UNIVERSIDAD NACIONAL DE

INGENIERA
FACULTAD DE INGENIERA QUMICA

Trabajo de
Microbiologa
TINCIN
DE
GRAM
Profesor:
Alejandro Hernndez

Carlos Roberto Trujillo Zapata

2008

INTRODUCCION
En el estudio de la ciencia que nos ocupa, la microbiologa, es fundamental la observacin de
los microorganismos. Esta observacin se hace necesaria para su clasificacin e identificacin.
Para ello se usa el microscopio tanto ptico como electrnico, y en sus diversas variantes
(microscopio de rayos UV, electrnico de barrido, de contraste de fase, de campo oscuro).
Un microscopio suele tener cuatro objetivos, pero en microbiologa se usa preferentemente el
objetivo de inmersin, aunque para visualizar una preparacin siempre se recomienda empezar
por el objetivo de x10 y una vez localizada la muestra ir subiendo poco a poco el nivel de
aumentos.
Al microscopio ptico hay dos formas de ver las preparaciones:

1.

Preparaciones en fresco con el objetivo seco. Tiene el inconveniente de que las

preparaciones son muy difciles de ver debido al poco contraste del medio que les rodea.

2.

Preparaciones fijadas y teidas con el objetivo de inmersin. Se matan las bacterias, pero
son ms visibles y su contraste es superior y de mayor calidad.

Entre los tipos de preparaciones del segundo tipo, hay un mtodo de tincin que se usa
universalmente para distinguir a las bacterias en dos grandes grupos: se trata de la Tincin de
Gram.
El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el
microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que
la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste es la utilizacin de colorantes. Estos
pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de clulas o para revelar la presencia
de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes
celulares, centros de actividad respiratoria, etc.
Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teirlas, proceso
llamado fijacin. Para bacterias, la fijacin por el calor es lo ms corriente, aunque tambin
puede fijarse con sustancias qumicas como formaldehido, cidos y alcoholes. Despus de la
fijacin, si se aade el colorante, no se producen ulteriores cambios estruturales en el
protoplasma. La fijacin se realiza habitualmente en clulas que han sido fijadas sobre un
portaobjetos, tratando despus ste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el
proceso de tincin. La fijacin produce habitualmente el encogimiento de las clulas; la tincin,
por el contrario, hace que las clulas aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera
que las medidas de las clulas que han sido fijadas o teidas no pueden realizarse con mucha
precisin.
La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica
por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas
cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes
celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos.

Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros
colorantes son molculas cargadas negativameute (aniones) y se combinan con los
constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas. Esos
colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son
sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipdicos
de la clula, usndose a menudo para revelar la localizacin de las gotculas o depstos de
grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudn.
Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada con otra
sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia se denomina
mordiente; un mordiente habitual es el cido tnco. El mordiente se combina con un
constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora s podr atacar el colorante.
Si se desea simplemente incrementar el contraste de las clulas para la microscopa, son
suficientes los procedimientos simples de tincin. El azul de metileno es un buen colorante
simple que acta sobre todas las clulas bacterianas rpidamente y que no produce un color
tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente til para detectar la
presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular
no se tie.
La tincin negativa es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas se dejan sin
teir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de
las clulas. La sustancia utilizada para la tincin negativa es un material opaco que no tiene
afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las clulas, tal como la tinta
china (que es una suspensin de particulas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante
negro insoluble en agua). La tincin negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste
de las clulas en la microscopia ptica, pero su mxima utilidad est en revelar la presencia de
cpsulas alrededor de las clulas bacterianas.
Los mtodos de tincin son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaucin, ya
que pueden conducir a errores. Las molculas de colorante forman en ocasiones precipitados o
agregados que parecen estructuras celulares autnticas, pero que son formaciones
completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan
artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos
estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente.
Bacteria Gram Positiva:
Tiene una capa gruesa de peptidoglicano (mureina) y dos clases de cidos teicoicos. cido
Lipoteicoico que est en la superficie, empotrado en la capa de peptidoglicano y unido a la
membrana citoplsmica. Y cido teicoico de la pared que est en la superficie y se une slo a
la capa de peptidoglicano. El cido Teicoico es el responsable del determinante antignico del
organismo.

Bacteria Gram Negativa

Tiene una capa delgada de peptidoglicano (mureina) unida a una membrana exterior por
lipoprotenas. La membrana exterior est hecha de protena, fosfolpido y lipopolisacrido. En el
lipopolisacrido, la porcin de lpido est embebida en el fosfolpido y el antgeno O
polisacrido est en la superficie. El lpido se llama Lpido A y es txico, pero el lipopolisacrido
entero se llama Endotoxina. La pared de la clula tiene poros llamado Porines para el
transporte de substancias de peso molecular bajo. Entre la membrana citoplsmica y la pared
celular hay un espacio periplsmico con enzimas hidrolticas, enzimas inactivadoras de
antibiticos y protenas de transporte.

PREPARACION DE UN FROTIS:
Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del material que se va a teir
(si es lquido) o se hace rodar el hisopo con que se tom la muestra. Una vez que el hisopo ha
tocado la superficie del portaobjetos, que no est estril, ya no puede ser empleado para
inocular los medios de cultivo. Puede usarse una aguja estril para transferir una pequea
cantidad de un cultivo bacteriano a la superficie del portaobjetos. Este material es suspendido
en una gota de agua o solucin salina previamente colocada sobre el portaobjetos. Cuando se
trata de colonias muy pequeas que pueden perderse en una gota de lquido se emplea una
varilla delgada de madera estril con la cual se toca la colonia obtenindose as una fraccin
apreciable del desarrollo. El material se frota directamente sobre el portaobjetos, donde puede
visualizarse con facilidad. El material colocado en el portaobjetos se deja secar al aire o bien se
pasa varias veces por la zona azul de la llama de un mechero de Bunsen hasta que el vidrio
est tan caliente que moleste al tacto pero no queme.
DEFINICION
Es uno de los metodos de tincin diferencial mas importante en el laboratorio bacteriologico,
que basa su distincin en la estructura diferente de la pared bacteriana de las bacteria Gram +
(pared ms gruesa, y una sola capa de peptidoglucano ) y de las Gram- ( pared ms delgada y
dividida en dos partes).
REACTIVOS A UTILIZAR:

1.

Colorante bsico Cristal Violeta o Violeta de Genciana. Es el primer colorante que se hecha
sobre el frotis previamente preparado. Es un colorante selectivo que tie a todos los
microorganismos. Se deja actuar durante un minuto y se lava con agua a continuacin.

2.

Lugol. Producto compuesto de yodo y yoduro potsico. Es un mordiente, que intensifica al

Cristal Violeta haciendo que precipite. Se deja actuar un minuto y se lava con alcohol, el
tiempo justo para que no se arrastre el colorante del todo.

3.

Alcohol 96. El alcohol retira el colorante de las gram- debido a su diferente estructura de la
pared celular (tamao de los poros).

4.

Safranina. Colorante bsico diferenciador. Tie a las bacterias gram-. Se deja actuar treinta
segundos y se lava con agua.

Como puede verse una vez finalizada la tincin las bacterias gram- estarn teidas de un color
rosceo, y las gram+ de un color violeta. Esto sirve para diferenciarlas claramente al
microscopio ptico.
PROCEDIMIENTOS A SEGUIR:
En primer lugar encendemos el mechero, ya que para realizar cualquier estudio de una muestra
bacteriana, debemos usar la tcnica asptica para evitar la contaminacin de la muestra.
Usamos un asa de siembra, aparato fundamental en la preparacin de frotis y cultivos. La
calentamos al rojo en el mechero y a continuacin cogemos una gota de agua el asa y la
depositamos en el portaobjetos que previamente habremos preparado. Volvemos a esterilizar el
asa y con otra mano abrimos un tubo de ensayo tapado con un algodn donde se encuentra el
inoculo a sembrar. Con cuidado introducimos el asa, evitando que el asa mate por excesivo
calor a los microorganismos, dando unos golpecitos dentro del tubo y mojando el asa en el tubo
un poco.
Cerramos el tubo y colocamos el inculo en el portaobjetos, haciendo un frotis con l. Fijamos a
la llama cuidadosamente con ligeros pases con el mechero y dejamos secar.
A continuacin hacemos la tincin de Gram de la forma antes explicada, usando un barreo
para evitar el desparramamiento de los colorantes y el agua por el laboratorio. Hay que tener
cuidado en la cantidad de colorantes a usar, con una gota suele ser suficiente. Una vez hecha
la tincin dejamos secar de nuevo.
Ahora nos dirigimos al microscopio. Preparamos el objetivo de inmersin echando un poco de
aceite de cedro al cubre. Esta gota de aceite crea una fina pelcula entre objetivo y muestra ,
que disminuye el ndice de refraccin de la luz, mejorando la visin de la muestra.

BILOLOGIA DE LOS MO
PARKER ET AL