dysenteriae-1.

Caractres

S. dysenteriae

S. flexneri

S. boydii

S. sonnei

Mannitol

(-)

(+)

(+)

(+)

Indole

(-)

(-)

ONPG

(-)

(+)

f) Antibiogramme : tester les antibiotiques suivants : amoxicilline, acide nalidixique, cotrimoxazole,


ttracycline.
g) Acheminement des souches au Laboratoire National de Rfrence :
Les souches identifies et isoles en culture pure seront envoyes au Laboratoire National de Rfrence
sur milieu de conservation qui sera mis la disposition des laboratoires du Rseau, et conformment aux
rgles dexpdition des chantillons infectieux.

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 27)

3.2. HEMATOLOGIE
3.2.1. Hmatologie cellulaire
a) Hmogramme (NFS)
Cest ltude quantitative et qualitative des lments figurs du sang.
Le prlvement est effectu sur tube EDTA
(Le sang de contrle (haut, normal et bas) pass une deux fois par jour selon le nombre de
prlvements doit donner des rsultats inclus dans les normes tablies par le laboratoire).
Il doit comporter :
la numration des cellules sanguines (globules rouges, globules blancs et plaquettes)
ltude des constantes hmatologiques :

Taux dhmoglobine (Hb)


Hmatocrite (Ht)
Volume globulaire moyen (VGM)
VGM= Ht / nombre de GR (en millions) 10
Il est exprim en femtolitre (fL) ou en microns cube (3)

Teneur corpusculaire moyenne en hmoglobine (TCMH)


TCMH= Hb/ nombre de GR (en millions) 10
Il est exprim en pico gramme (pg)

Concentration corpusculaire moyenne en hmoglobine (CCMH)


CCMH= Hb / Ht 100
Il est exprim en pourcentage
Ltude morphologique des cellules sur frottis sanguin qui permet en outre dtablir la formule
leucocytaire.

Ralisation dun frottis


- Dposer 1 cm de lextrmit dune lame parfaitement propre, une goutte de sang laide
dun capillaire.
- Placer le bord de la lamelle talement en contact avec la lame, proximit de la goutte de
sang.
- Faire glisser la lamelle incline 45 sur la lame jusqu atteindre la goutte de sang. Le sang
stend par capillarit sur toute la largeur de la lamelle.
- Tirer la lamelle dun mouvement rgulier et rapide. Il faut conserver linclinaison et ne pas trop
appuyer sur la lamelle. Tout le sang doit tre tal avant datteindre le bout de la lame.
- Scher lair.
NB : A la place de la lamelle, on peut utiliser une lame bord mousse

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 28)

Ralisation dun frottis

Coloration au May Grunwald Giemsa (MGG)

Fixation

- Placer la lame du frottis sur un support horizontal au dessus dun bac de coloration.
- Verser sur la lame 5 gouttes de colorant May-Grnwald pur de faon recouvrir compltement le
frottis. Laisser agir 3 minutes. Laver leau tamponne ( dfaut utiliser leau de robinet)

Coloration au Giemsa

Prparer une dilution du Giemsa au dixime avec de leau tamponne (eau neutre)
Recouvrir le frottis de la solution dilue
Laisser agir 20 mn

Laver leau

Schage

Laisser scher la lame lair, en position incline, aprs avoir essuy la face infrieure de la lame
avec du papier filtre.
- Attendre au moins 5 minutes avant lexamen microscopique du frottis.

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 29)

Galerie de photographies des lments figurs du sang aprs coloration au MGG

Polynuclaire neutrophile
o Taille: 12 14m, arrondi
o Noyau : 3 5 lobes
o Cytoplasme : acidophile,
petites granulations marron clair
(granulations neutrophiles)

Polynuclaire neutrophile : La chromatine du


noyau forme des mottes denses avec de petits
espaces clairs. Deux plaquettes sont visibles
gauche de limage.

Polynuclaire neutrophile: Le noyau est


form ici de 5 lobes relis entre eux par un fin fil
de chromatine. Le cytoplasme est ros et rempli
de petites granulations

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 30)

Polynuclaire osinophile : Noyau souvent bilob


(comme sur cette image). Cytoplasme rempli de
grosses granulations oranges (osinophiles)

Polynuclaire osinophile

Polynuclaire basophile
o Taille:11 13 arrondi
o Noyau:2 4 lobes denses
o Cytoplasme:acidophile clair
o Granulations:bleu violet fonc,
nombreuses pouvant recouvrir le noyau

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 31)

Polynuclaire basophile: les nombreuses


granulations violet fonc sont le critre
majeur didentification de la cellule.

Lymphocyte (Petit):
o Taille: 9-11 arrondi
o Noyau: rond et dense
o Cytoplasme: basophile clair
o Granulations: nant

Lymphocyte (Grand):
o Taille: 10-15 arrondi,
dformable
o Noyau: rond, ovale ou en
drapeau
o Cytoplasme: bleu trs clair

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 32)

Lymphocyte (Granuleux):
o Taille: 10-14 arrondi,
o Noyau: rond, ovale
o Cytoplasme: bleu clair
o Granulations: quelques
granulations azurophiles

Monocyte
o Taille: 18-20 arrondi,
o Noyau: rond ou irrgulier
o Cytoplasme: bleu clair, peut
contenir des vacuoles
o Granulations: trs fines, trs
nombreuses, azurophiles

Monocyte:
Noyau irrgulier, cytoplasme gris
dans lequel on devine de fines
granulations

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 33)

Paquettes:
Cinq petits lments colors en violet.
NB : une diffrence de taille = aniso
cytose plaquettaire

Numration globulaire et paramtres rythrocytaires


1re
semaine

8 jours 3
mois

3 mois 3
ans

3 6ans

6 15
ans

Hmaties 10.6/L
(Tera/L)

5,0 6,0

3,8 4,8

3,6 5,2

4,1 5,3

4,0 5,4

Leucocytes 10/L
(Giga/L)

10,0 30,0

6,0 18,0

6,0 15,0

5,0 13,0 5,0 11,0

4,0 10,0

Plaquettes 10/L
(Giga/L)

150 400

150 400

150 400

150 400 150 400

150 400

Hmoglobine g/dL

Adulte
H : 4,5 5,8
F : 3,8 5,4

14,5 22,5

10 16

10,5 13,5

10,5
13,5

11,5
14,5

36 44

37 45

H : 13,5
17,5
F : 12,5
15,5
H : 40 50

Hmatocrite %

44 58

38 44

36 44

F : 37 47
VGM fl

100 120

85 96

70 86

73 89

77 91

82 98

TCMH pg

34 38

24 34

23 31

24 30

24 30

> ou = 27

CCMH g/dL

32 36

32 36

32 36

32 36

32 36

32 36

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 34)

Formule leucocytaire
en 10/L

1re semaine 8 jours 3 mois 3 mois 3 ans 3 6 ans 6 15 ans Adulte

Polynuclaires neutrophiles

6,0 26,0

1,5 8,5

1,5 8,5

1,5 8,5

1,8 8,0

1,8
7,5

Polynuclaires osinophiles

0,2 0,85

0,2 1,2

0,05 0,7

0,02 0,65

0 0,6

0,04
0,8

Polynuclaires basophiles

0 0,64

0 0,2

0 0,2

0 0,2

0 0,2

0 0,2

Lymphocytes

2,0 11,0

2,0 11,0

4,0 10,5

2,0 8,0

1,5 6,5

1,0
4,5

Monocytes

0,4 3,1

0,05 1,1

0 0,8

0 0,8

0 0,8

0,2
1,0

b) Vitesse de sdimentation
Conditions de prlvement
- Prlvement de sang veineux (en gnral au pli du coude) ; le tube de prlvement contient un anticoagulant :
EDTA ou citrate trisodique 3,8% dans une proportion de 20% (1 volume danticoagulant pour 4 volume
de sang)
- Le prlvement est ralis de prfrence jeun

Principe
Cest la vitesse laquelle les hmaties contenues dans le plasma sdimentent au fond dun tube calibr et
gradu, appel tube de Westergreen. Elle correspond la hauteur de chute des particules sanguines dans
le tube.

Matriel et ractifs
- le tube de Westergreen : cest une pipette de dimensions standardises : longueur totale 300 mm, diamtre
infrieur 2,5 mm. Cette pipette est gradue de 0 200 mm de haut en bas. Elle est en matire plastique
et usage unique.
- le support : gnralement adapt aux pipettes, il permet de les maintenir strictement verticales.
Technique
- Aspirer le sang, bien homognis, dans la pipette de Westergreen jusquau trait 0 en tirant sur la
languette prsente dans la pipette.
- Placer aussitt la pipette sur le support.

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 35)

Lecture
Lire la hauteur du plasma surnageant (exprime en mm) au bout dune heure.
NB : les anciennes lectures 2h et 24h nont pas dintrt.

Rsultats
Les valeurs normales sont :
- enfant : 6 25 mm
- femme adulte : 4 20 mm
- homme adulte : 3 10 mm

Portoir pour vitesse de sdimentation

Causes derreurs
La sdimentation des hmaties peut tre ralentie artificiellement si :
- lchantillon sanguin est partiellement coagul
- la mesure est faite partir dchantillon sanguin prlev depuis plus de 2 heures
- la temprature du laboratoire est basse
La sdimentation des hmaties peut tre augmente artificiellement si :
- la pipette de Westergreen est incline
- lchantillon sanguin est hmolys ou prlev avec un excs danticoagulant
- la temprature du laboratoire est leve.

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 36)

b) Test dEmmel ou test de falciformation des hmaties

Conditions de prlvement
le prlvement est effectu sur sang veineux dans un tube avec ou sans anticoagulant
il nest pas ncessaire dtre jeun

Principe
En prsence dun rducteur (mtabisulfite de sodium 2%), les hmaties du drpanocytaire prennent une
forme en faucille ou en feuille de houx .

Matriel et ractifs

Spatule
Mta bisulfite de sodium en poudre
Balance de prcision
Eau distille
Flacon de 125 ml
Papier buvard
Lame
Lamelles
Vernis ongles

Technique

o Prparation du mtabisulfite
- dposer le papier buvard sur le plateau de la balance
- calibrer lappareil
- laide de la spatule, prlever la poudre de mta bisulfite et la dposer sur le papier buvard
- peser exactement 2 grammes de cette poudre
- recueillir les 2 grammes dans un flacon de 125 ml
- ajouter 100 ml deau distille
- mlanger et attendre 15 mn environ pour que la solution soit stable
- tester la solution de mta bisulfite 2% avec les chantillons positifs de la veille
NB : Le contrle de qualit interne exige de prparer le mtabisulfite tous les jours et de le vrifier sur des
chantillons considrs connus positifs et ngatifs.

o Prparation du test
dposer sur une lame propre une goutte de sang et une goutte de la solution de mtabisulfite
mlanger doucement
dposer sur le mlange une lamelle en vitant les bulles dair
essuyer dlicatement lexcs du mlange avec du papier buvard ( dfaut utiliser une compresse)
sceller les bords de la lamelle avec du vernis ongles ou de la paraffine, le but tant dempcher
le contact des hmaties avec loxygne de lair ambiant.

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 37)

Lecture
Elle se fait au bout de 15 30 mn au microscope un grossissement 40.
Rsultats
- test ngatif : les hmaties gardent leur forme rgulirement arrondie ;
- test positif : prsence de nombreuses hmaties en forme de faucille .

une hmatie normale :


un beau disque biconcave de 7 m de diamtre

une hmatie falciforme

Hmaties normale et falciforme

Frottis sanguin avec prsence de drpanocytes

Causes derreurs
Etalement mal fait avec hmaties traumatises
Prsence de bulles dair

b) Taux des rticulocytes

Conditions de prlvement
sang veineux sur tube EDTA ou sang capillaire
il nest pas ncessaire dtre jeun
RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 38)

Principe

Les rticulocytes sont des globules rouges jeunes qui possdent encore des ribosomes et des
mitochondries. Ils sont ds lors capables dun mtabolisme assez intense et ils synthtisent encore activement
de lhmoglobine. On les reconnat le plus facilement au moyen de colorations utilisant le bleu de crsyl ou
le bleu de mthylne nouveau : dans ces conditions les organites cellulaires cits plus haut sont rendus
visibles sous la forme dune substance granulo-filamenteuse caractristique.

Matriel et ractifs

bleu de crsyl brillant ou bleu de mthylne

tube hmolyse

bain marie

pipette Pasteur

lame

Technique

dans un tube hmolyse, dposer 1goutte de sang et 1goutte de bleu de crsyl (si le taux dHb est
infrieur 11g/dL, mettre 2 gouttes de sang et 1 goutte de bleu de crsyl)

incuber au bain marie 37C pendant 20 mn

puis confectionner un frottis et lire au microscope au grossissement 100 avec de lhuile immersion
(idalement lire sur dix champs ; compter le nombre de rticulocytes et de globules rouges et
exprimer le pourcentage de rticulocytes sur le nombre globules rouges).

Rsultats

Le rsultat est exprim en pourcentage et surtout en valeur absolue de rticulocytes par mm3 de sang. Le
taux normal est de :
-

0,2 2% chez ladulte (gnralement 0,5 1,5%)

2 6% chez le petit enfant

Le taux des rticulocytes traduit lactivit de lrythropose mdullaire. Il est un indicateur du type danmie.

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 39)

Frottis avec prsence de rticulocytes (3 rticulocytes sont visibles sur chaque frottis)

Causes derreurs

corps de Jolly

hmaties ponctuations basophiles (mieux visibles sur microscope diaphragme ferm)

inclusions parasitaires (plasmodium)

corps de Heinz

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 40)

b) Dtermination de la rsistance globulaire osmotique

Conditions de prlvement
sang veineux
utiliser un tube avec de lhparine (EDTA contient des sels)

Principe
Les hmaties, qui in vivo sont dans un milieu isotonique, se comportent in vitro dans des solutions
hypotoniques comme des osmomtres. Par osmose, leau diffuse du milieu le moins concentr en osmoles
vers le compartiment le plus concentr en osmoles.
Dans les solutions hypotoniques, leau pntre dans les hmaties qui gonflent grce aux proprits dlasticit
de la membrane plasmique. Au-del dun volume maximal, les hmaties clatent en librant lhmoglobine
dans le milieu extrieur : il y a hmolyse.
Dans certaines pathologies et notamment lors danmies hmolytiques, la rsistance globulaire osmotique
(ou RGO) des hmaties peut tre :
- augmente : lhmolyse apparat pour des solutions de concentration en NaCl infrieure celle
provoquant normalement lhmolyse, donc pour des solutions dhypotonie suprieure. Cest le
cas lors de thalassmies
- diminue : lhmolyse apparat pour des solutions de concentration en NaCl suprieure celle
provoquant normalement lhmolyse, donc pour des solutions dhypotonie infrieure. Cest le cas
lors de la microsphrocytose.

tubes hmolyse
portoir
eau distille
NaCl
Pipette
Etuve
Centrifugeuse

Matriel

Technique
La dtermination de la RGO se ralise sur sang total ou sur sang dplasmatis, 37C pendant une heure.
On ralise une gamme de solutions de NaCl hypotoniques par rapport au plasma. Les concentrations en
NaCl de ces solutions varient de 2,6 6g/L et sont croissantes de 0,2 en 0,2g/L.
- disposer les 18 tubes hmolyse sur un portoir et les numroter
- prparer les 18 solutions de NaCl partir dune solution mre 7g/L et deau distille selon le
protocole prsent dans le tableau suivant :
N des tubes

Nombre de gouttes deau 5


distille
Nombres de gouttes de solution 30
mre de NaCl 7g/L
Concentration finale en NaCl en 6
g/L

29

28

14

15

16

17

18

18

19

20

21

22

27

26

17

16

15

14

13

5,8 5,6 5,4

5,2

3,4 3,2

2,8

2,6

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 41)

mettre dabord leau distille


distribuer la solution de NaCl 7g/L avec la mme pipette aprs lavoir correctement rince avec
cette solution
ajouter dans chaque tube une goutte de sang homognis, ou dhmaties dplasmatises
mlanger doucement, boucher les tubes et les porter ltuve 37C pendant 1 heure
centrifuger tous les tubes 2 mn 2000 tours par minute.

Lecture
o Lecture directe
Faire la lecture de la gamme de gauche droite en partant des solutions les moins hypotoniques. Observer :
- dans les premiers tubes, le surnageant est incolore, les hmaties sont intactes et forment un culot
rouge au fond du tube : il ny a pas dhmolyse
- partir dun certain tube, le surnageant devient jaune, quelques hmaties ont t lyses et ont
libr leur hmoglobine : il y a hmolyse partielle ; dans les tubes suivants, le culot globulaire
diminue de plus en plus et la couleur du surnageant saccentue
- partir dun certain tube, le culot globulaire a disparu, toutes les hmaties sont dtruites, lhmolyse
est totale : il reste un petit culot blanchtre compos de restes membranaires.
Noter les concentrations en NaCl des solutions des 2 tubes :
- Hi ou hmolyse initiale : premier tube o le surnageant est jaune
- Ht ou hmolyse totale : premier tube o le culot globulaire a disparu.
o Lecture ou spectrophotomtre
Complter la lecture en mesurant labsorbance de chaque surnageant 540 nm afin de doser la quantit
dhmoglobine libre. Labsorbance du surnageant du premier tube de la gamme correspondra 0%
dhmolyse et labsorbance du surnageant du dernier tube correspondra 100% dhmolyse.
Tracer la courbe % dhmolyse = f (concentration en NaCl)
Dterminer la valeur de la concentration en NaCl correspondant 50% dhmolyse (H50%)

Rsultats

o Lecture directe
Les valeurs normales sont les suivantes :
Valeurs normales de la RGO

Hi

Sang total
4,4 4,6 g/L

Hmaties dplasmatises
4,8g/L

Ht

3,4g/L

3,6g/L

Lecture au spectrophotomtre

La valeur normale moyenne H50 % est de 3,8 4,2g/L

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 42)

Interprtation
pour des valeurs obtenues suprieures la normale, la RGO est diminue, les hmaties sont plus
fragiles.
Pour des valeurs obtenues infrieures la normale, la RGO est augmente, les hmaties sont plus
rsistantes

b) Adnogramme

Principe

Cest ltude cytologique du suc ganglionnaire aprs ponction laiguille fine. Ladnogramme permet un
diagnostic dorientation des prolifrations lymphodes, quelles soient bnignes ou malignes.

Matriel
aiguille fine (23 G de prfrence) et seringue
lames
coton
alcool

Technique

la peau non anesthsie et dsinfecte est tire


introduire laiguille (de type intramusculaire) monte sur une seringue avec un piston bien mobile,
dans le ganglion
- le tissu ganglionnaire est alors aspir en faisant varier plusieurs fois lorientation de laiguille (en
maintenant toujours laspiration)
- le contenu de la seringue est ensuite chass sur la lame
- on confectionne des frottis qui seront colors au MGG
NB : Le suc ganglionnaire sera dautant moins ml de sang et donc facile analyser que lon vitera
daspirer. La meilleure technique consiste laisser un peu de suc cellulaire remonter dans laiguille en
massant fermement le ganglion, puis chasser ce suc sur une lame et procder ltalement.

c) Mylogramme
Principe
Cest ltude cytologique de la moelle osseuse.
Sites de la ponction
La moelle osseuse rouge est essentiellement situe dans les piphyses des os longs et dans les os plats. Le
site de ponction prfrentiel chez ladulte est le sternum et lpine iliaque chez lenfant. Chez le nourrisson,
il faut prfrer lpine iliaque ou la tubrosit tibiale antrieure.

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 43)

Matriel
La ponction est ralise laide dun trocart : le trocart de Mallarm qui est compos de 2 lments
distincts :
- une aiguille creuse, lextrmit infrieure effile. Sa partie suprieure est compose de 2 branches
perpendiculaires laxe de laiguille, branches permettant une bonne prise en main par loprateur ;
- un mandrin lextrmit suprieure aplatie afin de pouvoir exercer une pression suffisante. Le
mandrin traverse laiguille creuse.
Aiguille et mandrin doivent avoir une extrmit pointue, tranchante et non mousse.
Prlvement
Au site de la ponction :
- la peau est soigneusement dsinfecte
- le trocart tenu fermement par loprateur, est enfonc perpendiculairement la peau et la surface
osseuse avec un mouvement de rotation jusqu ce que lon franchisse la corticale osseuse
- aprs pntration, le mandrin est retir et remplac par une seringue qui aspire de la substance
mdullaire (volume prlev est infrieur 0,5cc)
- enlever la seringue et replacer le mandrin
- le contenu de la seringue est dpos directement sur la lame pour un frottis mdullaire ralis de la
mme faon quun frottis sanguin
NB : si la premire aspiration a ramen du matriel, laiguille peut tre retire et un pansement lgrement
compressif est appliqu au point de ponction.
Coloration
Les frottis confectionns sont schs lair et colors au May Grunwald Giemsa mais ventuellement avec
des colorants cytochimiques.
Lecture
Elle se fera dabord au faible grossissement pour apprcier la richesse cellulaire puis au fort grossissement
pour ltude des diffrentes lignes.

3.2.2. Hmostase
Lexploration de la coagulation doit se faire sur des prlvements avec comme anticoagulant le citrate
trisodique raison dun volume danticoagulant pour 9 volumes de sang.
Les tests doivent tre raliss dans les 4 heures qui suivent le prlvement.
Les outils du contrle de qualit reposent sur deux types dchantillons biologiques :
- des pools de plasmas normaux ou anormaux prpars localement et aliquots
- des plasmas lyophiliss prpars industriellement par diffrentes firmes pharmaceutiques qui
sont soit des plasmas talons ou standards de calibration ou alors des plasmas de contrle
ayant une valeur moyenne et un intervalle de confiance dtermine selon la technique utilise.
Ces diffrents chantillons sont utiliss pour le contrle de qualit journalier qui permet la validation
quotidienne des rsultats. Il est prfrable de passer ces contrles en dbut et en cours de srie et de
mentionner les rsultats sur un graphe. Lensemble des procdures de contrle de qualit interne doit tre
clairement dcrit dans un cahier technique qui doit tre rgulirement mis jour. Le contrle de qualit
RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 44)

interne doit aussi vrifier les tapes pr analytiques (prlvements) et post analytiques (validation, rendu et
archivage des rsultats).

a) Temps de saignement
Principe
Cest un test global qui explore lhmostase primaire dans son ensemble (ladhsion, lagrgation et le
facteur Willebrand)
.Il est ralis in vivo et mesure la dure de lhmorragie provoque par une incision de la couche superficielle
de la peau des les conditions normalises.
Nous dcrirons la mthode dIvy 3 points qui est la mthode de rfrence.

Matriel
tensiomtre
vaccinostyle strile
papier buvard
ther
chronomtre

Technique

- Placer le brassard tension au bras gonfl 40 mm Hg, pression qui sera maintenue constante toute
la dure du test,
- dsinfecter la peau de lavant bras avec lther (lalcool entrane une vasodilatation), laisser scher,
- raliser 3 piqres distantes de 2 cm chacune au niveau de lavant bras laide du vaccinostyle
- dclencher immdiatement le chronomtre,
- lexcs de sang est pong dlicatement toutes les 30 secondes laide du papier buvard (viter de
toucher et de frotter les berges des points de piqre) ;
- noter le temps au bout duquel le saignement sarrte au niveau de chaque point de piqre et faire la
moyenne

Rsultats
La valeur normale chez ladulte doit tre infrieure 5 mn.

b) Temps de Quick (Taux de prothrombine et INR)

Principe
Cest le temps de coagulation dun plasma citrat, pauvre en plaquettes recalcifi en prsence de
thromboplastine tissulaire. Le TQ explore la voie extrinsque de la coagulation.

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 45)


Matriel et ractifs
o Matriel (commun pour les autres tests dhmostase)
- Billes magntiques
- Barrettes
- Plasma Citrate
- Micropipette
- Coagulomtre au moins semi automatique (type ST art)
- Embouts
o Ractif
- Thromboplastine calcique (ractif dclenchant)

Technique
dposer les barrettes dans la zone dincubation
distribuer une bille dans chaque cupule
mettre 50L de plasma citrat dans chaque cupule
incuber pendant 1mn
transfrer dans la zone de lecture
dclencher la coagulation en distribuant 100L de thromboplastine calcique (princube 37C)
dans chaque cupule

Le temps de coagulation se mesure par larrt du mouvement de billes

Rsultats
o Expression en pourcentage dactivit prothrombinique
En pratique courante, le temps de Quick (TQ) est converti en taux de prothrombine (TP) exprim en
pourcentage. La conversion du TQ en TP se fait laide dune droite dtalonnage ou droite de Thivolle ,
tablie partir de plasmas normaux tests en dilution.
Les valeurs moyennes normales sont comprises entre 70 et 100%.
o Expression des rsultats lors des traitements aux antivitamines K (AVK)
Pour la surveillance des traitements aux AVK le pourcentage utilis dans lexpression du TQ ne convient
pas, car les thromboplastines commerciales utilises ont une sensibilit ingale aux AVK. Le rapport
international normalis (ou International Normalized Ratio : INR) est un nombre sans dimension, gal au
rapport entre le TQ du malade (TQm) et le TQ du tmoin (TQt), rapport lev lindex international de
sensibilit (ou International Sensitivity Index : ISI).
LISI est dtermin pour chaque thromboplastine commerciale par rapport une prparation de rfrence.
Il est fourni par le fabricant chaque utilisateur.
INR= (TQm /TQt) ISI
Les valeurs exprimes en terme dINR dfinissent deux niveaux danticoagulation :
- anticoagulation faible : INR= 1,5 3
- anticoagulation leve : INR= 3 5
Un INR suprieur 5 est associ un risque hmorragique excessif
RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 46)

c) Temps de cphaline active (TCA)


Principe
Cest le temps de coagulation dun plasma citrat, pauvre en plaquettes, recalcifi 37C en prsence de
substitut plaquettaire (cphaline) et dun activateur (kaolin, silice ou acide ellagique) standardisant lactivation
des facteurs contacts et en prsence de calcium.
Le TCA explore la voie endogne de la coagulation ainsi que la voie commune. Seul le facteur VII ninterfre
pas sur ce test.

Ractifs
ractif cphaline activateur
solution de CaCl2

Technique
placer les barrettes dans la zone dincubation
mettre une bille dans chaque cupule
ajouter 50L de plasma citrat et 50L de cphaline activateur
incuber pendant 3mn
transfrer la barrette en zone de lecture
dclencher la coagulation en ajoutant 50L de solution de CaCl2

Le temps de coagulation se mesure par larrt du mouvement de billes


Rsultats
Ils sont exprims en secondes et varient entre 20 et 40 secondes selon le ractif utilis.
Est considr comme pathologique un cart suprieur 8 secondes par rapport au contrle.
Chez les enfants de moins de 5 ans, le TCA est souvent la limite suprieure des valeurs normales voire
lgrement allong, sans anomalies associes.
NB : Si le TCA dun patient est allong, on ralise un TCA sur le mlange volume gal du plasma du
malade et du plasma du tmoin :
- une correction du TCA indique un dficit en un ou plusieurs facteurs de la voie intrinsque
- une non correction du TCA indique la prsence danticoagulants circulants.

d) Temps de thrombine
Principe
Cest le temps de coagulation dun plasma citrat pauvre en plaquettes, recalcifi 37C en prsence
dune quantit dtermine de thrombine, quantit choisie de faon entraner la coagulation en 20 secondes
dun plasma tmoin.
Le temps de thrombine explore la fibrinoformation.
Matriel
Solution de thrombine calcique.

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 47)

Technique
mettre 100L de plasma dans les barrettes places en zone dincubation et contenant des billes
incuber 2 mn
dclencher la coagulation en ajoutant 100L de solution de thrombine calcique

Rsultats
Un temps de thrombine est gnralement infrieur 22 s. Tout cart suprieur ou gal 5s entre le temps
de thrombine du plasma tester et le temps de trombine du plasma tmoin est considr comme significatif.
e) Dosage du fibrinogne par mthode chronomtrique (Clauss)
Principe
Le temps de coagulation dun plasma citrat pauvre en plaquettes, dilu dans des proportions adquates,
mis en prsence dun excs de thrombine 37C et en optimum calcique, est directement fonction du taux
de fibrinogne fonctionnel plasmatique.

Ractifs
solution de thrombine contenant un inhibiteur spcifique de lhparine permettant le dosage du
fibrinogne sur le plasma des patients traits par cet anticoagulant.
Tampon pH 7,35 permettant la dilution du plasma (tampon Owren-Koller)
Technique
raliser une dilution du plasma au 1/20 avec le tampon
mettre 100L de la dilution dans les cupules places en zone dincubation et contenant des billes
incuber 1mn
Transfrer la barrette en zone de mesure et dclencher la coagulation en ajoutant 50L de solution
de thrombine calcique.

Rsultats

Le taux de fibrinogne normal est compris entre 2 et 4 g/L (le temps de coagulation mesur est compris
entre 8 et 20 secondes.
f) Dosage des D-Dimres
Principe
Les D-Dimres sont des structures spcifiques des produits de dgradation de la fibrine. Ils sont mis en
vidence directement dans le plasma citrat par une raction dagglutination passive utilisant des particules
de latex sensibilises avec un anticorps monoclonal anti D-Dimres ne ragissant pas avec le fibrinogne.
Les particules de latex sont sensibilises de telle sorte que lon observe une agglutination partir dune
concentration plasmatique des D-Dimres gale ou suprieure 500ng/mL.

Ractifs
suspension de latex sensibilise avec des anticorps anti D-Dimres
plasma contrle positif
plasma contrle ngatif
solution tampon pH 8,2
RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 48)

Technique

o Protocole qualitatif
- sur une carte, dposer
50 L de contrle positif
-

50 L de plasma tester

50 L de contrle ngatif

ajouter cot de chaque dpt, une goutte de suspension de latex homognis


mlanger avec un agitateur
imprimer la plaque un mouvement rotatoire pendant 2 mn et observer lapparition ventuelle
dagglutination
valider imprativement les tmoins

o Protocole semi quantitatif


- diluer lchantillon de en dans le tampon 8,2
- procder pour chaque dilution comme pour le test qualitatif
Rsultats
La raction est positive lorsquon observe une agglutination
Le seuil de sensibilit de la technique tant de 500L, une agglutination indique une concentration de DDimres gale ou suprieure 500ng/Ml dans la dilution correspondante : la concentration plasmatique en
D-Dimres est donc estime en multipliant cette valeur par linverse de la dernire dilution donnant une
agglutination.
Interprtation
Les valeurs physiologiques en D-Dimres sont infrieures 500ng/mL
Des valeurs suprieures traduisent une activation de la fibrinolyse conscutive une activation anormale de
la coagulation.
NB : Il existe une mthode immuno-enzymatique plus sensible mais plus longue dans sa ralisation.
g) Dosage de lactivit des facteurs de la coagulation
Le dosage consiste mesurer le temps de coagulation dun plasma contenant tous les facteurs de coagulation
lexception du facteur doser, celui ci tant apport par le plasma tudier, convenablement dilu.
Le systme test utilis doit tre sensible au facteur mesurer : temps de Quick pour les facteurs II + X, V
et VII, temps de cphaline active pour les facteurs VIII, IX, XI, XII et contacts.
h) Dosage du facteur Willebrand
Il sagit dapprcier lactivit biologique dagrgation plaquettaire du facteur Willebrand en prsence dun
inducteur qui est la Ristoctine. La vlocit dagrgation des plaquettes est proportionnelle au taux de
facteur Willebrand contenu dans le plasma. Cette vlocit est mesure par un agrgomtre ou un automate
dhmostase.
En ce qui concerne le facteur Willebrand 3 entits peuvent tre doses :
Mesure de lactivit CoFacteur de la Ristoctine : peut tre ralise par une technique dagglutination
sur lame (test semi quantitatif) ou une technique dagrgation de plaquettes laves en prsence de
plasma et de Ristoctine
RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 49)

Le taux normal est compris entre 50 et 150%

Mesure du Facteur Willebrand Antigne (vWAg) : ce facteur peut tre dos par des mthodes
immunologiques laide dantisrum htrologue par lectro-immuno-diffusion (Laurell), immunoenzymologie (ELISA), ou radio-immunologie.

Mesure du Facteur VIIIc


i) Dosage des protines S, C et de lantithrombine

Les protines S, C et lantithrombine sont les inhibiteurs physiologiques de la coagulation. Leur mesure
repose sur des techniques chronomtriques ou immunologiques (en centre spcialis uniquement).
j) Dtermination des anticorps anti phospholipides (LA et APA)
Les anti phospholipides de type lupus anticoagulant (LA) sont dpists devant un allongement dun temps
de la coagulation non corrig par ladjonction dun plasma normal.
Le principe des tests spcifiques didentification de cet anticoagulant circulant est bas, soit sur des tests
de potentialisation en diluant la cphaline ou la thromboplastine, soit sur des tests de neutralisation en
apportant un excs de phospholipides.
Les antiphospholipides de type anticardiolipine (APA) ne perturbent pas les tests de coagulation. Leur
diagnostic est ralis par des tests immunologiques (Elisa ou radio-immunologie).
3.2.3. Immuno-hmatologie et transfusion sanguine
Les prlvements peuvent tre raliss soit sur tube sec soit sur tube avec anticoagulant.
Le contrle de qualit interne repose sur lanalyse quotidienne dchantillons de contrle effectue dans
les mmes conditions que celles appliques aux chantillons biologiques.
a) Groupage sanguin dans les systmes ABO
Principe
Le groupage sanguin dans le systme ABO repose sur deux preuves ralises simultanment et
complmentaires, toutes deux tant des ractions dagglutination directe :
- preuve de Beth Vincent (ou preuve globulaire) : les hmaties tester sont mises en contact avec
des anticorps sriques connus afin didentifier les allo-antignes de ces hmaties.
- preuve de Simonin (ou preuve srique) : des hmaties tests, dont les allo-antignes du systme
ABO (H) sont connus, sont mises en contact avec le srum tester afin didentifier les anticorps
du systme ABO(H) prsents dans ce srum
Ractifs
o Srums tests
- srum-test anti-A
- srum-test anti-B
- srum-test anti-AB
o Hmaties tests
Ce sont des hmaties humaines prleves sur une solution anticoagulante et conservatrice, laves 3 fois en
srum physiologique, puis remises en suspension dans cette solution.

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 50)

Sont utilises :
- des hmaties-tests A
- des hmaties tests B
- des hmaties tests O
NB : les hmaties tests doivent tre prpares quotidiennement au laboratoire.
Les diverses techniques
Elles doivent toujours tre ralises:
- deux fois
- par deux manipulateurs diffrents
Elles sont varies :
- technique en plaque
- technique en tube hmolyse
- technique en microplaque (technique manuelle ou automatise
- technique en gel (technique manuelle ou automatise)

Technique en plaque : technique classique manuelle


Epreuve globulaire directe de Beth Vincent
Sur une plaque :
- dposer dans lordre : - une goutte de srum test anti-A
- une goutte de srum test anti-B
- une goutte de srum test anti-AB
- ajouter ct de chaque goutte de srum test, une goutte de culot dhmaties tester (une petite
goutte ou des hmaties dilues)
- mlanger soigneusement les deux gouttes puis animer la plaque dun mouvement rotatoire lent
- observer au bout dune minute et rechercher sil y a ou non agglutination
NB : il est important quil ny ait pas trop dhmaties risquant dempcher lobservation correcte des
agglutinations.
Epreuve srique indirecte de Simonin
Sur une plaque :
- dposer dans lordre : - une goutte de suspension dhmaties-tests A
- une goutte de suspension dhmaties-tests B
- ajouter ct de chaque goutte deux gouttes de culot du srum tester (une petite goutte ou des
hmaties dilues)
- mlanger soigneusement les deux gouttes puis animer la plaque dun mouvement rotatoire lent
- observer au bout dune minute et rechercher sil y a ou non agglutination

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 51)

Les diffrents groupes sanguins

Epreuves de Beth Vincent et de Simonin

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 52)

Les tmoins
Les preuves de Simonin et de Beth Vincent doivent tre obligatoirement valides par des tmoins :
Tmoin AB : mlanger une goutte de srum AB et une goutte de culot dhmaties tester.
Ce tmoin ne doit pas prsenter dagglutination. Il permet de sassurer que les hmaties testes ne sont
pas agglutines par des anticorps sriques autres que les Ac anti-A ou anti-B. La prsence
dagglutination signifie une poly agglutinabilit
Le tmoin AB permet de contrler lpreuve de Beth Vincent.
Tmoin allo : mlanger une goutte de srum tester et une goutte de culot dhmaties tests O.
Ce tmoin ne doit pas prsenter dagglutination. Il permet de sassurer quil ny a pas dans le srum
tester, dAc susceptibles de ragir avec des structures rythrocytaires autres que les Ag A et B.
La prsence dagglutination attesterait de la prsence dallo Ac en dehors du systme ABO.
Le tmoin allo permet donc de contrler lpreuve de Simonin.
Tmoin auto : mlanger une goutte de srum tester et une goutte de culot dhmaties tester
Ce tmoin, ralis partir des hmaties et du srum du sujet ne doit pas prsenter dagglutination. Il
permet de sassurer que dans le srum du sujet, il ny a pas dauto-anticorps dirigs contre des structures
de membrane des hmaties et que les hmaties ne sont pas auto-agglutinables.
Il permet donc le contrle des agglutinations observes dans les deux preuves.
Quelques causes derreurs
o Erreurs de manipulation : - erreurs dtiquetage des chantillons
- existence dhomonymes
- technicit dfaillante
o Erreurs srologiques :
- agglutination faible ou incomplte
- double population dhmaties (aprs une transfusion htrogroupe ou incompatible)
- altrations des rythrocytes : on observe une positivit dans tous les tests sriques.

a) le Phnotypage Rhsus
Principe
Cest la recherche la surface des hmaties testes des allo Ag courants du systme Rhsus, lAg D, lAg
C, lAg E, lAg c et lAg e, en mettant en contact ces hmaties avec des Ac spcifiques connus :
- anti-D
- anti-C
- anti-c
- anti-E
- anti-e

Ractifs ncessaires
srum-test anti-D dorigine humaine ou monoclonale
srum-test anti-E dorigine humaine ou monoclonale
srum-test anti-e dorigine humaine ou monoclonale
srum-test anti-C dorigine humaine ou monoclonale
srum-test anti-c dorigine humaine ou monoclonale
RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 53)

Technique sur plaque chauffe 40C

o Mode opratoire
prlever dans un mlange constitu du mme volume de culot globulaire et de plasma
dlimiter sur la plaque chauffante dun microscope, huit espaces spars les uns des autres de 2
3 cm
au niveau de chaque espace, raliser rapidement les dpts comme indiqus ci-dessous
Technique du phnotypage Rhsus

1
1goutte de
sang
tester

2
1goutte
hmaties
O
Rhsus+

3
1goutte
hmaties
O rhsus

+
1goutte de
srum
tmoin
albumineux

+
1goutte
de srum
test
anti-D

+
+
1goutte 1 goutte
de srum de srum
test
test
anti-D
anti-D

4
5
1goutte
1goutte
de sang de sang
tester
tester

+
1 goutte
de srum
test
anti-C

6
1goutte
de sang
tester

7
1goutte
de sang
tester

8
1goutte
de sang
tester

+
1 goutte
de srum
test
anti-c

+
1 goutte
de srum
test
anti-E

+
1 goutte
de srum
test
anti-e

mlanger sans dlai, laide dun agitateur bien propre


agiter en inclinant doucement la plaque sur le rhsuscope par des mouvements lents de
balancier, pendant 1 3 secondes
observer tout dabord les tmoins (dpts 1, 2 et 3). Si les rsultats attendus sont observs,
lire alors les essais et conclure.
o Rsultats attendus pour les tmoins

1 : tmoin ractif
Il ne doit pas prsenter
dagglutination. Une image
dagglutination peut tre
due :
- une auto-agglutination des
hmaties testes en raison
dune altration membranaire
ou de la prsence dauto-Ac
dans le srum
- une formation de rouleaux
dhmaties dus la BSA et
pouvant tre confondus avec
des agglutinants

2 : tmoin positif
Il doit prsenter une
agglutination. Il permet de
tester lefficacit du srum
anti-D en milieu albumineux
en sassurant que dans ces
conditions, les Ac anti-D
agglutinent bien les hmaties
porteuses dAg D.

3 : tmoin ngatif
Il ne doit pas prsenter
dagglutination. Il permet de
vrifier :
- la spcificit des Ac anti-D
en vrifiant quils ne donnent
pas de ractions croises
avec dautres Ag
- la non formation de
rouleaux dhmaties par le
srum anti-D.

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 54)

o Lecture des essais


prsence dagglutination : les hmaties du sang test portent leur surface lAg spcifique des
Ac utilises
absence dagglutination : les hmaties du sang test ne portent pas leur surface lAg spcifique
des Ac utiliss.

NB : En laboratoire, il est usuel de raliser simultanment le groupage ABO et le


phnotypage Rhsus
a) Recherche de lAg D faible (par le test de Coombs indirect)
Principe
Il consiste vrifier si les hmaties possdent lAg D faible (lorsquelles se sont avres sans Ag D avec le
test prcdent), en utilisant des Ac anti-D lors dune raction dagglutination active indirecte (artificielle)
utilisant comme artifice des antiglobulines.
Lantigne D faible se recherche dabord par 1 prchauffage des hmaties laide dun rhsuscope afin de
mieux mettre nu les pitopes de lantigne.

Ractifs ncessaires
srum test anti-D
hmaties O Rhsus standard +
hmaties O Rhsus standard
srum antiglobuline humaine
srum albumineux sans Ac anti-D

Technique
* dans un tube hmolyse, mettre 1ml de sang tester
* laver les rythrocytes tester en srum physiologique et prparer, partir de ces rythrocytes, une
suspension 5% dans du srum physiologique
* prendre 4 tubes hmolyse et introduire dans les tubes 2, 3, et 4 : 100 L de srum anti D et dans
le tube 1 : 100 L de srum albumineux tmoin sans anti-D
* ajouter : - en 1 : 50 L drythrocytes examiner
- en 2 : 50 L drythrocytes O Rh standard +
- en 3 : 50 L drythrocytes O Rh standard - en 4 : 50 L drythrocytes examiner
* incuber les 4 tubes au bain marie pendant 45mn
* laver 3 fois la pastille globulaire en eau physiologique de la faon suivante :
- remettre les hmaties en suspension dans leau physiologique, centrifuger 1 mn 750 g
- la mme opration est rpte 3 fois
- aprs le dernier lavage, la totalit du surnageant doit tre bien limine
* ajouter 100 L de srum antiglobuline
* agiter doucement pour remettre les rythrocytes en suspension
* centrifuger 1 mn 400 g
* faire la lecture aprs agitation douce

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 55)

Interprtation des rsultats

o Premier cas
Lagglutination nest observe que dans le tube 2 : cela signifie que les rythrocytes tests ne possdent
pas dAg D faible. Le sujet est donc Rh standard
o Deuxime cas
Lagglutination nest observe que dans les tubes 2 et 4 : cela signifie que les rythrocytes tests possdent
lAg D faible. Le sujet est donc D faible.
o Troisime cas
Les tubes 1, 2 et 4 prsentent une agglutination :
- lagglutination du tube 2 est normale
- lagglutination dans le tube 1 tmoigne de la prsence dauto-Ac sur les rythrocytes ou de formation
de rouleaux en prsence de BSA. Le rsultat positif dans le tube 4 ne peut tre valid.
o Quatrime cas
Aucune agglutination nest observe dans le tube 2 (ni dans aucun des 3 autres tubes), il sagit dune erreur
ou de mauvais ractifs notamment le srum anti D. il faut donc recommencer.

b) Phnotypage tendu
Il consiste rechercher un ou plusieurs antignes rythrocytaires autres que ceux qui sont dfinis par le
groupage ABO-D et le phnotypage Rhsus.
Pour un systme donn, la recherche de chaque antigne est base sur lutilisation de lanticorps monoclonal
spcifique et du tmoin adquat.
Le contrle de qualit interne doit utiliser deux chantillons de contrle de phnotypes garantis, lun tant
ngatif, et lautre dexpression htrozygote .
c) Test de Coombs direct

Principe

Le test direct lantiglobuline ou test de Coombs direct permet la mise en vidence de la sensibilisation in
vivo des hmaties humaines par des anticorps de nature Ig G et/ou des fractions du complment. Ce test
doit tre ralis sur un chantillon de prfrence anti coagul.
Il repose sur lutilisation dantiglobuline humaine polyspcifique ou monospcifique.
Le contrle de qualit utilise des hmaties pralablement sensibilises par une antiglobuline in vitro par des
Ig G et ventuellement du complment.

Technique

Laver les hmaties tester 3 fois


Diluer les hmaties laves 5%
Mettre dans un tube hmolyse 1 goutte de la dilution
Ajouter une goutte dantiglobuline
Centrifuger 1 mn 1000 tr/mn
RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 56)

Lecture : - si prsence dagglutination : CD Positif


- si absence dagglutination: CD Ngatif

d) Test de Coombs indirect

Principe

Ce test met en prsence le srum tester dans lequel on recherche des anticorps libres, avec des hmaties
comportant des sites antigniques spcifiques de ces anticorps. Le test est positif lorsquil existe une
agglutination des hmaties en prsence dune antiglobuline.

Faire un panel O+
Diluer le pannel 5%
Mettre dans un tube hmolyse 1goutte de la dilution
Ajouter 3 gouttes de srum tester
Incuber 45 mn au bain marie prchauff 37C
Aprs incubation lire une premire fois
Sil ny a pas dagglutination faire 3 lavages leau physiologique
Bien goutter leau du troisime lavage
Ajouter une goutte dantiglobuline
Centrifuger une minute 1000 tr/mn
Remettre doucement les hmaties en suspension,
Agiter et incliner pour dceler la prsence dagglutination ou observer au microscope x 40 (entre
lame et lamelle)

Technique

Lecture

Si prsence dagglutination : CI + = Prsence danticorps dans le srum


Si agglutination absente : CI - = Absence danticorps dans le srum

e) Recherche des agglutinines irrgulires (RAI)

Principe de la recherche de lagglutination par le test de Coombs indirect

On recherche dans un srum des Ac irrguliers en incubant le srum en prsence dhmaties porteuses des
Ag spcifiques. Les anticorps, sils sont prsents, sunissent aux Ag : on obtient des hmaties sensibilises,
mais souvent sans provoquer une agglutination, en raison :
- des forces de rpulsion lectrostatiques importantes entre hmaties voisines
- du caractre masqu, peu accessible de certains antignes
Provoquer lagglutination en ralisant un pontage spcifique entre Ac unis des hmaties voisines grce
des antiglobulines spcifiques des pitopes des Ig humaines.
Il sagit donc dune raction dagglutination active indirecte.
RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 57)

NB : Dautres tests peuvent tre utiliss, il sagit de :


- la recherche de lagglutination par le test aux enzymes
- la recherche de lagglutination en milieu salin (ne dtecte que les Ac irrguliers complets)

Technique en tubes usage unique

Le sang examin doit tre, de prfrence, prlev sur tube sec, les agglutinines sont alors recherches sur
le srum.
-

raliser un pannel O+
laver les hmaties 3 fois leau physiologique (le surnageant du dernier lavage doit tre compltement
limin)
remettre les hmaties en suspension dans leau physiologique (dilution 3%)
Prendre 3 tubes hmolyse, dposer dans chaque tube, 1goutte de la dilution et 3 gouttes de
srum tester
Incuber le tube 1 37, le tube 2 25 (temprature ambiante) et le tube 3 4 pendant 45 mn
Faire une premire lecture en agitant le tube tout doucement
Si le test est ngatif, faire trois lavages leau physiologique (le surnageant du dernier lavage doit
tre compltement limin)
Dans chaque tube mettre une goutte dantiglobuline
Centrifuger 1 mn 1000 tours/mn

Lecture

- Sil y a prsence dagglutination dans lun des 3 tubes la RAI est positive et il faut spcifier la
temprature
- Sil ny a pas dagglutination, la RAI est ngative
NB : les chantillons positifs doivent faire lobjet dune seconde tape didentification qui utilise au
moins 10 hmaties tests de groupe O qui doivent porter sparment diffrents antignes (les diffrents
Ag du systme rhsus, Ag Kell, Kidd, Duffy, MNS, Lewis, Lutheran)
Le contrle de qualit interne utilise des chantillons de contrle comportant des anticorps de spcificit et
de titre connus et sur des hmaties comportant lantigne correspondant dexpression htrozygote .
h) Test de compatibilit au laboratoire entre poche de sang et receveur
Cest une analyse qui consiste tester lchantillon de srum ou de plasma du receveur vis--vis des
hmaties de la tubulure du produit sanguin transfuser.
Ce test comporte la slection des units de sang transfuser en respectant les bonnes rgles de distribution,
puis prparer des hmaties de la tubulure afin quelles puissent tre testes dans les mmes conditions
techniques que la RAI, et enfin lexcution technique du test qui est identique celle utilise par la RAI.
Le contrle de qualit interne doit utiliser des chantillons identiques ceux utiliss pour la RAI.

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 58)

3.3. PARASITOLOGIE
3.3.1. Examen parasitologique des selles :
a) Prlvement :
Emettre au laboratoire la totalit des selles dans un rcipient adapt lusage, tanche et rsistant. Les
techniques danalyse demandent un minimum de matires fcales et certains lments parasitaires sont
faiblement reprsents dans les selles.
Lorsque lmission au laboratoire est impossible, lacheminement de lchantillon doit tre immdiat.
b) Examen macroscopique :
Il renseigne sur ltat de la selle (diarrhe / constipation), sur la prsence danneaux de taenia, dadultes
dhelminthes.
c) Examen microscopique frais :
Il est fait partir dun frottis de selles tales dans une goutte deau. La totalit de la prparation doit tre
examine au grossissement 10 puis au 40.
Il permet de mettre en vidence : des flagells ou des amibes mobiles, des kystes, des ufs et larves
dHelminthes intestinaux.
d) Examen microscopique aprs coloration
La coloration de lugol ou du M.I.F prcisent certains lments morphologiques des protozoaires intestinaux.
* Coloration au lugol (solution iodo iodure 1%)
- dposer une goutte de selles liquides (ou rendues liquides avec de leau physiologique) ;
- ajouter une goutte de lugol sur la prparation et mlanger avant de recouvrir dune lamelle.
Le lugol colore en jaune les kystes et en brun fonc les vacuoles intra cytoplasmiques.
Le noyau, les cristallodes et la membrane cytoplasmique apparaissent par rfringence.
Le lugol dtruit les formes vgtatives de trichomonas intestinalis
* Coloration au MIF (Mercurothiolate-Iodo-Formol)
- Le mlange MIF est prpar au moment de lemploi de la manire suivante : dans un tube hmolyse,
mettre 0,15 ml de solution iodo iodure 5% puis 2,35 ml de solution mre MF et mlanger par
retournement du tube
- Ajouter au mlange ainsi ralis une parcelle de selles, homogniser laide dun agitateur. - Laisser
sdimenter 30 min puis recueillir avec une pipette Pasteur, la partie suprieure du culot o sont rassembls
les parasites.
Le MIF colore en rouge le cytoplasme, la membrane nuclaire et le caryosome des protozoaires. La
chromatine non colore apparat par rfringence. Les kystes murs apparaissent en blanc sur fond ros de
la prparation.
e) Examen microscopique aprs la concentration de Ritchie modifi :
Diluer une noix de selles dans de leau formole 10%. Aprs avoir tamis, transvaser 9 ml dans un tube
conique et ajouter 3 ml dther. Agiter et centrifuger 1 mn 1000 tours/ mn. Rejeter le surnageant, prlever
et examiner le culot.

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 59)

3.3.2. Recherche des Plasmodies


a) Prlvement :
Le sang est recueilli au bout du doigt ou au niveau du talon sil sagit dun bb aprs piqre laide dun
vaccinostyle.
b) Confection :
/ Frottis :
Placer une extrmit dune lame une petite goutte de sang. Sans attendre que le sang sche, appliquer sur
la lame ct de la goutte, entre elle et le centre de la lame, larte dune lame rode. Former environ
45du ct de la goutte. Reculer la lame jusqu ce quelle touche la goutte. Par capillarit, celle-ci stale
le long du didre. Par un mouvement uniforme, sans excessive rapidit, faire parcourir au didre la surface
de la lame. Ne pas quitter le contact de la lame avant la fin de ltalement. Agiter la lame pour obtenir un
schage rapide. Colorer.
/ Goutte paisse :
Placer au centre de la lame une goutte de sang. Dfibriner le sang en tournant laide du coin dune autre
lame ou dun vaccinostyle et tendre la surface de la goutte en raclant la surface de la lame (1-2 mn).
Laisser scher 2 h au minimum (tuve 37) labri de la poussire et des mouches. Dshmoglobiniser
avec quelques gouttes deau jusqu lyse totale des hmaties. Egoutter, scher, colorer.
c) Coloration :
/ Frottis :
- Fixer le frottis avec du mthanol pendant quelques secondes en le trempant dans une cuve qui en contient.
- Prparer une solution de Giemsa 10% (1ml de solution mre dans 9 ml deau de robinet).
- Recouvrir toute la lame de cette solution et laisser colorer pendant 15minutes.
- Chasser dlicatement le colorant de la lame en ajoutant de leau propre goutte goutte. Faire scher
lair libre et examiner au microscope
/ Goutte paisse :
La coloration se fait comme pour le frottis, exception faite de ltape de la fixation.
d) Lecture :
Elle se fait lobjectif immersion (x 100). La numration des Plasmodiums (parasitmie) est faite sur la
goutte paisse. Le nombre de parasites par microlitre de sang est tabli par rapport au nombre de leucocytes,
fix 8000 par microlitre.
3.3.3. Recherche des oeufs de bilharzies dans les urines :
a) Prlvement :
Recueillir soit les urines de fin de miction entre 10 et 14 h aprs un effort modr soit celles de 24 heures.
Aprs homognisation, centrifuger 10 ml durines 3000 tours /mn pendant 5 minutes.
b) Examen :
Il est fait sur le culot de centrifugation des urines.
Parcourir toute la prparation lobjectif x 10

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 60)

3.3.4. Recherche des microfilaires dans le sang


a) Prlvement
Prlever 5 ml de sang par ponction veineuse. Le sang est recueilli sur anticoagulant, de prfrence le
citrate de sodium 3,8% raison de 0,4 ml pour 1,6ml de sang ou dfaut lEDTA.
Remarques :
- Les autres anticoagulants sont dconseills car lhparine provoque une agglutination des microfilaires ;
le fluorure de sodium et loxalate de sodium tuent les microfilaires.
- Pour la recherche des microfilaires diurnes (Loa loa) le prlvement doit tre effectu de prfrence
entre 12 et 14 heures ; pour celles des microfilaires nocturnes (Wuchereria bancrofti), lheure propice
est entre 22 heures et minuit .Cependant, lutilisation dune technique de concentration permet deffectuer
tous les prlvements pendant la journe.
b) Frottis sanguins colors au Giemsa
Mme procdure que pour la recherche des plasmodies mais le temps de coloration doit tre de 25
minutes.
c) Gouttes paisses colores au Giemsa
Dshmoglobiniser avec quelques gouttes deau jusqu lyse totale des hmaties. Egoutter, scher, fixer
au mthanol puis colorer avec une solution 10%de Giemsa pendant 25 minutes. Rejeter le colorant.
Laver sous un fin filet deau de robinet ; scher lair libre.
d) la technique de leucoconcentration la saponine
Dans un tube centrifuger cnique
- Mettre 5 ml de sang citrat
- Ajouter 10 ml de srum physiologique
- Mlanger par retournement du tube
- Ajouter quelques gouttes de saponine 2% jusqu lobtention dun sang rouge laqu
- Retourner le tube plusieurs fois et sassurer que lhmolyse est complte (le liquide au niveau du
cne doit tre limpide)
- Laisser reposer 5 minutes
- Centrifuger 1500 tours/mn pendant 10 minutes
- Rejeter le surnageant
- Recueillir laide dune pipette Pasteur le culot qui renferme les leucocytes et les parasites vivants
- Examiner le culot entre lame et lamelle et aprs coloration au Giemsa
e) Examen microscopique
Les frottis , gouttes paisses et culot de leucoconcentration colors au Giemsa doivent dabord tre
observs lobjectif x 10 ou x 40 pour la recherche des microfilaires . Lidentification des
espces de microfilaires se fait lobjectif 100 sous huile immersion.

3.3.5. Assurance qualit et systme de rfrence :


Deux personnes effectuent les lectures microscopiques. Il doit y avoir corrlation des rsultats.
Voir ci-aprs les photos et tailles des parasites humains.

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 61)

I. Dans les selles :


Larves dAnguillules :

ufs dAscaris :

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 62)

ufs de Trichuris trichiura (trichocphale

ufs doxyures au scotch test anal :

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 63)

ufs dAnkylostomes :

Hymnolpis nana : anneaux et ufs

Anneaux

ufs

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 64)

Oocystes de cryptospridium aprs coloration de Ziehl Nielsen :

ufs de Fasciola Hepatica

Amibe Entamoeba histolytica histolytica

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 65)

Forme vgtative et kyste de Giardia intestinalis

Trophozoite (forme vgtative)

Kyste

Anneaux et ufs de tnia :

Anneaux de Tnia saginata

ufs de tnia

Schistosoma mansoni :

ufs : peron latral


RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 66)

II. Dans le sang :


Plasmodium :

Trypanosomes :

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 67)

Filaires :

Microfilaires de Loa Loa

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 68)

Filaire de Mdine : Dracunculose

III. Dans les urines :


Schistosoma haematobium :

ufs : peron terminal

Accouplement de schistosomes

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 69)

3.4. BACTERIOLOGIE
3.4.1. Urines :
a) Prlvement
Conditions :
. De prfrence, recueillir les urines du matin avant toute miction ; dfaut, on peut prlever les urines
tout moment, aprs une rtention dau moins 2 heures.
. Chez le malade sous sonde, viter de prlever directement dans la poche : clamper la tubulure et
ponctionner en amont du clampage aprs nettoyage soigneux.
. Prlever idalement avant toute antibiothrapie
. Respecter une asepsie rigoureuse
Technique
. Chez ladulte et grand enfant :
Au cours dune miction physiologique, il faut nettoyer le mat urinaire, rejeter les premires gouttes durines
et recueillir les urines en milieu de jet dans un pot strile.
. Chez le Nourrisson et le petit enfant :
Appliquer une poche adhsive strile autour des organes gnitaux externes et la changer toutes les 30
minutes en labsence de miction.
. En cas de rtention aigue durines, le recueil des urines se fait par sondage vsical ou par ponction
sus pubienne
Transport
Procder un envoi immdiat de lchantillon au laboratoire avec une fiche de renseignements bien remplie.
Les urines peuvent aussi tre conserves +4C pendant 2 heures.
b) Examen macroscopique :
Il permet dapprcier lil nu laspect des urines : claires, troubles, purulentes, hmatiques.
c) Examen microscopique :
Lexamen ltat frais est effectu sur les urines totales et permet une apprciation quantitative ou
semi quantitative des leucocytes, des hmaties, des cellules pithliales (en nombre / champ ou en croix).
Cet examen permet galement de vrifier la prsence de cristaux, de levures, de parasites (Trichomonas
vaginalis, ufs de bilharzies), et de prciser la morphologie et la mobilit des bactries.
La coloration de Gram est effectue sur un frottis ralis partir du culot de centrifugation. Elle
apporte des informations supplmentaires sur les caractres morphologiques des bactries. Elle permet de
mieux apprcier la flore bactrienne.
d) Culture : Dnombrement des germes urinaires
Elle se fait sur des milieux permettant un dnombrement des germes urinaires pour dterminer le seuil
dinfection.
Il existe plusieurs mthodes dont celle de la lame glose qui consiste immerger la lame de DGU dans les
urines et la mettre en incubation 37C pendant 24 heures. La lecture consistera comparer la densit
des colonies bactriennes obtenue avec les modles fournis dans le kit. Une infection du tractus urinaire est
retenue lorsque le DGU donne un rsultat suprieur ou gal 105 bactries / ml avec une culture en souche
pure et la prsence de leucocyturie. Des mthodes alternatives peuvent tre utilises en labsence de lames
gloses.
RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 70)

e) Identification
A partir des colonies isoles, une galerie didentification est ensemence pour tudier les caractres
biochimiques. Lidentification est parfois complte par des tests immunologiques avec des srums
agglutinants.
f) Antibiogramme
Les antibiotiques sont choisis en fonction de lespce identifie. Les antibiotiques limins sous forme
active par voie urinaire sont toujours inclus dans la liste.
3.4.2. Pus et liquides dpanchement :
a)
Introduction
Le but est de dtecter lagent tiologique dun panchement.
Il existe diffrents types de foyers infectieux suppurs :
. foyers superficiels : plaies chirurgicales, mdicales ou traumatiques, escarres, brlures etc.
. foyers profonds : abcs : collection de pus dans une cavit
exemples : furoncles, anthrax, abcs des viscres
phlegmons : inflammation localise non collecte (prlvement souvent impossible)
adnites
. foyers des sreuses : pleursie : purulente, sro-fibrineuse
pritonite purulente, ascite
pricardite : purulente, sreuse
synovite : purulente, sreuse
b)

Prlvements
* Indications :
- on ne prlve que les collections fermes
- ne pas prlever les pus de plaies ouvertes car inexploitables
* Techniques
- nettoyer la peau avec de lalcool iod
- soit on prlve le pus avec une seringue
- soit on incise la collection avec un bistouri et on prlve le pus avec une pipette Pasteur ou un
couvillon
* Transport conservation
- transporter immdiatement le pus au laboratoire,
- utiliser des milieux de transport / conservation si ncessaire (grande distance)
- transporter le pus labri de loxygne (si germes anarobies rechercher)

c) Technologie au Laboratoire
/ Examen macroscopique
- noter la consistance du pus
. purulent
. sreux ou citrin : exsudat, transsudat
- noter la couleur du pus
. bleue : faisant penser au bacille pyocyanique
. chocolat : faisant penser au pneumocoque
- noter lodeur : trs ftide (voquant les anarobies)
RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 71)

/ Examen microscopique
- Coloration de May Grunwald Giemsa : oriente vers une infection bactrienne ou virale
. polynuclaires altrs : bactries pyognes
. lymphocytes : virus, BK
. absence de cellules : exsudat, transsudat
- Coloration de Gram : oriente le choix des milieux ensemencer
. qualit de la flore : monomicrobienne ou polymicrobienne
. quantit de la flore : abondance de germes
/ Culture :
- milieux
. gloses au sang frais ou sang cuit
. bouillon thioglycolate, ou bouillon cur-cervelle
- technique : mthode des quadrants
- recherches particulires
. anarobies : milieu de Rosenow, milieu de Schaedler
. glose de Lwenstein-Jensen pour la culture des BK
/ Rsultats et interprtation
- flore monomicrobienne : cest lidal
- flore polymicrobienne
. peut se voir en cas de pleursie ou de pritonite
. il sagit dune association de germes anarobies et de germes arobies
Caractristiques des liquides pleuraux
Composition
du liquide
Cellules/mm3
Lymphocytes
Neutrophiles
Germes
Culture
Protine g/l
Interprtation

Aspect macroscopique du liquide


Clair
< 500
+
+
0
< 20
Transsudat

Clair
> 500
+++
Rares
0
BK
> 20
Exsudat
(tuberculose)

Louche
> 500

+++
0
+
> 20
Exsudat
Pleursie

Purulent
> 2000
Rares
+++++
+++
+
> 50
Exsudat
Abcs

Hmatique
+
+
+ ou 0
; BK
> 20
Exsudat

Caractristiques des liquides articulaires


Liquide

Aspect
Coagulation
spontane
Leucocytes/mm3
Neutrophiles %
GS/GL X 100*
Culture

Normal

Septique

Tuberculose

inflammation

Clair
Non

Trouble
Oui

Trouble
Oui

trouble
Oui

<200
<25%

50000- 200000
25000
>80%
Variable
<50%
<50%
100%
Ngative
Variable
BK
Dosage des protines : sans intrt

5000-50000
50%
75%
Ngative

* : rapport glucose sanguin/glucose dans le liquide X 100


RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 72)

Produit pathologique

Examen macroscopique
- sreux, purulent
- crmeux, fluide
- pais, grains
- ftides
Collections fermes

- fluidifier
- homogniser

Ne pas cultiver

Culture
- milieux classiques
- milieux spciaux

Cytologie
- pharynges
- bronchiques
- alvolaires
- leucocytes

Plaies

Examen microscopique

Coloration de Gram

Coloration de Ziehl-Neelsen

Examen cytobactriologique des pus et liquides dpanchement

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 73)

3.4.3. Scrtions broncho-pulmonaires :


a) Introduction
Le but de ltude est de rechercher lagent tiologique dune infection germes banals des voies
respiratoires infrieures
c) Indications
Infections respiratoires infrieures
d) Prlvements
* Techniques
/ Expectorations
. matin au rveil, aprs toilette bucco-dentaire
. prlvement physiologique : aprs une toux
/ Scrtions prleves avec des instruments
. aspiration trans-trachale
. aspiration bronchique
. brossage bronchique
. lavage broncho-alvolaire (LBA)
* Transport - conservation
/ Transport immdiat au laboratoire (< 30mn)
/ Ne pas conserver
* Prlvements complmentaires
/ Hmoculture
/ Srum sanguin : recherche dantignes solubles

e) Technologie au Laboratoire
Examen macroscopique :
/ expectorations muqueuses, muco-purulentes, purulentes, hmoptoques etc.
/ aspects des liquides daspiration
/ fluidifier, homogniser
Examen microscopique :
/ fluidifier, homogniser
/ cytologie : coloration de May Grunwald Giemsa
. cellules pharynges < 25/champ (si > 25/champ : rejeter lchantillon)
. leucocytes
: > 25/champ : chantillon bon
: < 25 + flore monomorphe : chantillon bon
: < 25 + flore polymorphe : rejeter lchantillon
. autres cellules : bronchiques, alvolaires
/ Bactriologie : coloration de Gram
. flore monomorphe + PN > 25/ champ : cultiver
. prdominance dun germe + PN > 25/champ : cultiver
. autres situations : ne pas cultiver
RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 74)

Culture :
/ milieux
. ensemencer toujours : GSO et GSC + Facteurs de croissance
. autres milieux : en fonction du Gram
/ technique
. diluer les prlvements au 1/1000
. appliquer mthode des quadrants

Rsultats :
/ Devant des bactries pathognes spcifiques
- bronchopathies
. S. pneumoniae, H. influenzae, S. aureus
. B. catarrhalis, N. mucosa,
. Bacille pyocyanique, entrobactries
- pneumopathies
. pneumonie : S. pneumoniae
. abcs : K. pneumoniae, S. aureus, anarobies
. pneumopathies atypiques : M. pneumoniae,
Chlamydia, Legionella pneumophila
/ Interprtation ncessaire
- expectorations et aspirations non protges
. seuil : 107 bactries / ml de prlvement
. bactrie commensale : 105 bactries/ml
. signification douteuse : 106 bactries/ml
. Cytologie > 25 leucocytes/ml de prlvement
- aspirations bronchiques protges, trans-trachales
. seuil : 103 bactries / ml de prlvement
. prsence de cellules bronchiques et pulmonaires

3.4.4. Scrtions ORL :


a) Introduction
* Composition de la sphre ORL
- bouche, nez, sinus
- oreille
- pharynx ou gorge
* Intrt de la question : Rechercher des agents tiologiques des angines et des otites moyennes aigus
(OMA) non fistulises.
b) Prlvement du pharynx = prlvement de gorge
* Indications du prlvement de gorge
- tout pisode dangine
- angines rptition chez un enfant
- recherche de porteur sain de bactries pathognes spcifiques (BPS)

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 75)

* Prlvement
/Technique
-

matriel : couvillon strile ; abaisse-langue


noter laspect anatomo-clinique de langine
technique : frotter 2 couvillons sur les amygdales, la muqueuse du pharynx,
sous les fausses membranes

/ Transport conservation
- transport immdiat, sans dlai (risque de desschement)
- milieux de transport-conservation disponibles
- humidifier les prlvements si culture retarde
* Technologie au Laboratoire
/ Examen microscopique
- coloration de Gram
. apprcier qualit/quantit de la flore
. chercher isoler le germe prdominant
- coloration au bleu de mthylne
. pour apprcier la prsence de levures, la cytologie etc.
/ Culture
-

milieux
. gloses au sang frais + acide nalidixique
. glose au sang cuit + complexe vitaminique
. bouillon denrichissement : streptosel, BGT
. spciaux : au srum de buf coagul ; Hoyle
technique : mthode des quadrants

/ Recherches particulires
- Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum
- Candida albicans
- virus : Herpes simplex virus
/ Rsultats
- angines rouges ou rythmato-pultaces
. S. pyogenes, S. pneumoniae , Streptocoque du groupe C , Streptocoque du
groupe G
. Staphylococcus aureus, H. influenzae
. Candida albicans
. virus = 50%
- angines pseudomembraneuses
. Corynebacterium diphteriae
. Staphylococcus aureus
. virus : EBV (mononuclose infectieuse)
- angines ulcro-ncrotiques
. angine de Vincent : association de 2 germes
. chancre syphilitique : Treponema pallidum
- angines vsiculeuses : elles sont virales
RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 76)

Prlvement de gorge

Types dangines

Microscopie

- rythmateuse
- pseudomembraneuse
- ulcro-ncrotique

Bleu de
mthylne

Gram

- qualit flore
- quantit flore
Culture

Glose sang frais

Glose sang cuit + FC

Glose Sabouraud

- Isolement

- Identification
- Antibiogramme

Technologie du prlvement de gorge au Laboratoire de Bactriologie

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 77)

c) Prlvement de pus doreille


* Indications
-

otite moyenne aigu +++


otite interne +
furoncle du conduit auditif externe
ne pas prlever
: plaie du conduit auditif externe
: otite suppure spontanment

* Prlvements
/ Techniques
- Otite externe : ponction de furoncle
- OMA : faire une paracentse (acte mdical)
: nettoyer le CAE (antisepsie)
: poser un spculum et inciser
: aspirer le pus
/ Transport conservation
- transport immdiat au laboratoire
- milieux de transport-conservation
* Technologie au Laboratoire
/ Examen macroscopique
- Scrtions fluides, purulentes
- Odeur : ftides (anarobies)
/ Examen microscopique
- coloration de Gram : flore monomicrobienne
- bleu de mthylne : levures, cytologie etc.
/ Culture
- milieux : GSO, GSC + complexe vitaminique
- technique : mthode des quadrants
/ Rsultats
-

otite moyenne aigu


. S. pneumoniae, Streptococcus spp.
. S. aureus, H. influenzae, Entrobactries, bacille pyocyanique
otite externe (furoncle) : S. aureus

d) Autres prlvements : ORL et oculaire


* Prlvement de sinus
- indications : sinusites aigus ou chroniques
- technique : ponction-lavage, couvillonnage mat
- examen macroscopique
- examen microscopique : flore souvent mixte : arobie-anarobie
parfois monomicrobienne
- milieux de culture : dpendent de la flore
- germes : S. pneumoniae, H. influenzae, S. aureus, streptocoques, bactries anarobies

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 78)

* Prlvement buccal et nasal


- Indications : lpre, ozne, rhinosclrome, portage
- Technique : couvillonnage
- Examen macroscopique ;
- Examen microscopique : Gram, Ziehl-Neelsen
- Milieux de culture : fonction du germe recherch
- Germes : M. leprae, K. rhinoscleromatis, K. ozenae, BPS en portage
* Prlvement oculaire
- Indications : conjonctivites
- Technique : couvillonnage au niveau de langle interne, du cul de sac lacrymal, de la conjonctive
palpbrale
- Examen macroscopique
- Examen microscopique aprs coloration de Gram
- Milieux de culture : fonction du germe recherch
- Germes : Chlamydia trachomatis, Moraxella, pneumocoque, gonocoque, Haemophilus,
Staphylococcus aureus

3.4.5. Hmoculture
a) Introduction
Il sagit de rechercher un agent tiologique dans le sang lors dune infection
Le sang est normalement strile, et la prsence de bactries dans le sang peut signifier :
. une bactrimie : dcharges transitoires de bactries dans le sang pouvant tre physiologique
(aprs les repas) ou pathologique ( partir dun foyer infectieux),
. une septicmie : dcharges rptes de bactries dans le sang avec fivre trs leve. Les
causes frquentes sont : lendocardite, la thrombophlbite, la fivre typhode.
Les indications de lHmoculture sont :
- toute fivre inexplique chez un cardiaque, une femme enceinte, un immunodprim
- tableau de septicmie
- hypothermie
b) Prlvement :
* Techniques :
- moment du prlvement : quand prlever ?
. quand ? : avant toute antibiothrapie, au moment des pics fbriles, loin des repas
. rythme : faire une hmoculture toutes les 6H
- techniques : comment et o prlever ?
. o : tout territoire veineux disponible
. comment (technique) : badigeonner la peau lalcool
poser un garrot
ponctionner la veine avec une seringue strile
recueillir 10 ml de sang chez ladulte, 5 ml chez lenfant et
1 ml chez le nouveau-n.

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 79)

- culture du sang : hmoculture


. milieux de culture : bouillon cur cervelle (BCC), bouillon trypticase soja (BTS) etc.
. technique de culture.
: nettoyer le capuchon du ballon dhmoculture avec de lalcool iod
: disposer dune flamme : bec bunsen notamment.
: injecter le sang dans le ballon sans louvrir au travers du capuchon et cela le plus prs
possible de la flamme
: tiqueter le ballon en prcisant lheure et la date de prlvement, puis lacheminer au
laboratoire accompagn dun bulletin danalyse correctement rempli.
* Transport-conservation
- transport immdiat au laboratoire
- conservation = incubation +37C
b) Technologie au Laboratoire
* Incubation et surveillance
- incubation en atmosphre arobie + 37C
- examiner les ballons tous les jours
* Traitement dune hmoculture positive
- le ballon devient trouble en 2-3 jours
- faire un examen ltat frais et aprs une coloration de Gram
- repiquer systmatiquement sur glose au sang et glose MH
- ensemencer une galerie didentification
- raliser un antibiogramme
* Traitement dune hmoculture ngative
- garder les ballons non suspects pendant 7 10 jours
- repiquer systmatiquement sur glose au sang
- si culture ngative, rendre les rsultats
* Recherches particulires
- mdulloculture
. fivre typhode, brucellose
. tuberculose miliaire
- borrliose, leptospirose : milieux spciaux
c) Interprtation des rsultats
* Hmoculture positive
- le diagnostic bactriologique est sr en prsence de bactries pathognes spcifiques comme : .
Salmonella Typhi
. Streptococcus pneumoniae
. Neisseria meningitidis
. Brucella
- en prsence de bactries pathognes opportunistes, le diagnostic reposera sur :
. leur isolement dans plusieurs ballons successifs
. si la culture est positive dans un seul ballon, le choix sera difficile entre une souillure et une bactrimie
- prsence de plusieurs germes dans un ballon
. soit cest une souillure
. soit cest une infection si le malade est cathtris, ou immunodprim

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 80)

* Hmoculture ngative
- absence dinfection bactrienne du sang
- HC faite tardivement dans lvolution de la maladie
- malade sous antibiotique
- quantit de sang prleve insuffisante
- milieux ou conditions de culture inappropris
- dlai dobservation trop court

Ballon dhmoculture

Incubation-observation
(atmosphre aro/anarobie)
Hmoculture positive
- dlai : 2-3 jours
Cas particuliers

Hmoculture ngative
- dlai : 7 jours
Examen
microscopique

Identification
- Etat frais
- Gram

- galerie
- recherche dAg
- ABG

Interprtation des rsultats

Schma de la technologie de lhmoculture

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 81)

3.4.6. Srologies :
A/ Srodiagnostic de Widal et Flix
Cest le diagnostic indirect ou srologique des salmonelloses par la recherche danticorps spcifiques des
antignes O, H, Vi de Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A , B, C, Salmonella Enteritidis et Salmonella
Typhimurium.
v Indications
Diagnostic des fivres typhode et paratyphodes
v Prlvement
sang veineux chez un patient jen
srum recueilli aprs centrifugation
v Ractifs
srums agglutinants de trois types :
- srums contenant des Antignes O = Ag somatiques, dnaturs lalcool
TO AO BO CO
- srums contenant des Antignes H = Ag flagellaires, dnaturs au formol
TH AH BH CH ENH -TMH
- srums contenant des Antignes Vi = Ag capsulaires, dnaturs lalcool de
S. Typhi, S. Paratyphi C, S. Dublin
v Principe
Raction dagglutination entre Ag et Ac (Srum tudier et suspensions antigniques)
v Technique
Se fait en deux temps :
- Dtecter la prsence des Anticorps anti O, H, et Vi aux dilutions 1/100e et 1/200e
- Procder au titrage de ces Anticorps
1- DETECTION DES ANTICORPS

Srum dilu au 1/100e + suspensions antigniques


Srum dilu au 1/200e + suspensions antigniques
Centrifugation Chiquenaude Lecture :
Dgagement de fume rsultat ngatif
Prsence dagglutinats (grains) rsultat positif
2- TITRAGE

Dilutions du srum positif


Dilutions croissantes de raison 2 : 1/400, 1/800, 1/1600e
Centrifugation Chiquenaude Lecture
Titre final = inverse de la dernire dilution positive
Exemple : si dilution 1/400e positive Titre : 400 UI/ml

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 82)

v Interprtation
Elle permet de prciser le srotype de Salmonelle en cause et de dterminer la priode de la maladie
grace ltude de la cintique des anticorps
Agglutinines O : apparaissent vers le 8e jour, montent puis atteignent le titre de 400.
Ils disparaissent aprs 2 3 semaines
Si le taux est > 100 : infection rcente ou en cours
Agglutinines H : apparaissent entre le 10e et 12e jour, atteignent rapidement le titre de 800 1600, mais
persistent titre faible pendant plusieurs mois voire annes
On les retrouve seuls lors dinfection ancienne ou dune infection rcente avec antibiothrapie prcoce.
Leur association avec lAg O signe une infection rcente ou en cours
- Le srodiagnostic est normalement positif pour un srotype de Salmonella
- Possibilit de communaut antignique entre diffrents srotypes : coagglutination
- Une srologie ngative nlimine pas une Salmonellose
- Contrle au bout de 2 3 semaines : volution des taux
NB : Manque de sensibilit et de spcificit
Il existe des faux positif : paludisme, dysglobulinmie, typhus exanthmantique

B/ Srodiagnostic des streptococcies : ASLO


Les streptocoques scrtent des substances antigniques appeles toxines qui induisent la production
danticorps anti-toxines spcifiques par lorganisme infect.
La recherche de ces anticorps dans le srum du sujet atteint et leur dosage permettent un srodiagnostic.
En pratique, la recherche la plus couramment demande est le dosage des anticorps antistreptolysines
O (ASLO).
RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 83)

v But
Recherche danticorps antistreptolysine O dans le srum humain.
v Principe
Cest un test bas sur une raction dagglutination sur carte.
Le ractif est constitu par un antigne fait de particules de latex polystyrne recouvertes de streptolysines
O.
En prsence danticorps antistreptolysines O dans le srum tester, il se forme une agglutination visible
lil nu.
v Matriel ncessaire
- Kit ractif qui comprend : ractif, contrle positif, contrle ngatif, tigettes, carte dagglutination ( le kit
est conserv +4C)
- Agitateur mcanique (non indispensable)
v Mode opratoire
Sortir les ractifs et les laisser temprature ambiante
Prlever le sang du patient, centrifuger et recueillir le srum
A laide dune carte sur laquelle sont individualiss des cercles, dposer 50ul de srum
tester dans un cercle et une goutte de chaque contrle positif et ngatif dans dautres cercles
Agiter le ractif ASLO et ajouter une goutte cot de chaque chantillon.
Mlanger, laide dune tigette usage unique, de faon recouvrir toute la surface
du cercle (changer de tigette pour chaque cercle)
Agiter la carte 100 tours/mn ou imprimer un mouvement de rotation avec les mains
pendant 2 minutes
Lire la raction obtenue.
v Lecture et Interprtation
- Absence dagglutination : raction ngative = absence danticorps antistreptolysine O
- Prsence dagglutination : raction positive = prsence danticorps antistreptolysine O
Une raction positive traduit un taux >200UI/ml (seuil de positivit du ractif utilis, Bio Mrieux)
Tout srum positif doit tre titr.
Pour titrer, on procde des dilutions sries de 2 2 (1/2,1/4,1/8 etc)
Le taux final sera dfini comme tant la plus grande dilution qui donne une raction positive (srum positif
la dilution 1/A : titre = A x seuil
exemple : un srum positif la dilution 1/8 correspond un titre de 8 x 200 soit 1600 UI/ml.
Un taux dASLO < ou = 200UI/ml est considr comme normal chez le sujet africain.
Un taux > 200UI/ml signe une infection rcente.

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 84)

3.5. Antibiogramme
Source: Comit de Lantibiogramme de la Socit Franaise de Microbiologie - Recommandations 2007
3.5.1 - Enterobacteriaceae, bacilles Gram ngatif non fermentaires (Pseudomonas
aeruginosa, Acinetobacter spp., Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia cepacia ),
Staphylococcus spp., Enterococcus spp.
- Inoculum
A partir dune culture de 18-24 h sur milieu glos non slectif, prparer une suspension en bouillon
Mueller-Hinton ou en solution saline (0,9 % NaCl) quivalente au standard McFarland 0,5 (~ 108 UFC/
ml).
Cette suspension peut galement tre prpare partir dune culture en bouillon Mueller-Hinton obtenue
aprs incubation 37 C au bain-marie agit pendant 3 5 h, et dont la densit est ajuste au standard
McFarland 0,5.
- Milieu
Glose Mueller-Hinton
- Ensemencement
Diluer la suspension inoculum au 1/100 (~ 106 UFC/ml) et ensemencer par couvillonnage ou par inondation
en respectant les mesures de scurit ncessaires.
Cas particulier : Pour Staphylococcus aureus et pour loxacilline, diluer la suspension inoculum au 1/10
(~ 107 UFC/ml) et incuber 30C sur milieu non supplment en chlorure de sodium ou 37C sur milieu
hypersal (2 4%).
Prolonger ventuellement lincubation jusqu 48 h si la croissance apparat faible aprs 24 h.
- Lecture
Aprs 18-24 h dincubation 35-37 C.
- Antibiotiques tudier
v Enterobacteriaceae
Amoxicilline ou Ampicilline

Imipnme

Amoxicilline + ac. Clavulanique ou

Chloramphnicol

ampicilline/sulbactam

Ttracycline / Doxycycline (si Shigella)

Ticarcilline

Gentamicine

Pipracilline ou M ezlocilline

Kanamycine

Mcillinam

Tobramycine

Cfalotine

Cotrimoxazole

Cfoxitine

Colistine

Ceftriaxone ou cfotaxime

Ntilmicine

Ceftazidime

Acide nalidixique

Cfixime

Norfloxacine ou Pfloxacine ou ofloxacine

Aztronam

Ciprofloxacine
Nitrofuranes

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 85)

Concentrations critiques, diamtres critiques et lecture interprtative


Antibiotique
C
TE
CS
SXT
NT
NA
CIP
NOR
PEF

Charge
disque
30
30 UI
50
1,25/23,75
300
305
5
5
5

Concentration critique mg/ml

S
8
4
2
2/38
32
5
0,5
0,5
1

R
16
8
2
8/152
128
16
1
1
4

Diamtre critique mm
S
R
23
19
19
17
15
15
16
10
17
14
20
15
25
22
25
22
22
16

v Pseudomonas aeruginosa

Ticarcilline

Kanamycine (Rsistance naturelle)

Ticarcilline/ac. clavulanique

Gentamicine

Pipracilline

Tobramycine

Aztronam

Amikacine

Cefsulodine

Ntilmicine

Ceftazidime

Colistine

Imipnme ou mropnme

Pfloxacine

Aztronam

Ciprofloxacine

Chloramphnicol

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 86)

- Concentrations critiques, diamtres critiques et lecture interprtative

Antibiotique

TIC
TCC
PIP
IMP
ATM
CAZ
CFS
CFM
TM
AN
GM
NET
CS
CIP
RIF

v Autres bacilles Gram ngatif non fermentaires (Acinetobacter spp.,


Charge
Concentration critique mg/ml
Diamtre critique mm
Stenotrophomonas,
Burkholderia
cepacia....)
disque
S
R
S
R
75
16
75/10
16//2
75
16
Ticarcilline
10
4
Ticarcilline/ac. clavulanique
30
4
Pipracilline
30
4
30
8
Pipracilline/tazobactam
30
4
Ceftazidime
10
4
30
8
Cfpime
15
4
Imipnme
30
4
50
4
Gentamicine
5
1
30
4

64
64/2
64
8
32
32
32
32
4
16
4
4
4
2
19

22
18
22
18
18
12
Amikacine
22
17
Ntilmicine
20
15
Tobramycine
21
15
22
14
Chloramphnicol
21
15
Ttracycline
16
14
17
15
Colistine
16
14
Cotrimoxazole
19
17
22
19
Ciprofloxacine
22
19
19
14

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 87)

- Concentrations critiques, diamtres critiques et lecture interprtative


Antibiotique

TIC
TCC
PIP
IMP
ATM
CAZ
CFM
TM
AN
GM
NET
C
TE
CS
PEF
CIP
SXT

Charge
disque

Concentration critique mg/ml


S
R

75
75/10
75
10
30
30
30
10
30
15
30
30
30 UI
50
5
5
1,25/23,75

16
16//2
16
4
4
4
4
4
8
4
4
8
4
4
1
1
2/38

Diamtre critique mm
S
R

64
64/2
64
8
32
32
32
4
16
4
4
16
8
4
4
2
8/152

22
22
18
22
20
21
21
16
17
16
19
23
19
22
22
22
16

18
18
12
17
15
15
15
14
15
14
17
19
17
19
16
19
10

v Staphylococcus spp.

Pnicilline G

Acide fusidique

Oxacilline (sur MH 5% Nacl)

Cotrimoxazole

Cfoxitine

Chloramphnicol

Gentamicine

Ttracycline

Kanamycine

Pfloxacine

Tobramycine

Ciprofloxacine

Erythromycine

Fosfomycine

Lincomycine

Vancomycine

Pristinamycine

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 88)

- Concentrations critiques, diamtres critiques et lecture interprtative


Antibiotique

PG
OX
FOX
K
TM
GM
E
L
P
PEF
CIP
C
TE
FA
RIF
VAN
SXT

Charge
disque

6
5
30
30 UI
10
15
15 UI
15
15
5
5
30
30 UI
10
30
30
1,25/23,75

Concentration critique mg/ml


S
R

0,25
2

0,25
2

8
1
1
1
2
1
1
1
8
4
2
0,5
4
2/38

16
1
1
4
8
2
4
2
16
8
16
16
8
8/152

Diamtre critique mm
S
R

29
20
27
15
20
20
22
21
22
22
22
23
19
22
29
17
16

29
20
23
133
20
20
17
17
19
16
19
19
17
15
14
10

v Enterococcus spp.

Ampicilline

Chloramphnicol

Oxacilline

Ttracycline

Kanamycine

Erythromycine

Gentamicine

Lincomycine ou clindamycine

Nitrofuranes

Pristinamycine

Vancomycine

Cotrimoxazole
Fluoroquinolones

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 89)

- Concentrations critiques, diamtres critiques et lecture interprtative


Antibiotique

AM
K
GM
C
TE
E
L
P
SXT
VAN

Charge
disque

Concentration critique mg/ml


S
R

10
1000
500
30
30 UI
15 UI
15
15
1,25/23,75
30

4
250
250
8
4
1
2
1
2/38
4

Diamtre critique mm
S
R

16
500
500
16
8
4
8
2
8/152
8

19
14
17
23
19
22
21
22
16
17

14
12
11
19
17
17
17
19
10
-

3.5.2 - Streptococcus pneumoniae, Streptococcus spp.


- Inoculum
A partir dune culture de 18-24 h sur glose Mueller-Hinton additionne de 5 % de sang de mouton,
prparer une suspension en bouillon Mueller- Hinton ou en solution saline (0,9 % NaCl) quivalente au
standard McFarland 0,5 (~108 UFC/ml)
- Milieu
Glose Mueller-Hinton additionne de 5 % de sang de mouton.
Pour le cotrimoxazole, utiliser une glose Mueller-Hinton + 5 % de sang de cheval hmolys.
- Ensemencement
Diluer la suspension inoculum au 1/10 (~ 107 UFC/ml) et ensemencer par couvillonnage ou par
inondation en respectant les mesures de scurit ncessaires.
- Lecture
Aprs 18-24 h dincubation 35-37C
- Antibiotiques tudier
v Streptococcus pneumoniae

Pnicilline G

Chloramphnicol

Ampicilline ou amoxicilline

Cotrimoxazole

Oxacilline

Fosfomycine

Cfotaxime ou ceftriaxone

Lincomycine

Gentamicine

Pristinamycine

Kanamycine

Norfloxacine

Ttracycline

Vancomycine

Erythromycine

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 90)

- Concentrations critiques, diamtres critiques et lecture interprtative


Antibiotique

OX
K
GM
C
TE
E
L
P
SXT
CIP
VAN

Charge
disque

Concentration critique mg/ml


S
R

5
1000
500
30
30 UI
15 UI
15
15
1,25/23,75
5
30

250
250
8
4
1
2
1
2/38
0,12
4

Diamtre critique mm
S
R

21
14
17
23
19
22
21
19
16
30
17

500
500
16
8
4
8
2
8/152
2
8

10
11
19
17
17
17
10
19
-

v Streptococcus spp. (autres que S. pneumoniae)

Pnicilline G

Lincomycine

Ampicilline ou amoxicilline

Pristinamycine

Oxacilline

Chloramphnicol

Gentamicine

Cotrimoxazole

Kanamycine

Fluoroquinolones

Ttracycline

Vancomycine

Erythromycine

- Concentrations critiques, diamtres critiques et lecture interprtative


Antibiotique

OX
K
GM
C
TE
E
L
P
SXT
CIP
VAN

Charge
disque

5
1000
500
30
30 UI
15 UI
15
15
1,25/23,75
5
30

Concentration critique mg/ml


S
R

250
250
8
4
1
2
1
2/38
0,12
4

500
500
16
8
4
8
2
8/152
2
8

Diamtre critique mm
S
R

26
14
17
23
19
22
21
19
16
30
17

10
11
19
17
17
17
10
19
-

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 91)

3.5.3 - Haemophilus influenzae


- Inoculum
A partir dune culture de 18-24 h sur glose chocolat PolyViteX, prparer une suspension en bouillon
Mueller-Hinton ou en solution saline (0,9 % NaCl) quivalente au standard McFarland 0,5 (~ 107
UFC/ml).
- Milieu
Glose chocolat PolyViteX ou Milieu HTM (Mueller-Hinton + NAD 15 mg/l + hmine 15 mg/l +
extrait de levure 5 g/l).
- Ensemencement
Diluer au 1/10 la suspension inoculum (~106 UFC/ml) et ensemencer par couvillonnage ou par
inondation en respectant les mesures de scurit ncessaires.
- Lecture
Aprs 18-24 h dincubation 35-37 C.
- Antibiotiques tudier
Ampicilline

Chloramphnicol

Amoxicilline/ac. clavulanique

Kanamycine

Cfalotine

Gentamicine

Cftriaxone

Fluoroquinolones

Ttracycline

Cotrimoxazole

- Concentrations critiques, diamtres critiques et lecture interprtative


Antibiotique

AM
CF
AMC
TE
SXT
C
RIF
K
GM
NA

Charge
disque

2
30
20/10
30 UI
1,25/23,75
30
30
30 UI
15
30

Concentration critique mg/ml


S
R

2/1
2
0,5/9,5
2
2
8
2

1
8
4
1/19
4
4
16
4

Diamtre critique mm
S
R

21
23
24
28
24
18
15

20
17
18
24
20
15
14
21

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 92)

3.5.4 - Neisseria meningitidis


- Inoculum
A partir dune culture de 18-24 h sur glose chocolat PolyViteX, prparer une suspension en tampon
phosphate M/15 pH 7,2 quivalente au standard McFarland 0,5 (~ 106 UFC/ml).
- Milieu
Glose Mueller-Hinton additionne de 5% de sang de mouton.
- Ensemencement
Ensemencer la suspension inoculum par couvillonnage ou par inondation en respectant les mesures de
scurit ncessaires. Disposer les disques une distance de 60 mm, centre centre, afin dviter le
chevauchement des zones dinhibition.
- Lecture
Aprs 18 20 h dincubation 35-37 C en atmosphre contenant 5 % de CO2.

- Antibiotiques tudier
Pnicilline G

Chloramphnicol

Oxacilline

Spiramycine

Amoxicilline

Ciprofloxacine

Cfotaxime ou ceftriaxone

Cotrimoxazole

Gentamicine

Erythromycine

- Concentrations critiques, diamtres critiques et lecture interprtative


Antibiotique

Charge
disque

OX
OX
C
RIF

5
1
30
30

Concentration critique mg/ml


S
R

2
0,25

4
-

Diamtre critique mm
S
R

18
11
30
30

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 93)

3.5.5 - Neisseria gonorrhoeae


- Inoculum
A partir dune culture de 18-24 h sur glose chocolat PolyViteX, prparer une suspension en tampon
phosphate M/15 pH 7,2 quivalente au standard McFarland 1 (~108 UFC/ml).
- Milieu
Glose chocolat PolyViteX
- Ensemencement
Ensemencer la suspension inoculum dilue au 1/100 ou ajuste au standard McFarland 0.5 (~106 UFC/
ml) par couvillonnage ou par inondation en respectant les mesures de scurit ncessaires. Disposer les
disques une distance de 60 mm, centre centre, afin dviter le chevauchement des zones dinhibition.
- Lecture
Aprs 18-24 h dincubation 35-37 C en atmosphre contenant 5 % de CO2, et, si la croissance est
insuffisante, aprs 36-40 h.
- Antibiotiques tudier

Pnicilline G ou amoxicilline

Chloramphnicol

Ceftriaxone

Erythromycine

Spectinomycine

Acide nalidixique

Ttracycline

Ciprofloxacine ou ofloxacine

- Concentrations critiques, diamtres critiques et lecture interprtative


Antibiotique

Charge
disque

SPT
TE
NA

100
30 UI
30

Concentration critique mg/ml


S
R

64
1

64
4

Diamtre critique mm
S
R

20
-

20
19
25

CONTROLE DE QUALITE INTERNE


Un contrle de qualit interne doit tre organis pour sassurer de la validit des rsultats obtenus. Les
souches de rfrence recommandes sont les suivantes :
Escherichia coli CIP 7624 (ATCC 25922),
Pseudomonas aeruginosa CIP 76110 (ATCC 27853),
Staphylococcus aureus CIP 7625 (ATCC 25923),
Providencia stuartii CIP 107808,
Streptococcus pneumoniae CIP 104485

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 94)

3.6. ANATOMIE ET CYTOLOGIE PATHOLOGIQUES


3.6.1. Types de prlvement
v Frottis cervico-vaginal de dpistage :
Parmi les actes mdicaux ncessaires au dpistage et au diagnostic des lsions prcancreuses et cancreuses
du col utrin, le frottis cervico-vaginal de dpistage (Papanicolaou) doit rester lexamen de premire
intention, qui est facile pratiquer, indolore et fiable.
Cet examen permet aussi dapprcier limprgnation hormonale du tractus gnital de la femme et
accessoirement de faire le diagnostic dinfections gnitales.
v Liquides biologiques :
Urines, expectorations, lavages broncho-alvolaires, brossages des muqueuses, panchements des sreuses
(plvre, pricarde, pritoine), de la synoviale articulaire et du liquide cphalo-rachidien (LCR), coulements
mamelonnaires spontans ou provoqus. Le volume de prlvement souhait est de 5 10 ml.
v Ponction laiguille fine de masses palpables :
Les masses solides ou kystiques accessibles la vue ou lEchographie peuvent faire lobjet dune ponction
laide dune aiguille fine et le produit de ponction tal sur lames ; on ralisera aussi des frottis dulcrations
du mamelon ou des lsions eczmatiformes aprs grattage.
Le matriel recueilli lors de la ponction est tal sur des lames de verre en couches minces, puis fixs la
laque ou lair ambiant (prciser sur la demande dexamen le mode de fixation). Il faut un lot de lames
suffisant.
Lorsquon retire du liquide, celui ci doit tre adress rapidement au laboratoire pour une centrifugation ou
une cytocentrifugation. En cas de dlai, la prfixation est indispensable et une conservation + 4C.
v Biopsies et pices opratoires (si le Centre de sant est dot dun bloc opratoire)
Les chantillons de petite taille (biopsies endoscopiques, biopsies la pince, biopsie partielle cutane ou
biopsie exrse, etc.) peuvent tre fixs dans du liquide de Bouin (viter alors les contenants en plastique),
ou dans du formol 10%.
Les chantillons de grande taille en loccurrence les pices opratoires peuvent tre adresss au laboratoire
aprs fixation dans du formol 10% dans un rcipient de grande taille pouvant contenir 5 10 fois le
volume de la pice en fixateur et ouverture large. Il est recommand de ne pas sectionner la pice pour
permettre au Pathologiste den faire un examen macroscopique correct et des prlvements de bonne
qualit.
3.6.2. Matriel de laboratoire ncessaire
v Frottis cervico-vaginal de dpistage
Spculums, Spatules dAyre, brosses endocervicales, laque cytofixiante ou mlange alcool-ether, lames
porte-objet propres, lamelles, milieu de montage, colorants et solvants
v Liquides biologiques
Flacons propres, alcool 50, EDTA, lames porte-objet propres, lamelles, milieu de montage, colorants et
solvants

RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 95)

v Biopsies et pices opratoires


Rcipients propres, formol dilu 10% tamponn
Les chantillons de petite taille (biopsies endoscopiques, biopsies la pince, biopsie partielle cutane ou
biopsie exrse, etc.) peuvent tre fixs dans du liquide de Bouin (viter alors les contenants en plastique),
ou dans du formol 10%.
Les chantillons de grande taille en loccurrence les pices opratoires peuvent tre adresss au laboratoire
aprs fixation dans du formol 10% dans un rcipient de grande taille pouvant contenir 5 10 fois le
volume de la pice en fixateur et ouverture large. Il est recommand de ne pas sectionner la pice pour
permettre au Pathologiste den faire un examen macroscopique correct et des prlvements de bonne
qualit.

3.6.3. Modes de prlvement


v Frottis cervico-vaginal de dpistage
Les conditions de prlvements sont une abstinence dau moins 48 heures, une absence de menstrues et
de traitement local par des ovules au moment du prlvement.
Commencer par moucher le col afin de diminuer les scrtions. A laide de la spatule raliser un frottis
partir des scrtions vaginales, dun prlvement exocervical et grce la brosse endocervicale faire un
prlvement endocervical et ltaler sur une lame.
v Liquides biologiques
Le seul impratif est que le prlvement soit fait dans des conditions dasepsie et que lchantillon soit mis
dans un rcipient propre.
v Biopsies et pices opratoires
Les modes de prlvements sont variables. Il faut viter de prlever des zones de ncrose, des caillots
sanguins, ou des foyers de calcifications pathologiques. Autant que possible, le prlvement en cas de
biopsie sous contrle de la vue se fera cheval entre la zone saine et la zone pathologique.
Tous ces chantillons seront accompagns dune fiche dexamen anatomo-pathologique sur laquelle
seront mentionns les donnes personnelles du patient, un rsum clinique et paraclinique et des
hypothses diagnostiques.

3.6.4. Procdures de conservation


v Frottis cervico-vaginal de dpistage
Fixation immdiate des frottis laide de la laque cytofixiante ou immersion des lames fraches dans un
volume alcool-ether pendant 4-5 min
v Liquides biologiques
Mlange volume gal du liquide prlev avec de lalcool 50 dans un rcipient propre.
Si le liquide est hmorragique, il faut le mettre dans un tube EDTA.
v Biopsies et pices opratoires
Immersion dans 5 10 fois le volume de lchantillon avec du formol tamponn 10%
RNL Sngal : Manuel de Procdures techniques (Page 96)

3.6.5. Procdures dacheminement


Tous ces chantillons doivent tre achemins au laboratoire dans des dlais raisonnables.
v Frottis cervico-vaginal de dpistage
Mettre les lames qui auront t pralablement identifies pour chaque patient dans des botes de
transport de lames
v Liquides biologiques
Chaque flacon devra porter le nom et le prnom du patient, son ge, son sexe et le service de provenance.
Eviter dcrire sur les couvercles des rcipients et utiliser des rcipients qui ferment hermtiquement.
v Biopsies et pices opratoires
Chaque flacon devra porter le nom et le prnom du patient, son ge, son sexe et le service de provenance.
Eviter dcrire sur les couvercles des rcipients et utiliser des rcipients qui ferment hermtiquement.

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