14/07/2013

Cultivo de Fibroblastos y Adipocitos

Dr. Francisco Carricondo

Ctedra de Neurobiologa de la Audicin
Facultad de Medicina
Universidad Complutense de Madrid

Tejido Conectivo o Conjuntivo

Es el tejido ms extendido del organismo
Funciones:
Rellena espacios entre rganos
Da soporte a tejidos (epitelio, etc.)
Responsable de la sangre y el plasma (nutricin y defensa)
Formado por clulas y matriz extracelular abundante, organizada y compleja

Tejido Conectivo o Conjuntivo

Tejido conectivo laxo:
-estructura tipo red
-clulas llamadas fibroblastos
-algunas fibras colgenas o reticulares

FUNCIONES
Nutricin,
defensa
y soporte

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Tejido Conectivo o Conjuntivo

Tejido conectivo denso:
-clulas fibroblastos
-muchas fibras colgenas o reticulares dan resistencia o
elasticidad
-Tendones
-Cpsulas de rganos

Fibroblastos: morfologa y fisiologa

Tejido
conjuntivo

fibroblastos
tejido adiposo
tejido seo
tejido cartilaginoso
tejido hematopoytico

Tejido formado por clulas y una matriz extracelular.

Tejido conjuntivo laxo: fibras poco compactas
denso: fibras muy compactas
Las fibras son producidas por los fibroblastos
Las fibras son de

colgeno (a partir de tropocolgeno

tropocolgeno))
elastina (a partir de tropoelastina
tropoelastina))

Un poco de historia
1920-30: Subcultivo de lneas celulares de fibroblastos (Carrel & Ebeling, 1923)
1943: Establecimiento de la primera lnea celular contnua de fibroblastos (L-cell
mouse fibroblast) (Earle et al., 1943)
1954: Descripcin de la inhibicin por contacto de la motilidad celular de los
fibroblastos (Abercrombie & Heaysman, 1954)
19641969: Fabricacin de las vacunas de la rabia y la rubeola en la lnea de
fibroblastos de pulmn WI-38 (Wiktor et al., 1964; Andzaparidze, 1968)
1975: Descripcin del factor de crecimiento fibroblstico (fibroblast growth
factor) (Gospodarowicz et al., 1975)

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Fibroblastos: morfologa y fisiologa

- Los fibroblastos son clulas de origen mesodrmico.
- Principal funcin: sintetizar y mantener a la matriz extracelular propia del tejido.
- Esta act ivida d le pe rmite inte rveni r en el e qui li bri o metab l ico e integ rida d de l os
tejidos.
- Son clulas con abundante retculo endoplsmico rugoso.
- Aparato de Golgi bien representado.
- Un nuclolo.
- Ncleo con cromatina granular (heterocromatina).
- Gran actividad metablica.

La Matriz Extracelular
En los tejidos conjuntivos, los espacios intercelulares estn rellenos de matriz
extracelular (ME). Su constitucin est determinada por el tipo celular:
- Los fibrocitos secretan fibras de colgeno tipo I y fibronectina en la ME
- Las clulas epiteliales producen laminina.
La complejidad de la ME es un reflejo de la expresin fenotpica de las clulas inmersas
Clulas de la ME
controlan

Composicin
de la ME

Expresin fenotpica
de las clulas

Cada tipo celular requerir un tipo especfico de ME

Las lneas celulares en cultivo pueden producir su propia ME, mientras que el cultivo de
clulas aisladas puede requerir una adicin exgena de una ME.
La ME est compuesta por colgeno, laminina, fibronectina, cido hialurnico,
proteoglicanos y determinados factores de crecimiento y citokinas.

M icrotubules of NIH 3T3 cells visualized with

blue-fluorescent Alexa Fluor 405 goat antimouse
IgG antibody.

M ouse 3T3 cells. E thidium homodimer1 and B ODIPY FL

phallacidin.

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Preparacin de una ME para el cultivo de otras clulas

Objetivo: Eliminar una monocapa celular de clulas formadoras de ME tras la
confluencia y cultivar las clulas deseadas en la matriz residual.
- Cultivo de fibroblastos (p. ej., lneas 3T3 de ratn o MRC-5 humana) hasta la
confluencia.
- Tras 3-5 das de confluencia, eliminar el medio y aadir un volumen equivalente de
Tritn estril al 1% en agua ultrapura sobre la monocapa celular.
- Incubacin durante 30 a 37C
- Eliminar el Tritn y lavar con agua ultrapura varias veces.
- Usar directamente o almacenar a 4C durante un mximo de 3 semanas.

Substratos para el Cultivo: Feeder layers

Se ha descrit o previam ent e que algu nos tipos c elulares pa ra crec er en
cultivo y expr esar s us car act ersticas dife ren ciadas p recis an de
suplem entos es pe cficos. Un a ma nera de obten er estos su pleme ntos es
la de hace rlos cr ec er sobr e los rest os de m ono cap as de otros tipos
celulare s. Estas mono cap as pr evias se esteriliza n o se in hibe su
crecimie nto ( normalme nte por irradiaci n X o ). Este efe cto p odra ser
debido a dos posibilidades: supl eme ntaci n del m edio, o modific acin
del sustrato. Una de las monoco pas ms empl eadas son los fibrobastos
de ratn 3T3 irradiados.

Colonias de clulas madre embrinicas cultivadas en la ausencia o

sobre una feeder layer de fibroblastos embrionarios primarios
de ratn

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Morphology on Feeder Layers.

Human embryonic stem cell colony on mouse

embryonic fibroblast feeder layer

Ba sa l k e ra tin o c y te c u ltu re o n f ibro bla sts f e e de r la y er

A) Fibro bla sts in c o n f lu e nc e (3 rd p a ssa g e ) whic h we re u se d a s f e ede r c ells
f o r k e ra tin o c y te c u ltu re .
B) Ke ra tin o c y te c o lo n y with a smo o th p e rime te r (2 nd p a ssa g e )
C) Ke ra tin o c y te c o lo n y with wrin k le d p e rime te r (3 rd p a ssa g e ).
D) Co lo n y with lo w p ro lif e ra tive k e ra tin o c y te s, whic h c o n ta in s la rg e a n d
f la tte n e d c e lls (2 nd p a ssa g e ).
Ba rs re p re se n t 50 m f o r A; 200 m f o r B & C; a n d 100 m f o r D.

I so la tio n a n d c ha rac te riz a tio n o f p u ta tive e p d

i e rma l ste m c e lls de rive d
f ro m Ca shme re g o a t f e tu s. I sla m M S, Zho u H. Eu r J De rma tol.
2007;17(4):302-8.

Obtencin celular y medios de cultivo

Los mtod os de obtenci n celular de pe nder n del tejido sobre el qu e
se extraern los fibroblastos.
-Disociacin enzimtica segn procedencia de las clulas:
colagenasa para estructuras fibrosas
hialuronidasa para mucopolisacridos
tripsina + pronasa + dispasa para dermis humana
-Medio DMEM, HAM F12, 10-20 % suero bovino fetal
-FGF (fibroblast growth fa ctor), EGF (e pidermal growt h fact or),
insulina, hidro cortiso na, som atomedin a, PD GF (f actor de cr ecimie nto
derivado de plaqu etas). Este fa ctor se obtie ne p or sediment acin del
suero sin centrifugar
-37 C , 5% CO 2 y 95% de aire

Las clulas del tejido conectivo generalmente sobreviven muy bien a la mayora de los
procedimientos de disgregacin mecnica y enzimtica y pueden ser cultivadas en
medios simples, particularmente si hay SBF.
Aunque clulas errneamente llamadas fibroblastos pueden ser aisladas de diferentes
tejidos conectivos, la identidad precisa de estas clulas no siempre est clara. Las
lneas de fibroblastos (p.ej., 3T3 de ratn) producen colgenos I y III y lo liberan al
medio. Aunque la produccin de colgenos no es especfica de los fibroblastos, s que lo
es el hecho de producirlo en grandes cantidades.
Sin embargo, las clulas 3T3 pueden ser inducidas a diferenciarse en adipocitos y las de
10T1 en condrocitos y osteocitos, por lo que parece que estas lneas de fibroblastos
podran ser clulas mesodrmicas poco diferenciadas y que pueden diferenciarse de
varias maneras.
Los fibroblastos humanos o de hamster son morfolgicamente distintos de los de ratn
Se ha sugerido que las lneas celulares fibroblsticas deben ser derivadas de los
pericitos vasculares, aunque debe confirmarse su identidad.
Las lneas celulares de fibroblastos deben ser confirmadas mediante la deteccin de los
marcadores y que puedan diferenciarse en fibrocitos. El colgeno tipo I es uno de esos
marcadores.

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- Buena supervivencia a la disgregacin y en el cultivo de las clulas del tejido conectivo

-Pueden ser cultivadas en medios simples, particularmente si hay SBF.
- Errores en la extraccin de fibroblastos: Evaluar la produccin de colgeno (no
especfica de los fibroblastos) en grandes cantidades.
- Las fibroblastos de la lnea 3T3 pueden ser inducidas a diferenciarse en adipocitos y
las de 10T1 en condrocitos y osteocitos. clulas mesodrmicas poco diferenciadas?
- Los fibroblastos humanos o de hamster son morfolgicamente distintos de los de
ratn
- Lneas celulares de fibroblastos: Confirmacin mediante deteccin de marcadores y su
diferenciacin en fibrocitos. El colgeno tipo I es uno de esos marcadores.

- Algunas lneas celulares crecen mejor a pH 7.4-7.7.

- DMEM: para cultivos de fibroblastos de ratn, su transformacin y propagacin de
virus.
- MEM de Eagle: con SBF. Tambin se pueden cultivar en medios libres de suero.
- Poli-L-lisina: mejora la supervivencia de los fibroblastos, no es un requerimiento esencial
- Cultivo a bajas densidades, mejora el anclaje al sustrato y la proliferacin

Tcnicas de disociacin enzimtica

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El cultivo con medios libres de suero:

- Estandarizacin de resultados
- Necesidad de medios especializados para un tipo celular especfico
- Eliminar variables naturales de los productos
Los sueros tienen inhibidores de crecimiento (factores inhibidores). Aunque la
estimulacin de la propagacin predomina el efecto total de estas sustancias no puede
ser controlado.
Los medios selectivos se pueden usar para controlar el crecimiento descontrolado de
los fibroblastos

Tipos de Cultivo de Fibroblastos

-Cultivo primario de explantes:
El mtodo habitual de explantes se hace solo para fibroblastos de la piel:
-Limpiar la biopsia.
-Eliminar las zonas de fibras de colgeno (inhibidoras de la proliferacin celular)
-Lavar con solucin salina y antibiticos
-Los explantes deben ser como mximo de 2 mm 2
-El medio de cultivo debe suplementarse con 10% de SBF y antibiticos
(penicilina-estreptomicina).
-A los tres das ya es evidente la migracin y la proliferacin de los fibroblastos

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Tipos de Cultivo de Fibroblastos

- Cultivo de clulas en monocapa:
Los fibroblastos crecen bien sobre el plstico o sobre sustratos de polilisina.
La confluencia se alcanza rpidamente y aparece el fenmeno de inhibicin por
contacto. Resiembra. Tripsinizacin (tripsina 0.25% en PBS).
- Cultivo tridimensional:
Se han realizado este tipo de cultivo para clulas de la dermis de la piel sobre
un gel de colgeno formando un conjunto dermoequivalente mediante
modificacin de la matriz extracelular por parte de los fibroblastos.
El mtodo es el mismo y las clulas aisladas se mantienen en suspensin hasta
que son inoculadas en el gel.

Evolucin del Cultivo de Fibroblasto s

A partir de un cultivo primario se pueden obtener dos tipos de cultivo:
-Un cultivo de una lnea celular diploide finita.
-Un cultivo de una lnea celular transformada y contnua.
-Lnea diploide normal:
Se obtiene fcilmente a partir de un cultivo primario. Hay que tener en cuenta
la senescencia de las clulas caracterizada por un aumento en el tamao de las
clulas, una disminucin en la actividad mittica y una acumulacin de detritus
celulares. Se pueden realizar estudio de envejecimiento celular.
-Lnea transformada:
Se obtiene mediante transformacin de un cultivo primario. Esta mutacin
puede venir dada por agentes transformantes como agentes fsicos como los
rayos UV, qumicos (promotores de tumores, etc) o biolgicos (virus).

Caractersticas de los fibroblastos in vitro

las clulas pueden desplazarse 40m/h
llegan a rediferenciarse con su morfologa caracterstica
llegan a la confluencia e inhibicin por contacto pierden la
morfologa, se transforman.
sintetizan y secretan: fibronectina, colgeno
el anticuerpo marcador especfico de fibroblastos es antivimentina
La presencia de fibras de colgeno inhibe su crecimiento
el citosinarabinsido en el medio impide su proliferacin
baja concentracin de suero disminuye la proliferacin

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Fibroblastos de embrin de ratn

- Los fibroblastos cultivadas en baja densidad son muy mviles
-Generan un lamelipodio por polimerizacin de actina lo extienden en la direccin del
movimiento, lo adhieren al sustrato y el citoplasma del lado opuesto se retrae
provocando el movimiento de la clula.
-Si la clula encuentra a otra, la polaridad cambia y la migracin procede en sentido
contrario.
-La migracin es errtica hasta que se alcanza la confluencia, la migracin cesa y se
produce la inhibicin por contacto.

Contaminacin por fibroblastos

Buena parte del esfuerzo en el desarrollo de condiciones selectivas de cultivo
viene dado por la necesidad de limitar o eliminar el crecimiento de los fibroblastos:
- la cis-OH-prolina se us pero era txica para otras clulas
- La fenobarbitona inhibe los fibroblastos en cultivos de hepatocitos
- El etilmercuritiosalicilato sdico reduce tambin la contaminacin por
fibroblastos
- Tambin son sensibles a la geneticina.
Un mtodo eficaz puede ser la utilizacin de determinados anticuerpos
monoclonales conjugados con toxinas.

Adhesin selectiva
Las clulas tienen diferentes afinidades por el sustrato de cultivo y se anclan en tiempos
diferentes.
Despegue selectivo
El tratamiento de la placa con tripsina o colagenasa puede eliminar algunas clulas ms
rpidamente que a otras. En concreto los fibroblastos son especialmente sensibles a estos
tratamientos puntuales.

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azul de tolouidina

anti-vimentina

Aplicacin de los cultivos

estudios de metabolismo
efectos de drogas, virus, toxicologa, farmacologa
estudios de viabilidad, proliferacin,
estudios de diferenciacin celular
diagnstico prenatal
interaccin clula-clula
promotores de tumores
transformacin celular
substrato de otros cultivos: monocapa de alimentacin
migracin celular
sntesis y secrecin de sustancias in vitro

Tejido adiposo: morfologa y fisiologa

Tejido adiposo blanco: abundante en la embriognesis forma el tejido adiposo
en adulto.
Es el principal rgano de reserva energtica .
Formado por agregados de clulas :adipocitos y un estroma abundante
conjuntivo y vascular.
La funcin esencial de los adipocitos es:
almacenar energa en gotas lipdicas : triglicridos
liberar energa al medio extracelular cidos grasos libres glicerol

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Tejido adiposo: morfologa y fisiologa

Su morfologa es muy particular: una enorme vacuola lipdica 80%
de la masa celular. Ncleo y citoplasma migran a la periferia.
Es un tejido diana para las hormonas: insulina, glucocorticoides,
catecolaminas, hormona del crecimiento, hormonas tiroideas.

- Los adipocitos son clulas diferenciadas. Funcin de reservorio de energa.

Almacn de triglicridos y de cidos grasos que liberan tras lipolisis en los
momentos necesarios.
- Papel importante como reguladores del metabolismo de los carbohidratos y
el lipdico.
- Defectos en el tejido adiposo pueden contribuir a enfermedades comunes
como la diabetes, hipertensin, etc.

Cultivo de clulas adiposas

- Opcin: A partir de la diferenciacin de cultivos de clulas mesenquimales (3T3 de
ratn) mediante cultivo a elevadas densidades. El suero porta un factor adipognico
que puede ser responsable de la induccin.
- Opcin: A partir de la grasa del epiddimo de rata. Digestin con colagenasa.
Protocolo:
- Extraccin estril de las placas de grasa del epiddimo.
- Disgregacin mecnica con tijeras y pipeta.
- Disgregacin con colagenasa 37C, 1h.
- Lavado con medio de disociacin.
- Disgregacin final con pipeta.
- Centrifugacin
- Eliminacin del sobrenadante (los adipocitos flotan)
- Resuspensin del sedimento en DMEM
- Cultivo en placa (37C, 5% CO2 en aire)

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Tcnica de cultivo
Cultivo primario de preadipocitos del estroma
estroma--conjuntivo vascular
vascular..
Cultivo de lneas celulares de preadipocitos ( 3T3 LI, MS 32
32A,
A, ST13
ST13,, A31
31T,
T, F 442A)
442A)
Disociacin con colagenasa
Centrifugacin: adipocitos maduros flotan densidad 1 preadipocitos en el fondo
medio DMEM (Dubelco
( Dubelco modificado medio Eagle), M99
10% suero bovino fetal + glucosa 4,5 g/l
biotina + pantotenato (como coenzimas implicadas en la biosintesis lipdica de
cidos grasos).
37 C , 5% CO2 y 95% de aire

Caractersticas de los adipocitos in vitro

Los adipoctos en cultivo sintetizan y secretan lipasa.
los adipocitos maduros no se multiplican in vitro.
los adipocitos maduros flotan en cultivo.
la resiembra no se hace con adipocitos maduros.

Aplicacin de los cultivos

estudios de obesidad.
sntesis se enzimas implicados en metabolismo lipdico.
transportador de glucosa por la insulina.
diferenciacin celular.

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