Weber Beringui Feitosa

WEBER BERINGUI FEITOSA
Protena quinase C (PKC) e protena quinase dependente de

clcio/calmodulina (CaMK II) na ativao de ocitos bovinos
So Paulo
2010
WEBER BERINGUI FEITOSA
Protena quinase C (PKC) e protena quinase dependente de

clcio/calmodulina (CaMK II) na ativao de ocitos bovinos
Tese apresentada ao Programa de PsGraduao em Reproduo Animal da

Faculdade
de
Medicina
Veterinria
Zootecnia da Universidade de So Paulo para

obteno do ttulo de Doutor em Cincias
Departamento:
Reproduo Animal
rea de Concentrao:
Reproduo Animal
Orientadora:
Profa. Dra. Mayra Elena Ortiz Dvila
Assumpo
So Paulo
2010
FEITOSA, W. B. Protena quinase C (PKC) e protena quinase dependente de clcio/calmodulina (CaMK II) na ativao
de ocitos bovinos. [Protein kinase C (PKC) and Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) in bovine
oocyte activation]. 2010. 87 f. Tese (Doutorado em Cincias) - Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia,
Universidade de So Paulo, So Paulo, 2010.
Pgina
Resumo
Pargrafo
1
Linha
4
Onde se l
87 f.
Leia-se
86 f.
FOLHA DE AVALIAO
Nome: FEITOSA, Weber Beringui

Ttulo: Protena quinase C (PKC) e protena quinase dependente de clcio/calmodulina
(CaMK II) na ativao de ocitos bovinos
Tese apresentada ao Programa de Ps-Graduao

em Reproduo
Medicina
Animal
Veterinria
da
e
Faculdade
Zootecnia
de
da
Universidade de So Paulo para obteno do

ttulo de Doutor em Cincias
Data: ____/____/____
Banca Examinadora
Prof. Dr. ________________________ Instituio: _____________________________

Assinatura: ______________________ Julgamento: ____________________________
Com os pais que tenho

Com o irmo que tenho
Com a famlia que tenho
Com os amigos que tenho
Com a orientadora que tenho
Com tudo que tenho
S posso dedicar esta tese vida
Pela sorte que tenho
AGRADECIMENTOS
Mayra Elena Ortiz Dvila Assumpo Camilla Mota Mendes Pai Marcela
Pecora Milazzotto Marclio Nichi Fabiola Paula Lopes Renata Simes Jose
Antonio Visintin Me Rafael Fissore FAPESP Camila Infantosi Vanuchi Francesco

Silvestre Mariana Groque Marques Chang Li He Marcelo Demarchi Goissis Maria
Anglica Peres Pedro Henrique Bugallo Risolio Jos Srgio Arruda Gonalves
Mariana Ianello Giassetti Fernanda Sevciuc Maria Everton Lopes Melissa Coney
Irmo Harumi Doi Shiraishi FMVZ Paulo Varoni Cavalcanti CAPES Dona Slvia
Marcia de Almeida Monteiro Melo Ferraz USP
Thais Soto Longaro Mariana
Ramos Queiroz Takuya Wakai Mara Bianchi Rodrigues Alves Lus Felipe Ortiz
Assumpo Padovese
Chris Malcuit Julia Maria Baldrighi Adriano
Felipe
Perez Siqueira Avital Sagalyn Joo Guilherme Ortiz Assumpo Padovese Nan Zhang
Banyoon Cheon Reginaldo da Silva Fontes V Claudia Lima Verde Leal

Flavia Regina Oliveira de Barros
Enrico Sala de Andrade
Veerle Vanderheyden Departamento de Reproduo Animal Giana Carla

Pimentel Saurin Hoi Chang Lee Adaris Matinez Rodrigo Amaral Laura Mota de
Oliveira Ana Rita de Sousa Coutinho Sook-Young Yoon Alessandra Coralo
Nicacio Maria Alice de Oliveira Samir Saldanha Nicolau Jessca Espada Rafaela
Sabchez Lima
O velho e o moo
Deixo tudo assim
no me importo em ver
a idade em mim
ouo o que convm
eu gosto do gasto
sei do incmodo
e ela tem razo
quando vem dizer
que eu preciso sim
de todo o cuidado
e se eu fosse o primeiro
a voltar pra mudar
o que eu fiz
quem ento agora eu seria
tanto faz
e o que no foi no
eu sei que ainda vou voltar
mas eu quem ser?
deixo tudo assim
no me acanho em ver
vaidade em mim
eu digo o que condiz
eu gosto do estrago
sei do escndalo
e eles tem razo
quando vem dizer
que eu no sei medir
nem tempo e nem medo
e se eu for o primeiro
a prever e poder
desistir do que for dar errado
olha se no sou eu
quem mais vai decidir
o que bom pra mim
dispenso a previso
se o que eu sou
tambm o que eu escolhi ser
aceito a condio
vou levando assim
que o acaso amigo
do meu corao
quando falo comigo
quando eu sei ouvir
(Rodrigo Amarante)
RESUMO
FEITOSA, W. B. Protena quinase C (PKC) e protena quinase dependente de
clcio/calmodulina (CaMK II) na ativao de ocitos bovinos. [Protein kinase C (PKC)
and Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) in bovine oocyte activation].
2010. 87 f. Tese (Doutorado em Cincias) - Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia,
A fecundao resulta no aumento intracelular de clcio que necessrio para a transio do
ocito at o estdio de zigoto. Os eventos que ocorrem durante esta transio so
caracterizados como ativao, sendo estes dependentes de clcio. Entretanto, os eventos
bioqumicos que ocorrem durante a ativao ainda no esto completamente elucidados. A
protena quinase C (PKC) e a protena quinase dependente de clcio/calmodulina (CaMKII),
por apresentarem atividade durante a fecundao e por serem ativadas por clcio so
implicadas na regulao dos eventos da ativao. Entretanto, existem muitas dvidas sobre o
real papel destas protenas na ativao do ocito. Deste modo, o objetivo do presente trabalho
foi avaliar o papel da PKC e da CaMKII na ativao de ocitos bovinos. Para tal, ocitos
bovinos maturados in vitro foram ativados partenogeneticamente (AP) com clcio ionforo
A23187 (5M) por 5 minutos, sendo a retomada da meiose, a organizao do citoesqueleto e
do retculo endoplasmtico (RE) avaliada 1 hora aps a ativao. No experimento 1 foi
avaliado o papel da CaMKII nestes eventos. Os ocitos foram AP na presena ou ausncia de
100M do inibidor de CaMKII (Autocamtide-2 Related Inhibitory Peptide, Myristoylated). A
inibio da CaMKII no afetou a retomada da meiose e nem a distribuio dos RE, aps a AP.
Entretanto, no ocorreu a rotao do fuso meitico no estdio de telfase II quando a CaMKII
foi inibidada. Estes resultados demonstram que embora a CaMKII no tenha efeito na
retomada da meiose, esta protena participa na progresso do ciclo celular de ocitos bovinos,
aps a AP. No experimento 2 foi avaliado o papel da PKC em ocitos bovinos AP. Os ocitos
foram ativados partenogeneticamente na presena ou ausncia de 10M do inibidor de PKC
(Bisindolymaleimide I). A inibio da PKC no afetou a retomada da meiose e nem a
progresso pelo ciclo celular at o estdio de telfase II. Entretanto, a organizao do RE foi
afetada pela inibio da PKC. Resultado semelhante foi obtido quando os ocitos foram
ativados na presena de citocalasina C, um despolimerizador de filamentos de actina. O
presente experimento demonstra a participao da via PKC-actina na organizao do RE na
ativao de ocitos bovinos.
Palavras-Chave: PKC. CaMK II. Retculo endoplasmtico. Ocito. Bovinos.
ABSTRACT
FEITOSA, W. B. Protein kinase C (PKC) and Calcium/calmodulin-dependent protein
kinase II (CaMKII) in bovine oocyte activation. [Protena quinase C (PKC) e protena
quinase dependente de clcio/calmodulina (CaMK II) na ativao de ocitos bovinos]. 2010.
87 f. Tese (Doutorado em Cincias) - Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia,
The intracellular calcium increase resulting from fertilization is necessary for oocyte
transition to zygote. The events that occur during this transition are characterized as
activation, which are dependent on calcium. However the biochemical events that occur
during this activation are still not fully elucidated. The protein kinase C (PKC) and the
calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII), are involved in regulating the
events of activation, since these proteins have activity during fertilization and are activated by
calcium. However there are many doubts about the real role of these proteins in the oocyte
activation. Thus, the objective of this study was to evaluate the role of PKC and CaMKII in
bovine oocyte activation. For this purpose, in vitro matured bovines oocytes were
parthenogenetically activated (PA) by using calcium ionophore A23187 (5M) for five
minutes, and the resumption of meiosis, the cytoskeleton organization and the endoplasmic
reticulum (ER) organization were evaluated 1 hour post-activation. In experiment 1, were
evaluated the role of CaMKII in these events. The oocytes were PA in the presence or absence
of 100M of CaMKII inhibitor (Autocamtide-2 Related Inhibitory Peptide, Myristoylated).
The inhibition of CaMKII did not affect the meiosis resumption and the ER after the PA.
However, there was no spindle rotation at telophase II stage when the CaMKII was inhibited.
These results showed that although the CamKII has no effect on resumption of meiosis, it
participates in the regulation of cell cycle progression after PA of bovine oocytes. In
experiment 2, was evaluated the role of PKC on PA bovine oocytes. The oocytes were
parthenogenetically activated in the presence or absence of 10M of PKC inhibitor
(Bisindolymaleimide I). The PKC inhibition did not affected the resumption of meiosis and
the progression through the cell cycle until the stage of telophase II. However, the ER
organization was affected by PKC inhibition. A similar result was obtained when the oocytes
were activated in the presence of cytochalasin C, which promotes the depolymerization of the
actin filaments. The current experiment showed the participation of the PKC-actin pathway at
the ER organization in the bovine oocytes activation.
Key words: PKC. CaMKII. Endoplasmic reticulum. Oocyte. Bovine.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Modelo hipottico grfico das possveis vias da ativao do ocito....... 19
Figura 2
Representao esquemtica das estruturas e da classificao das

isoformas. ................................................................................................ 22
Figura 3
Esquema da estrutura da CaMKII. .......................................................... 25
Figura 4
Distribuio dos filamentos de actina em ocitos no estdio de MII

e aps a ativao partenogentica com ou sem o inibidor de
CaMKII (AIP). ........................................................................................ 42
Figura 5
Retomada da meiose aps a ativao partenogentica com clcio

ionforo e efeito do inibidor de CaMKII (AIP) sobre a rotao do
fuso meitico. .......................................................................................... 43
Figura 6
Distribuio do RE em ocitos no estdio de MII e aps a ativao

partenogentica com ou sem o inibidor de CaMKII (AIP). .................... 44
Figura 7
Modelo hipottico grfico da participao da CaMKII na ativao

partenogentica de ocitos bovinos......................................................... 52
Figura 8 -
Organizao e distribuio dos microtbulos nos ocitos em MII e

aps a ativao partenogentica induzida pelo clcio ionforo,
tratados ou no com o inibidor de PKC (BIM). ...................................... 55
Figura 9
Distribuio dos filamentos de actina em ocito no estdio de

metfase II e aps a ativao partenogentica na presena ou
ausncia do inibidor de PKC (BIM)........................................................ 56
Figura 10
Distribuio do RE em ocitos no estdio de MII e aps a ativao

partenogentica com ou sem o inibidor de PKC (BIM). ......................... 57
Figura 11
Efeito da despolimerizao dos filamentos de actina na organizao

do RE. ...................................................................................................... 58
Figura 12
Modelo hipottico grfico da participao da PKC na ativao

partenogentica de ocitos bovinos......................................................... 66
LISTA DE ABREVIATURAS
g Micrograma;
L Microlitro;
AIP Autocamtide-2 Related Inhibitory Peptide, Myristoylated
BIM Bisindolylmaleimide I
BSA Albumina Srica Bovina
Ca2+ Clcio
[Ca2+]i Clcio intracelular
CaMK II Protena quinase dependente de Calmodulina
CIV Cultivo in vitro;
CO2 Dixido de carbono;
CSF Fator citosttico;
DAG Diacil glicerol
DNA cido desoxirribonuclico
Emi2 Inibidor meitico endgeno
ERM Esrina, Radixina e Miosina
ERP Protena relacionada a Emi2/Emi1
FITC Isotiocianato de fluorescena
FE Fator Espermtico
FSH Hormnio Folculo Estimulante
IP Fosfolipdio de inositol
IP3 Inositol trifosfato
LH Hormnio Luteinizante;
MAPK Protena quinase ativada por mitgenos
MARCKS Substrato de quinase C rico em alanina miristolada
MIV Maturao in vitro
mL Mililitro
MPF Fator Promotor da Maturao
MII Metfase II
PBS Tampo fosfato salino
PIP2 Fosfatidilinositol bifosfato
PLC Fosfolipase zeta;
Plx Polo quinase

PKC Protena quinase C
PVA lcool polivinlico
RE Retculo Endoplasmtico
SFB Soro Fetal Bovino;
SOF Fluido de oviduto sinttico
TCM-199 Meio de cultura de tecidos 199
VG Vescula Germinativa
SUMRIO
1 INTRODUO ...................................................................................................................... 15
2 REVISO DE LITERATURA ............................................................................................. 18
2.1 PROTENA QUINASE C (PKC) ......................................................................................... 21
2.2 PROTENA QUINASE DEPENDENTE DE CALMODULINA CaMKII .......................... 24
2.3 RETCULO ENDOPLASMTICO ..................................................................................... 27
3 HIPTESE ............................................................................................................................. 30
4 OBJETIVOS........................................................................................................................... 32
4.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................................. 32
4.2 OBJETIVOS ESPECFICOS................................................................................................ 32
5 MATERIAL E MTODO ..................................................................................................... 34
5.1 OBTENO DOS OCITOS.............................................................................................. 34
5.2 MATURAO IN VITRO................................................................................................... 34
5.3 DILUIO DOS INIBIDORES ........................................................................................... 35
5.4 INIBIO DA PKC E DA CAMKII ................................................................................... 35
5.5 DESPOLIMERIZAO DOS MICROFILAMENTOS DE ACTINA ................................ 35
5.6 ATIVAO PARTENOGENTICA................................................................................... 36
5.7 FIXAO E PERMEABILIZAO DOS OCITOS E ZIGOTOS .................................. 36
5.8 AVALIAO DA CROMATINA ....................................................................................... 37
5.9 AVALIAO DOS MICROTBULOS.............................................................................. 37
5.10 AVALIAO DOS FILAMENTOS DE ACTINA ........................................................... 37
5.11 AVALIAO DOS RETCULOS ENDOPLAMTICOS................................................ 38
5.12 MONTAGEM DAS LMINAS E AVALIAO DOS OCITOS E ZIGOTOS ............ 38
5.13 ANLISE ESTATSTICA ................................................................................................. 39
6 RESULTADOS: EXPERIMENTO 1 ................................................................................... 41
7 DISCUSSO: EXPERIMENTO 1 ....................................................................................... 46
8 CONCLUSES: EXPERIMENTO 1................................................................................... 52
9 RESULTADOS: EXPERIMENTO 2 ................................................................................... 54
10 DISCUSSO: EXPERIMENTO 2 ..................................................................................... 60
11 CONCLUSES: EXPERIMENTO 2................................................................................. 66
REFERNCIAS ........................................................................................................................ 68
ANEXOS .................................................................................................................................... 81
Introduo
15
1 INTRODUO
Durante a fecundao ocorre a liberao intracitoplasmtica de Ca2+. Uma vez

liberado, o Ca2+ inicia um processo de transduo de sinais que desencadeia a ativao do
ocito. O Ca2+ desempenha um papel piv na fecundao desencadeando todos os eventos da
ativao oocitria e o correto padro de oscilao Ca2+ fundamental para uma perfeita
transio ocito-zigoto-embrio (JONES, 2007).
Os eventos da ativao iniciados em resposta ao aumento da concentrao de Ca2+
intracelular [Ca2+]i na fecundao so classificados em eventos iniciais ou tardios da ativao
(SCHULTZ; KOPF, 1995). Os eventos iniciais incluem a retomada da meiose e a exocitose
dos grnulos corticais. O processo de exocitose seguido por alteraes das glicoprotenas da
zona pelcida e membrana plasmtica, estabelecendo deste modo o bloqueio da poliespermia
(RAZ; BEN-YOSEF; SHALGI, 1998). Os eventos tardios da ativao incluem a extruso do
segundo corpsculo polar, a descondensao do ncleo espermtico, o recrutamento de RNA
materno, a formao de proncleo, o incio da sntese de DNA e a clivagem (XU et al., 1994;
SCHULTS; KOPF, 1995). Entretanto, o efeito destas oscilaes de Ca2+ em protenas
especficas e como essas protenas regulam vrios eventos da ativao ainda no est
completamente elucidado. Algumas protenas quinase como a PKC e a CaMKII, por serem
ativadas pelo Ca2+, tem sido implicadas na regulao dos eventos da ativao oocitria.
H evidncias de que a PKC participa de importantes eventos da ativao do ocito
como a exocitose de grnulos corticais, a sada da metfase II, a extruso do corpsculo polar,
a formao do pr-ncleo, a reorganizao do citoesqueleto e a formao do fuso meitico.
Contudo, estes mesmos eventos tambm tem sido descritos como regulados pela CaMKII
(DUCIBELA; FISSORE, 2008).
Estas contradies em relao ao exato papel de cada protena (PKC e CaMKII) pode
ser devido aos diferentes agentes ativadores e inibidores utilizados em cada estudo, aos
diferentes mtodos de ativao partenogentica e tambm devido s particularidades inerentes
a cada espcie animal estudada. Embora exista contradio quanto ao papel que cada uma
destas protenas exerce durante a ativao do ocito, o que se sabe que tanto a PKC quanto a
CaMKII so ativadas durante a fecundao em conseqncia do aumento da concentrao de
[Ca2+]i (HALET et al., 2004; MADGWICK, 2005).
Weber Beringui Feitosa
Introduo
16
Na tentativa de trazer um pouco mais de conhecimento sobre o papel da PKC e da

CaMKII na ativao do ocito em bovinos, surgiu a idia de se delinear e realizar este
trabalho.
Reviso de literatura
18
9
2 REVISO DE LITERATURA
Ocitos da maioria dos mamferos so ovulados em metfase II (MII) e permanecem

neste estgio at a fecundao, quando retomam a meiose. A primeira srie de eventos que
ocorre no ocito chamada de ativao e inclui a retomada da meiose, a extruso do segundo
corpsculo polar, a replicao do DNA e a primeira clivagem mittica (SCHULTZ; KOPF,
1995). O aumento na concentrao intracelular de clcio (Ca2+) o sinal universal
responsvel pela ativao do ocito, entretanto existem vrias hipteses sobre como ocorre
este aumento de Ca2+ na ativao do ocito pelo espermatozide. Atualmente, a mais aceita
da presena de um fator espermtico (FE) (RUNFT et al., 2002), que introduzido junto com
o ncleo do espermatozide no citoplasma do ocito, sendo este fator o responsvel pelas
oscilaes de Ca2+, aps a fecundao.
Experimentos que realizam a microinjeo do extrato espermtico contendo o FE,
verificaram que este promove a ativao dos ocitos, promovendo oscilaes de clcio
semelhante s que ocorrem durante a fecundao em ocitos de camundongos (SWANN,
1996), de bovinos (KNOTT et al., 2002), de sunos (MACHATY et al., 2000) e de eqinos
(BEDFORD et al., 2003). Recentes estudos demonstram que uma nova fosfolipase C (PLC),
chamada de PLCzeta (PLC) fator espermtico responsvel por esta ativao do ocito, no
qual a microinjeo da PLC ou respectivo mRNA provoca oscilaes de clcio semelhantes
s que ocorre durante a fecundao (SAUNDERS et al., 2002; KOUCH et al., 2004; KNOTT
et al., 2005).
A fosfolipase C atua no fosfolipdio de inositol (IP) de membrana, catalisando a
hidrlise do fosfatidil 4,5-bifosfato (PIP2) gerando duas molculas mensageiras distintas. H
liberao da parte hidroflica do fosfolipdio e a produo do inositol 1,4,5-trifosfato (IP3),
enquanto que a cauda do lipdio, o diacilglicerol (DAG), permanece inserido na membrana
plasmtica. O IP3 deixa a membrana plasmtica e se difunde pelo citoplasma. Quando chega
ao retculo endoplasmtico, o IP3 se liga a receptores especficos (IP3R), abrindo os canais de
Ca2+ do retculo endoplasmtico, liberando estes ons para o citoplasma. Uma vez livre no
citoplasma h duas possveis vias pelas quais o Ca2+ atua na ativao do ocito (Figura 1).
19
Figura 1 - Modelo hipottico grfico das possveis vias da ativao do ocito. 1) Na fecundao, o
espermatozide libera dentro do ocito o fator espermtico (FE) contendo a PLC que causa
hidrlise do fosfolipdio de inositol produzindo duas molculas mensageiras (IP3 e DAG). O IP3 se
difunde pelo citosol, se liga aos receptores de IP3, liberando Ca2+ do retculo endoplasmtico e o
DAG que permanece na membrana plasmtica. 2) O DAG juntamente com o Ca2+ ativam a enzima
protena quinase C, que recrutada do citosol para a face citoslica da membrana plasmtica. 3) O
IP3 libera Ca2+ do retculo endoplasmtico que modifica a estabilidade conformacional da
calmodulina, fazendo com que esta se ligue a CaMKII tornando-a ativa
Durante a fecundao, os ocitos bloqueados no estdio de MII retomam a meiose.

Embora seja conhecido que o aumento da [Ca2+]i necessrio para induzir a retomada da
meiose, apenas recentemente os mecanismos que regulam este processo tm sido elucidados,
sendo descrito o envolvimento do fator promotor de maturao (MPF). O MPF um
heterodmero composto por uma quinase cataltica (p34cdc2 ou CDK1) e uma subunidade de
ciclina B regulatria. A atividade de MPF alta em ocitos no estdio de MII e diminui
rapidamente na fecundao (DOREE; HUNT, 2002; JONES, 2004). A diminuio da
atividade do MPF durante a fecundao mediada pelo complexo promotor de anfase
(APC), no qual a atividade essencial para a retomada da meiose (PETERS, 2006).
Recentemente, uma protena inibidora do APC chamada de protena relacionada
Emi2/Emi1 (Erp1), especfica para ocitos foi identificada como alvo do aumento do [Ca2+]i,
A Erp1 necessria para prevenir a atividade prematura do APC e, portanto, a retomada da
meiose. A Emi2 na fecundao fosforilada e degradada, sendo este evento promovido pela
CaMKII. A atividade da CaMKII aumenta na fecundao em resposta ao aumento da
20
9
concentrao de [Ca2+]i (MARKOULAKI et al., 2003; MARKOULAKI; MATSON;
DUCIBELLA, 2004), induzindo a degradao da ciclina B1, a inativao da MPF e a
retomada da meiose (MADGWICK; LEVASSEUR; JONES, 2005). Deste modo, a via de
transduo de sinal bsica, que atua na fecundao conhecida por ser a ativao da APC,
pela degradao da Emi2, estimulada pela CaMKII. A ativao da APC induz degradao
da ciclina B1 e consequentemente perda da atividade de MPF, levando retomada da
meiose.
Aps a fecundao ou a ativao partenogentica de ocitos de camundongos (MOOS
et al., 1995), de bovinos (LIU et al., 1998) e de sunos (YAMAUCHI et al., 1998), a atividade
do Fator Promotor da Maturao (MPF) diminui rapidamente, enquanto que um longo perodo
necessrio para a diminuio da atividade da Protena Quinase Ativada por Mitgeno
(MAPK). A diminuio da atividade do MPF est envolvida com o incio da ativao do
ocito (sada da MII) e a diminuio da MAPK est relacionada com a formao dos prncleos, evidenciando que a inativao de ambos ocorre por processos independentes (LIU et
al., 1998).
As funes celulares da inativao tardia da MAPK no esto muito claras. J o MPF
inativado rapidamente pela via da degradao dependente do Complexo Promotor de
Anfase (APC), sendo que esta inativao pr-requisito para a transio da metfase para a
anfase. Entretanto, o nvel de fosforilao e a quantidade da MAPK permanecem estveis
aps a ativao do ocito at a formao dos pr-ncleos.
As vias de transduo responsveis pela ativao do ocito em mamferos no so
completamente entendidas, e perguntas sobre Qual o sinal de transduo responsvel pela
ativao do ocito? Como esse mecanismo regulado? Qual o real papel do clcio? H
possibilidade de participao de novos fatores? ainda no foram respondidas. A literatura
confrontante sobre qual via de sinalizao utilizada pelo ocito aps a fecundao, para
retomar o ciclo celular. Atualmente a PKC e/ou CaMKII so as protenas mais cotadas,
entretanto o verdadeiro papel destas quinases na ativao do ocito e na diminuio da
atividade de MPF e conseqentemente na retomada da meiose precisa ser melhor estudada.
21
9
2.1 PROTENA QUINASE C (PKC)
A PKC foi originalmente identificada como uma protena quinase dependente de

clcio e fosfolipdio. Entretanto, no mnimo 11 isotipos de PKC foram identificados em
mamferos e classificados em 3 grupos de acordo com a estrutura e caracterstica de ativao:
O primeiro grupo foi constitudo pela PKCs convencionais (PKC, PKCI, PKCII e PKC)
que so dependentes de clcio e ativadas pela fosfatidilserina ou pelo diacilglicerol. O
segundo grupo constitudo por PKCs denominadas de novas (PKC, PKC, PKC, PKC
e PKC) que so independente de clcio, mas tambm reguladas pela fosfatidilserina ou pelo
diacilglicerol; e constituindo o terceiro grupo esto as PKC denominadas de atpicas (PKC e
PKC) que so independente de clcio e no necessitam de fosfatidilserina nem do
diacilglicerol para a ativao (MACKAY; TWELVES, 2007).
O domnio regulatrio da PKC contm dois mdulos conservados; o domnio C1 e o
C2. Diferente das PKCs convencionais, o domnio C2 das PKCs novas no possui
aminocidos para a ligao de clcio, enquanto que as PKCs atpicas no contm o domnio
C2 inteiro e possuem apenas um anel rico em cistena no domnio C1 (Figura 2)
(NISHIZUKA, 1992; NEWTON, 1995; SCHENK; SNAAR-JAGALSKA, 1999; SHIRAI;
SAITO, 2002).
O processo de fecundao em mamferos desencadeia oscilaes de [Ca2+]i e a
produo de diacilglicerol. Tanto o clcio quanto o DAG so tambm ativadores da PKC. Por
este motivo a PKC tem sido implicada na regulao dos principais eventos da ativao
oocitria relacionados estrutura desta clula desde a metfase II (MII) at a formao do
zigoto (GALLICANO et al., 1995; YU et al., 2008).
22
Fonte: MACKAY; TWELVES, 2007

Figura 2 - Representao esquemtica das estruturas e da classificao das isoformas da PKC. A PKC possui 4
domnios conservados (C1-4): C1 contm 1 ou 2 motifis que formam o stio de ligao do
diacilglicerol e do ster de forbol. C2 contm o stio para ligao de cidos lipdicos e de ligao de
clcio. C3 e C4 formam o stio de ligao de ATP e de substrato da unidade cataltica. O domnio C2
das PKCs novas no possui aminocidos para a ligao de clcio. As PKCs atpicas tm somente um
motifi rico em cistena e o stio de ligao do ster de forbol no foi detectado
Tem sido demonstrado que a atividade da PKC aumenta drasticamente em

conseqncia da elevao da concentrao de Ca2+ aps a fecundao em camundongos
(LURIA et al., 2000) e em sunos (FAN et al., 2002). Para que a PKC seja ativada, esta dever
migrar at a membrana plasmtica, local onde os domnios C1 e C2, desta protena,
interagem, respectivamente, com o DAG e os lipdeos de membrana (OANCEA; MEYER,
1998). A migrao da PKC para a membrana plasmtica foi descrita na ativao de ocitos de
camundongos (GALLICANO; MCGAUGHEY; CAPCO, 1997; LURIA et al., 2000), de ratos
(ELIYAHU; SHALGI, 2002) e de sunos (FAN et al., 2002), sendo correlacionada com as
oscilaes de [Ca2+]i (HALET et al., 2004).
A PKC est associada com vrios componentes do citoesqueleto (INAGAKI et al.,
1987). H evidncia de haver interao da sinalizao citoplasmtica com dois dos trs
componentes principais do citoesqueleto nos ocitos, os microtbulos e os microfilamentos
(CAPCO, 2001), no interagindo com os filamentos intermedirios.
Os filamentos de actina tm sido propostos como sendo reguladores da exocitose.
Evidncias observadas em outros tipos celulares sugerem que estes filamentos de actina
associados membrana plasmtica, atuam como uma barreira para a exocitose pela excluso
de vesculas secretrias (BURGOYNE et al., 1989; VITALE et al., 1991; TRIFARO et al.,
23
9
1992), sendo que a despolimerizao a primeira etapa na translocao destas para a
membrana plasmtica (LELKES et al., 1986; SONTAG et al., 1988; MUALLEM et al.,
1995).
Os filamentos de actina desempenham importante papel durante a fecundao. So
responsveis pela incorporao do espermatozide, pela exocitose dos grnulos corticais, pela
movimentao do fuso e pela extruso do corpsculo polar (CAPCO; TUTNICK; BEMENT,
1992; GALLICANO; MCGAUGHEY; CAPCO, 1992; GALLICANO; MCGAUGHEY;
CAPCO, 1995; TERADA; SIMERLY; SCHATTEN, 2000; WANG et al., 2000). Devido ao
fato destes microfilamentos possurem importante papel na dinmica da fecundao, e de que
a PKC promove a reorganizao dos filamentos de actina, com conseqente exocitose de
vesculas, nas clulas somticas (MUALLEM et al., 1995 TAKASHI 1997; WANG et al.,
2000), atribuiu-se a essa protena quinase a regulao do trfico de vesculas pelos filamentos
de actina durante a fecundao (ELIYAHU; SHALGI, 2002; ELIYAHU et al., 2005).
Como durante a fecundao, as PKCs convencionais migram at a membrana
plasmtica para se ligarem ao DAG, estas no so implicadas na regulao do microtbulo na
formao do fuso meitico. Contudo, as PKCs novas e atpicas possuem importante papel
no controle da dinmica do fuso durante a ativao de ocitos de mamferos (LEE et al.,
2000; SUN et al., 2001). Em um estudo no qual se realizou imunoprecipitao, Baluch et al.
(2004) demonstraram que a PKC fortemente associada com -tubulina e ambas
encontravam-se associadas ao fuso meitico. A inibio destas formas de PKC resultou na
quebra do fuso (BALUCH et al., 2004). J a PKC encontra-se associada ao fuso e ao ncleo
em zigotos de camundongos (VIVEIROS et al., 2003), no qual a sua distribuio muda de
difusa, em ocitos no estdio de MII, para localizada no fuso, aps a fecundao (TATONE et
al., 2003). Todavia, camundongos knockout para o gene da PKC continuaram frteis
(LEITGES et al., 2001), demonstrando que embora a PKC esteja presente no fuso meitico
na fecundao, sua atividade parece no ser fundamental na regulao deste.
A PKC tambm est envolvida em pelo menos uma das duas principais protenas
reguladoras do ciclo celular. A ativao farmacolgica da PKC pela droga 1-oleoyl-2-acetylsn-glycerol (OAG) provoca a desfosforilao da MAPK e promove a formao de prncleos (FAN; SUN, 2004). Este efeito pode ser impedido pelo uso do inibidor de PKC o1oleoyl-2-acetyl (OA), na ativao partenogentica, sugerindo que a ativao da PKC pode
induzir a formao pr-nuclear por uma cascata que desfosforila a MAPK em ocitos de
camundongos e de ratos (FAN; SUN, 2004). Resultado semelhante tambm foi observado
24
9
com o ativador de PKC, o forbol 12-miriatae 13 acetato (PMA) na formao dos pr-ncleos
em camundongos (SUN et al., 1999; HALET et al., 2004) e na diminuio da atividade da
MAPK em camundongos (LU at el., 2002).
Recentemente, Ito et al. (2003) compararam o papel da onda de Ca2+ e da ativao da
PKC com a diminuio da atividade do MPF e da MAPK durante a ativao partenogentica
de ocitos de sunos. O emprego de concentraes elevadas do clcio ionforo diminuiu a
atividade do MPF e da MAPK e induziu a formao pr-nuclear. A inibio da PKC com
calfostin foi suficiente para inibir a inativao da MAPK e conseqentemente a formao dos
pr-ncleos, aps a ativao partenogentica com clcio ionforo.
Por sua vez, a ativao da PKC com PMA, sem tratamento prvio com clcio
ionforo, diminuiu a atividade de MAPK de maneira dose-dependente, mas sem reduzir a
atividade do MPF em ocitos de sunos. Deste modo, a ativao partenogentica em ocitos
de sunos foi mediada pela inativao do MPF via clcio-dependente, seguida pela inativao
da MAPK, via dependente de PKC. A ativao da PKC induz a exocitose de grnulos
corticais, mas no h relatos na literatura de uma ligao direta entre a ativao da PKC e a
retomada da meiose (RAZ et al., 1998; JONES, 1998). De fato, a microinjeo de mRNA
para a forma constitutivamente ativa da PKC em ocitos de camundongo no foi suficiente
para a retomada da meiose (MADGWICK et al., 2005).
2.2 PROTENA QUINASE DEPENDENTE DE CALMODULINA CaMKII
Membros da famlia da protena quinase dependente de calmodulina (CaMK) so

classificados como Serina (ser) ou Threonina (thr) quinase no qual o substrato P (stio de
fosforilao) contm uma ser ou thr. Como diz o prprio nome, a ativao da CaMK
inicialmente dependente da ligao de Ca2+/calmodulina. Entretanto, em alguns casos elas so
capazes de se tornarem independente de Ca2+/calmodulina aps a ativao ou necessitam de
modificao adicional como a fosforilao por outros reguladores para alcanarem uma
ativao completa. A CaMK possui um domnio cataltico bi-lobado seguido por um domnio
regulatrio contendo tanto o domnio auto-inibitrio quanto o domnio de ligao da
calmodulina (GRIFFITH; 2004).
25
9
A famlia da CaMK dividida em duas classes: CaMK multifuncional (CaMKK,
CaMKI, CaMKII e CaMKIV),
na qual cada uma possui mltiplos alvos e; substrato
especfico (CaMKIII, Quinase fosforilase e MLCK) que possuem apenas um alvo especfico.
A CaMKII (Figura 3), por mediar diversas respostas fisiolgicas em resposta ao aumento
intracelular de Ca2+, tem sido implicada com a principal CaMK envolvida na ativao do
ocito. Isto ocorre devido a sua capacidade de ativao por Ca2+/calmodulina e por modular
diversas funes como regulao de canais inicos, da exocitose e do citoesqueleto
(COLBRAN, 2004).
Fonte: GRIFFITH; 2004

Figura 3 - Esquema da estrutura da CaMKII. Todos os isotipos da CaMKII contm um domnio cataltico Nterminal, um domnio regulador interno, e um domnio C-terminal. O domnio regulatrio, da
seqncia, descrito na parte superior do diagrama bipartido. A parte proximal do domnio (AA 282300) contm resduos que interagem com o domnio cataltico para inibir a atividade de
fosfotransferase (indicado pela barra abaixo da seqncia). A poro distal deste domnio (AA 293310) se liga ao Ca2+/calmodulina (indicado pela barra acima da seqncia). Os stios de fosforilao
regulatrio na Thr286, Thr305, e Thr306 esto indicados por crculos
Corroborando com o papel da CaMK na ativao do ocito est o fato de a CaMKII

estar presente em ocitos de vrias espcies (BAITINGER et al., 1990; LORCA et al., 1993;
JOHNSON et al., 1998) e sua atividade aumentar durante a fecundao ou a ativao
partenogentica (WINSTON; MARO, 1995; WINSTON et al., 1995; JOHNSON et al., 1998;
TATONE et al., 2002; MARKOULAKI et al., 2003; MARKOULAKI; MATSON;
DUCIBELLA, 2004) com pulsos de atividade em respostas s oscilaes de [Ca2+]i
(MARKOULAKI; MATSON; DUCIBELLA, 2004).
A inibio da CaMKII bloqueou a sada da Metfase II em ocitos de camundongos
ativados por clcio (JOHNSON et al., 1998), etanol (WINSTON; MARO, 1995) ou pela
fecundao (TATONE et al., 2002). Resultado semelhante foi observado em ocitos de
sunos, aps a ativao (FAN et al., 2003). Confirmando a participao da CaMKII na
retomada da meiose, a microinjeo de CaMKII constitutivamente ativa em ocitos de
26
9
Xenopus e do respectivo mRNA em ocitos de camundongos promoveu a retomada da
meiose e a degradao da ciclina, mesmo na ausncia de Ca2+ (LORCA et al., 1993;
MADGWICK et al., 2005).
O fator promotor de maturao/mitose (MPF), um heterodmero composto por uma
unidade cataltica chamada de p34cdc2 e uma unidade reguladora chamada de ciclina B tornase ativo quando a ciclina B se liga p34cdc2, promovendo a desfosforilao e torna-se inativo
quando ocorre a degradao da ciclina B. Em ocitos de camundongos e de sunos, durante a
fecundao ou a ativao partenogentica h estmulo para a degradao da ciclina B. A
degradao da ciclina B evitada pela inibio da CaMKII (WINSTON et al., 1995;
JOHNSON et al., 1998; TATONE et al., 2002; FAN et al., 2003). O mesmo pode ser descrito
em ocitos de Xenopus, no qual a onda de clcio induzida durante a fecundao ativa a CaMquinase, que estimula a degradao da ciclina B pela via da ubiquitina, resultando na
inativao da quinase p34cdc2 (WATANABE et al., 1991).
De fato, o aumento da atividade de [Ca2+]i promove a retomada da meiose durante a
fecundao pela regulao da atividade de MPF (degradao da ciclina) mediada pelo
complexo promotor de anfase (APC) (NIXON et al., 2002). Recentemente, trs grupos
relataram que a inibio do (APC) pela Emi2 sustentada pela CaMKII e pela Plx1 de
maneira dose dependente (LIU; MALLER, 2005; RAUH et al., 2005; HANSEN et al., 2006).
A CaMKII fosforila a Emi2, permitindo a ligao da Plx1, que por sua vez gera uma segunda
fosforilao na Emi2. Esta segunda fosforilao promove a degradao da Emi2, reduzindo a
inibio do APC, permitindo a retomada da meiose.
A CaMKII tambm participa da regulao do citoesqueleto na formao do fuso ou
segregao do cromossomo (FAN et al., 2003) apresentando forte associao com o fuso
meitico, imediatamente aps a ativao, passando a localizar-se nos microtbulos entre a
anfase II e a telfase II (JOHNSON et al., 1998). Embora seja descrito que a CaMKII regule
os filamentos de actina em clulas somticas (XX),
na fecundao, de acordo com os
experimentos realizados por Knott et al. (2006) e por Gardner et al. (2007) essa protena
parece no exercer esse papel. Ao microinjetarem mRNA para CaMKII constitutivamente
ativa em ocitos de camundongos no houve induo de migrao dos grnulos corticais e
nem bloqueio da poliespermia, Como se sabe que amigrao dos grnulos corticais durante a
fecundao organizada pelos filamentos de actina (ELIYAHU et al., 2005), presume-se que
h uma ausncia da regulao dos filamentos de actina pela CaMKII durante esta etapa.
27
9
2.3 RETCULO ENDOPLASMTICO
O retculo endoplasmtico (RE) uma organela multifuncional e altamente dinmica

que esta envolvida na sntese de lipdeos e protenas e na regulao da homeostase do clcio.
Durante a maturao, o RE sofre reorganizao, ou seja, no estdio de vescula germinativa, o
RE encontra-se na regio medular do citoplasma em ocitos de camundongos (MEHLMANN
et al., 1995; FITZHARRIS; MARANGOS; CARROLL, 2007) ou na regio cortical em
ocitos de hamster (SHIRAISHI et al., 1995). Na retomada da meiose, durante a quebra da
vescula germinativa, o RE forma um denso anel no centro do ocito ao redor do ncleo
(MEHLMANN et al., 1995; SHIRAISHI et al., 1995; FITZHARRIS; MARANGOS;
CARROLL, 2007). O RE continua se reorganizando durante a progresso da meiose,
migrando junto com o fuso meitico para a regio cortical do ocito no estdio de metfase II.
Como o retculo endoplasmtico (RE) a principal fonte de Ca2+ em ocitos, esta
reorganizao parece ser essencial para o estabelecimento adequado das oscilaes de [Ca2+]i
durante a ativao (artigo em elaborao)1.
Dependendo da espcie, o RE tambm sofre profunda reorganizao durante a
fecundao. Em ocitos de ourio do mar, a rede cortical do RE, logo aps a entrada do
espermatozide (30 segundos) sofre alteraes que resultam em fragmentao desta rede, que
volta conformao original (ocito no fecundado) depois 5 a 10 minutos (TERASAKI;
JAFFE, 1991).
O mesmo fenmeno pode ser observado em ocitos de starfish (JAFFE; TERASKAI,
1994). Em ocitos de Xenopus tambm observada uma rpida reorganizao do RE durante
a fecundao, porm sem fragmentao da rede de RE (TERASAKI; RUNFT; HAND, 2001).
O que ocorre nesta espcie a desagregao do cluster (agrupamento) de RE durante a
fecundao, que diferentemente do que ocorre em ourio do mar e no starfish, no retornam
posio original, encontrada em ocitos no fecundados (TERASAKI; RUNFT; HAND,
2001).
Diferentemente do que ocorre em ocitos de ourio do mar, starfish e Xenopus, em
camundongos no foi observada esta rpida reorganizao do RE (MEHLMAN et al., 1995).
Entretanto os clusters de RE desagregam aproximadamente entre 3 a 4 horas aps a
fecundao (FITZHARRIS; MARANGOS; CARROLL, 2003), aproximadamente 2 horas
1
FEITOSA, W.B. Reorganizao do RE na maturao de ocitos de camundongos. Em elaborao
28
9
antes do trmino das oscilaes de [Ca2+]i (JONES et al., 1995). Aps a desagregao, o RE
perde a capacidade de se agregar durante a progresso do ciclo celular e o incio da clivagem
(FITZHARRIS; MARANGOS; CARROLL, 2003), sugerindo que a desagregao do RE e
importante para o trmino das oscilaes de [Ca2+]i.
Em bovinos, a organizao da protena calreticulina (protena do RE associada
liberao de clcio) em ocitos em MII, encontra-se distribuda pelo citoplasma em forma de
cluster (PAYNE; SCHATTEN, 2003). De forma semelhante ao zigoto de camundongo, o
RE em ocitos de bovino, avaliado por sua protena calreticulina no sofre reorganizao aps
a fecundao (PAYNE; SCHATTEN, 2003). Entretanto, a protena Sec 23 (protena do RE
associada exocitose de vesculas), que se encontra distribuda pelo citoplasma em ocitos no
estdio de metfase II, sofre reorganizao aps a fecundao passando a se localizar na
regio cortical aps a fecundao (PAYNE; SCHATTEN, 2003). O motivo da reorganizao
do RE assim como os mecanismos que a regulam no so muito claro.
Aparentemente, a reorganizao e/ou fragmentao do RE pode facilitar a migrao
do pr-ncleo de maneira similar a quebra do envelope nuclear espermtico (TERASKAI;
JAFFE, 1991). Adicionalmente, a reorganizao do RE parece estar associada ao padro de
oscilao de clcio de cada espcie. Em ocitos de equinodermes, espcie que apresenta um
nico pico de [Ca2+]i, o RE reorganizado rapidamente aps a fecundao. Por outro lado,
em ocitos de mamferos, que possuem picos repetitivos de [Ca2+]i (oscilaes), na
fecundao, o RE no sofre rpida reorganizao. Isto sugere que o padro do sinal de clcio
pode estar relacionado estabilidade e/ou reorganizao do RE (STRICKER, 1999; KLINE,
2000).
Todos os eventos envolvidos na ativao do ocito so um complexo mecanismo
bioqumico, molecular e celular, que envolvem uma extensa rede de sinalizao regulada por
vrias protenas. As vias de transduo responsveis pela ativao do ocito em mamferos
no so completamente entendidas. Muitas dvidas sobre os sinais de transduo na ativao
do ocito, mecanismos de regulao destas vias, mecanismo pelo qual o Ca2+ ativa o ocito e
at a possvel existncia de novos fatores ainda existem. A literatura confrontante sobre qual
via de sinalizao utilizada pelo ocito aps a fecundao, na regulao dos eventos da
ativao e qual a real funo de cada uma dessas vias. Atualmente a PKC ou a CaM-quinase
so consideradas protenas chave na regulao destes eventos, embora a literatura tambm
seja confrontante em relao participao destas protenas na ativao oocitria. Desta
forma o presente trabalho se prope a estudar o papel destas protenas na ativao de ocitos
bovinos
Hiptese
30
3 HIPTESE
A PKC e a CaMKII participam na regulao dos mecanismos de ativao de ocitos

bovinos em diferentes vias de sinalizao que regulam eventos distintos.
Objetivos
4 OBJETIVOS
Para confirmar a hiptese, os objetivos desta tese foram:
4.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a funo da PKC e da CaMKII na ativao de ocitos bovinos
4.2 OBJETIVOS ESPECFICOS
Avaliar a funo da PKC e da CaMKII na retomada da meiose
Avaliar a funo da PKC e da CaMKII na regulao do citoesqueleto
Avaliar a funo da PKC e da CaMKII na organizao do retculo endoplasmtico
32
Material e mtodo
34
5 MATERIAL E MTODO
Para a realizao deste trabalho, o material mtodo est descrito nos itens a seguir.
5.1 OBTENO DOS OCITOS
Os ovrios foram obtidos de fmeas bovinas abatidas em frigorfico comercial e

transportados em recipiente trmico contendo soluo fisiolgica, aquecida a 30C. No
laboratrio, os ovrios foram lavados em soluo fisiolgica aquecida a 30C, acrescida de 50
g/ml gentamicina.
Os ocitos foram obtidos com auxlio de bisturi e pina hemosttica, em bquer de
vidro contendo 50 mL de meio de fatiamento (TCM 199 Hepes suplementado com 1% (v/v)
de SFB e 50 g/ml gentamicina - Anexo A). Para tanto, os folculos com dimetro de 2 a 8
mm foram fixados com pina hemosttica e incisados com lmina de bisturi, sendo o lquido
folicular recolhido no bcker. Ao trmino das incises de cada ovrio, o mesmo foi agitado no
meio de lavagem, para melhor recuperao do contedo folicular. O meio de lavagem
contendo o lquido folicular de todos os ovrios incisados foi transferido para um tubo de
centrfuga de 50 mL, que permaneceu em banho-maria 37 C por 15 minutos para
sedimentao dos complexos cumulus oophorus (CCOs). Aps este perodo, o sedimento foi
lavado em filtro de nylon de 100m (BD) e o material retido foi transferido pra uma placa de
petri de 100 mm, para recuperao e posterior avaliao dos ocitos, sob estereomicroscpio.
5.2 MATURAO IN VITRO
Os ocitos classificados como graus I e II (contendo trs ou mais camadas de clulas

do cumulus oophorus e citoplasma uniforme) foram lavados trs vezes em meio de lavagem
(TCM 199 Hepes suplementado com 10% (v/v) de SFB, 22 g/ml de piruvato e 50 g/ml
gentamicina Anexo A) seguido por trs lavagens em meio de maturao (TCM 199
Material e mtodo
35
suplementado com 10% (v/v) de SFB, 0,5g/ml de FSH, 5g/ml de hCG, 1g/ml de E2,
22g/ml de piruvato e 50g/ml de gentamicina Anexo A). Aps as lavagens, 20 a 30 ocitos
foram colocados em gotas de 90 L de meio de maturao, sob leo mineral e foram
maturados in vitro por 24 horas a 38,5C em atmosfera de 5% de CO2 em ar e alta umidade.
5.3 DILUIO DOS INIBIDORES
O inibidor de PKC Bisindolylmaleimide I (BIM) foi diludo em dimetilsulfxido na

concentrao de 10 mM (Anexo B). O inibidor da CaMKII Autocamtide-2 Related
Inhibitory Peptide, Myristoylated (AIP) foi diludo em gua ultrapura (Milli Q) na
concentrao de 1 mM (Anexo B). Aps a diluio, os inibidores foram aliquotados em tubos
de microcentrfuga e armazenados a 20 C.
5.4 INIBIO DA PKC E DA CAMKII
Ao trmino da maturao, as clulas do cmulus foram removidas enzimaticamente

com 0,1% (p/v) de hialuronidase por 10 minutos e mecanicamente com auxlio de pipeta
automtica. Aps a remoo das clulas do cmulus, os ocitos, previamente ativao
partenogentica foram incubados por 30 minutos em meio SOFaa suplementado com 10M
do inibidor (BIM) ou sem inibidor (grupo controle), nos experimentos nos quais foi avaliada a
funo da PKC; ou na ausncia (controle) ou suplementado com 100M do inibidor AIP ou
sem inibidor (grupo controle), nos experimentos nos quais foi estudada a funo da CaMKII.
5.5 DESPOLIMERIZAO DOS MICROFILAMENTOS DE ACTINA
Ao trmino da maturao, as clulas do cmulus foram removidas enzimaticamente

com 0,1% (p/v) de hialuronidase por 10 minutos e mecanicamente com auxlio de pipeta
Material e mtodo
36
automtica. Aps a remoo das clulas do cmulus, os ocitos, previamente ativao

partenogentica foram incubados por 30 minutos em meio SOFaa suplementado com
citocalasina B (5/mL). Aps este perodo, os ocitos foram ativados partenogeneticamente e
cultivados por 1 hora em SOFaa suplementado com citocalasina B (5/mL).
5.6 ATIVAO PARTENOGENTICA
Aps a incubao por 30 minutos com ou sem a suplementao dos inibidores BIM ou
AIP, os ocitos foram ativados partenogeneticamente com clcio ionforo A23187 (5M) por
5 minutos (Anexo C). Aps a ativao, os ocitos foram lavados 3 vezes em meio SOFaa
(Anexo C)e cultivados in vitro por 1 hora, no mesmo meio, suplementado com 10M de BIM
ou no (grupo controle), nos experimentos no qual foi avaliada a funo da PKC ou por 1
hora com 100M do inibidor AIP ou sem (grupo controle), nos experimentos no qual foi
estudada a funo da CaMKII.
5.7 FIXAO E PERMEABILIZAO DOS OCITOS E ZIGOTOS
Os ocitos no estdio de MII e os zigotos ativados com ou sem inibidores de PKC

(BIM) ou de CaMKII (AIP) foram fixados em 3,7% (v/v) de formaldedo por 30 minutos
(Anexo D). Aps a fixao, os ocitos foram lavados trs vezes em PBS (tampo fosfato
salina, livre de clcio e magnsio), acrescido de 0,1% (p/v) de PVA (lcool polivinlico)
(Anexo D). Ao trmino das trs lavagens, ocitos e zigotos foram permeabilizados por 5
minutos com 0,1% (v/v) de triton X-100 diludo em PBS suplementado com 0,1% de PVA
(Anexo D), sendo posteriormente lavados 3 vezes em PBS, acrescido de 0,1% (p/v) de PVA.
Material e mtodo
37
5.8 AVALIAO DA CROMATINA
Para a avaliao da configurao nuclear, os ocitos e zigotos foram incubados por 10

minutos em PBS acrescido de 0,1% (p/v) de PVA, contendo 10 g/ml de Hoechst 33342,
diludo em glicerol (Anexo D). As estruturas foram avaliadas em lminas que foram
confeccionadas conforme descrito detalhadamente no item 5.12, sob microscopia de
epifluorescncia.
5.9 AVALIAO DOS MICROTBULOS
Os ocitos e os zigotos foram bloqueados em PBS sem clcio e magnsio,

suplementado com 5% de soro de cabra (v/v) por 30 minutos (Anexo D). Aps o bloqueio, os
ocitos e zigotos foram incubados por 1 hora com o anticorpo primrio de camundongo
antialfa-tubulina bovina (Invitrogen, Carlsbad, California, EUA - A11126). O anticorpo
primrio foi diludo (1:100; v/v) em PBS sem clcio e magnsio, suplementado com 5% de
soro de cabra (v/v). Ao trmino da incubao, ocitos e zigotos foram lavados 3 vezes em
PBS sem clcio e magnsio, suplementado 5% de soro de cabra (v/v) e incubados por mais 1
hora com o anticorpo secundrio de coelho anti-IgG de camundongo Alexa Fluor 568
(Invitrogen, Carlsbad, California, EUA - A11031), sendo este diludo1:200; v/v em PBS sem
clcio e magnsio, suplementado com 5% de soro de cabra (v/v). Aps este perodo, as
estruturas foram lavadas 3 vezes em PBS sem clcio e magnsio suplementado com 5% de
soro de cabra (v/v). As estruturas foram avaliadas em lminas que foram confeccionadas
conforme descrito detalhadamente no item 5.12., sob microscopia de epifluorescncia.
5.10 AVALIAO DOS FILAMENTOS DE ACTINA
Para a avaliao dos filamentos de actina, ocitos e zigotos foram fixados e

permeabiliazados e incubados com 120L da toxina faloidina conjugada com alexa fluor 568
Material e mtodo
38
(Invitrogen, Carlsbad, California, EUA A12380), por 1 hora. Ao trmino da incubao,

ocitos e zigotos foram lavados trs vezes em PBS sem clcio e magnsio suplementado com
5% de soro de cabra (v/v). As estruturas foram avaliadas em lminas que foram
confeccionadas conforme descrito detalhadamente no item 5.12., sob microscopia de
epifluorescncia.
5.11 AVALIAO DOS RETCULOS ENDOPLAMTICOS
Para avaliar o efeito da PKC e da CaMKII na distribuio do RE, os ocitos e os

zigotos foram bloqueados com PBS sem clcio e magnsio suplementado com 5% de soro de
cabra (v/v), por 30 minutos. Ao trmino da incubao, ocitos e zigotos foram incubados por
1 hora com o anticorpo primrio de coelho anti-retculo (PDI) (abcam, Cambridge,
Massachusetts, EUA AB3672), utilizando a diluio 1:100 (v/v) em PBS sem clcio e
magnsio suplementado com 5% de soro de cabra. Aps a incubao, ocitos e zigotos foram
lavados trs vezes em PBS sem clcio e magnsio suplementado com 5% de soro de cabra
(v/v) e incubados com o anticorpo secundrio de jumento anti-IgG de coelho (Santa Cruz
Biotechnolohy, Santa Cruz, Califrnia, EUA SC-2090). Para diluir o anticorpo secundrio
foi utilizado PBS sem clcio e magnsio suplementado com 5% de soro de cabra 1:200; v/v
por 1 hora. Aps este perodo, as estruturas foram lavadas trs vezes em PBS sem clcio e
magnsio suplementado com 5% de soro de cabra (v/v). Os ocitos e os zigotos foram
avaliados em lminas que foram confeccionadas conforme descrito detalhadamente no item
5.12., sob microscopia de epifluorescncia.
5.12 MONTAGEM DAS LMINAS E AVALIAO DOS OCITOS E ZIGOTOS
Aps a imunofluorescncia e/ou marcao com as sondas fluorescentes, os ocitos ou

os zigotos foram agrupados (n=5) e colocados em 10 L de DABCO (Anexo D) sobre lmina.
A lamnula foi previamente marcada com parafina nas extremidades e as estruturas foram
Material e mtodo
39
comprimidas entre lmina e lamnula com uma leve presso nas extremidades da lamnula,
sendo ento realizado vedao com esmalte de unha comum.
A avaliao da cromatina, dos microtbulos, dos filamentos de actina e do RE foi
realizada sob microscpio de epifluorescncia, utilizando filtros com 355, 490 e 520nm de
excitao e 465, 552 e 610nm de emisso, para as fluorescencias azul, vermelha e verde,
respectivamente.
5.13 ANLISE ESTATSTICA
A avaliao da organizao dos filamentos de actina, de tubulina e o retculo

endoplasmtico foi feita por microscopia de epifluorescncia e a intensidade da fluorescncia
emitida pelos ocitos e zigotos foi quantificada pelo programa image J (Maryland, USA). Os
dados de intensidade de fluorescncia capturados pelo programa foram avaliados utilizando o
procedimento PROC GLM do programa Statistical Analysis System, verso 9.1.3 (SAS,
1995), sendo posteriormente utilizado o teste t Student, com nvel de significncia de 5%.
Foram realizadas cinco replicatas por tratamento, com uma mdia de 20 ocitos por replicata
(n=100 ocitos).
41
Resultados: Experimento 1
6 RESULTADOS: EXPERIMENTO 1
A CAMKII REGULA A ROTAO DO FUSO MEITICO APS A ATIVAO

PARTENOGENTICA
A distribuio e a organizao dos filamentos de actina foram avaliadas por

fluorescncia, e esto apresentadas na figura 4. Os filamentos de actina encontravam-se
distribudos por todo o citoplasma nos ocitos em MII, com uma marcada concentrao na
membrana plasmtica e especialmente na placa metafsica (Figura 4A-C). Aps a ativao
partenogentica foi observada uma diminuio na fluorescncia dos filamentos de actina,
quando comparada a dos ocitos em MII. A diminuio de intensidade de fluorescncia pode
representar uma despolimerizao ou reorganizao dos filamentos de actina. Esta reduo da
fluorescncia dos filamentos de actina ocorreu tanto no citoplasma quanto na membrana
plasmtica.
Entretanto, a marcao fluorescente estava aumentada na regio do fuso meitico e no
segundo corpsculo polar, indicando aumento de filamentos de actina nestas estruturas
(Figura 4D-F). Nos ocitos tratados com AIP, os filamentos de actina aps a ativao
partenogentica, se assemelhavam aos dos ocito em MII, distibudos pelo citoplasma e com
alta concentrao na membrana plasmtica. Porm, diferindo apenas pela forte organizao ao
redor do fuso meitico (Figura 4G-I).
42
Figura 4 - Distribuio dos filamentos de actina em ocitos no estdio de MII e aps a ativao partenogentica
com ou sem o inibidor de CaMKII (AIP). Os filamentos de actina (vermelho) e a cromatina (azul)
foram corados com faloidina e hoechst, respectivamente Os ocitos em MII apresentam os filamentos
de actina distribudos pelo citoplasma e com forte marcao na membrana plasmtica (A-C). A
ativao partenogentica induziu a despolimerizao e/ou reorganizao dos filamentos de actina (DF), que foi prevenida pela inibio da CaMKII (G-I)
A organizao dos microtbulos e a morfologia dos cromossomos esto apresentadas

na figura 5. Nos ocitos em MII, os microtbulos foram observados distribudos por todo o
citoplasma apresentando maior concentrao no fuso meitico (Figura. 5A-C). Aps a
ativao partenogentica, os ocitos retomaram a meiose progredindo pelo ciclo celular at a
telfase II (92%). As cromtides irms migraram para plos opostos ao fuso ligeiramente
alongado formado pelos microtbulos. O fuso sofreu rotao, localizando-se verticalmente em
relao membrana plasmtica (Figura 5D-F). A ativao dos ocitos tratados com 100 M
de AIP no afetou a retomada da meiose ou a migrao das cromtides irms para lados
opostos ao fuso. O fuso apresentou morfologia ligeiramente alongada de forma semelhante
43
aos ocitos ativados sem a presena do inibidor AIP. Entretanto, o tratamento com AIP inibiu
a rotao do fuso meitico (37%), o qual, 1 hora aps a ativao partenogentica continuavam
se localizado paralelamente membrana plasmtica (Figura 5G-I)
Figura 5 - Retomada da meiose aps a ativao partenogentica com clcio ionforo e o efeito do inibidor de
CaMKII (AIP) sobre a rotao do fuso meitico. Os microtbulos (vermelho) e a cromatina (azul)
foram marcados com anticorpo anti-tubulina e hoechst, respectivamente. Aps 24 horas de
maturao os ocitos alcanaram o estdio de MII e os microtbuos estavam localizados em maior
concentrao no fuso meitico (A-C). O clcio ionforo induziu a retomada da meiose e 1 hora aps
a ativao, o fuso no atingiu o estdio de telfase e apresentava orientao perpendicular
membrana plasmtica e os cromossomos separados pelos microtbulos em dois plos (D-F). Nos
ocitos nos quais a CaMKII foi inibida, o fuso no sofre rotao, aps a ativao partenogentica (GI)
Como o inibidor de CaMKII afetou a organizao dos filamentos de actina foi avaliado
se esta alterao tambm poderia afetar a organizao dos retculos endoplasmticos (RE).
Em ocitos no estdio de MII, o RE encontrava-se disperso pelo citoplasma, de maneira
uniforme (Figura 6A).
44
Aps a ativao partenogentica com clcio ionforo houve a migrao dos RE para a
regio cortical (Figura 6B). Embora a fluorescncia emitida pelo RE, disperso no citoplasma,
tenha diminudo em relao aos ocito em MII, o mesmo continuou disperso pelo citoplasma
com exceo da regio ao redor do fuso (Figura 6C). A ativao partenogentica dos octitos
tratados com AIP, no alterou a organizao do RE em relao aos ocitos ativados
partenogeneticamente, na ausncia do AIP (Figura 6D).
Figura 6 - Distribuio do RE em ocitos no estdio de MII e aps a ativao partenogentica com ou sem o
inibidor de CaMKII (AIP). O RE endoplasmtico (verde), os microtbulos (vermelho) e a cromatina
(azul) foram corados com os anticorpos anti RE (PDI), anti-tubulina e com o hoechst,
respectivamente. O RE se localiza de forma homognea pelo citoplasma do ocito em MII (A). Aps
a ativao partenogentica ocorre a migrao para a regio cortical (B), embora uma menor
quantidade permanea distribuda pelo citoplasma, com exceo da regio ao redor do fuso (C). O
uso o inibidor de CaMKII (AIP) no alterou o padro de organizao do RE, aps a ativao
partenogentica em relao aos ocitos ativados sem o uso do AIP (D)
Discusso: Experimento 1
46
7 DISCUSSO: EXPERIMENTO 1
A protena quinase dependente de calmodulina (CaMKII) est envolvida na regulao

e na coordenao de vrios processos celulares que ocorrem durante a ativao de ocitos de
Xenopus (HANSEN et al., 2006), de camundongos (MADGWICK et al., 2005) e de sunos
(FAN et al., 2003). Entretanto, no existem informaes sobre a funo da CaMKII na
ativao de ocitos bovinos. Por este motivo, o papel da CaMKII na ativao de ocitos desta
espcies foi estudada no presente trabalho.
Aps a extruso do corpsculo polar, o ocito deve restabelecer o alto nvel de
atividade do MPF e deve permanecer bloqueado em MII at a fecundao. Na fecundao, a
fosfolipase C zeta (PLC), introduzida pelo espermatozide induz as oscilaes de [Ca2+]i,
responsveis pela ativao da CaMKII. Uma vez ativada, a CaMKII causa a degradao da
Erp1/Emi2 ativando o complexo promotor de anfase (APC), o que direciona pra a retomada
da meiose.
A inibio da CaMKII bloqueia a progresso do ciclo celular em ocitos de rato
(YOO; SMITH, 2007) e de sunos (FAN et al., 2003) ativados partenogeneticamente e
tambm nos ocitos fecundados ou ativados partenogeneticamente de camundongos
(JOHNSON et al., 1998; TATONE et al., 2002; MARKOULAKI; MATSON; DUCIBELLA,
2004). Resultado semelhante foi obtido com a microinjeo da sequncia anti-sense do RNA
para CaMKII, em ocitos de camundongos (CHANG et al., 2009) ou em camundongos
knockout para CaMKII (BACKS et al., 2010). Por outro lado, a microinjeo de mRNA para a
CaMKII constitutivamente ativa, induziu a retomada da meiose, mesmo na ausncia de
oscilaes de [Ca2+]i, reduzindo a atividade do MPF, da MAPK e a formao dos pr-ncleos
(MADGWICK et al., 2005; CHANG et al., 2009).
Embora a CaMKII seja considerada a protena alvo das oscilaes de [Ca2+]i,
responsvel pela retomada do ciclo celular, o tratamento com 100M de AIP, utilizada no
presente trabalho, no foi suficiente para manter os ocitos bloqueados em MII aps a
ativao partenogentica com clcio ionforo, j que 86% retomaram a meiose comparados
aos 89% no grupo sem tratamento com AIP. Estes resultados sugerem que a CaMKII no
participa da retomada da meiose na ativao dos ocitos em bovinos.
47
Vrias hipteses podem explicar a diferena dos resultados do presente trabalho com
os descritos na literatura em camundongos (TATONE et al., 2002; MARKOULAKI;
MATSON; DUCIBELLA, 2004), suno (FAN et al., 2003) e rato (YOO; SMITH, 2007). Uma
delas poderia ser com relao a no eficincia do inibidor utilizado. Contudo, esta
provavelmente no seja a explicao mais provvel para o resultado aqui apresentado. O AIP
tem ao no domnio auto-inibitrio da CaMKII, no qual ocorre a substituio da alanina pela
treonina. Isto confere ao AIP maior especificidade pela CamKII do que os outros inibidores
comumente usados, como o KN-93 e KN-62, que marcam o domnio de ligao da CaM,
podendo potencialmente inibir outras protenas que tambm interagem por meio deste
domnio (ISHIDA et al., 1995). Adicionalmente, o AIP tem sido usado com sucesso na
inibio da atividade de CaMKII e por consequncia, da retomada da meiose em ocitos de
camundongos aps a ativao (TATONE et al., 2002; MARKOULAKI; MATSON;
DUCIBELLA, 2003, 2004)
Outra hiptese plausvel pode ser o mtodo de ativao utilizado. Neste trabalho,
somente foi avaliado o envolvimento da CaMKII na ativao partenogentica em ocitos
bovinos. No entanto, fisiologicamente esta ativao ocorre durante a fecundao. A atividade
da CaMKII e o efeito dos respectivos inibidores so diferentes entre ocitos de camundongos
fecundados ou ativados partenogeneticamente. Em ocitos de camundongos ativados
partenogeneticamente com etanol foi observado um pico de atividade de CaMKII, 6,5
minutos aps a ativao, caindo rapidamente depois. Contudo, em ocitos fecundados, a
manuteno da atividade de CaMKII foi estimulada pelas oscilaes de [Ca2+]i (TATONE et
al., 2002). Ao utilizarem o inibidor AIP, os autores relatam que a retomada da meiose foi
bloqueada nos ocitos ativados partenogeneticamente, o que no ocorreu nos ocitos
fecundados (TATONE et al., 2002).
Entretanto, Avaliar o papel da CaMKII em ocitos fecundados na espcie bovina
difcil e com resultados imprecisos. O tempo da penetrao espermtica, aps a inseminao
assincrnico, variando de 6 a 10 horas ps-inseminao (MILAZZOTTO et al., 2008). Alm
disso, somente com a ativao partenogentica possvel se obter grande nmero de ocitos
ativados simultaneamente e em um determinado tempo. Outro problema a participao da
CaMKII na motilidade espermtica (MARN-BRIGGILER et al., 2005), o que dificulta a
interpretao dos resultados.
48
Se a CaMKII realmente participa da retomada da meiose em ocitos bovinos ativados

partenogeneticamente, como participa em outras espcies, a hiptese mais provvel da
ausncia de efeito na inibio da retomada nesta espcie poderia ser explicada pela
concentrao do inibidor utilizada neste experimento. Em ocitos de camundongo a
concentrao usada variou de 25 M (FAN et al., 2003) a 50 M (GARDNER et al., 2007).
Neste experimento foi utilizado 100 M de AIP, concentrao quatro vezes maior do que a
dose mais baixa relatada para camundongos. Contudo, devido ao grande volume do ocito de
bovinos, a concentrao de AIP usada neste experimento pode no ter sido suficiente para
inibir a retomada da meiose. Entretanto, Fan et al. (2003) relataram diminuio na formao
de pr-ncleos em ocitos de sunos tratados com 20 M de AIP (86,67% no grupo controle
para 10, 99% no grupo tratado com 20 M de AIP). Como o ocito de suno possui volume
celular prximo ao de bovino, a inibio da retomada da meiose em suno com uma dose de
AIP 5 vezes menos concentrado ao do presente trabalho, praticamente exclui a hiptese de
uma concentrao inadequada de inibidor, para explicar a ausncia do efeito na retomada da
meiose em bovinos.
Excluindo a possvel inespecificidade ou dose inadequada do inibidor, outra
explicao da ausncia de inibio do AIP a no participao da CaMKII na retomada da
meiose na espcie bovina. A ativao de ocitos bovinos tem se mostrado diferente das
demais espcies. A injeo intracitoplasmtica de espermatozide (ICSI) em bovinos, falha
em estabelecer ndices normais de desenvolvimento embrionrio e fetal, na ausncia de algum
estmulo exgeno de ativao como Ca2+ ou inibidores de ciclinas da fase-M (RHO et al.,
1998, CHUNG et al., 2000; SUTTNER et al., 2000). Recentemente tem sido demonstrado,
que o espermatozide bovino submetido ICSI no sofre dissoluo da teca perinuclear (uma
densa matriz de citoesqueleto adjacente ao ncleo) como ocorre durante a fecundao
propriamente dita (SUTOVSKY et al., 2003). Adicionalmente, aps a ICSI o espermatozide
bovino no tem a capacidade de iniciar as oscilaes de [Ca2+]i em ocito bovino, mas
consegue inici-las quando submetido ICSI em ocitos de camundongo. Por outro lado, o
espermatozide de camundongo no tem a capacidade de iniciar as oscilaes de [Ca2+]i em
ocitos bovinos aps a ICSI (KNOTT et al., 2003; MALCUIT et al., 2006). Estes
experimentos indicam que a incapacidade da induo das oscilaes de [Ca2+]i na espcie
bovina talvez seja devido a uma combinao de fatores espermticos e ocitrios e que em
bovinos o processo de ativao do ocito talvez seja diferente das demais espcies.
49
As oscilaes de [Ca2+]i durante a fecundao so estimuladas pela liberao da PLC

do espermatozide dentro do citoplasma do ocito. Em camundongos tem sido demonstrado
que a PLC migra do citoplasma para o pr-ncleo ao trmino das oscilaes de [Ca2+]i (ITO
et al., 2008). Entretanto, esta migrao no ocorre na microinjeo de mRNA para a PLC
bovina em ocitos de bovinos e de camundongos. Entretanto, quando se microinjeta mRNA
da PLC murina em ocitos de bovinos, esta tambm migra para o pr-ncleo, como ocorre
em ocitos de camundongos (No prelo)2. Como o ocito bovino apresenta grande
particularidade em relao ao mecanismo de ativao e liberao de [Ca2+]i em comparao
com as outras espcies, plausvel supor que as protenas que respondem s oscilaes de
[Ca2+]i regulando os eventos da ativao, como a retomada da meiose tambm possam ser
diferentes.
Deste modo, a hiptese mais provvel para o resultado do presente trabalho que a
CaMKII no participa na retomada da meiose em ocitos bovino, no qual este o primeiro
trabalho a demonstrar isso.
De qualquer maneira, independente da explicao da ausncia de efeito do AIP na
retomada da meiose, o presente trabalho mostra pela primeira vez que a CaMKII regula a
rotao do fuso meitico no estdio de telfase II. Este fenmeno nunca foi observado em
outras espcies na qual a CaMKII foi estudada devido ao fato desta protena participar da
retomada da meiose nestas espcies. Deste modo, a inibio da CaMKII nestes trabalhos,
induz o bloqueio dos ocitos em MII aps a ativao, impedindo a observao de qualquer
efeito da CaMKII em eventos posteriores.
Em sunos, um nvel bsico da atividade de CaMKII observada nos ocitos em MII.
Esta atividade aumenta drasticamente atingindo atividade mxima 15 minutos aps a ativao
partenogentica por estimulao eltrica. Aps este pico, a atividade de CaMKII diminui
progressivamente voltando a aumentar e a atingir um novo pico no momento em que os
ocitos entram em telfase II. Estes resultados demonstram que a CaMKII possui grande
atividade em dois momentos da progresso do ciclo celular durante a ativao (FAN et al.,
2003). Assim, embora neste experimento a inibio da CaMKII no tenha tido efeito na
retomada da meiose, momento em que ocorre o primeiro pico de atividade desta quinase, a
COONEY, M. A.; MALCUIT, C.; CHEON, B.; HOLLAND, M.K.; FISSORE, R.A.; DCRUZ, N. T. Speciesspecific differences in activity and nuclear localization of murine and bovine phospholipase C, zeta 1. Biology of
Reproduction. DOI:10.1095/biolreprod.109.079814
50
inibio desta apresentou efeito na rotao do fuso meitico ao iniciar a telfase, momento em
que descrito um segundo pico de atividade da CaMKII (FAN et al., 2003).
Em ocitos aps a ativao, o fuso meitico deve sofrer rotao do eixo antes da
telfase, estgio no qual o 2 corpsculo polar ser originado (LIU et al., 2000). O eixo de
rotao muda de paralelo para perpendicular membrana plasmtica. Experimentos que
utilizam a citocalasina D (despolimerizador de filamentos de actina) demonstram que os
microfilamentos de actina esto envolvidos neste processo (ZHU et al., 2003; NAVARRO et
al. 2005). Adicionalmente, a inibio da miosina (protena reguladora de filamentos de actina)
inibiu a rotao do fuso prevenindo a extruso do 2 corpsculo polar (MATSON et al.,
2006).
No presente trabalho, aps a ativao partenogentica foi observado uma diminuio
da fluorescncia para os microfilamentos de actina na membrana plasmtica. Entretanto, esta
diminuio no foi observada quando a CaMKII foi inibida pelo AIP, demonstrando a
regulao da organizao de microfilamentos de actina pela CaMKII.
Como tem sido descrito, a organizao do retculo endoplasmtico (RE) regulada
pelos microfilamentos e no pelos microtbulos (FITZHARRIS et al., 2007), o presente
trabalho avaliou se a CaMKII, pelo fato de regular os microfilamentos na rotao do fuso
meitico, tambm regularia a organizao do RE, via microfilamento, na ativao
partenogentica de ocitos bovinos.
Foi observado que o RE se distribui de forma homognea pelo citoplasma do ocito
em MII. Aps a ativao partenogentica ocorreu a migrao destes para a regio cortical,
sendo que uma pequena quantidade permaneceu distribuda pelo citoplasma. Padro similar
de distribuio foi descrito por Payne e Schatten (2003) em ocitos de bovinos, aps a
fecundao.
Ao ser inibida, a CaMKII no alterou a distribuio do RE aps a ativao
partenogentica. Embora o presente trabalho tenha demonstrado que a CaMKII regula a
organizao dos microfilamentos, o fato da inibio desta no alterar a organizao do RE
aps a ativao partenogentica, demonstra que em ocitos bovinos a organizao do RE no
regulada pelos microfilamentos ou que esta organizao possivelmente seja regulada por
outra protena quinase.
Concluses: Experimento 1
52
8 CONCLUSES: EXPERIMENTO 1
Baseado nos resultados, as concluses deste trabalho foram:

1 - A CaMKII no participa da retomada da meiose em ocitos bovinos ativados
partenogeneticamente.
2 A organizao dos microtbulos no regulada pela CaMKII.
3 A CaMKII regula a organizao dos filamentos de actina.
4 A CaMKII coordena a rotao do fuso meitico em telfase II.
4 A distribuio do retculo endoplasmtico no coordenada pela CaMKII.
Baseado nas concluses foi formulado o modelo hipottico grfico apresentado na figura 7.
Figura 7 - Modelo hipottico grfico da participao da CaMKII na ativao partenogentica de ocitos bovinos.
1 O Ca2+ se liga a CaM que ativa a CaMKII. 2 - A CamKII ativada regula a organizao dos
filamentos de actina que por sua vez so responsveis pela rotao do fuso meitico nos ocitos em
telfase II. 3 - A CaMKII no participa da retomada da meiose aps a ativao partenogentica de
ocitos bovinos. Para confirmar esta hiptese, novos experimentos necessitam ser realizados
54
9 RESULTADOS: EXPERIMENTO 2
A REORGANIZAO DO RETCULO ENDOPLASMTICO APS A ATIVAO

REGULADA PELA PKC
A organizao dos microtbulos e a morfologia dos cromossomos foram avaliadas por

imunofluorescncia e os resultados esto apresentados na figura 8. Os microtbulos foram
observados distribudos por todo o citoplasma apresentando maior concentrao no fuso
meitico dos ocitos em MII (Figura 8A-C). A ativao partenogentica induzida pelo clcio
ionforo ocasionou a retomada e a progresso da meiose at o estdio de telfase II. As
cromtides irms migraram para plos opostos do fuso ligeiramente alongado formado pelos
microtbulos, sofrendo rotao e localizando-se verticalmente em relao membrana
plasmtica (Figura 8D-F). Nos ocitos ativados partenogeneticamente na presena de 10 M
do inibidor de PKC Bisindolylmaleimide I (BIM), a retomada da meiose e a migrao das
cromtides irms para lados opostos do fuso no foi afetada. O fuso apresentou morfologia
ligeiramente alongada e sofreu rotao de forma semelhante aos dos ocitos ativados sem a
presena do inibidor (Figura 8G-I).
55
Figura 8 - Organizao e distribuio dos microtbulos nos ocitos em MII e aps a ativao partenogentica
induzida pelo clcio ionforo, tratados ou no com o inibidor de PKC (BIM). Os microtbulos
(vermelho) e a cromatina (azul) foram corados com anticorpo anti-tubulina e hoechst,
respectivamente. Nos ocitos em MII, os microtbulos estavam localizados em maior concentrao
no fuso meitico (A-C). A retomada da meiose foi induzida pelo clcio ionforo e 1 hora aps a
ativao o ocito no atingiu o estdio de telfase II, apresentando orientao perpendicular
membrana plasmtica e os cromossomos separados pelos microtbulos em dois plos (D-F). O
mesmo padro foi observado nos ocitos ativados na presena de BIM (G-I). Aumento de 250X
A distribuio e organizao intracelular dos filamentos de actina nos ocitos em MII

e nos ativados partenogeneticamente foi avaliada utilizando a toxina faloidina marcada com
Alexa Fluor 568, que em baixas concentraes pode ser utilizada como um marcador
fluorescente para microfilamentos de actina. Nos ocitos em MII, os filamentos de actina
encontravam-se distribudos por todo o citoplasma com acentuada concentrao na membrana
plasmtica e no fuso meitico (Figura 9A-C).
56
Aps a ativao partenogentica, ainda estava presente uma forte marcao dos
filamentos de actina no fuso meitico. Entretanto, uma diminuio na fluorescncia destes
filamentos foi observada, na membrana plasmtica (Figuira 9C-D), quando comparado com
ocitos em MII. J na presena do inibidor da PKC, aps a ativao partenogentica, os
filamentos de actina encontravam-se distribudos pelo citoplasma havendo pouca
concentrao destes na membrana plasmtica. Entretanto, a forte organizao ao redor do fuso
meitico continuou presente (Figura 9G-I).
Figura 9 - Distribuio dos filamentos de actina em ocito no estdio de metfase II e aps a ativao
partenogentica na presena ou ausncia do inibidor de PKC (BIM). Os filamentos de actina
(vermelho) e a cromatina (azul) foram corados com faloidina e hoechst, respectivamente. Nos
ocitos em MII os filamentos estavam distribudos pelo citoplasma e com forte marcao na
membrana plasmtica (A-C). A ativao partenogentica diminuiu fluorescncia dos filamentos de
actina na membrana plasmtica (D-F), sendo esta diminuio mais acentuada nos ocitos ativados
na presena de BIM (G-I)
57
A distribuio do retculo endoplasmtico (RE) foi avaliada por imunofluorescncia

no ocito em MII e aps a ativao partenogentica, na presena ou ausncia de BIM (Figura
10), com intuito de investigar o papel da PKC na reorganizao deste. Nos ocitos em MII, o
RE encontrava-se aglomerado (cluster) no crtex, contguo membrana plasmtica (Figura
10A-C). Aps a ativao partenogentica, o RE mudou o padro de distribuio, passando a
se localizar por todo o citoplasma (Figura 10D-F). A reorganizao e a disperso dos
aglomerados de RE aps a ativao foram inibidas pelo BIM. A inibio da PKC induziu uma
aproximao dos aglomerados de RE, de forma densa, na regio cortical do ocito (Figura
10G-I).
A
Figura 10 - Distribuio do RE em ocitos no estdio de MII e aps a ativao partenogentica com ou sem o
inibidor de PKC (BIM). O RE endoplasmtico (verde) e a cromatina (azul) foram corados com
anticorpo anti RE (PDI) e hoechst, respectivamente. O RE se encontra aglomerado (cluster) no
crtex junto membrana plasmtica do ocito em MII (A-C). Aps a ativao partenogentica, o
RE continua aglomerado, porm se difundindo por todo o citoplasma (D-F). A inibio da PKC
afetou a reorganizao do RE, podendo ser observado de forma densa na regio cortical (G-I)
58
Para avaliar o papel dos filamentos de actina na reorganizao do RE, os ocitos

foram ativados na presena da droga despolimerizadora de actina, a citocalasina. Nos ocitos
em MII, os filamentos de actina se encontravam localizados junto ao RE (colorao
alaranjada), na regio cortical do ocito (Figura 11A). Aps a ativao partenogentica, o RE
se distribuiu pelo citoplasma (Figura 11B), contudo ao utilizar o inibidor da PKC, o padro de
distribuio do RE foi diferente, estando localizado em grande concentrao na regio cortical
(Figura 11C). Resultado semelhante ao da inibio da PKC foi obtido quando os filamentos
de actina foram despolimerizado pela citocalasina (Figura 11D).
Figura 11 - Efeito da despolimerizao dos filamentos de actina na organizao do RE. Distribuio do RE em

ocitos no estdio de MII (A) e aps a ativao partenogentica na ausncia do inibidor BIM (B),
presena (C) ou com o despolimerizador de filamentos de actina, citocalasina (D). O RE
endoplasmtico (verde) e os filamentos de actina (vermelho) foram corados com anticorpo anti RE
(PDI) e faloidina
60
10 DISCUSSO: EXPERIMENTO 2
A PKC uma protena quinase que participa ativamente da ativao do ocito

(DUCIBELLA et al., 1993; ELIYAHU et al., 2002), sendo as isoformas convencionais
ativadas por Ca2+ e DAG durante a fecundao (RAZ et al., 1998; LURIA et al., 2000).
Entretanto, pouco se sabe sobre a funo da PKC na ativao de ocitos nos bovinos.
Objetivando preencher esta lacuna, o presente trabalho estudou a importncia da PKC no
processo de ativao de ocitos nesta espcie.
A atividade da PKC aumenta durante a ativao do ocito, podendo esta atividade ser
avaliada diretamente (GALLICANO et al., 1997), ou indiretamente pela redistribuio de
vrias isoformas para a membrana plasmtica (LURIA et al., 2000; ELIYAHU; SHALGI,
2002). Adicionalmente, tem sido relatado que a inibio farmacolgica da PKC previne a
sada do bloqueio meitico em MII (GALLICANO et al., 1997), e que a ativao induz a
retomada da meiose (GALLICANO et al., 1993; COLONNA et al., 1997; LURIA et al.,
2000).
Entretanto, no presente trabalho, a inibio farmacolgica da PKC com 10M de BIM
no foi suficiente para prevenir a retomada da meiose aps a ativao partenogentica com
5M de clcio ionforo. Tanto os ocitos tratados com o inibidor de PKC quanto os sem
inibidor, retomaram a meiose progredindo pelo ciclo celular at o estdio de telfase, 1 hora
aps a ativao partenogentica. Em experimento prvio dose-resposta foi observado que
concentraes de BIM acima de 10M induzem alteraes morfolgicas e acima de 50M, a
degradao dos ocitos ativados partenogeneticamente (dados no apresentados). Isto
demonstra que em ocitos de bovinos, a retomada da meiose, aps a ativao partenogentica,
no regulada pela PKC. De fato, os resultados aqui apresentados vo de acordo com
trabalhos prvios que demonstram que a retomada da meiose independente de PKC
(GALLICANO et al., 1993; RAZ et al., 1998). O mesmo foi relatado por Madgwick et al.,
(2005) que observaram que a microinjeo de mRNA da forma ativa da PKC em ocitos de
camundongo no induziu a retomada da meiose.
A controvrsia do papel da PKC descrito na literatura (GALLICANO et al., 1993;
COLONNA et al., 1997; RAZ et al., 1998; LURIA et al., 2000; MADGWICK et al., 2005)
pode ser devido ao uso de inibidores e ativadores farmacolgicos que podem afetar processos
que no teriam funo fisiolgica durante a fecundao ou afetar a atividade de outras
61
protenas. Por exemplo, altas concentraes do ativador de PKC PAM podem ocasionar
oscilaes de Ca2+ em ocitos de camundongos induzindo a retomada da meiose. Por outro
lado, uma alta concentrao do inibidor BIM pode inibir a protena quinase A (PKA), que
regula o ciclo celular, pelo controle da degradao de cilcina (GRIECO et al., 1996)
Atualmente a microinjeo de mRNA da forma ativa de uma protena especfica tem
sido considerado a estratgia mais eficiente para se avaliar a funo desta protena em um
determinado evento. A protena ativa mimetiza o que ocorre fisiologicamente e os resultados
dos trabalhos que utilizam esta tecnologia so considerados mais fidedignos do que os que
utilizam inibidores ou ativadores farmacolgicos. Todavia, a microinjeo de mRNA
originar uma protena ativa que desempenhar uma funo, sendo que est no ocorreria
naquele determinado momento dentro da clula. Os eventos que porventura ocorrerem em
cascata ao ser desencadeados pelo mRNA podem ativar todas as protenas de forma
simultnea ou desordenadamente.
Embora tenha sido demonstrado que a atividade da PKC aumenta na ativao do
ocito (GALLICANO; MCGAUGHEY; CAPCO, 1997; LURIA et al., 2000; ELIYAHU;
SHALGI, 2002; HALET et al., 2004), provavelmente tambm possua funes em outros
eventos mecanismos da ativao oocitria, independentes do ciclo celular. Uma destas
funes foi recentemente demonstrada (HALET et al., 2004; MADGWICK et al., 2005).
Estes autores relatam um importante papel desta protena na entrada de Ca2+ operada por
estoque (SOCE) durante a fecundao, estando envolvida na recarga dos estoques deste on
controlando o influxo durante cada onda. Estes achados ajudam a explicar a diferena nos
resultados sobre o papel da PKC na retomada da meiose. provvel que para alguns
inibidores ou ativadores o bloqueio ou induo da retomada de meiose, respectivamente, no
seja porque a PKC transduza o sinal do Ca2+ para a retomada da meiose, mas sim porque est
envolvida na regulao das oscilaes de Ca2+ necessrias para a ativao de outras protenas,
sendo que estas efetivamente participam da retomada da meiose.
Nos ocitos no estdio de MII, a PKC (, , , e ) encontra-se em baixo nvel no
citoplasma e em alta concentrao no fuso meitico (exceto a PKC ) (RAZ et al., 1998;
BALUCH et al., 2004). A fecundao induz a migrao da PKC , e para a membrana
plasmtica. Em contraste, as PKCs e continuam associadas ao fuso meitico e a inibio
destas formas de PKC durante a ativao acompanhada pela quebra do fuso (BALUCH et
al., 2004; MA et al., 2008). Estes resultados sugerem que as PKCs participam da estabilidade
do fuso em MII, mas no participam diretamente da retomada da meiose durante a
62
fecundao, uma vez que a ativao induz a migrao destas para a membrana.
Adicionalmente, as PKCs que permanecem regulando o fuso meitico so a PKC nova () e a
atpica (), no qual ambas so independentes de Ca2+. Deste modo, a ao da PKC no fuso
meitico no regulada diretamente pelo aumento da [Ca2+]i em resposta a ativao do
ocito. Estes resultados tambm ajudam a explicar a diferena do papel da PKC na retomada
da meiose, plausvel atribuir que o efeito da PKC na progresso pelo ciclo celular,
observado em alguns trabalhos seja devido ao das PKCs e no fuso meitico e no uma
ao das PKCs convencionais ativadas pelo Ca2+ na fecundao.
A PKC tambm participa da regulao dos filamentos de actina em uma variedade de
tipos celulares (LARSON; 2006). Os ocitos em MII apresentaram uma distribuio
homognea dos filamentos de actina pelo citoplasma com acentuada localizao na membrana
plasmtica. A ativao partenogentica induziu a reorganizao dos filamentos de actina
como observado pela alterao da intensidade de fluorescncia emitida. Entretanto, a
distribuio dos filamentos de actina no citoplasma foi alterada quando a atividade de PKC
foi inibida. A mudana, mas significativa foi observada no citoplasma e no na membrana
plasmtica. possvel que a alta concentrao de filamentos de actina na membrana
plasmtica e a forte fluorescncia detectada nesta regio possam mascarar algumas mudanas
sutis. Outra possvel explicao seria de que as protenas ligadoras de actina, que ancoram os
filamentos de actina membrana plasmtica estejam presentes de forma mais abundantes do
que a actina citoplasmtica. Os resultados do presente trabalho vo de encontro com os
encontrados na literatura, no qual demonstram que a PKC regula os filamentos de actina
(ELIYAHU et al., 2005, 2006).
Recentemente foi demonstrado que a reorganizao do retculo endoplasmtico (RE)
regulada pelos filamentos de actina e no pelos microtbulos (FITZHARRIS et al., 2007).
Como a PKC participa da regulao dos filamentos de actina durante a ativao do ocito,
estando estes envolvidos na regulao de vrios eventos (reorganizao de organelas,
migrao e rotao do fuso meiotico) da maturao e da fecundao, este trabalho avaliou o
papel da PKC na reorganizao do RE.
Nos ocito em MII, o RE encontrava-se aglomerado (cluster) no crtex, contguo
membrana plasmtica. A ativao partenogentica induziu a reorganizao do RE, passando a
se localizar distribudo por todo o citoplasma. Entretanto, a reorganizao do RE aps a
ativao partenogentica foi afetada pela inibio da PKC, que passou a se localizar em forte
63
concentrao junto membrana plasmtica. Estes resultados demonstram que a reorganizao

do RE durante a ativao regulada pela PKC.
Na tentativa de correlacionar a ao da PKC, a reorganizao dos filamentos de actina
e a reorganizao do RE foram avaliadas a capacidade dos ocitos ativados
partenogeneticamente na presena de citocalasina D sofrerem reorganizao do RE.
A induo da despolimerizao dos filamentos de actina com citocalasina D alterou a
reorganizao do RE endoplasmtico aps a ativao partenogentica. De forma semelhante
ao que ocorreu na inibio da PKC, na despolimerizao dos filamentos de actina, o RE
passou a se localizar em alta concentrao prximo membrana plasmtica. Os resultados do
presente trabalho demonstraram que a polimerizao dos filamentos de actina coordenou a
reorganizao do RE na ativao partenogentica de ocitos de bovinos e que esta
reorganizao do RE regulada pela PKC.
Contudo, tem sido demonstrado que a PKC induz a despolimerizao dos filamentos
de actina, promovendo a exocitose dos grnulos corticais (ELIYAHU et al., 2005;
TSAADON; KAPLAN-KRAICER; SHALGI, 2008). Estes resultados podem ser explicados
pelo substrato no qual a PKC atua. Os substratos so mediadores centrais do efeito da PKC
nos filamentos de actina. Entre os principais substratos da PKC, que atuam na regulao dos
filamentos de actina esto as MARCKS, Adducin; Fascin e a protena ERM.
A MARCKS um importante fator de ancoramento dos filamentos de actina
membrana plasmtica. A PKC fosforila a MARCKS, que por sua vez se desprende da
membrana desorganizando os filamentos de actina ancorados membrana plasmtica
(HARTWING et al., 1992).
A aducina cobre a extremidade do filamento de actina permitindo a ligao da
espectrina actina. A fosforilao da aducina pela PKC resulta na dissociao da aducina e da
espectrina dos filamentos de actina expondo a extremidade na qual ocorre a polimerizao.
Deste modo, a ao PKC nos filamentos de actina via aducina, regula a polimerizao destes
filamentos (MATSUOKA; LI; BENNETT, 1998).
A fascina uma protena que une fortemente os feixes de actina e importante na
manuteno destas estruturas no citoplasma e em processos de protuses. A PKC fosforila a
fascina que perde a capacidade de se ligar aos feixes de actina resultando na dissociao dos
feixes (ADAMS et al., 1999).
As protenas ERM (esrina, radixina e miosina) constituem um grupo de protenas que
tanto conecta os filamentos de actina com a membrana plasmtica quanto participam como
64
transdutores de sinais em diversas vias de sinalizao. A ERM encontra-se inativa pelo

citoplasma devido a interao do seu domnio N-terminal FERM com a parte C-terminal da
protena. A fosforilao pela PKC quebra esta interao abrindo o estado conformacional da
protena. O domnio FERM exposto interage com protenas da membrana plasmtica e o
domnio C-terminal com os filamentos de actina. Com o estado conformacional aberto, a
protena ERM tambm interage com vrias protenas sinalizadoras, mas sempre sinalizando
para alguma ao na membrana plasmtica (SIMONS et al., 1998).
Deste modo, a despolimerizao dos filamentos de actina pode ser devido ao da
PKC em algum substrato especfico para este fim. De fato, recentemente foi demonstrado que
a despolimerizao dos filamentos de actina pela PKC resulta na exocitose dos grnulos
corticais, sendo que ocorre pela ao desta protena no substrato MARCS (ELIYAHU et al.,
2005; TSAADON; KAPLAN-KRAICER; SHALGI, 2008). Assim, passa a ser plausvel
supor que enquanto a PKC induz a despolimerizao dos filamentos de actina via substrato
MARCKS, na regulao da exocitose dos grnulos corticais, tambm regula a polimerizao
dos filamentos de actina na reorganizao do RE via outro substrato. Por regular a
polimerizao dos microfilamentos, a fascina seria o substrato de escolha para a ao da PKC
na reorganizao do RE aps a ativao partenogentica.
Resultado semelhante do efeito da PKC na polimerizao dos filamentos de actina tem
sido descrito. A ativao da PKC com 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) induz a
polimerizao dos filamentos de actina em ocitos de T. tubifex, enquanto o antagonista de
PKC inibe a polimerizao (TAKASHI, 1997).
O presente trabalho demonstrou que a PKC regula a reorganizao do RE e que a
reorganizao do RE, aps a ativao ocorre via polimerizao dos filamentos de actina.
Contudo experimentos adicionais necessitam ser realizados para unir a via PKC-actina-RE,
principalmente para elucidar qual seria o substrato de ao da PKC para a polimerizao dos
filamentos de actina durante a reorganizao do RE.
Concluses: Experimento 2
66
11 CONCLUSES: EXPERIMENTO 2
De acordo com os resultados apresentados, este trabalho permite concluir que:

1 - A PKC no participa da retomada da meiose em ocitos bovinos ativados
partenogeneticamente.
2 A organizao dos microtbulos no regulada pela PKC.
3 A PKC regula a organizao dos filamentos de actina.
4 A PKC regula a reorganizao do RE.
5 A reorganizao do RE ocorre via polimerizao dos filamentos de actina.
Baseado nas concluses foi formulado o modelo hipottico grfico apresentado na figura 12.
Figura 12 - Modelo hipottico grfico da participao da PKC na ativao partenogentica de ocitos bovinos. 1
O Ca2+ e o DAG se ligam PKC. 2 - A PKC ativada regula a polimerizao dos filamentos de
actina que por sua vez so responsveis pela reorganizao do RE, aps a ativao partenogentica. A
ao da PKC nos filamentos de actina possivelmente ocorre por intermdio do substrato de PKC,
fascina, conhecido por induzir polimerizao dos filamentos de actina. Para confirmar esta hiptese,
novos experimentos necessitam ser realizados
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81
Anexos
ANEXO A
Reagente
TCM 199 bicarbonato
Soro Fetal Bovino
Soluo de Gentamicina
Uso dirio
Reagente
TCM 199 bicarbonato
Soro Fetal Bovino
Soluo de piruvato
Uso dirio
Meio de Fatiamento
Quantidade
200 mL
2 mL
200 L
Marca/cdigo
Gibco / 31100-035
Nutricell
Sigma/ G1264
Meio de Lavagem
Quantidade
4,5 mL
0,5 mL
10 L
25 L
Marca/cdigo
Gibco / 11150-59
Gibco/ 12657-029
Sigma/ P-3662
Sigma/ G1264
Meio de maturao
Quantidade
4,5 mL
0,5 mL
10 L
25 L
5 L
50 L
5 L
Reagente
TCM 199 com hepes
Soro Fetal Bovino
Soluo de piruvato
Soluo de FSH
Soluo de LH
Soluo de estradiol
Marca/cdigo
Gibco/ 12350-099
Gibco/ 12657-029
Sigma/ P-3662
Sigma/ G1264
Bioniche
Intervet/057176
Sigma/ E-4389
Estabilizar em estufa de CO 2 por 2-3 horas. Uso dirio
Reagente
Gentamicina
NaCl 0,9%
Soluo de gentamicina 10 mg/mL

Quantidade
Marca/cdigo
0,1g
Sigma / G-1264
10 mL
Beker
Armazenar a -20 C; Validade: 6 meses
Reagente
Piruvato
NaCl 0,9%
Soluo de piruvato 0,2 mM

Quantidade
Marca/cdigo
0,1320 g
Sigma / P-4562
12 mL
Beker
82
Anexos
Reagente
Estradiol
gua MiliQ
Soluo de estradiol 1 g/mL

Quantidade
Marca/cdigo
0,02041g
Sigma / E-4389
1 mL
----------
Reagente
Folltropin
NaCl 0,9%
Soluo de FSH (Estoque)

Quantidade
Marca/cdigo
400 mg
Bioniche
2 mL
Beker
Soluo de FSH (uso) 0,5 mg/mL

Reagente
Quantidade
Marca/cdigo
Soluo estoque
---------50 L
TCM-199 Sodium bicarbonato 20 mL
Gibco / 11150-59
Reagente
Chorulon
TCM-199 Sodium bicarbonato
Soluo de LH 700 UI/mL

Quantidade
Marca/cdigo
5000 UI
Intervet/ 057176
7,14
Gibco / 11150-59
83
Anexos
ANEXO B
Reagente
NaCl
KCl
KH2PO4
NaHCO3
Na Lactato
cido pirvico
Phenol red
L-glutamina
MgCl2
CaCl2
SOF (Estoque)
Quantidade
0,6294 g
0,0534 g
0,0162 g
0,2106 g
0,0370 g
0,0034 g
0,00013 g
0,0146 g
0,0098 g
0,0252 g
Marca/cdigo
Sigma / S-9625
Sigma / P-4504
Sigma / P-5655
Sigma / S-5761
Sigma / L-7900
Sigma/ P-3662
Sigma / P-4633
Sigma / G-1517
Sigma/ M2393
Sigma/ C5670
SOF (Uso)
Quantidade
4,5 mL
0,25 mL
100 L
50 L
Marca/cdigo
---------Gibco / 12657-029
Sigma / M-5550
Sigma / M-7145
Armazenar 8 C; Validade: 2 meses
Reagente
SOF estoque
Soro Fetal Bovino
Amino cidos essenciais
Amino cidos no essenciais
Armazenar a 8 C; Validade: 1 semana
Soluo de clcio ionforo (1 mM) (Estoque)

Reagente
Quantidade
Marca/cdigo
Calcium Ionophore A23187
5 mg
Sigma/ C-7522
DMSO
10 ml
Sigma/ D-2650
84
Anexos
ANEXO C
Soluo de inibio da CaMKII (1mM)
Reagente
Quantidade
Autocamtide-2 Related Inhibitory Peptide, Myristoylated 500g
gua Milli Q
292,7L
Marca/cdigo
Merck/ 189482
----------
Reagente
Bisindolylmaleimide I
DMSO
Soluo de inibio da PKC (10 mM)

Quantidade
Marca/cdigo
1 mg
Merck/ 203290
242L
Sigma/ D-2650
Reagente
Citocalasina B
PBS
Soluo de citocalasina B (estoque)

Quantidade
Marca/cdigo
0,005g
Sigma/ C-6762
1 mL
Reagente
Citocalasina B (estoque)
SOF
Soluo de citocalasina B (diluio 1)

Quantidade
Marca/cdigo
50 L
950 L
Usar no dia
Soluo de citocalasina B (diluio 2) (uso)

Reagente
Quantidade
Marca/cdigo
Citocalasina B (diluilo 1)
20 L
SOF
980 L
Usar no dia
85
Anexos
ANEXO D
Reagente
NaCl
KCl
NaH2PO4
KH2PO4
Soluo de PBS
Quantidade
Concentrao
10 g
0,1711 M
0,25g
0,0034 M
1,44g
0,012 M
0,25g
0,0018 M
Marca/cdigo
Sigma/ S-5886
Sigma/ P-5405
Sigma/ S-5011
Sigma/ P-5655
Armazenar 8 C; Validade: 2 meses
Soluo de paraformaldedo 7,4% (Estoque)

Quantidade
Marca/cdigo
7,4g
EMS/ 19210
gua Milli Q(55-60oC)
1L
---------Reagente
Paraformoldedo
Adicionar NaOH 2N at a soluo ficar incolor. Armazenar a -20 C; Validade: 6 meses
Reagente
Paraformoldedo 7,4%
PBS
Soluo de paraformaldedo 3,7% (Uso)

Quantidade
Marca/cdigo
1mL
---------1 mL
----------
Usar no dia
Reagente
Triton X-100
PBS
Soluo de Triton 10% (Estoque)

Quantidade
Marca/cdigo
1 mL
Sigma/ X-100
10 mL
----------
Armazenar a 8 C; Validade: 6 meses
Reagente
Triton X-100 10%
PBS
Soluo de Triton 0,1% (Uso)

Quantidade
Marca/cdigo
100 L
---------10 mL
----------
Usar no dia
Reagente
Soro de cabra
PBS
Armazenar a 8 C; Validade: 1 semana
Soluo de Bloqueio
Quantidade
5 mL
95 mL
Marca/cdigo
Gibco/ 16210-064
----------
86
Anexos
Reagente
Hoechst 33342
DMSO
Soluo de Hoechst 33342 5g/ml (Estoque)

Quantidade
Marca/cdigo
5 g
Sigma/ B-2261
1ml
Sigma/ D-2650
Reagente
Hoechst 33342 estoque
PBS
Soluo de Hoechst 33342 (Uso)

Quantidade
Marca/cdigo
1 L
---------1ml
----------
Usar no dia
Reagente
1,4-Diazabicyclo [2.2.2]octane
Tris 0.5M, pH 8.0
Glicerol
gua destilada
Soluo de DABCO
Quantidade
0,23g
0,4ml
5ml
4,6ml
Armazenar a 8 C protegido da luz; Validade: 6 meses
Marca/cdigo
Sigma/ D-2522
Fluka/ 93363
Sigma/ G-5516
----------

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