UNIVERSIDAD ANDRES BELLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLGICAS

LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR BIO-131

GUA N 3:
MICROSCOPIA II

INTRODUCCIN
Cuando las ondas de luz son emitidas desde una fuente coherente (como un lser), las ondas
estn en fase, o sea, los picos y los valles de las ondas coinciden. Esto tiene el efecto de
reforzar las ondas y crear una mayor amplitud, que percibimos como un aumento en el
brillo. Sin embargo, cuando las ondas de luz estn fuera de la fase, se interfieren entre s
reduciendo la amplitud y el brillo.
Cuando las ondas de luz pasan de una sustancia a otra, se curvan o se difractan y sus
trayectorias cambian ligeramente. Esta difraccin altera las relaciones de la fase de las
ondas, dando como resultado cantidades variables de interferencia. La cantidad de
interferencia producida cuando la luz atraviesa las diferentes estructuras de una clula no es
grande, y el contraste que se detecta es escaso cuando la clula se observa con un
microscopio ptico comn, lo cual por su puesto es la razn por la cual las clulas deben
teirse. Sin embargo, en los microscopios de contraste de fase y de interferencia diferencial,
sistemas pticos especialmente diseados intensifican la escasa interferencia y
proporcionan un mayor contraste. La resolucin de estos microscopios es limitada, como
ocurre en un microscopio ptico comn, pero suministran una perspectiva diferente de la
clula viva, mostrando aspectos difciles de detectar en otro sistema.
Otra tcnica usada frecuentemente en las clulas vivas es la microscopia de campo oscuro.
El haz de iluminacin llega a la muestra desde el costado y los sistemas de lentes detectan
la luz reflejada por el espcimen, que aparece como un objeto brillante contra un fondo
oscuro. Los rasgos de las clulas que son visibles en estas fotomicrografas, a menudo
adquieren un gran relieve en las de campo oscuro.
Actualmente, ocurre un rpido progreso en el uso de otras tcnicas microscpicas; por
ejemplo, acoplando cmaras de televisin a los microscopios pticos es posible efectuar las
observaciones en la pantalla y grabarlas en una cinta de video. Ajustando los controles,
como puede hacerse en un aparato de televisin, el ruido de fondo puede reducirse,
mejorar el contraste e intensificar aspectos particulares. Las tcnicas de televisin aplicadas
al estudio de la clula viva estn en su infancia, pero estn generando gran excitacin, dado
que revelan procesos no vistos previamente dentro de la clula.
Los constantes avances en la microscopa han permitido su utilizacin en muchos aspectos
de la biologa celular, fisiologa e incluso en patologa humana, uno de stos es la
determinacin del nmero de clulas en suspensin. Por ejemplo, en hematologa humana
no tan slo es importante conocer el tipo y caractersticas de las clulas presentes en la
sangre, sino que adems el nmero de cada una de ellas presentes en un volumen
determinado (por ej.: 1 ml o 1 mm3).
Objetivo del prctico:
En este laboratorio el objetivo principal es que el estudiante observe preparaciones frescas
de sangre generando un campo oscuro; conozca la tcnica de recuento de glbulos rojos a
travs de la cmara de Neubauer y determine el tamao celular en un frotis sanguneo
permanente.

Recuento de clulas en cmara de Neubauer:

Las cmaras de recuento se utilizan para determinar el nmero de partculas por unidad de
volumen de un lquido. Las partculas leucocitos, eritrocitos, trombocitos, bacterias,
esporas, polen etc. se cuentan visualmente con un microscopio.
La placa base en vidrio ptico especial tiene el tamao de un portaobjetos (Fig.1 A). Las
ranuras fresadas en la superficie de la placa base la dividen en dos zonas anchas exteriores
y 3 campos pequeos interiores. A diferencia de las zonas exteriores, que se utilizan para
rotulacin, los campos interiores estn esmerilados y pulidos (Fig.1 B). En el campo central
(= fondo cmara) estn grabadas dos cuadrculas de recuento separadas una de otra por una
ranura. El fondo de la cmara del campo central es usualmente 0,1 mm ms bajo (=
profundidad cmara) que ambos campos adyacentes. Entre campo central y cubreobjetos ya
colocado existe por tanto una ranura de 0,1 mm. La limitacin lateral del volumen a contar
se forma mediante las superficies imaginadas por la proyeccin vertical sobre las lneas
exteriores de la cuadrcula de recuento.

Procedimiento para utilizar la

cmara: Se coloca un cubreobjeto
sobre una cmara Neubauer limpia
y seca, y se deposita una gota en
uno de los lados del cubreobjeto;
esta gota penetra por capilaridad y
rellena el retculo de la misma.
Una vez preparada se espera un
poco para que sedimenten las
clulas en reposo, y luego se
procede a colocar la cmara sobre
la platina del microscopio (no
colocar antes, pues el calor de la
fuente de luz comienza a evaporar
el lquido).

Fig. 1: Procedimientos en la utilizacin de una cmara de Neubauer.

Como determinar el nmero de clulas con cmara de Neubauer usando el cuadrado

central: Recuento de glbulos rojos.

El cuadrado central posee 25 cuadrados grandes (cada uno subdivido en 16 cuadrados

menores) (Fig1 C). Si cada uno de los cuadrados grandes posee 1/5 mm de lado, la
superficie de 1 cuadrado grande ser:

= 1/5 1/5 = 1/25

Volumen de un cuadrado grande (1/10 mm de profundidad):

= 1/25

1/10

= 1/250

Si contamos "a" glbulos rojos en "n" cuadrados, el nmero de glbulos por cuadrado ser
a / n, y si en un cuadrado de volumen 1/250 mm3 hay a / n glbulos rojos, en 1 mm3
habr X.

250/

Siendo X el nmero de glbulos rojos existentes por cada mm3 de sangre diluida.
Si la sangre se diluy a 1/100 o 1/200, habr que multiplicar el valor X por 100 o 200,
respectivamente, con lo cual obtendremos un nuevo valor, Y, que representa el nmero de
glbulos rojos existentes por cada mm3 de sangre (sin diluir).

250/

Fig. 2: rea de recuento de clulas rojas.

Para tener en cuenta:

1. Observe que en la grilla de la cmara de Neubauer las reas de recuento de
eritrocitos y linfocitos son diferentes, debido a que los eritrocitos se encuentran en
mayor cantidad.
2. Mientras que los glbulos rojos se cuentan en las reas del cuadrado central, los
glbulos blancos se cuentan en las reas coloreadas de azul (los cuadrados L). (Fig.
2)
3. Tenga en cuenta que la grilla central tiene 25 cuadrados de 1mm x 1mm de rea y
0.10 mm de profundidad. Para acelerar el conteo, se cuenta el nmero de glbulos
rojos (a) en los 5 cuadrados (n) coloreados de rojo para calcular el n glbulos
rojos/l. 1l (microlitro) = 1 mm3)
4. Cuando un eritrocito se sita en la mitad de las lneas superior y/o de la izquierda,
entonces es contabilizado. Pero no se contabiliza cuando se sita en la mitad de las
lneas inferior y/o de la derecha.
5. El rango normal de recuento de glbulos rojos es el siguiente:
o Mujeres: 3.9-5.6 millones/l.
o Hombres: 4.5-6.5 millones/l.

ACTIVIDADES PRCTICAS.
A.- Campo Oscuro
Procedimientos y observaciones de una muestra fresca de sangre
Si bien existen otros microscopios que incluyen en su mecnica la alternativa de realizar
observaciones por la tcnica de microscopa de campo oscuro, el microscopio convencional
de campo claro puede ser adaptado para realizar una observacin con esta tcnica de
manera muy simple.
Se le entregar una seccin de cartn negro, el cual Ud. deber recortar siguiendo la lnea
demarcada para obtener un crculo de papel negro.
Proceda a observar en una primera instancia la muestra que se le entregar con su
microscopio de campo claro normal (a 4X, 10X y 40X). Luego, coloque el crculo negro
sobre la fuente de luz en la parte inferior del microscopio, de manera tal que la luz pase
solo por los bordes del crculo.
Cul es la diferencia en la observacin con el microscopio de campo claro y el de
campo oscuro? Cul es el efecto obtenido? Describa este cambio observando con el
objetivo 40X.
De la misma manera es posible jugar con la luz del microscopio de campo claro de manera
de transformarlo en uno de contraste de fases o de interferencia diferencial.
En primer lugar, coloque su muestra en el microscopio y enfoque a un aumento de 10X.
Luego, con la ayuda de un cartn negro, interponga lentamente ste entre la fuente de luz y
la platina del microscopio. Observe que pasa con los contornos de las clulas.
B.- Reglilla
Dentro de las posibilidades de resolucin del microscopio ptico, es posible medir
directamente los tamaos de clulas y estructuras (ncleos, vacuolas, cloroplastos).
Para realizar estas mediciones, se necesita tener una reglilla en el ocular del microscopio.
Esta reglilla posee una escala que contiene 100 rayas sin unidades (Fig. 3). Por lo tanto,
previo a medir una clula hay que calibrar la reglilla usando un cuadro de calibracin, como
el que se muestra a continuacin a modo de ejemplo:
Objetivo
4X
10X
40X

Distancia en
Ocular
0 a 80 rayas
0 a 100 rayas
0 a 80 rayas

Distancia en
Patrn conocido
1 mm
0,5 mm
0,1 mm

Distancia entre
2 rayas
12,5 m
5 m
1,25 m

La calibracin se realiza usando un portaobjeto especial como patrn, que posee una lmina

de vidrio en la cual existe grabada una lnea graduada de 1 mm de largo.

Fig. 3: Reglilla en forma de cruz, situada en el ocular.

Fig. 4: Diagrama de la reglilla situada en el ocular calibrada en el objetivo 4X.

Determine el tamao celular promedio de un glbulo rojo y de un glbulo blanco en un
frotis sanguneo permanente, midiendo 3 clulas de cada tipo para establecer un
promedio y su desviacin estndar en cada caso.

C.- Determinacin del nmero de clulas

1) Su ayudante le entregar una suspensin de eritrocitos cuyo nmero de clulas por l o
por ml tendr que ser determinado por Ud.
2) Saque una alcuota de 5 l de la suspensin de clulas y llvelos a 1000 l con suero o
PBS (ver preparacin ms abajo). Agite bien para obtener una mezcla homognea.
3) Para determinar el nmero de clulas en una suspensin se usa una cmara de
NEUBAUER. La cmara se carga colocando primero un cubreobjetos sobre el
reticulado y posteriormente depositando una gota en la cmara, adyacente al
cubreobjetos para que entre por capilaridad. Espere unos 30 segundos para permitir que
las clulas sedimenten. Enfoque el reticulado de la cmara, primero con el lente de
menor aumento del microscopio y luego cambie al objetivo 10X. Cuente las clulas
que ve en cada uno de los cuadrados sealados anteriormente. Tenga presente que si
demora mucho en el conteo, el calor de la fuente de luz comenzar a secar el lquido
dentro de la cmara, afectando el resultado.
4) Saque el promedio de la cantidad de clulas por L. Si desea calcular el nmero de
clulas por ml, simplemente multiplique la cantidad obtenida por 1000 (1 ml = 1000
l).

Preparacin de 1 litro de PBS: Buffer de uso frecuente.

PBS Buffer de fosfatos pH 7.4
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)

8 g (137 mM) NaCl

0.2 g (2.7 mM) KCl
1.44 g (10 mM) NaHPO
0.24 g (2mM) KH2PO
800 ml agua bi-destilada
Ajustar pH a 7.4 con HCl
Aforar a 1 litro.

Nota: Conservar a 4-8 C. Es estable por unos 3 o ms meses.

BIBLIOGRAFA:
6. Buffer PBS. Labtox: Protocolos y tcnicas de laboratorio. (http://labtox02.blogspot.com/2006/02/pbs-buffer.html)
7. Introduccin a la biologa celular 2a. ed. Alberts, Bruce, 1938. 2006.
8. Biologa celular y molecular 4a. ed. Lodish, Harvey. 2002.
9. Biologa celular y molecular de De Robertis. De Robertis, Eduardo M. F; 2000.

Materiales de laboratorio. Microscopa II

Materiales por grupo (3 alumnos por grupo)
Microscopios.
Porta objetos.
Cubreobjetos.
1 cmara Neubauer con cubre objeto.
1 crculo negro para generar campo oscuro.
Un frotis de sangre.

Materiales por Laboratorio.

1 microscopio con reglilla.
2 tubos con 9 ml de PBS estril.
3 tubos de ensayo estriles.
1 micropipeta 1000 l.
1 caja con puntas azules estriles.
1 vaso pp. con alcohol para desechos.
1 jeringa de 3 o 5 ml.
1 tubo con anticoagulante (EDTA) de 3 o 5 ml.