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MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

Prof Jos Cals Gaspar Jnior


Monitor: Daniel Arajo Gis Pinheiro Guerra

Data:

NORMAS DE SEGURANA PARA AS AULAS PRTICAS DE


MICROBIOLOGIA

indispensvel o uso de avental no laboratrio. O avental deve ser comprido, de mangas


compridas e estar abotoado;
No comer (inclusive balas e chicletes), beber e fumar no laboratrio;
O Material pessoal (bolsas cadernos, mochilas, agasalhos, etc.) deve ser mantido longe das
bancadas de trabalho. Utilizar na bancada somente o material necessrio ao trabalho prtico,
como: roteiro de aula, papel e lpis ou caneta para anotaes;
Em caso de qualquer acidente (derramamento de culturas, quebra de placas, ferimentos,
aspirao de culturas, etc) comunicar imediatamente o professor ou o tcnico responsvel
pela aula prtica;

Descarte de material:
a) Materiais contaminados devem ser colocados nos recipientes prprios, existentes nos
laboratrios. NUNCA deix-los nas bancadas ou pias;
b) Placas de petri devero ser deixadas tampadas sobre a bancada;
c) Lminas fornecidas para visualizao devero ser deixadas sobre as bancadas;
d) Tubos com culturas devero ser deixados nas estantes.

Prestar ateno s atividades dos colegas ao lado para evitar acidentes


Terminados os trabalhos prticos:
a)
b)
c)
d)
e)
f)

Esterilizar alas e fios de platina;


Verificar se as torneiras de gua e gs esto fechadas;
Desligar lmpadas e microscpios;
Limpar microscpios e cobri-los com a capa;
Tirar o avental e guardar;
Lavar cuidadosamente as mos com gua e sabo ou anti-sptico.

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
Prof Jos Cals Gaspar Jnior
Monitor: Daniel Arajo Gis P. Guerra

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PREPARAO DE MATERIAL DE LABORATRIO PARA


ANLISES MICROBIOLGICAS
1. INTRODUO
A preparao do material de laboratrio para utilizao em anlises microbiolgicas envolve
todas as atividades necessrias para garantir que os frascos, utenslios, instrumentos e vidrarias
destinados ao contato com as amostras de alimentos, encontrem-se totalmente limpos, estreis e
isentos de resduos qumicos e orgnicos no momento das anlises.

2. DESCONTAMINAO E DESCARTE DE RESDUOS CONTAMINADOS


Todo material resultante das anlises microbiolgicas altamente contaminado, uma vez
que os mtodos analticos promovem a multiplicao dos microrganismos presentes na amostra,
elevando o seu nmero em vrios milhares de vezes, em comparao com as contagens normalmente
encontradas nos alimentos. Para a descontaminao, deve-se submeter todo o material esterilizao
em autoclave, a 121C por 30 minutos.

3. LAVAGEM
Os detergentes mais utilizados para lavagem de vidraria e utenslios de laboratrio so
detergentes aninicos, principalmente aqueles que contm compostos alcalinos. Eventualmente pode
ser necessria a aplicao de um agente mais forte para a remoo de resduos mais resistentes
ao dos detergentes (soluo sulfocrmica, constituda de cido sulfrico e dicromato de potssio, e
a soluo alcolica 1N de hidrxido de sdio).
O enxge dos utenslios deve ser feito de forma a garantir a completa remoo dos resduos
de detergente ou outro agente de limpeza utilizado, Os resduos desses compostos podem interferir
com os resultados das anlises, tanto por alterao das caractersticas dos meios de cultura, como por
inibio do crescimento dos microrganismos.
1.1 Procedimentos para lavagem
Remover todo o material descontaminado presente nos frascos e utenslios antes de iniciar a
lavagem;
Mergulhar todo o material em soluo detergente e deixar de molho por 2 horas ou mais
dependendo do grau de aderncia do material a ser removido;
Com o auxlio de escovas e esponjas esfregar os frascos e demais utenslios lembrando de
remover tambm as anotaes de caneta vidrogrficas. No conseguindo uma boa limpeza

(principalmente do material que no pode ser esfregado com escovas) mergulhar em soluo
sulfocrmica ou soluo alcolica 1N de NaOH e deixar de molho por alguns minutos ou ate horas,
dependendo da aderncia do material a ser removido;
Enxaguar bastante, a fim de garantir que nenhum resduo das solues permanea nas vidrarias
ou utenslios.

4. ACONDICIONAMENTO (DEVIDAMENTE IDENTIFICADO)


ATENO: As recomendaes deste item, bem como as do 5 (esterilizao), referem-se aos frascos
e utenslios vazios.
a)Placas de Petri: Devem ser acondicionadas em estojos porta-placas de alumnio ou ao
inoxidvel, em grupos de mesma dimenso, ou embrulhadas em papel Kraft, em grupos de at 3
placas.
b)Pipetas: preencher o local com o algodo e acondicionar em estojos porta-pipetas de alumnio ou
ao inoxidvel, em grupos de mesma capacidade, com as pontas para baixo, na extremidade oposta a
da tampa do estojo. Proteger o fundo dos estojos com um chumao de gaze ou algodo, para evitar
danos s pontas das pipetas. Alternativamente, embrulhar individualmente em papel Kraft,
lembrando-se de identificar a extremidade do embrulho que deve ser aberta no momento da anlise.
c)Tubos de ensaio vazios: Tampar com tampo de algodo ou com as respectivas tampas no caso de
tubos rosqueveis. Acondicionar em grupos, em cestas apropriadas para esse fim, lembrando-se de
afrouxar as tampas dos tubos de rosca. Cobrir a parte superior dos tubos com papel Kraft e amarrar
com barbante.
d)Frascos de homogeneizao e outros frascos vazios tampados com tampo de algodo: Cobrir a
tampa ou o tampo com papel Kraft e amarrar com barbante, individualmente.
e)Esptulas, pinas, tesouras e demais utenslios: Embrulhar individualmente em papel Kraft,
lembrando-se de identificar a extremidade do embrulho que deve ser aberta no momento da anlise.

5. ESTERILIZAO
Todo o material de laboratrio vazio (placas, pipetas, tubo de ensaio, frascos, pinas,
tesouras etc.) pode ser esterilizado tanto em autoclave quanto em estufa de esterilizao. Na
esterilizao em estufa, o material deve permanecer a 170C/1h e, na esterilizao em autoclave, a
121C/15 minutos.
5.1 Uso da Autoclave
Esterilizao de meios e vidrarias: 121C / 15min.
Destruio de microorganismos: 121C / 30min.

Procedimento:
1
2
3
4
5
6

Verificar se a autoclave est ligada rede eltrica;


Verificar o nvel da gua;
Colocar o material dentro da autoclave;
Fechar a autoclave;
Verificar se a torneira de remoo de ar ou vapor encontra-se aberta;
Ligar a autoclave;

7 Quando todo o ar for removido, deixar que o fluxo de vapor persista por cerca de 3
minutos;
8 Fechar a torneira do vapor;
9 Deixar que a presso interna cresa at 15 lb/pol 2 ou 1 atm, correspondendo
temperatura de 121C;
10 Marcar o tempo;
11 Passados os 15 ou 30 minutos (dependendo o uso: para esterilizar ou
descontaminar), desligar;
12 Esperar que o manmetro volte ao ponto zero;
13 Abrir a tampa da autoclave;
14 Levantar a tampa e remover o material.

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COLETA / TRANSPORTE / ESTOCAGEM DE AMOSTRAS


1. INTRODUO
A coleta de amostras para a avaliao de lotes de alimentos processados deve obedecer a
planos de amostragem que permitam tomar decises a respeito do destino dos lotes.
Deve haver sincronismo entre a remessa e a capacidade do laboratrio em executar a
anlise.
Para entendermos melhor este processo segue abaixo algumas importantes definies:
Lote: Significa uma quantidade de alimento de mesma composio e caractersticas fsicas,
qumicas e sensorial produzida e manuseada sob as mesmas condies. Na pratica, lote geralmente
significa a quantidade de um determinado alimento produzida dentro de um intervalo de tempo de
funcionamento de uma linha de produo sem interrupes.
Amostra de lote e unidade de amostra: Uma amostra de lote seria um determinado nmero de
entidades individuais, escolhidas ao acaso, para representar o lote. A partir do conjunto de
caractersticas dessas entidades individuais, chamadas de unidades de amostra, seria possvel inferir
as caractersticas de toda a populao por elas representada, ou seja, o lote. Assim, uma amostra de
lote sempre composta de n unidades de amostra e cada unidade de amostra sempre analisada
individualmente.
Unidade analtica: a quantidade de alimento efetivamente utilizada na analise de uma unidade
de amostra.

2. COLETA DE AMOSTRAS PARA ANLISE


Providncias especiais devero ser tomadas para que o tempo decorrido entre a colheita da
amostra e sua chegada ao laboratrio seja o menor possvel.
Plano de amostragem

Os planos de amostragem para avaliao microbiolgica de alimentos so


diversos. Os rgos regulamentadores nacionais sugerem a adoo dos planos
elaborados pelo ICMSF (International Commission on Microbiological Specification
for Foods) que leva em considerao o risco que cada microrganismo presente na
amostra traz sade do consumidor e se em condies normais de manuseio e consumo
esse risco ser reduzido, no alterado ou aumentado.

Plano de amostragem segundo a ICMSF

Sem risco direto (Contagem total de


mesfilos, mofos e leveduras).

Com risco sade Pequeno, indireto


(indicadores).

Com risco sade Moderado, direto, sem


disseminao extensiva.

Com risco sade Moderado, direto, com


disseminao extensiva.

Com risco sade direto, severo.

Reduzem o
risco

No alteram o
risco

Aumentam o
risco

Caso 1 (3)

Caso 2 (3)

Caso 3 (3)

n=5

n=5

n=5

c=3

c=2

c=1

Caso 4 (3)

Caso 5 (3)

Caso 6 (3)

n=5

n=5

n=5

c=3

c=2

c=1

Caso 7 (3)

Caso 8 (3)

Caso 9 (3)

n=5

n=5

n=10

c=2

c=1

c=1

Caso 10 (2)

Caso 11 (2)

Caso 12 (2)

n=5

n=10

n=20

c=0

c=0

c=0

Caso 13 (2)

Caso 14 (2)

Caso 15 (2)

n=15

n=30

n=60

c=0

c=0

c=0

Onde:
n = nmero de unidades escolhidas separadamente e inteiramente ao acaso como representativas do
lote, ou seja, nmero de unidades examinadas na amostragem.
c = nmero de aceitao, ou seja, nmero mximo tolervel de unidades com resultados positivos.
(3) = indica um plano de trs classes, no qual o alimento se enquadra em trs situaes, ou seja, o
lote inteiramente aceitvel quando todas as amostras analisadas apresentam resultados abaixo de
m; o lote aceito dependendo dos valores de c quando as contagens esto entre os valores de m e
M; e, finalmente, o lote inaceitvel quando uma ou mais amostras apresentam contagens acima de
M.
(2) = indica um plano de duas classes onde o produto classificado como aceitvel ou inaceitvel,
em funo de um valor ou ndice microbiolgico estabelecido como critrio de aceitao ou rejeio,
representado pelo valor de M.
Definio de m e M:
m = o limite que, em um plano de trs classes, separa o lote aceitvel do produto ou lote com
qualidade intermediria aceitvel.
M = o limite que, em plano de duas classes, separa o produto aceitvel do inaceitvel. Em um
plano de trs classes, M separa o lote com qualidade intermediria aceitvel do lote inaceitvel.
Valores acima de M so inaceitveis.
2.1 Coleta de amostras de alimentos em embalagens individuais

Sempre que possvel, as amostras de alimentos devem ser coletadas e encaminhadas ao


laboratrio na sua embalagem comercial original, fechada e intacta. Se a embalagem unitria do
produto contiver uma quantidade de alimento menor do que duas vezes o peso ou volume da unidade
analtica, recomenda-se coletar varias embalagens unitrias, como parte de uma mesma unidade.

2.2 Coleta de amostras de alimentos em embalagens no individuais.


No caso de alimentos contidos em tanques ou grandes embalagens, impossveis de serem
transportadas ao laboratrio, deve-se transferir pores representativas da massa total para frascos ou
sacos estreis, sob condies asspticas.
Obs: Uma unidade de amostra deve conter, no mnimo, 2 vezes a unidade analtica, de preferncia, 3
a 4 vezes esse valor, para a separao da contra amostra e preveno de possveis perdas.
Usualmente 200g de alimentos slidos ou 300 a 500mL de produtos lquidos so quantidades
suficientes para a maioria dos alimentos.
2.3 Informaes que devem acompanhar as amostras:
- Tipo de amostra e processo utilizado na fabricao (exemplos: leite pasteurizado, suco de
fruta concentrado pasteurizado, polpa de tomate concentrada, etc).
- Fabricante / data de fabricao / cdigo de lote.
- Interessado solicitante da analise (nem sempre o interessado e o fabricante so os
mesmos).
- Data e local da coleta da amostra.
- Razo da analise (controle de qualidade interno do fabricante, avaliao da conformidade
com padres legais, registro de novo produto, concorrncia pblica, litgio, amostra envolvida em
surto, etc).
3. TRANSPORTE E ESTOCAGEM DAS AMOSTRAS
Como regra geral, deve-se transportar e estocar amostras de alimentos da mesma forma
como o produto normalmente transportado e estocado na sua comercializao.

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PREPARAO DO LOCAL E DA AMOSTRA PARA ANLISES


MICROBIOLGICAS
1. PROCEDIMENTOS
a) Preparao do meio de cultura, gua peptonada para as diluies, vidrarias e demais
utenslios;
b) Preparao da bancada: limpeza com lcool 70%;
c) Preparao do material para a anlise: levar tudo o que for preciso para a bancada (meio
de cultura pronto e esterilizado, vidrarias, descartes, etc);
d) Higiene do analista.

2. RECEPO DAS AMOSTRAS PARA ANLISE


Na recepo de amostras para anlise no laboratrio, devem ser observadas as condies da
embalagem e as condies em que foi feito o transporte, antes da aceitao de pedido de anlise.
Deve ser recusadas qualquer amostra com embalagem rasgada, furada, violada, com corpos
estranhos ou qualquer outro tipo de defeito, bem como amostras transportadas sob condies
inadequadas.

3. PREPARAO DAS AMOSTRAS PARA ANLISE


A preparao das amostras para a analise envolve basicamente duas etapas: a retirada da
unidade analtica, que deve ser feita de forma a garantir que a poro removida seja representativa de
todo o contedo da unidade de amostra e a preparao de diluies decimais seriadas da unidade
analtica, para inoculao nos meios de cultura.
No caso de alimentos slidos ou lquidos concentrados, a primeira diluio (10 -1) deve ser
acompanhada de uma adequada homogeneizao da unidade analtica, que pode ser conseguida por
agitao ou triturao em liquidificador.
3.1 Preparao de amostras de alimentos
a) Antes de abrir as embalagens, deve-se desinfetar a rea externa com etanol 70% para
remover os contaminantes presentes. Observar e anotar qualquer anormalidade nas embalagens, bem
como no contedo interno como odor, aparncia ou corpos estranhos.
b) Retirar a unidade analtica (para a maioria dos alimentos de 25g ou 25mL)
assepticamente da amostra para um frasco de homogeneizao / diluio, previamente esterilizado.
Diluio 10-1: adicionar ao frasco contendo 225mL de diluente (previamente esterilizado e
tarado) a unidade analtica de 25g, homogeneizar obedecendo as seguintes recomendaes:
- os diluentes recomendados para a anlise da maioria dos alimentos so a gua peptonada
0,1% ou gua salina 0,9%;

- homogeneizar o alimento na prpria embalagem e retirar assepticamente uma unidade de


25g de amostra;
- o intervalo entre a mistura da amostra e a retirada da unidade analtica no deve ultrapassar 3
minutos;
- todos os instrumentos e utenslios (tesouras, pinas, facas, esptulas, etc) utilizados na
abertura das embalagens e retirada das unidades analticas devem ser previamente esterilizados em
autoclave, estufa de esterilizao ou mergulhados em etanol 70% e flambados no momento do uso.
Diluies seriadas: para a preparao da segunda diluio 10-2, transferir assepticamente 1mL
da diluio 10-1 para 9mL de diluente, ou 10mL da 10-1 para 90mL de diluente. As diluies
subseqentes so obtidas de maneira similar, transferindo-se 1 ou 10mL da diluio anterior para 9
ou 90mL de diluente. Ao preparar as diluies seriadas, procurar obedecer as seguintes
recomendaes:
- o diluente utilizado na preparao das diluies 10-2 e superiores devem ser o mesmo
utilizado na preparao da primeira diluio (10-1);
- nmero de diluies requeridas depende do nvel de contaminao esperado;
- na transferncia de volumes entre as diluies usar sempre uma pipeta diferente para cada
diluio;
- antes de retirar o volume a ser transferido agitar vigorosamente o tubo ou frasco.
Obs: Para alimentos lquidos a diluio 10-1 ser obtida transferindo-se assepticamente uma poro
de 1mL da amostra para 9mL de diluente.

Esquema para Diluio da Amostra

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PRTICA 01 ANLISE DE POTABILIDADE DA GUA


(CONTAGEM DE COLIFORMES A 35C E A 45C)
1. DEFINIES
a) gua potvel (Portaria n 518, 25/03/2004, FUNASA / MS)

b) Coliformes a 35C

c) Coliformes a 45C

d) Escherichia coli

e) Indicadores de Contaminao Fecal

2. METODOLOGIA E MEIOS DE CULTURA


Metodologia NMP (nmero mais provvel)
a

1 Fase: Teste Presuntivo


- Meio Usado: Caldo Lauril Sulfato Triptose (concentrao dupla)
- Objetivo

10

- Material: 10 tubos de ensaio com tubos de Durhan contendo 10ml de meio


- Unidade Analtica
- Temperatura / Tempo de Incubao
2a Fase: Teste Confirmatrio
# Coliformes a 35C
- Meio Usado: Caldo Verde Brilhante Bile (BVB)
- Particularidades

- Material: tubos de ensaio com tubos de Durhan contendo de 6-8ml de meio


- Temperatura / Tempo de Incubao
# Coliformes a 45C
- Meio Usado: Caldo Escherichia coli (EC)
- Particularidades

- Material: tubos de ensaio com tubos de Durhan contendo de 6-8ml de meio


- Temperatura / Tempo de Incubao

3. PROCEDIMENTOS PARA COLETA E PREPARO DA AMOSTRA


Coleta
Higiene do Coletador;
Limpar a sada de gua com lcool e flambar (se possvel);
Deixar escorrer a gua de 2-3 minutos;
Coletar em frasco estril (no encher o frasco completamente);
Coletar a amostra de preferncia no dia da anlise ou em at 24 horas antes;
Manter a amostra refrigerada desde de sua coleta, durante seu transporte e estocagem at o
momento da anlise;
Informaes sobre a amostra (procedncia, hora da coleta, alguma observao, etc.).

Preparo da Amostra
Misturar bem o contedo da amostra, invertendo o frasco 25 vezes, em arco de 30cm.

11

4. PROCEDIMENTOS DE ANLISE (INOCULAO E INCUBAO)


-

Inocular 10ml da amostra de gua em cada um dos 10 tubos contendo Caldo Lauril Sulfato
Triptose concentrao dupla;

Incubar a 35C/24-48h;

Dos tubos positivos (com crescimento e produo de gs), transferir uma alada bem
carregada da cultura para tubos de Caldo Verde Brilhante Bile e tubos de Caldo E. coli;

Incubar os tubos, inoculados, de Caldo Verde Brilhante Bile a 35C/24-48h;

Incubar os tubos, inoculados, de Caldo E. coli a 45C (+ 0,5C) /24h.

5. Resultado CONTAGEM DE COLIFORMES


- Observar e anotar o nmero de tubos positivos de Caldo Verde Brilhante Bile (com
crescimento e produo de gs) para contagem de coliformes totais;
- Observar e anotar o nmero de tubos positivos de Caldo E. coli (com crescimento e
produo de gs) para contagem de coliformes termotolerantes;
- Determinar o Nmero Mais Provvel (NMP)/100ml.

6. DETERMINAO DO NMERO MAIS PROVVEL (NMP)


Tabela: Nmero Mais Provvel (NMP) e intervalo de confiana ao nvel de 95% de
probabilidade, para diversas combinaes de tubos positivos e negativos na inoculao de 10
pores de 10ml de amostra por tubo (AMERICAN PUBLIC HEALTH OF WATER AND
WASTERWATER. Standard methods for the examination of water and wasterwater. 16

Ed. Washington: American Public Health Association, 1985).


Nmero de tubos
positivos

NMP/100ml

0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

<1,1
1,1
2,2
3,6
5,1
6,9
9,2
12,0
16,1
23,0
>23,0

Intervalo de Confiana (95%)


(valores aproximados)
Mnimo

Mximo

0
0,03
0,26
0,69
1,3
2,1
3,1
4,3
5,9
8,1
13,5

3,0
5,9
8,1
10,6
13,4
16,8
21,1
27,1
36,8
59,5
infinito

12

7. PADRO MICROBIOLGICO DE POTABILIDADE DA GUA PARA


CONSUMO HUMANO
(Segundo a Portaria 518, 25/03/2004, FUNASA MS)

a) gua para consumo humano em toda e qualquer situao, incluindo fontes individuais como
poos, minas, nascentes, entre outras: ausncia de Escherichia coli ou coliformes a 45C em
100ml.

b) gua na sada do tratamento: ausncia de coliformes a 35C em 100ml e ausncia de


Escherichia coli ou coliformes a 45C em 100ml.

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PRTICA 02 - CONTAGEM DE COLIFORMES EM ALIMENTOS


E INVESTIGAO DA PRESENA DE STAPHYLOCOCCUS
aureus.
1. INTRODUO
O mtodo de contagem em placa se baseia no fato de que quando uma clula isolada cresce
num meio slido, d origem a uma colnia visvel a olho nu. Ao se semear uma diluio de uma
suspenso bacteriana, possvel determinar o nmero de bactrias viveis na populao original pela
contagem do nmero de colnias formadas aps o perodo de incubao.
O mtodo NMP, como foi discutido na Anlise de Potabilidade da gua, estima a densidade
microbiana considerando a freqncia de ocorrncia de uma srie de resultados positivos que so
mais provveis de ocorrer quando um certo nmero de organismos est presente numa amostra.
Os microrganismos, cuja presena ser investigada em placas, so Escherichia coli e
Staphylococcus aureus.
A E. coli um dos microrganismos mais prolferos no trato intestinal humano; sua presena
em alimentos processados uma indicao til de contaminao fecal. A E. coli normalmente
inofensiva, mas certas cepas podem ser patognicas. Existem vrios grupos patognicos distintos,
que produzem toxinas que causam distrbios gastrintestinais, denominados coletivamente
gastointerite por E. coli. Suas colnias em meio azul de metileno eosina (EMB) apresentam-se
verde-metlicas com aspecto mucide e com centro negro. Seguindo essas caractersticas ser feita a
verificao de coliformes fecais. Lembre-se que a E. coli um organismo indicador.
Staphylococcus aureus, tambm conhecidos como Estafilococos dourados so uma espcie
de estafilococos coagulase-positivos. uma das espcies patognicas mais comum, juntamente com
a E. Coli. O S. aureus habita freqentemente as passagens nasais, a partir das quais contamina as
mos. Ele tambm uma causa freqente de leses cutneas nas mos. Destas fontes, pode
facilmente penetrar no alimento e causar Intoxicao Alimentar Estafiloccica (Enterotoxicose
Estafiloccica), devido presena de enterotoxinas na comida ingerida, e no a uma infeco.
Comum em presunto e outras carnes com sal, que no apresentam nenhum sinal ou gosto diferente.
Caracteriza-se por aparecimento sbito (aps 4h) de vmitos, diarreia aquosa, dores abdominais. O
S.aureus a mais virulenta espcie do seu gnero (Staphylococcus).
Suas colnias em meio de cultura Baird Parker gar Padro so negras com alo
transparente ao redor.

14

2. OBJETIVO
Esta prtica se destina a estimar a carga microbiana em amostras de alimentos atravs de
tcnicas bsicas de contagem de bactrias em laboratrio - Nmero Mais Provvel (NMP) e
Contagem Padro em Placa (CPP) e verificar as caractersticas visuais de colnias de Escherichia
coli e Staphylococcus aureus em seus respectivos meios diferenciais.

3. MATERIAL
Material analisado: Alimentos processados.
Vidraria/equipamento:

lamparina

ou

bico

de

Bunsen;

Placas

de

Petri

estreis;Pipetas; Tubos de ensaio; Estufa bacteriolgica.

Estufa bacteriolgica

Solues/meios: Baird Parker gar Padro (meio para contagem em placa de


colnias de S. aureus); Azul de metileno eosina (meio para contagem em placa de
colnias de E. coli); Caldo EC, caldo BVB, caldo Lauril Sulfato Triptose
concentrao simples (meios para NMP); gua peptonada ou soluo salina
(soluo diluente).

Tubos de ensaio com BVB

Placas de Petri com BP

4. PROCEDIMENTO
1 PARTE: Diluio de amostra
1. Utilizando pinas, luvas e/ou bisturi estreis, pesar assepticamente 25g
representativos da amostra, de forma a tomar partes diversas.
2. Diluir os 25g da amostra em 225ml de gua peptonada.
3. Homogeneizar. Esta a primeira diluio (10-1).
2 PARTE: Contagem de coliformes em alimentos lcteos e no-lcteos.

15

No-Lcteos
1. Transferir 1ml do homogeneizado da amostra para um tubo com 9ml de gua
peptonada ou soluo salina. Esta se torna a diluio 10-2.
2. Proceder da mesma forma a partir da diluio 10 -2 para novo tubo com 9ml de gua
peptonada ou soluo salina, de forma a formar a diluio 10-3.
3. De cada uma das diluies partem sries de 3 tubos com Caldo Lauril Sulfato
Triptose (todos o tubos devem conter tubos Durham). Explicando: da diluio 10 -1
so retirados 3ml que sero distribudos por 3 tubos com o caldo (1ml por tubo). O
mesmo procedimento feito para as demais diluies.
4. Ao final da inoculao, os caldos so incubados em estufa a 35C por um perodo
de 24-48 horas.
5. A contagem de coliformes a 35C feita tomando os tubos de LST com produo
de gs e transferindo uma alada bem carregada de cada cultura para tubos de
Caldo Bile Verde Brilhante (BVB).
6. Incubar a 35C por 24-48 horas e observar se h crescimento com produo de gs.
7. Anotar os resultados de tubos de BVB com gs. Confirmativo da presena de
coliformes totais e determinar o Nmero Mais Provvel (NMP)/g ou ml em uma
tabela de NMP apropriada s diluies inoculadas.
8. A contagem de coliformes a 45C feita tomando os tubos LST com produo de
gs e transferindo uma alada bem carregada de cada cultura para tubos E. coli
(EC).
9. Incubar em banho-maria a 44,5C por 24-48 horas e observar se h crescimento
com produo de gs.
10. Anotar o nmero de tubos de EC com produo de gs, confirmativo da presena de
coliformes fecais e determinar o NMP/g ou ml em uma tabela de NMP adequada s
diluies inoculadas.
Lcteos
1. De cada uma das diluies partem sries de trs tubos com Caldo Bile Verde
Brilhante (todos o tubos devem conter tubos Durham). Explicando: da diluio 10 -1
so retirados 3ml que sero distribudos por 3 tubos com o caldo (1ml por tubo). O
mesmo procedimento feito para as demais diluies. Observe que, neste caso,
partimos direto para a inoculao em BVB.
Procede-se com a mesma metodologia utilizada para alimentos no-lcteos- excluindo a
inoculao em Caldo Lauril Sulfato Triptose- para contagem de coliformes a 35C e a 45C.

16

3 PARTE: Confirmao da presena de Coliformes fecais


1. De cada tubo positivo do teste anterior (caldo EC), semear uma alada em gar
eosina azul de metileno (BEM/Levine).
2. Ao final da inoculao, as placas so incubadas em estufa a 35-37C por um
perodo de 24 horas.
3. Aps este perodo, observar a presena de colnias positivas, verde metlica, com
aspecto mucide e com centro negro.
Para obteno de culturas puras de E. coli, havendo colnias tpicas, transferir duas colnias
bem isoladas de cada placa para tubos de Agar Padro para Contagem (PCA) inclinados e incubar os
tubos a 35C por 24h. A partir das culturas puras em PCA, fazer colorao de Gram e inocular os
meios testes (Caldo Citrato de Koser ou Agar Citrato de Simmons, Caldo Triptona 1%, Caldo VMVP) para realizao de provas bioqumicas.

4. INVESTIGAO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS


1. A partir das diluies feitas a partir da homogeneizao da amostra (10 -1, 10-2 e 103

), semear 0,1ml (de cada diluio) em gar Baird Parker pela tcnica SPREAD

PLATE.
2. Espalhar o inculo com ala de Drigalski por toda a superfcie do meio at que o
excesso de lquido seja absorvido.
3. Ao final da inoculao, as placas so incubadas em estufa a 35-37C por um
perodo de 24 a 48horas.
4. Aps este perodo, observar a presena de colnias negras com alo transparente ao
redor, que caracterizam colnias de positivas de S. aureus.

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O Agar BP no capaz de suprimir completamente o crescimento de competidores de S.


aureus, particularmente outras espcies no patognicas do gnero Staphylococcus, que produzem
colnias semelhantes, havendo necessidade de submeter as colnias tpicas a testes adicionais para
confirmao definitiva. Nestes casos, os testes mais utilizados so a atividade de coagulase,
termonuclease e catalase.

5. FIXANDO O CONTEDO
Como se chega o nmero de bactrias nos meios de cultura pela Contagem Padro em
Placa? E pelo Nmero Mais Provvel?

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PRTICA

03

PESQUISA

DE

PRODUTOS

Data:

NATURAIS

ANTIBACTERIANOS

1. INTRODUO
Muitos vegetais contm compostos que so inibidores de crescimento de microrganismos e exercem
papel importante na resistncia destes vegetais a patgenos. Um importante exemplo deste processo
o alho.
A presena de substncias antimicrobianas pode ser verificada atravs de extratos ou partes
homogeneizadas de vegetais colocados frente a culturas de microrganismos.

2. OBJETIVO
Estudar a presena de compostos antimicrobianos em vegetais.

3. MATERIAL

Placas de gar Sabouraud;


Alho, cebola;
Cotonetes;
Graal e pistilo;
Discos de papel de filtro;

Culturas: Staphylococcus sp e E. coli.

4. PROCEDIMENTO
1. Mergulhar o cotonete na suspenso do microrganismo;
2. Espalhar sobre a superfcie do meio com o prprio cotonete embebido na cultura;
3. Macerar o alho e a cebola, separadamente, em graal,
4. Embeber os discos de papel de filtro no macerado e coloc-los sobre a superfcie do
meio semeado;
5. Incubar a 35C por 2 ou 3 dias e observar os halos de inibio.

RESULTADOS

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Descreva as observaes feitas ao final da incubao.

FIXANDO O CONTEDO
Pesquise e relate algum outro antimicrobiano natural . Pode ser algum j relatado na literatura ou
algum de conhecimento popular.

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Data:

Prtica 03: CONTAGEM TOTAL DE MICRORGANISMOS


MESFILOS E PSICROTRFILOS
1. Introduo
O grupo de bactrias mesfilas (faixa e crescimento de 20- 37C) aerbias ou
anaerbias facultativas so indicadores higinicos. A contagem aumentada destes
microrganismos pode indicar falhas no processamento dos alimentos, contaminao
ambiental durante a manipulao e o potencial e deteriorao do alimento.
Desde que o contedo microbiano est relacionado com a higiene e a
conservao de alimentos (vida de prateleira), a contagem total pode servir de ndice de
controle higinico na produo, transporte e armazenamento.
A contagem de mesfilos por meio de placas no vlida para refletir as
condies de processamento dos produtos fermentados (leites fermentados, chucrutes,
salames, etc) j que a adio de culturas lticas ir influenciar num resultado elevado.
2. Material necessrio

Placas de Petri estreis;

Meio de cultura para Contagem Padro: PCA (Plate Count Agar);

Tubos com gua Peptonada para diluies.

3. Contagem de MESFILOS
POUR PLATE
a) Inocular 1ml de cada diluio em cada placa (duplicata);
b) adicionar aproximadamente 15ml do meio de cultura (PCA), homogeneizar;
c) incubar as placas invertidas a 35C/ 48horas.
4. Contagem de PSICROTRFILOS
SPREAD PLATE
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a) Inocular 0,1ml de cada diluio em cada placa previamente preparada (duplicata);


b) Espalhar o inculo com ala de Drigalski por toda a superfcie do meio at que o
excesso de lquido seja absorvido;
a) Incubar as placas Invertidas a 7C / 10 dias.
Esquema de Anlise

6. CONTAGEM: Contar as placas que tenham de 25 a 250 colnias, fazer a mdia


das colnias da mesma diluio como segue:
POUR PLATE: Aplicar mdia das colnias =______UFC / g ou UFC / ml
(unidade)
Diluio
SPREAD PLATE: Aplicar mdia das colnias x 10 =______UFC / g ou UFC
/ ml (unidade)
diluio
OBSERVAES
Psicrfilos
So microrganismos que tem a temperatura de crescimento entre 0C e 20C com uma faixa tima de
crescimento entre 10 e 15C. Exemplos: Pseudomonas, Alcaligenes, Flavobacteirum.
Psicrotrficos
Microrganismos que tem a capacidade de crescer a 7C ou menos sem considerar sua temperatura tima
de crescimento. Exemplos: Pseudomonas, Alcaligenes, Flavobacteirum, Enterobacter, Bacillus,
Lactobacillus, etc.

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Data:

Prtica 04: CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS


1. INTRODUO
A contagem de bolores e leveduras aplicvel principalmente na anlise de
alimentos cidos (pH < 4,5), alimentos parcialmente desidratados, farinhas, etc, nos
quais a presena elevada indicativa de falhas ao longo do processamento,
comprometendo a vida til do produto. Embora existam muitas espcies toxignicas,
os resultados desta contagem no visam obteno de informaes relacionadas
sade pblica, mas sim uma avaliao geral da qualidade do produto.

2. MEIO DE CULTURA
O meio de utilizado o Agar Batata Dextrose (PDA), acidificado com cido
tartrico 10% (esterilizado), para que haja inibio do crescimento de bactrias.
Os bolores apresentaro aspecto cotonoso em funo da presena do
agrupamento de hifas que forma o miclio e as leveduras apresentaro colnias
mucides, ambos em diversas coloraes.

3. PREPARO E DILUIO DA AMOSTRA


Pesar 25g da amostra em 225mL de gua Peptonada = Diluio 10-1
Diluies Seriadas:

1mL (da diluio 10-1) em 9mL de gua Peptonada = Diluio 10-2

1mL (da diluio 10-2) em 9mL de gua Peptonada = Diluio 10-3

(...) Assim sucessivamente at atingir o nmero de diluies desejadas.

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4. PLAQUEAMENTO E CONTAGEM

SPREAD PLATE
a) Inocular 0,1mL de cada diluio em placas (duplicata) com meio PDA
(acidificado) j solidificado;
b) Espalhar a alquota com auxlio de ala de Drigalski at completa absoro pelo
meio de cultura;
c) Incubar a 25C / 3-5 dias;
d) Contagem: contar as placas que tenham de 25 a 250 colnias.
Aplicar mdia das colnias x 10 =______UFC / g ou UFC / ml (unidade)
diluio
Esquema de Anlise

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