LAS ENZIMAS II

CENTRO ACTIVO
MECANISMO DE ACCION
CLASIFICACIN
CINETICA ENZIMATICA

abril 2012

Enzimas II - CA

Modelos de unin E-S

abril 2012

Enzimas II - CA

Centro activo

abril 2012

Enzimas II - CA

Grupos catalticos especficos

abril 2012

Enzimas II - CA

Zimgenos

abril 2012

Enzimas II - CA

Actividad enzimtica
Cuntos moles de sustrato son
convertidos en producto por
unidad de tiempo?

abril 2012

Enzimas II - CA

CINETICA ENZIMATICA
VELOCIDAD DE TRANSFORMACIN DE
LOS SUSTRATOS EN PRODUCTOS EN
EL TIEMPO

E + S? ES EP E + P?

abril 2012

Enzimas II - CA

Disminucin de la energa de
activacin

abril 2012

Enzimas II - CA

Disminucin de la energa de
activacin

abril 2012

Enzimas II - CA

Cmo las enzimas disminuyen la

energa de activacin?
Estado de transicin en forma de un
complejo enzima- sustrato
E + S ES EP E + P
Qu evidencias hay de la existencia
del complejo ES?
abril 2012

Enzimas II - CA

10

Actividad enzimtica

E + S ES EP E + P

abril 2012
Enzimas II - CA

11

PRINCIPALES FACTORES
1. Concentracin de enzima [E]
2. Concentracin de sustrato [S]
3. La temperatura

4. pH
5. Efectores (activadores e inhibidores)

abril 2012

Enzimas II - CA

12

EFECTO DE LA TEMPERATURA
El fro disminuye las
interacciones entre la
enzima y el sustrato
(disminuye la velocidad
de reaccin).
El calor incrementa la
velocidad de interaccin
entre enzima y sustrato a
un punto que la enzima
obtiene tanto calor que se
desnaturaliza
abril 2012

Enzimas II - CA

13

EFECTO DE LA TEMPERATURA
V

abril 2012

Enzimas II - CA

14

EFECTO DEL PH
Cambia la estructura
terciara y su
capacidad de fijar
su sustrato (s)
Tripsina pH 7.5
Pepsina pH 2.0

abril 2012

Enzimas II - CA

15

Enzyme activity

Acetilcolinesterasa

abril 2012

Pepsina

Amilasa

Enzimas II - CA

16

Efecto del pH
v

pH
abril 2012

Enzimas II - CA

17

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD
ENZIMTICA

abril 2012

Enzimas II - CA

18

Enzimas alostricas

abril 2012

Enzimas II - CA

19

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD
ENZIMTICA
[E]constante y [S]
diferentes
La velocidad de

reaccin permanece
constante cuando la
enzima se satura
abril 2012

Enzimas II - CA

20

ACTIVIDAD ENZIMTICA
UNIDAD DE ACTIVIDAD ENZIMATICA (U): mol de
sustrato transformado en un minuto
ACTIVIDAD ESPECIFICA: unidades de enzima por
miligramo de protena (U/mg protena o mol min-1
mg protena-1)
CONSTANTE CATALITICA O NUMERO DE
RECAMBIO (TURNOVER): unidades de actividad
enzimtica por mol de enzima ( mol min-1 mol de
enzima-1). Catalasa y alfa amilasa 5x106 y 1.9 x 104
abril 2012

Enzimas II - CA

21

Cmo se mide la velocidad de reaccin?

(sustrato producto en el tiempo)

Debemos hacer la reaccin in vitro ?

1. Determinar el sustrato y anlogos

2. Determinar los parametros cinticos de
reaccin (pH, T, [S], [E], [Ef])
3. Disear un ensayo para visualizar la reaccin
4. Medir la velocidad de reaccin
abril 2012

Enzimas II - CA

22

Ejemplo de actividad enzimtica

-galactosidasa
-enlace

(sustrato)
Nitrofenilglucosa
(incoloro)
abril 2012

(productos)
nitrofenol + glucosa
(amarillo)

Medir la velocidadEnzimas
de aparicin
de color amarillo
II - CA

23

Alcohol Deshidrogenasa (ADH)

CH3CH2OH + NAD+

CH3CH2O + H+ + NADH

Catalisa la conversin de etanol a aldehido

usando la co-enzima NAD+
NAD+ oxidado a NADH reducido
NADH SE LEE A 340 NM
abril 2012

Enzimas II - CA

24

Efecto de la concentracin de enzima (relacin

lineal)
v

.
..

.
.
.

.
.

.
.
.

[E]
abril 2012

Enzimas II - CA

25

Efecto de la concentracin de substrato

.
.
.
.
.

.
.
[s]
abril 2012

Enzimas II - CA

26

Se considera la reaccin en el equilibrio:

E + S ES E + P

abril 2012

Enzimas II - CA

27

Velocidad inicial (Vo)

Iniciar con [S] bajas e incrementar
Mantener la [E] saturante
Medir la velocidad de reaccin Vo hasta que la

velocidad sea constante Vmax

Cuando la enzima se mezcla con altas [S]

estado estacionario no permite la

caracterizacin
abril 2012

Enzimas II - CA

28

E + S
V0 =

k1
k-1

ES

k2

E + P

K2 [ES]

K2 [Et] [S]

= -----------------[S] + km

velocidad mxima (Vmax) ocurre cuando [ES] = [Et]

As,

abril 2012

Vmax = K2 [Et]

Vmax [S]
V0 = ------------------ (Ecuacin Michaelis-Menten)
km + [S]
Enzimas II - CA

29

E + S

k1
k-1

ES

k2

E + P

Km = [S] a 1/2 Vmax

Concentracin de substrato a la cual se alcanza

la mitad de la velocidad mxima
El Km ms bajo (menor sustrato para alcanzar la 1/2 Vmax)

El Km mide la afinidad de la enzima por el sustrato. A

bajo Km alta afinidad.
Una enzima con un Km de 10-6 M tiene mayor afinidad
por su sustrato que otra que tiene Km de 10-4 M
abril 2012

Enzimas II - CA

30

Cmo determinar la Km y Vmax?

abril 2012

Enzimas II - CA

31

Vmax [S]
V0 = -----------------km + [S]
1
--------V0

(ecuacin de Michaelis-Menten )

km + [S]
= -----------------Vmax [S]

1
km
[S]
---------- = ------------ + -----------V0
Vmax [S]
Vmax [S]
1
km
1
1
---------- = ------ ------ + ------ (ecuacin de Lineweaver-Burk)
V0
Vmax [S]
Vmax
abril 2012

Enzimas II - CA

32

En el caso de la ecuacin Lineweaver-Burk

y = mx + c

Variables:
Constante:
Pendiente:

abril 2012

1
km
1
1
---------- = ------ ------ + -----V0
Vmax [S]
Vmax

y = 1/ V0 , x = 1 / [S]
c = 1 / Vmax
m = km / Vmax

Enzimas II - CA

33

Determinacin del Km

abril 2012

Enzimas II - CA

34

Determinacin de la Km

abril 2012

Enzimas II - CA

35

Determinacin de Vmax

abril 2012

Enzimas II - CA

36

Representacin recproca doble

(Lineweaver - Burk)
0.04

1/v

1/Vmax

0.03

1 Km 1 1

v Vmx s Vmx

0.02

-1/Km
0.01

0.00
-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

1/s
abril 2012

Enzimas II - CA

37

Representacin s -s/v
(Eadie - Hofstee)
1.2

s/v
1.0

0.8

0.6

-Km

s
1
Km

s
v Vmx
Vmx

0.4

0.2

0.0
-20

20

40

60

80

100

120

abril 2012

Enzimas II - CA

38

Representacin v/s - v
(Wong - Hanes)

Vmax

100

v
v Km Vmx
s

80

60

40

20

v/s
0
0
abril 2012

8
Enzimas II - CA

10

12

14

16
39

Km de algunas enzimas

abril 2012

Enzimas II - CA

40

abril 2012

Enzimas II - CA

41

Inhibicin competitiva

abril 2012

Enzimas II - CA

42

Inhibicin acompetitiva

abril 2012

Enzimas II - CA

43

TIPOS DE INHIBIDORES

abril 2012

Enzimas II - CA

44

EFECTORES

abril 2012

Enzimas II - CA

45