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Braslia, DF
2008
Universidade de Braslia
Instituto de Cincias Biolgicas
Departamento de Biologia Celular
Programa de Ps-graduao em Biologia Molecular
de
Braslia
como
Braslia, DF
2008
15 Fevereiro de 2008
BANCA EXAMINADORA
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais (Edwin e Solange) pelo amor incondicional, carinho e incentivo.
Ao Isnard (Vi)... pela presena em minha vida. Pelo amor, pelos momentos de
distrao, pela ajuda, pelo carinho, por tudo.
Aos amigos Luane, Ndia e Saulo que me receberam no laboratrio, por toda a
ajuda, pacincia, fora e ensinamentos.
As amigas Mariana, Cristiane, Vernica e Adriana, que mesmo pelo curto tempo
de convivncia, foram muito importantes.
Aos funcionrios da Biomol, Ivonildes e Ftima pelo apoio tcnico, sem o qual
seria difcil a realizao deste trabalho.
Aos amigos, Diogo, Dbora, Ivo, Ed, Pedro, Paty, Sabo, Anglica, Anbal, Su,
Raul, Jana, pelas sextas no Fausto.
NDICE
Lista de figures
Lista de tabelas
ii
Abreviaturas
iii
Resumo
iv
Abstract
1. Introduo
1.1 Quimosina
2. Objetivos
2.1 Geral
14
2.2. Especficos
14
3. Estratgia
15
4. Material
4.1 Microrganismos utilizados
16
4.1.1 Bactrias
16
4.1.2 Leveduras
16
4.2 Enzimas
16
4.3 Marcadores
17
4.4 Kits
17
18
4.6 Vetores
18
19
19
19
22
22
23
desnaturante (SDS-PAGE)
4.11 Revelao de protenas com Coomassie blue
24
24
25
26
27
27
5. Mtodos
5.1 Digesto de DNA com enzimas de restrio
28
28
28
28
29
29
29
30
30
31
32
32
32
33
33
33
33
34
34
34
35
35
35
35
36
36
36
37
37
37
o vetor pPIC9)
5.25 Otimizao das condies de cultivo em frasco (clone transformado com
39
o vetor pPZ)
5.26 Cultivo em fermentador (clone transformado com o vetor pPIC9)
40
41
41
41
41
42
42
42
42
5.30.1 Ativao
42
5.30.2 Deglicosilao
43
43
6. Resultados
6.1 Sntese do gene da pr-quimosina B de Bos taurus
44
47
50
53
60
62
63
63
65
67
69
70
7. Discusso
76
8. Concluses e perspectivas
87
9. Referncias bibliogrficas
88
10. Anexos
LISTA DE FIGURAS
quimosina.
Figura 2. Estrutura tridimensional da quimosina bovina.
45-46
48
vetor pPIC9-CHYM.
Figura 5. Anlise de restrio para confirmao do vetor pPIC9-CHYM em gel
49
de agarose 0,8 %.
Figura 6. Anlise da digesto do vetor pPIC9-CHYM para liberao do cassete
50
51
vetor pPZ-CHYM.
Figura 8. Anlise de restrio para confirmao do vetor pPZ-CHYM em gel
52
de agarose 0,8 %.
Figura 9. Anlise de restrio para confirmar a ligao do promotor PGK1 ao
53
57
Figura 11. Cultura em frasco dos clones A3, P1 e controles negativos com
58
59
Figura 13. Anlise do perfil protico do sobrenadante das culturas dos clones
60
61
Figura 15. Southern blotting com DNA genmico de P. pastoris clone P1.
62
63
68
69
70
fermentador.
Figura 20. Perfil cromatogrfico da amostra de quimosina em uma coluna
71
Sephacryl S-100.
Figura 21. Anlise das fraes de protenas do processo de purificao em gel
72
73
74
75
79
80
LISTA DE TABELAS
ii
38
39
40
55
55
64
65
66
66
67
ABREVIATURAS
adenina
ADP
adenosina difosfato
Ala
alanina
Amy
-amilase
AOX
AOX1
AOX2
APS
persulfato de amnio
Asn
asparagina
Asp
aspartato
ATP
adenosina trifosfato
citosina
CaCl2
cloreto de clcio
cm
centmetro
Da
Daltons
DNA
cido desoxiribonuclico
DO
oxignio dissolvido
EDTA
cido etilenodiaminotetractico
guanina
grama
GAP
Glu
glutamato
Gly
glicina
hora
HCl
acido clordrico
His
histidina
HIS4
IPTG
isopropil -D-1-tiogalactopiranosdeo
kb
quilo base
kDa
quilo Daltons
KOH
hidrxido de potssio
iii
KV
quilo Volts
litro
Lys
lisina
molar
mA
miliampres
min
minutos
Met
metionina
mg
miligrama
MgCl2
cloreto de magnsio
mL
mililitro
mM
milimolar
mRNA
RNA mensageiro
ms
milisegundos
NaCl
cloreto de sdio
ng
nanograma
nm
nanmetro
OD 600
pb
pares de base
PGK1
pH
potencial hidrogeninico
Phe
fenilalanina
PNGase
N-Glicosidase F
p/v
peso/volume
RNAse
ribonuclease
rpm
segundos
SDS
dodecilsulfato de sdio
Ser
serina
timina
TAE
TCA
cido tricloroactico
TEMED
N,N,N`,N`- tetrametiletilenodiamina
Thr
tirosina
unidade
volume
Volts
v/v
volume/volume
YNB
xg
fora gravitacional
graus Celsius
PF
microFaraday
Pg
micrograma
PL
microlitro
Pm
micrmetro
RESUMO
A coagulao enzimtica do leite para fabricao de queijo envolve a quebra de
uma ligao peptdica da casena por uma protease asprtica. Tradicionalmente, esta
clivagem feita em escala industrial pela ao da quimosina bovina que combina uma
forte atividade de coagulao do leite com uma baixa atividade proteoltica. No presente
estudo, relatada a expresso, purificao e caracterizao de quimosina recombinante
bovina na levedura metilotrfica Pichia pastoris. Para alcanar altos nveis de produo,
o cDNA do fragmento codante da pr-quimosina B bovina foi desenhado e sintetizado
in vitro otimizando o codon usage para a expresso em P. pastoris. O gene sinttico
(CHYMb) foi clonado em vetores de expresso contendo os promotores PGK1
(expresso constitutiva) e AOX1 (expresso induzida) seguindo-se integrao no
genoma da levedura. Os clones transformantes com maior produo enzimtica de cada
sistema (P1 e A3, respectivamente) foram analisados em culturas simultneas para
comparao da produo enzimtica. Maiores nveis de atividade de quimosina foram
observados no clone sob o comando do promotor PGK1, que apresentou alta produo
durante toda a cultura. Uma otimizao na produo enzimtica foi desenvolvida
atravs de planejamentos fatoriais. A influncia da densidade celular inicial, metanol e
concentrao da fonte de nitrognio foram avaliados para aumentar a produo do clone
A3. A interao dos fatores densidade celular inicial e concentrao de metanol foi
determinada como sendo o parmetro mais importante, dobrando a produo. A
influncia de diferentes concentraes da fonte de nitrognio e carbono, previamente
selecionados (farelo de soja e acar invertido), foi tambm analisada para aumentar a
produo enzimtica no clone P1. Foi demonstrado por anlise estatstica que maiores
concentraes de cada fator aumentam a produo. O perfil de atividade enzimtica foi
avaliada em fermentador com as condies determinadas nas otimizaes. A atividade
encontrada nos dois casos (A3 e P1) foi superior quelas encontradas na fermentao
em frascos. A quimosina recombinante foi posteriormente purificada apenas por uma
etapa de cromatografia de excluso molecular. Foi demonstrada a presena de enzima j
processada no sobrenadante da cultura e uma frao de protenas glicosiladas. A
especificidade pela casena foi demonstrada ser semelhante quimosina comercial
recombinante produzida por Aspergillus niger (Chr. Hansen). A alta produo de
quimosina recombinante com alta especificidade em P. pastoris faz esse sistema de
expresso atrativo para produo industrial desta enzima.
iv
ABSTRACT
1. INTRODUO
1. INTRODUO
1.1 Quimosina
1. INTRODUO
A coagulao do leite pela quimosina um processo de duas etapas: a primeira
fase (cataltica) comea com o reconhecimento especfico da seqncia His98-Lys111
da casena (Beppu, 1993; Mohanty et al., 1999) e posterior clivagem proteoltica
especfica da ligao Phe105-Met106. Essa quebra resulta na liberao de um fragmento
solvel chamado macropeptdeo que passa para o soro, e outro, chamado p--casena
insolvel que permanece na micela. A p--casena no tem a propriedade de estabilizar
a estrutura micelar, causando diminuio na repulso eletrosttica entre as micelas (Reid
et al., 1997). A fase seguinte, no enzimtica, consiste na agregao da p-k-casena com
as outras casenas sob a associao de ons clcio, o que, eventualmente, resulta na
formao do cogulo micelar. Este fenmeno , portanto, produzido pela
desestabilizao da soluo coloidal da casena que origina a aglomerao de micelas
livres concentrando a protena do leite e retendo gordura. A fase aquosa contendo os
elementos hidrossolveis constitui o soro (Lawrence et al., 1998).
1. INTRODUO
aminocido na posio 244: um aspartato na quimosina A e uma glicina na quimosina
B. A presena desses aminocidos promove uma maior afinidade da quimosina A pela
casena devido a uma estabilizao eletrosttica adicional do complexo casena-quimosina, e uma maior estabilidade da quimosina B em pH baixos (Chitpinityol &
Crabbe, 1998).
Pre
Pr
-16
Pro
Pr
Quimosina
43
244
365
(Aminocidos)
1. INTRODUO
Asp
215).
Figura
extrada
do
site
MEROPS
(http://www.merops.sanger.ac.uk/).
1. INTRODUO
conseqente coagulao. No entanto, a coagulao enzimtica o mtodo mais
utilizado, pois apresenta maior rendimento em relao coagulao cida. A adio da
enzima quimosina, promove a coagulao do leite que se separa em duas fases, coalho e
soro, processo este chamado coalhagem. O coalho , ento, drenado, colocado em
formas e prensado. Depois de prensados, os blocos podem ser tratados de inmeras
maneiras ou moldados em diferentes formas dependendo do tipo de queijo. A etapa
final a maturao, que pode variar de quatro semanas a trs anos, e muito importante
na definio da aparncia, textura e sabor do queijo (Johnson & Lucey, 2006).
Nos anos 1960, a FAO (Food and Agriculture Organization) previu uma severa
queda no uso da quimosina de bezerro. Foi antecipado que uma demanda de carne
poderia levar necessidade de abater os bezerros em uma idade mais madura, o que
reduziria a produo de quimosina (quanto mais jovem o animal, mais enzima
secretada) (Moschopoulou et al., 2006). A necessidade de carne, a desaprovao do uso
de enzima animal por alguns grupos religiosos, e o custo elevado devido ao sacrifcio de
bezerros, fez com que os fabricantes de queijo buscassem por fontes alternativas de
menor custo, que no afetassem a qualidade dos queijos (Chitpinityol & Crabbe, 1997).
1. INTRODUO
fermentaes industriais. Entretanto, a demanda por quimosina animal, a enzima de
preferncia, que produz um gosto caracterstico aos queijos ainda prefervel j que
existem problemas associados com os queijos produzidos por fontes microbianas. A
atividade proteoltica destas enzimas causa problemas secundrios (ex: dificuldades
com o endurecimento do coalho e perda significativa de gordura e protenas no soro),
conseqentemente, o rendimento do queijo menor e podem desenvolver um gosto
diferente e um sabor amargo (Rao, 1984).
Como uma possvel soluo para se obter uma molcula similar a quimosina
animal, foi proposta a clonagem do gene que codifica a quimosina mediante tcnicas de
DNA recombinante. Em anos recentes essa tecnologia permitiu que o gene da
quimosina animal fosse clonado e expresso com sucesso, como um produto da
fermentao de linhagens no-patognicas de bactrias, leveduras e fungos
filamentosos.
Wang (1995) construiu um plasmdio que permitiu a hiperexpresso da prquimosina (39 % do total de protena celular) na bactria Escherichia coli K-12. No
entanto, a quimosina produzida nesta bactria acumula em corpos de incluso
aumentando consideravelmente o custo do processo de purificao (Nishimori et al.,
1982; Emtage et al., 1983; Marston et al., 1985). Outros sistemas de bactrias foram
usados para expressar a pr-quimosina. Parente et al. (1991) clonaram a seqncia do
gene da pr-quimosina em Bacillus subtilis, no entanto, tambm obtiveram a expresso
da enzima como um agregado insolvel. A produo extracelular da pr-quimosina foi
conseguida fusionando o gene da enzima com uma seqncia sinal da protena
subtilisina de B. subtilis. No entanto foram obtidos apenas baixos nveis de expresso
(100 g.l-1). A clonagem em Lactococcus lactis tambm apresentou nveis de produo
muito baixos (Simon et al., 1991) assim como em Proteus mirabilis (Kaprlek et al.,
1991).
Na levedura Saccharomyces cerevisiae, os genes codificando para pr-prquimosina, pr-quimosina e quimosina madura foram expressos, mas as protenas foram
sintetizadas principalmente na forma insolvel, acumulando nas clulas e dificultando a
ativao e purificao. J a levedura Kluyveromyces lactis foi usada com sucesso na
secreo da pr-quimosina. Os fungos filamentosos Aspergillus niger var. awamori e
6
1. INTRODUO
Trichoderma reesei tambm apresentaram altos nveis de expresso de quimosina
bovina recombinante. A produo em A. niger chegou a 1,3 g.L-1 combinando
mutagnese e um eficiente programa de screening (Goff et al., 1984; van den Berg et
al., 1990; Ward et al., 1990; Dunn-Coleman et al., 1991; Harkki et al., 1989; Cardoza et
al., 2003). Atualmente, apenas trs empresas internacionais (Pfizer, Chr-Hansen e Girst
Brocades) produzem e comercializam quimosinas recombinantes (Mohanty et al, 1999).
1. INTRODUO
est crescendo, seja de forma direta ou indireta e a quimosina utilizada pela maioria das
indstrias brasileiras a enzima recombinante, que importada. No existe no Brasil
produo de quimosina recombinante, apenas so produzidos coalhos naturais atravs
da extrao do estmago de bezerro. Embora o custo da quimosina recombinante seja
superior ao da quimosina natural produzida por indstrias brasileiras, a preferncia pela
recombinante se deve principalmente pureza das preparaes quando comparadas s
naturais que vm contaminadas com outras proteases.
1. INTRODUO
superiores, como os sistemas baseados em cultura de clulas de mamferos (Gellissen,
2000).
1. INTRODUO
resulta em uma transcrio substancial do AOX1, sendo, a presena de metanol como
nica fonte de carbono essencial, para a induo de altos nveis (Tschopp et al., 1987).
O crescimento celular em nveis limitantes de metanol induz dramaticamente a
concentrao de AOX, constituindo mais de 30 % do total de protenas solveis
(Coudec & Baratti, 1980; Roggenkamp et al., 1984). Embora o promotor AOX1 seja
utilizado com sucesso para expressar numerosos genes heterlogos, existem
circunstncias em que o promotor no adequado. O uso de metanol para a produo de
produtos alimentcios no apropriada, por exemplo, tambm, o metanol inflamvel
especialmente em quantidades requeridas para fermentaes em larga escala (Cregg et
al., 2000). Portanto, promotores que no so induzidos por metanol so interessantes
para expresso de certos genes em P. pastoris.
Devido aos altos nveis de expresso do gene PGK1 que codifica 3fosfoglicerato quinase (Baker, 1991), vetores carregando o promotor PGK1, que pode
ser induzido por qualquer fonte de carbono, esto entre os mais eficientes sistemas
usados para expresso constitutiva de protenas heterlogas em diferentes leveduras e
fungos filamentosos (Burke et al., 2000), podendo servir como alternativa ao promotor
AOX1. A 3-fosfoglicerato quinase uma enzima glicoltica, que transfere o grupo
fosfato do 1,3-bifosfoglicerato para o ADP, formando ATP e 3-fosfoglicerato. Esta
enzima tambm atua na via gliconeognica e pode constituir cerca de 5 % do total de
protenas celulares (Stanway et al., 1989). Quando presente em um plasmdio, o
promotor pode dirigir a produo da protena para nveis de 30-40 % da protena celular
total, embora nveis menores sejam obtidos quando protenas heterlogas so expressas.
Este promotor usado quando altas quantidades de expresso gnica so requeridas o
que particularmente atraente para a produo de protenas em larga escala. Em nosso
laboratrio, o promotor do gene PGK1 de P. pastoris foi isolado por Almeida et al.
(2005) e, no momento, novos vetores de expresso esto sendo desenvolvidos baseados
nesse sistema.
1. INTRODUO
transformao: estabilidade do cassete de expresso, gerao de transformantes com
mltiplas cpias, controle do stio de integrao e a capacidade de construir diferentes
modos de integrao (Screekrishna et al., 1997). Como em S. cerevisiae vetores lineares
podem gerar transformantes em P. pastoris por recombinao homloga entre
seqncias compartilhadas pelo vetor e pelo genoma da levedura. A integrao no
genoma pode ocorrer via insero por um simples evento de crossover, ou por
substituio gnica, atravs de duplo crossover. A integrao por insero ocorre mais
frequentemente e, pode resultar em mltiplas integraes in tandem do cassete de
expresso a uma taxa de 1-10 %, podendo aumentar a quantidade de protena expressa.
Transformaes por substituio gnica geralmente resultam em transformantes de
cpia nica, porm so geneticamente mais estveis.
1. INTRODUO
endoplasmtico, a protease Kex2p da levedura reconhece o stio de clivagem Lys-Arg
e libera a poro pr do fator . A repetio Glu-Ala quando presente prximo ao
stio de clivagem de Kex2p pode aumentar a atividade desta enzima, e ser
posteriormente removida da protena madura pela ao de uma diaminopeptidase,
produto do gene STE13 (Daly & Hearn, 2005).
Por tudo isso, o sistema de expresso de P. pastoris tem sido cada vez mais
utilizado e tem-se mostrado como uma atraente alternativa para a hiperexpresso de
genes humanos e de animais para fins biotecnolgicos. Nos ltimos anos, o nmero de
publicaes detalhando o uso desse sistema de expresso para pesquisa tem crescido
rapidamente. Isto vem refletindo no aumento de seu uso para produo industrial de
protenas heterlogas, substituindo mtodos mais convencionais, como a produo em
E. coli e S. cerevisiae. Apesar de existirem poucos exemplos de expresso de 10 g/L,
existem muitos exemplos de expresso de 1 g/L, elevando P. pastoris para um dos
mais produtivos sistemas de expresso eucaritica disponveis. De acordo com os dados
disponveis, h uma probabilidade de aproximadamente 50-75 % de se expressar
qualquer protena de interesse em P. pastoris em um nvel considervel (MacauleyPatrick et al., 2005). Embora o rendimento final de uma protena seja influenciado
principalmente por suas propriedades inerentes, pode significativamente ser realado
pela manipulao de fatores que influenciam a expresso do gene e a estabilidade do
12
1. INTRODUO
produto. Entre estes fatores est a utilizao de cdons preferenciais para P. pastoris no
gene de interesse, a otimizao da composio dos meios de cultivo, o ajuste de alguns
parmetros fsicos da cultura (pH, temperatura, disponibilidade de O2), assim como
tambm, o uso de promotores, seqncias sinais e stios de integrao que induzam a
maior produo da protena (Inan et al., 2006).
13
2. OBJETIVOS
2. OBJETIVOS
2.1 Geral
2.2 Especficos
14
3. ESTRATGIA
3.ESTRATGIA
Expresso de pr-quimosina B
em Pichia pastoris
Sntese do gene
CHYMb
INDUZVEL
CONSTITUTIVO
Subclonagem no vetor de
expresso pPIC9
Subclonagem no vetor de
expresso pPZ
Transformao de P. pastoris
GS115
Transformao de P.
pastoris X33
Screening dos clones
Purificao da enzima
Caracterizao enzimtica
15
4. MATERIAL
4. MATERIAL
4.1 Microrganismos utilizados
4.1.1 Bactrias
Escherichia coli linhagem DH5-D (Gibco BRL) endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44
relA1 'lacU169 (I80lacZ'M15) IU169 dcoR phoA.
Escherichia coli linhagem XL10 Gold (Stratagene) - Tetr (mcrA)183 (mcrCBhsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac Hte [F proAB lacIqZ
M15 Tn10 (Tetr) Amy Camr]a
Escherichia coli linhagem TOP10 (Invitrogen) F- mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC)
80lacZM15 lacX74 recA1 deoR araD139 (ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR)
endA1 nupG.
4.1.2. Leveduras
4.2 Enzimas
Enzimas de restrio
As enzimas Xho I, Not I, Sac I, Kpn I, Bgl II, BstB I, BamH I, Xba I e Hind III
foram fornecidas pela New England Biolabs, Promega, QBiogene e Fermentas Life
Sciences e utilizadas como indicado pelo fabricante.
16
4. MATERIAL
Enzima T4 DNA ligase (New England Biolabs) utilizada na concentrao de 40
U/L nas reaes de ligao.
RNAse A
RNAse A (DNAse-free)
10 mg/mL
50 mM
Hannilase (Chr. Hansen) quimosina recombinante produzida por uma cepa do fungo
Aspergillus niger var awamori e comercializada pela empresa Chr. Hansen, utilizada
como controle nos testes de atividade.
4.3 Marcadores
Marcadores de DNA
1 kb Ladder Promega;
DNA de fago O digerido com EcoR I e Hind III (O Eco/Hind) ou BstE II (O BstE
II).
Marcadores de protenas
Unstained Protein Molecular Weight Marker (Fermentas Life Sciences);
Prestained Protein Marker, Broad Range (New England Biolabs);
Bench Marker (Invitrogen).
4.4 Kits
4. MATERIAL
4.6 Vetores
4. MATERIAL
0,5 % (p/v)
Peptona de casena
1 % (p/v)
NaCl
1 % (p/v)
Meio LB-gar
Meio LB adicionado de gar bacteriolgico a 1,5 % (p/v).
19
4. MATERIAL
1 % (p/v)
Peptona de casena
2 % (p/v)
Glicose
2 % (p/v)
Meio YPD-gar
Meio YPD adicionado de gar bacteriolgico a 2 % (p/v).
1 % (p/v)
Peptona de casena
2 % (p/v)
Glicose
2 % (p/v)
Sorbitol
1M
gar bacteriolgico
2 % (p/v)
4 x 10 -5 %
YNB
1,34 %
Glicose
2 % (p/v)
MD-gar
Meio MD adicionado de gar bacteriolgico a 2 % (p/v).
MM (Meio mnimo)
YNB
1,34 % (p/v)
Biotina
4 x 10 -5 %
Metanol
0,5 %
1 % (p/v)
Peptona de casena
2 % (p/v)
100 mM
20
4. MATERIAL
YNB
1,34 % (p/v)
Biotina
4 x 10 -5 %
Glicerol
1%
1 % (p/v)
Peptona de casena
2 % (p/v)
100 mM
YNB
1,34 % (p/v)
Biotina
4 x 10 -5 %
Metanol
0,5 %
1 % (p/v)
Peptona de casena
2 % (p/v)
100 mM
YNB
1,34 % (p/v)
Biotina
4 x 10 -5 %
Glicose
2%
100 mM
YNB
1,34 % (p/v)
Biotina
4 x 10 -5 %
Glicerol
1%
42,9 g
(NH4)2SO4
5g
CaSO42 H2O
1g
K2SO4
14,3 g
MgSO4.7 H2O
11,7 g
Glicerol
40 g
4. MATERIAL
2g
NaI
0,8 g
MnSO4H2O
3g
Na2MoO42 H2O
0,2 g
H3BO3
0,2 g
CaSO42 H2O
0,5 g
CoCl2
0,5 g
ZnCl2
7g
FeSO47 H2O
22 g
Biotina
0,2 g
H2SO4 concentrado
1 ml/L
Soluo I
Tris-HCl pH 8,0
25 mM
EDTA
10 mM
Glicose
50 mM
Soluo II
NaOH
0,2 M
SDS
1 % (p/v)
Soluo III
Acetato de sdio
3M
cido actico
2M
22
4. MATERIAL
40 mM
EDTA
1 mM
50 % (v/v)
Glicerol
30 % (v/v)
Azul de bromofenol
0,25 % (p/v)
Tampo de amostra 2X
Tris-HCl 1 M pH 6,8
200 mM
SDS
4 % (p/v)
-Mercaptoetanol
4 % (v/v)
Glicerol
20 % (v/v)
Azul de bromofenol
0,1 % (p/v)
125 mM
Glicina
0,96 M
SDS
0,5 % (p/v)
Gel concentrador 5%
Acrilamida:Bis-acrilamida (30:0,8) 2,5 mL
Tris-HCl 1 M pH 6,8
5 mL
23
4. MATERIAL
gua destilada
12,15 mL
SDS 10 % (p/v)
0,2 mL
APS 10 % (p/v)
0,150 mL
0,015 mL
3,75 mL
gua destilada
13,21 mL
SDS 10 % (p/v)
0,3 mL
APS 10 % (p/v)
0,225 mL
0,015 mL
Soluo corante
Coomassie brilliant blue G-250
0,25 % (p/v)
Metanol
30 % (v/v)
7 % (v/v)
Soluo descorante
Metanol
30 % (v/v)
7 % (v/v)
Soluo de fixao
Metanol
50 % (v/v)
12 % (v/v)
Formaldedo
0,1 % (v/v)
Soluo de lavagem
Etanol
50 % (v/v)
24
4. MATERIAL
Soluo de tratamento
Tiossulfato de sdio
0,02 % (p/v)
Soluo de equilbrio
Nitrato de prata
0,2 % (p/v)
Formaldedo
0,075 % (v/v)
Soluo de revelao
Carbonato de sdio
6 % (p/v)
Soluo de tratamento
2 % (v/v)
Formaldedo
0,05 % (v/v)
Soluo de parada
Metanol
50 % (v/v)
12 % (v/v)
Tampo SE
Sorbitol
0,9 M
EDTA
100 mM
TE20
Tris-HCl
pH 7,5
EDTA
10 mM
20 mM
Clorofane
Fenol
1v
Clorofrmio
1v
8-Hidroxiquinolina
0,05 %
E-Mercaptoetanol
0,50 %
25
4. MATERIAL
Soluo de equilbrio
Tris-HCl
pH 8,0
NaCl
100 mM
100 mM
TE
Tris-HCl
pH 7,5
EDTA
10 mM
1 mM
SSC 20 X
NaCl
3M
Citrato trissdico
0,3 M
Soluo de depurinao
HCl
0,2 M
Soluo desnaturante
NaCl
1,5 mM
NaOH
0,5 mM
Soluo neutralizante
Tris-HCl pH 7,4
1M
NaCl
1,5 M
2M
SDS
0,1 % (p/v)
50 mM
NaCl
150 mM
MgCl2
1 mM
Reagente de bloqueio
0,2 % (p/v)
26
4. MATERIAL
(Kit AlkPhos)
1M
NaCl
2M
pH ajustado para 10
Soluo de trabalho diludo 1:20 e adicionado 2 mM de MgCl2.
12 % (p/v)
CaCl2
20 mM
25 mM
2,5 % (p/v)
Agarose
1,5 % (p/v)
1 mM
Soluo de Bradford
Coomassie brilliant blue G-250
0,05 % (p/v)
Etanol
25 % (v/v)
cido fosfrico 17 M
50 % (v/v)
27
5. MTODOS
5. MTODOS
5.1 Digesto de DNA com enzimas de restrio
Os sistemas de ligao foram feitos de modo que a razo molar entre vetor e
inserto ficasse entre 1:3 e 1:10. A enzima T4 DNA Ligase foi utilizada com os tampes
28
5. MTODOS
de reao fornecidos pelos fabricantes. Os sistemas foram incubados a 4C por pelo
menos 14 h antes de serem utilizados para transformao de bactrias.
Uma alquota de clula competente previamente preparada foi utilizada para cada
sistema de ligao. As clulas foram retiradas do freezer a -80 C e deixadas no gelo at
que descongelassem. Em seguida, foram adicionados 5 L do sistema de ligao s
clulas, e as mesmas foram novamente incubadas no gelo por 30 minutos. Aps este
perodo, as clulas foram submetidas a um choque trmico a 37 C, por 5 minutos e, o
sistema foi incubado no gelo por 2 minutos. Foram adicionados 900 L de meio LB ao
sistema que foi incubado a 37 C por 1 hora. O plaqueamento foi feito em trs placas
contendo LB-gar e o antibitico adequado. As placas foram incubadas a 37 C durante
a noite.
5. MTODOS
por 2 minutos a 4 C, descartando-se o sobrenadante. O sedimento foi ressuspenso em
200 PL de soluo I, e em seguida adicionou-se 360 L de soluo II recm-preparada.
A amostra foi homogeneizada, com cuidado, por inverso rpida do tubo. Aps
incubao por 5 minutos temperatura ambiente, foram adicionados 300 L de soluo
III gelada ao lisado, procedendo-se nova homogeneizao por inverso do tubo,
gentilmente. A amostra foi ento incubada no gelo por 5 minutos e centrifugada a 12000
x g por 5 minutos a 4 C. O sobrenadante foi transferido para outro tubo contendo 750
PL de isopropanol. A soluo foi homogeneizada por inverso e submetida a uma nova
centrifugao a 12000 x g por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado
ressuspenso em 200 PL de soluo TE. Foi adicionado 110 L de acetato de amnio 7,5
M. Aps forte agitao, o sistema foi centrifugado a 12000 x g por 10 minutos. O
sobrenadante foi recuperado em um tubo limpo, onde foi adicionado 750 L de etanol
100 % gelado. A mistura foi centrifugada a 12000 x g por 5 minutos a temperatura
ambiente. O precipitado foi lavado (sem ressuspender) com 1 mL de etanol 70 %
gelado. Aps secagem por exposio ao ar, o precipitado foi ressuspenso em 50 L de
TE com RNAse A (1 PL de RNAse 10 mg/mL para 100 PL de TE). O DNA plasmidial
foi estocado a -20 C at o uso.
30
5. MTODOS
clulas foram centrifugadas como anteriormente, e ressuspensas em 50 mL de gua
estril gelada. Aps a repetio deste ltimo procedimento, as clulas foram
ressuspensas em 10 mL de sorbitol 1M gelado. Aps centrifugao nas mesmas
condies anteriores, as clulas foram ressuspensas em 0,8 mL de sorbitol 1M gelado, e
mantidas no gelo at o momento do uso. Para a eletroporao, 80 L das clulas foram
misturadas com 5-10 g do DNA plasmidial (previamente linearizado) e 320 L de
sorbitol 1M gelado, e ento transferidas para uma cubeta de eletroporao de 0,2 cm
gelada. As clulas foram eletroporadas nas seguintes condies para o eletroporador da
BioRad: 7,5 KV/cm, 25 F e 400 :. O tempo de eletroporao foi de aproximadamente
10 ms. Imediatamente aps o choque, foi adicionado 1 mL de sorbitol 1M gelado na
cubeta. O contedo foi transferido para um tubo de Eppendorff de 1,5 mL estril. No
caso da transformao da linhagem X33 de P. pastoris, o contedo foi transferido para
um Falcon de 15 mL e incubado em shaker a 30 C por uma hora e meia. As clulas
foram espalhadas em placa de Petri previamente preparadas com meio de cultura MD
sem histidina para seleo dos transformantes com o vetor contendo a marca auxotrfica
HIS4 e YPDS + zeocina para os transformantes com plasmdio contendo o gene de
resistncia a zeocina (Sh ble). Finalmente, as placas foram incubadas a 30 C at o
aparecimento de colnias recombinantes, em geral em torno de 48 horas.
Em uma placa de deep well foram adicionados 800 PL de meio BMGY aos
poos e em cada um deles foi inoculada uma colnia escolhida aleatoriamente das
placas de transformao. A placa foi vedada com filme plstico e incubada em um
shaker a 30 qC e 200 rpm para crescimento das clulas. Aps trs dias a placa foi
centrifugada a 1280 x g por 10 minutos e o sobrenadante foi descartado. Foram
adicionados a cada poo 800 PL de meio BMMY (screening dos transformantes com o
vetor contendo o promotor AOX1 - vetor pPIC9) ou 800 PL de meio BMGluY
(screening dos transformantes com o vetor contendo o promotor PGK1 vetor pPZ).
A placa foi novamente fechada com o filme plstico e incubada em um shaker nas
mesmas condies descritas anteriormente. Foi adicionado metanol para uma
concentrao final de 0,5 %, a cada 24 horas aos poos dos transformantes crescendo
em meio BMMY. Aps centrifugao a 1280 x g por 10 minutos, uma alquota de 50
31
5. MTODOS
PL do sobrenadante de cada transformante foi retirada a cada 24 horas, para anlise da
atividade.
32
5. MTODOS
atividade foi definida como a quantidade mnima de quimosina necessria para formar
um coalho em 5 minutos nas condies determinadas. Nos experimentos de screening,
tanto em deep well como em frasco, analisou-se apenas o tempo necessrio para
coagular 400 L da soluo de leite.
5. MTODOS
precipitado foi seco a temperatura ambiente por 10 a 15 minutos e ressuspenso em 50
L de tampo de amostra 2X. No caso das amostras com o pH cido (amostra com
colorao amarela) acrescentou-se 2 L de tampo fosfato pH 6,0. As amostras foram
estocadas a -20 C at a anlise em gel SDS-PAGE.
Alguns gis foram submetidos colorao com prata. Aps a corrida foram
incubados sob agitao durante 1 hora na soluo fixadora. Em seguida, foram
incubados na soluo de lavagem por 10 minutos. Aps repetir o procedimento de
lavagem com gua destilada duas vezes, os gis foram incubados na soluo de
tratamento por 1 minuto, seguindo-se 3 lavagens com gua destilada durante 30
segundos cada uma. Ao trmino das lavagens, foram incubados durante 15 minutos na
soluo de equilbrio e novamente, lavados com gua destilada duas vezes, por 20
segundos cada, e revelados com a soluo de revelao. A reao foi interrompida, aps
o aparecimento das bandas, com a soluo de parada.
34
5. MTODOS
5.21 Extrao de DNA total da levedura P. pastoris (modificado de Burke et al.,
2000)
Cada gel contendo as amostras de DNA digerido foi primeiro tratado com
soluo de depurinao por 10 minutos sob agitao. Depois de lavado com gua
35
5. MTODOS
destilada foi imerso em soluo desnaturante, e incubado por 30 minutos, sob agitao
leve, a temperatura ambiente. Em seguida, o gel foi lavado rapidamente em gua
destilada e incubado em soluo neutralizante, sob agitao suave, por 30 minutos.
Aps as etapas de tratamento, foi montado o sistema de transferncia por capilaridade.
A soluo de transferncia SSC 10X permitiu a transferncia dos fragmentos de DNA
do gel para a membrana de nylon (Hybond-N). O DNA foi fixado membrana por meio
de exposio luz ultravioleta.
5. MTODOS
5. MTODOS
induo em frasco descritas anteriormente, trocando-se apenas o YNB por uria (na
mesma concentrao).
Nvel
Nvel Superior
(-1)
Intermedirio (0)
(+1)
% Metanol
0,5
0,75
OD 600 inicial
5,5
10
1,34
2,85
4,02
Fatores
% Fonte de
Nitrognio
38
5. MTODOS
5.25 Otimizao das condies de cultivo de P. pastoris em frasco (clone
transformado com pPZ).
-5
% e 25 L de PMT4 . As clulas
(2) Sulfato de
soja
Amnio
Glicose (1)
1-1
1-2
1-3
Glicerol (2)
2-1
2-2
2-3
3-1
3-2
3-3
C/N
(3) Uria
39
5. MTODOS
Tabela 3. Intervalos utilizados para construir o planejamento experimental (22)
para otimizao da produo enzimtica.
Fatores
Nvel Inferior
Nvel
Nvel Superior
(-1)
Intermedirio (0)
(+1)
1,4
2,8
5,6
Fonte de carbono
%
Fonte de
nitrognio %
O pr-inculo foi iniciado com clulas novas em placa, que foram transferidas
para um Erlenmeyer de 1 L com aletas, contendo 200 mL de meio MGY. O frasco foi
incubado sob agitao a 30 C por 20-24 horas at atingir uma OD600 de 10. Antes do
inculo acrescentou-se 1 mL/L de PMT4 ao meio FM22 que j estava no fermentador.
Ligou-se o fermentador a baixa rpm (~300 rpm) por 30 minutos antes do inculo para
promover aerao e calibrar o aerador para 100 %. Ento, o inculo estril foi
adicionado ao fermentador e comeou-se a fermentao com agitao de
aproximadamente 400 rpm.
40
5. MTODOS
garantir que o glicerol no acumulasse no meio. Quando a OD600 atingiu altas nveis a
bomba de glicerol foi desligada e a alimentao de metanol foi ajustada para 1 mL/L.h.
A taxa inicial baixa permite a cultura se adaptar a nova fonte de carbono. DO spikes
foram feitos antes de mudar a taxa de metanol. Uma vez que houve aumento de 10 % na
DO, a bomba alimentadora foi religada e a alimentao com metanol foi aumentada.
Amostras foram retiradas durante a fermentao para se determinar a atividade
enzimtica, peso seco, OD600 e precipitar protenas. Anti-espumante (silicone) foi
adicionado a cada 24 horas, para controlar o excesso de espuma.
41
5. MTODOS
Foi realizada uma cultura de 72 horas do clone selecionado em 2 Erlenmeyers
aletados de 1 L com 100 mL de meio BMGluY.
5. 30.1 Ativao
A enzima purificada foi ativada (ver item 5.15) e aplicada em gel SDS-PAGE.
42
5. MTODOS
5.30.2 Deglicosilao
43
6. RESULTADOS
6. RESULTADOS
6.1 Sntese do gene da pr-quimosina B de Bos taurus
44
6. RESULTADOS
KEX2/STE13
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
1081
Xho I
CTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCTGAGATCACTAGAATCCCATTGTACAAGGGTAAG
TCTTTGAGAAAGGCTTTGAAGGAGCACGGTTTGTTGGAGGACTTCTTGCAAAAGCAACAA
TACGGTATCTCTTCTAAGTACTCTGGTTTCGGTGAGGTTGCTTCTGTTCCATTGACTAAC
TACTTGGACTCTCAATACTTCGGTAAGATTTACTTGGGTACTCCACCACAAGAGTTCACT
GTTTTGTTCGACACTGGTTCTTCTGACTTCTGGGTTCCATCTATCTACTGTAAGTCTAAC
GCTTGTAAGAACCACCAAAGATTCGACCCAAGAAAGTCTTCTACTTTCCAAAACTTGGGT
AAGCCATTGTCTATCCACTACGGTACTGGTTCTATGCAAGGTATCTTGGGTTACGACACT
GTTACTGTTTCTAACATCGTTGACATCCAACAAACTGTTGGTTTGTCTACTCAAGAGCCA
GGTGACGTTTTCACTTACGCTGAGTTCGACGGTATCTTGGGTATGGCTTACCCATCTTTG
GCTTCTGAGTACTCTATCCCAGTTTTCGACAACATGATGAACAGACACTTGGTTGCTCAA
GACTTGTTCTCTGTTTACATGGACAGAAACGGTCAAGAGTCTATGTTGACTTTGGGTGCT
ATCAACCCATCTTACTACACTGGTTCTTTGCACTGGGTTCCAGTTACTGTTCAACAATAC
TGGCAATTCACTGTTGACTCTGTTACTATCTCTGGTGTTGTTGTTGCTTGTGAGGGTGGT
TGTCAAGCTATCTTGGACACTGGTACTTCTAAGTTGGTTGGTCCATCTTCTGACATCTTG
AACATCCAACAAGCTATCGGTGCTACTCAAAACCAATACGGTGAGTTCGACATCGACTGT
GACAACTTGTCTTACATGCCAACTGTTGTTTTCGAGATCAACGGTAAGATGTACCCATTG
ACTCCATCTGCTTACACTTCTCAAGACCAAGGTTTCTGTACTTCTGGTTTCCAATCTGAG
AACCACTCTCAAAAGTGGATCTTGGGTGACGTTTTCATCAGAGAGTACTACTCTGTTTTC
GACAGAGCTAACAACTTGGTTGGTTTGGCTAAGGCTATCTAAGCGGCCGC
Not I
original
sintetica
A E I T R I P L Y K G K S L R K A L K E
GCTGAGATCACCAGGATCCCTCTGTACAAAGGCAAGTCTCTGAGGAAGGCGCTGAAGGAG 60
GCTGAGATCACTAGAATCCCATTGTACAAGGGTAAGTCTTTGAGAAAGGCTTTGAAGGAG 60
*********** ** ***** ******* ** ****** **** ***** ********
original
sintetica
H G L L E D F L Q K Q Q Y G I S S K Y S
CATGGGCTTCTGGAGGACTTCCTGCAGAAACAGCAGTATGGCATCAGCAGCAAGTACTCC 120
CACGGTTTGTTGGAGGACTTCTTGCAAAAGCAACAATACGGTATCTCTTCTAAGTACTCT 120
** ** * *********** **** ** ** ** ** ** ***
********
original
sintetica
G F G E V A S V P L T N Y L D S Q Y F G
GGCTTCGGGGAGGTGGCCAGCGTGCCCCTGACCAACTACCTGGATAGTCAGTACTTTGGG 180
GGTTTCGGTGAGGTTGCTTCTGTTCCATTGACTAACTACTTGGACTCTCAATACTTCGGT 180
** ***** ***** **
** ** **** ****** ****
*** ***** **
original
sintetica
K I Y L G T P P Q E F T V L F D T G S S
AAGATTTACCTCGGGACCCCGCCCCAGGAGTTCACCGTGCTGTTTGACACTGGCTCCTCT 240
AAGATTTACTTGGGTACTCCACCACAAGAGTTCACTGTTTTGTTCGACACTGGTTCTTCT 240
********* * ** ** ** ** ** ******** ** **** ******** ** ***
original
sintetica
D F W V P S I Y C K S N A C K N H Q R F
GACTTCTGGGTACCCTCTATCTACTGCAAGAGCAATGCCTGCAAAAACCACCAGCGCTTC 300
GACTTCTGGGTTCCATCTATCTACTGTAAGTCTAACGCTTGTAAGAACCACCAAAGATTC 300
*********** ** *********** ***
** ** ** ** ******** * ***
original
sintetica
D P R K S S T F Q N L G K P L S I H Y G
GACCCGAGAAAGTCGTCCACCTTCCAGAACCTGGGCAAGCCCCTGTCTATCCACTACGGG 360
GACCCAAGAAAGTCTTCTACTTTCCAAAACTTGGGTAAGCCATTGTCTATCCACTACGGT 360
***** ******** ** ** ***** *** **** ***** ****************
original
sintetica
T G S M Q G I L G Y D T V T V S N I V D
ACAGGCAGCATGCAGGGCATCCTAGGCTATGACACCGTCACTGTCTCCAACATTGTGGAC 420
ACTGGTTCTATGCAAGGTATCTTGGGTTACGACACTGTTACTGTTTCTAACATCGTTGAC 420
** **
***** ** *** * ** ** ***** ** ***** ** ***** ** ***
original
sintetica
I Q Q T V G L S T Q E P G D V F T Y A E
ATCCAGCAGACAGTAGGCCTGAGCACCCAGGAGCCCGGGGACGTCTTCACCTATGCCGAA 480
ATCCAACAAACTGTTGGTTTGTCTACTCAAGAGCCAGGTGACGTTTTCACTTACGCTGAG 480
***** ** ** ** ** **
** ** ***** ** ***** ***** ** ** **
original
F D G I L G M A Y P S L A S E Y S I P V
TTCGACGGGATCCTGGGGATGGCCTACCCCTCGCTCGCCTCAGAGTACTCGATACCCGTG 540
45
6. RESULTADOS
sintetica
TTCGACGGTATCTTGGGTATGGCTTACCCATCTTTGGCTTCTGAGTACTCTATCCCAGTT 540
******** *** **** ***** ***** ** * ** ** ******** ** ** **
original
sintetica
F D N M M N R H L V A Q D L F S V Y M D
TTTGACAACATGATGAACAGGCACCTGGTGGCCCAAGACCTGTTCTCGGTTTACATGGAC 600
TTCGACAACATGATGAACAGACACTTGGTTGCTCAAGACTTGTTCTCTGTTTACATGGAC 600
** ***************** *** **** ** ****** ******* ************
original
sintetica
R N G Q E S M L T L G A I N P S Y Y T G
AGGAATGGCCAGGAGAGCATGCTCACGCTGGGGGCCATCAACCCGTCCTACTACACAGGG 660
AGAAACGGTCAAGAGTCTATGTTGACTTTGGGTGCTATCAACCCATCTTACTACACTGGT 660
** ** ** ** ***
*** * ** **** ** ******** ** ******** **
original
sintetica
S L H W V P V T V Q Q Y W Q F T V D S V
TCCCTGCACTGGGTGCCCGTGACAGTGCAGCAGTACTGGCAGTTCACTGTGGACAGTGTC 720
TCTTTGCACTGGGTTCCAGTTACTGTTCAACAATACTGGCAATTCACTGTTGACTCTGTT 720
** ********** ** ** ** ** ** ** ******** ******** *** ***
original
sintetica
T I S G V V V A C E G G C Q A I L D T G
ACCATCAGCGGTGTGGTTGTGGCCTGTGAGGGTGGCTGTCAGGCCATCTTGGACACGGGC 780
ACTATCTCTGGTGTTGTTGTTGCTTGTGAGGGTGGTTGTCAAGCTATCTTGGACACTGGT 780
** ***
***** ***** ** *********** ***** ** *********** **
original
sintetica
T S K L V G P S S D I L N I Q Q A I G A
ACCTCCAAGCTGGTCGGGCCCAGCAGCGACATCCTCAACATCCAGCAGGCCATTGGAGCC 840
ACTTCTAAGTTGGTTGGTCCATCTTCTGACATCTTGAACATCCAACAAGCTATCGGTGCT 840
** ** *** **** ** **
****** * ******** ** ** ** ** **
original
sintetica
T Q N Q Y G E F D I D C D N L S Y M P T
ACACAGAACCAGTACGGTGAGTTTGACATCGACTGCGACAACCTGAGCTACATGCCCACT 900
ACTCAAAACCAATACGGTGAGTTCGACATCGACTGTGACAACTTGTCTTACATGCCAACT 900
** ** ***** *********** *********** ****** **
******** ***
original
sintetica
V V F E I N G K M Y P L T P S A Y T S Q
GTGGTCTTTGAGATCAATGGCAAAATGTACCCACTGACCCCCTCCGCCTATACCAGCCAA 960
GTTGTTTTCGAGATCAACGGTAAGATGTACCCATTGACTCCATCTGCTTACACTTCTCAA 960
** ** ** ******** ** ** ********* **** ** ** ** ** **
***
original
sintetica
D Q G F C T S G F Q S E N H S Q K W I L
GACCAGGGCTTCTGTACCAGTGGCTTCCAGAGTGAAAATCATTCCCAGAAATGGATCCTG 1020
GACCAAGGTTTCTGTACTTCTGGTTTCCAATCTGAGAACCACTCTCAAAAGTGGATCTTG 1020
***** ** ********
*** *****
*** ** ** ** ** ** ****** **
original
sintetica
G D V F I R E Y Y S V F D R A N N L V G
GGGGATGTTTTCATCCGAGAGTATTACAGCGTCTTTGACAGGGCCAACAACCTCGTGGGG 1080
GGTGACGTTTTCATCAGAGAGTACTACTCTGTTTTCGACAGAGCTAACAACTTGGTTGGT 1080
** ** ********* ******* ***
** ** ***** ** ****** * ** **
original
sintetica
L A K A I
CTGGCCAAAGCCATCTAA 1098
TTGGCTAAGGCTATCTAA 1098
**** ** ** ******
46
6. RESULTADOS
6.2 Construo do vetor de expresso induzida
47
6. RESULTADOS
5' AOX1
amp
pBR322
f1 ori
Xho I
amp
Not I
3' AOX
pPIC9- Amy
pBSSK -CHYM
AMY
11.5 kb
4.0 kb
CHYMb
pUC ori
Not I
HIS4
Xho I
Digesto com
XhoI e NotI
Liberao do gene
CHYMb com Xho I e
Not I
Xho I
Not I
CHYMb
T4 DNA ligase
Bgl II
5' AOX1
Hind III
amp
pBR322
Xho I
CHYMb
pPIC9 - CHYM
Bgl II
Not I
9.1 kb
3' AOX
Hind III
Hind III
HIS4
Digesto com Bgl II para
liberar cassete de expresso
5' AOX1
Bgl II
CHYMb
3' AOX
Bgl II
48
6. RESULTADOS
5148 pb
2027 pb
1584 pb
1375 pb
947 pb
49
6. RESULTADOS
5kb
2,5 kb
50
6. RESULTADOS
5' AOX1
Bgl II
pUC ori
amp
BstB I
S
PGK
pBR322
CYC1 (TT)
CHYMb
pPZ-Amy
pPIC9 - CHYM
6.0 kb
Zeocina
Not I
3' AOX1 (TT)
9.1 kb
3' AOX
BstB I
BstB I
AOX1 (TT)
c-myc
Not I
AMY
HIS4
Digesto com
BstB I e Not I
Liberao do gene
CHYMb e do
peptdeo sinal com
BstB I e e Not I
BstB I
Not I
CHYMb
T4 DNA ligase
pUC ori
Xho I
PGK
KpnI
CYC1 (TT)
pPZ-CHYM
Xho I
5.9 kb
Zeocina
Xba I (1825)
BamH I
AOX1 (TT)
c-myc
CHYMb
Xba I
Not I
BstB I
BamH I
Xho I
51
6. RESULTADOS
enzimas que foram usadas para clonagem do gene, BstB I e Not I (Figura 8B). Todas as
anlises confirmaram a presena do inserto assim como a integridade do vetor.
52
6. RESULTADOS
purificado. Para confirmar a ligao do promotor, o vetor foi digerido com as enzimas
utilizadas para a clonagem, BstB I e Bgl II, e com Kpn I. Os fragmentos esperados eram,
de 2,0 e 2,6 kb, na primeira digesto, e 3357 pb e 1303 pb, na segunda (Figura 9). As
anlises de restrio comprovaram a presena do promotor PGK1 no vetor e a
integridade do mesmo. Para a transformao, o vetor foi linearizado com a enzima Sac I
que cliva dentro do promotor PGK1.
3675 pb
2323 pb
1929 pb
1371 pb
1264 pb
53
6. RESULTADOS
(X33), evitando assim, a necessidade de adio de histidina ao meio de cultura para
crescimento da clula. Devido presena do gene Sh ble que confere resistncia a
zeocina, a seleo dos transformantes com o vetor pPZ-CHYM foi feita pela
capacidade de crescimento em meio mnimo contendo zeocina. Os controles negativos
(vetores sem o gene CHYMb) tambm foram utilizados para transformar as mesmas
linhagens de P. pastoris.
54
6. RESULTADOS
Tabela 4. Resultado do screening em frasco dos clones A3, A6, A14 e A56.
0h
24 h
48 h
72 h
96 h
C-
A3
5 min
5 min
2 min
2 min
A6
30 min
10 min
10 min
A14
10 min
5 min
5 min
2 min
A56
50 min
20 min
10 min
24 h
48 h
72 h
96 h
C-
P1
5 min
2 min
2 min
2 min
P3
7 min
4 min
2 min
2 min
P28
7 min
4 min
2 min
2 min
55
6. RESULTADOS
Em contraste, mas como esperado, o crescimento do clone P1 em glicose foi
rpido, e foi detectada alta atividade de coagulao do leite no sobrenadante da cultura
do clone P1 logo nas primeiras 24 horas (25 U.mL-1). A atividade se manteve alta
durante todo o experimento, atingindo o mximo aps 72 horas de crescimento (66,66
U.mL-1) e conservando essa atividade at 96 horas. Foi observado tambm que, a partir
de 72 horas de cultura, a quimosina presente no sobrenadante provavelmente j se
apresentava em sua forma processada uma vez que no foi necessrio o processo de
ativao em baixo pH para se observar atividade enzimtica. O crescimento do clone P1
e do controle negativo foi similar, no entanto no foi detectada atividade de coagulao
do leite no sobrenadante do controle negativo.
Em um segundo experimento de comparao entre os clones A3 e P1, adicionouse glicose cultura do clone P1 para uma concentrao final de 2 %, a cada 24 horas de
cultura, assim como metanol cultura do clone A3 (Figura 11 A e B). Nesse
experimento foi observado que o crescimento celular e a produo da protena
heterloga, nos dois casos, permaneceram com o mesmo perfil, no entanto, a atividade
encontrada no sobrenadante do clone P1 foi ainda mais alta (aps 72 e 96 horas) do que
a encontrada na cultura do clone A3. Aps 72 horas de cultura, a atividade encontrada
foi de 100 U.mL-1.
56
6. RESULTADOS
A
Curva de crescimento AOX/PGK
45
40
OD 600
35
30
C- (AOX)
25
A3 (AOX)
20
C- (PGK)
15
P1(PGK)
10
5
0
0
24
48
72
96
120
B
Teste de Coagulao
Atividade U.mL-1
120
105
90
C- (AOX)
75
60
A3 (AOX)
C- (PGK)
45
30
P1(PGK)
15
0
0
24
48
72
96
120
Figura 10. Cultura em frasco dos clones A3, P1 e controles negativos (C-). A) Curva
de crescimento. B) Curva de atividade (U.mL-1) do sobrenadante das culturas at 96
horas de crescimento.
57
6. RESULTADOS
OD 600
C- (AOX)
A3 (AOX)
C- (PGK)
P1(PGK)
24
48
72
96
120
B
Teste de Coagulao
120
A tivid ad e U .m L -1
105
90
C- (AOX)
75
A3 (AOX)
60
C- (PGK)
45
P1(PGK)
30
15
0
0
24
48
72
96
120
Figura 11. Cultura em frasco dos clones A3, P1 e controles negativos (C-) com
adio de glicose, durante o experimento, cultura do clone P1. A) Curva de
crescimento. B) Curva de atividade (U.mL-1) do sobrenadante das culturas at 96 horas
de crescimento.
58
6. RESULTADOS
Figura 12. Ensaio de atividade em placa de agarose e leite. Sobrenadante ativado das
culturas dos clones A3 e P1 (2 e 3, respectivamente) e seus controles negativos (1 e 4).
Os halos de hidrlise compreendem as regies escuras. Os dois ltimos halos
correspondem aos controles positivos utilizando a enzima recombinante comercial
Hannilase.
6. RESULTADOS
Figura 13. Anlise do perfil protico do sobrenadante das culturas dos clones A3 e
P1 em gel SDS-PAGE 12,5% corado com Coomassie blue. C-) Sobrenadantes dos
controles negativos aps 96 horas de cultura; 1-2) Sobrenadantes das culturas aps 72 e
96 horas de cultura, respectivamente; M) Marcador Prestained Protein Marker, Broad
Range. As setas indicam a posio da banda de ~36 kDa.
60
6. RESULTADOS
presena de sinal de tamanho correspondente ao cassete de expresso no poo com seu
DNA genmico. Foi observado tambm que o clone controle, assim como o A3,
mantiveram o gene AOX1 selvagem (bandas de 2,4 kb e 1,7 kb), provavelmente devido
a ocorrncia de evento de crossover simples (integrao por insero) na regio 5AOX1
ou 3AOX1. Ainda, a hibridizao com a sonda permitiu identificar que houve dupla
integrao do cassete de expresso no genoma do clone A3. Para estimar o nmero de
cpias integradas, foi comparada a intensidade das bandas correspondentes ao cassete
de integrao (banda de ~6,7 kb) com a banda correspondente ao locus HIS4 (banda de
2,7 kb), que apresenta apenas uma cpia no genoma de P. pastoris atravs do programa
Scion Image. A anlise do mapa de restrio do DNA genmico descrito na literatura
refora a veracidade dos resultados obtidos, tanto no que se refere ao tamanho dos
fragmentos de hibridao quanto ao nmero deles.
Figura 14. Southern blotting com DNA genmico de P. pastoris clone A3. A: Gel de
agarose 0,8 % com o DNA total digerido com Bgl II. 1) 1) Marcador Eco/Hind, 2)
DNA do clone negativo, 3) DNA do clone A3, 4) sonda purificada (cassete de
integrao contendo o gene CHYMb clonado no vetor pPIC9) (controle positivo). B:
Southern blotting do gel mostrado em A.
61
6. RESULTADOS
6.6 Southern blotting do clone P1
Figura 15. Southern blotting com DNA genmico de P. pastoris clone P1. A: Gel de
agarose 0,8 % com o DNA total digerido com Bgl II da linhagem de P. pastoris X33
nativa (1), do controle negativo (2) e do clone P3 (3). No poo 1 o Marcador
Eco/Hind e, no 4 e 5 as sondas utilizadas como controle positivo. B e C: Membrana do
Southern blotting marcada com as sondas CHYM e PGK, respectivamente.
62
6. RESULTADOS
6.7 Estimativa do nmero de cpias integradas do cassete de expresso no DNA
genmico do clone P1
63
6. RESULTADOS
Foi realizado um planejamento experimental para a otimizao do meio de
cultivo do clone A3 para aumentar a produo enzimtica. Aps a realizao de uma
etapa inicial para escolha da melhor fonte de nitrognio entre uria e YNB (fonte de
nitrognio padro nos experimentos de fermentao de P. pastoris), em que no foi
observado diferenas significativas na densidade celular nem na atividade enzimtica,
foi realizado um planejamento fatorial 23 variando a densidade celular inicial (OD600),
concentrao de metanol e concentrao da fonte de nitrognio, para analisar a
influncia de cada fator, e a interao entre eles, na produo da enzima. A varivel
resposta foi a atividade enzimtica em 72 horas de induo. Nesses experimentos o
YNB foi substitudo pela uria como fonte de nitrognio por esta ltima ter menor
custo. A Tabela 6 apresenta os resultados das atividades enzimticas obtidas em cada
experimento.
Tabela 6. Resultado do planejamento fatorial completo (23).
Experimento
% Fonte de
Nitrognio
Atividade
% Metanol
OD 600 inicial
enzimtica
(U.mL-1)
4,02
10
100
1.34
10
100
4,02
0,5
10
1.34
0,5
10
10
4,02
13,3
1.34
4,02
0,5
40
1.34
0,5
100
2.85
0,75
5,5
40
10
2.85
0,75
5,5
40
11
2.85
0,75
5,5
50
6. RESULTADOS
densidade celular inicial vs % metanol apresentou significncia estatstica (p-level <
0,05), mostrando que s com o aumento de ambos fatores, a atividade enzimtica pode
ser aumentada. O modelo estatstico apresentou um ajuste adequado aos resultados
experimentais, j que o modelo explica 96,26 % (R2) da variao dos dados.
Tabela 7. Anlise de varincia (ANOVA) para a atividade enzimtica (U.ml-1).
Soma dos
Graus de
Mdia
Quadrados
Liberdade
Quadrtica
% Nitrognio (1)
401.8613
401.8613
2.786061 0.170411
% Metanol (2)
500.8613
500.8613
3.472417 0.135858
401.8613
401.8613
2.786061 0.170411
1e2
867.3613
867.3613
6.013322 0.070278
1e3
168.3613
168.3613
1.16723 0.340761
2e3
12537.36
12537.36
86.92018 0.000737
Erro
576.9598
144.2399
Total
15454.63
10
F0
65
6. RESULTADOS
Tabela 8. Resultados da combinao das fontes de nitrognio e carbono.
Fonte de
Fora ativa
Nitrognio
(48 horas)
Glicose
Farelo de soja
18,0
Glicose
(NH4)2SO4
<3
Glicose
Uria
<3
Glicerol
Farelo de soja
71,0
Glicerol
(NH4)2SO4
<3
Glicerol
Uria
<3
Acar invertido
Farelo de soja
115,0
Acar invertido
(NH4)2SO4
<3
Acar invertido
Uria
<3
Experimentos
Fonte de Carbono
Farelo de soja
Fora ativa
(% p/v)
(% p/v)
(24 horas)
1,4
37,1
1,4
46,0
5,6
47,2
5,6
76,4
2,8
56,0
2,8
54,4
2,8
47,7
Experimentos
Foi determinado pela anlise de varincia, para a fora ativa da enzima como
varivel resposta (Tabela 10), que os dois fatores (concentrao da fonte de nitrognio e
66
6. RESULTADOS
concentrao da fonte de carbono) apresentaram significncia estatstica (p-level <
0,05), mostrando que com o aumento destes, a varivel resposta tambm aumentada.
Na anlise de varincia, o modelo estatstico apresentou um ajuste adequado aos
resultados experimentais, j que o modelo explica 95,57 % (R2) da variao dos dados.
Graus de
Mdia
Quadrados
Liberdade
Quadrtica
F0
Acar (1)
362.9025
362.9025
26.82796
0.013969
Farelo (2)
410.0625
410.0625
30.31432
0.011795
1e2
103.0225
103.0225
7.61605
0.070169
Erro
40.5811
13.5270
Total
916.5686
67
6. RESULTADOS
Como pode ser observado, a atividade enzimtica teve seu pico entre 34 e 37
horas de induo, com atividade de 250 U.mL-1, 2,5 maior do que o mximo encontrado
na cultura em frasco em 96 horas de induo em condies otimizadas. Aps esse pico
ocorreu uma queda na atividade enzimtica, sem no entanto diminuio na densidade
celular. Ao final do cultivo a fim de tentar recuperar a atividade, o pH foi elevado para
6,0 e o fluxo de metanol foi novamente aumentado. Conseguiu-se um aumento da
atividade durante certo perodo, mas que no se manteve por muito tempo.
Metanol
10
90
30
Temperatura RC
pH
DO (%)
40
60
UEU.ml-1
4
20
20
metanol
pH
40
DO
10
0
200
150
100
50
0
0
100
10
60
50
seco
80
80
70
250
XPeso
12
80
60
40
20
0
0
20
40
60
80
100
Tempo (horas)
68
Glicerol
100
U.mL-1
Atividade enzimatica (U/mL)
14
100
6. RESULTADOS
provavelmente, em funo do baixo pH do meio (entre 5 e 5,5) em que foi realizado o
cultivo. A partir de 34 horas de induo, foi observado no sobrenadante da cultura
bandas menores que 30 kDa, e que podem corresponder a produtos de degradao das
proteases produzidas por P. pastoris.
6 12 15 22 28 31 M 34 37 43 46 52 55 69 73
horas
(1)
(2)
(3)
6. RESULTADOS
no grfico de atividade enzimtica, entre 24 e 48 horas de fermentao, a produo
enzimtica se manteve alta e em nveis quase constantes. Aps 43 horas de cultura, no
entanto, foi observada queda na atividade.
Resultados no biorreator
Atividade quimosina
250
200
150
100
50
0
0
10
20
30
40
50
60
70
Tempo (h)
70
6. RESULTADOS
4.5
4
1000
3.5
800
OD a 280 nm
U.mL-1
2.5
600
2
U/m L
OD a 280nm
400
1.5
1
200
0.5
0
0
1
11
16
21
26
31
36
41
46
51
56
61
66
71
76
81
86
91
Nmero da Frao
71
6. RESULTADOS
Quimosina
72
6. RESULTADOS
kDa
Quimosina
glicosilada
35
Quimosina
PNGase F
25
18.4
73
6. RESULTADOS
H2O
M
kDa
Hannilase
3
CHYMb
66.2
45
35
25
18.4
14.4
recombinantes
purificadas
apresentam
uma
nica
espcie
protica
74
6. RESULTADOS
Quimosina
75
7. DISCUSSO
7. DISCUSSO
Para promover a coagulao do leite no processo de fabricao do queijo, a
quimosina de Bos taurus a enzima de preferncia devido sua baixa atividade
proteoltica e especificidade sobre a casena . Por causa dos problemas encontrados
para a extrao da quimosina de bezerros, como o alto custo e a contaminao das
preparaes com outras enzimas que diminuem o rendimento da produo, diversos
microrganismos modificados geneticamente contendo o gene que codifica para a
quimosina bovina vm sendo desenvolvidos. Atualmente, apenas trs empresas
internacionais comercializam essas enzimas recombinantes. No Brasil, existe somente a
produo de quimosina extrada de bezerros, a enzima recombinante importada. Para
satisfazer demanda nacional, o principal objetivo deste estudo foi desenvolver, por
meio de tcnicas de Engenharia Gentica, uma linhagem de levedura capaz de expressar
quimosina e que possa ter aplicao comercial em laticnios para a fabricao de queijo.
7. DISCUSSO
expresso do gene da fitase cida de Aspergillus niger, em que o gene foi sintetizado
com cdon preferencial de P. pastoris e foi observado um aumento de 14,5 vezes na
expresso da enzima comparado com a expresso do gene nativo (Xiong et al., 2005).
Os vetores de expresso construdos neste trabalho (pPIC9-CHYM e pPZCHYM) foram utilizados para a transformao de P. pastoris. Os dois sistemas de
transformao mostraram-se muito eficientes gerando vrios transformantes. Os clones
resultantes da transformao com o vetor pPIC9-CHYM variaram quanto produo da
enzima, havendo transformantes (26 %) em que no foi possvel se detectar qualquer
atividade de coagulao do leite. Isto provavelmente se deve ausncia do vetor de
expresso em alguns transformantes His+ e parece ser decorrente de eventos de
recombinao gnica do gene HIS4 presente no vetor e o alelo his4 no genoma de P.
77
7. DISCUSSO
pastoris (Cregg et al., 2000). Este fato foi comprovado no presente trabalho aps um
experimento de Southern blotting que revelou a ausncia do cassete de expresso em
um dos clones His+ que no tinham atividade de quimosina (dado no mostrado). Estes
eventos podem esclarecer o fentipo de 10-50 % de colnias transformantes His+ que
no apresentam atividade enzimtica (Cregg et al., 2001). J a produo de nveis
variados da enzima nos clones transformantes com o mesmo cassete de expresso
consistente com o uso de vetores integrativos e ao fato de que os diversos eventos de
recombinao que governam a integrao genmica das construes recombinantes
podem tambm afetar os nveis de expresso heterloga e levar a variao clonal
(Gerasimova & Crces, 2001). Neste caso, a integrao de DNA exgeno pode ocorrer
em mltiplas inseres e em diferentes loci (AOX1 ou HIS4), devido organizao da
cromatina nos stios de integrao (Gerasimova & Corces, 2001).
Embora tenha havido estas variaes na transformao com o vetor pPIC9CHYM, o mesmo no foi observado com os transformantes com o vetor pPZ-CHYM.
Todos os clones analisados selecionados em placa com zeocina apresentaram atividade,
com baixa variao nos nveis de expresso. Este fentipo pode indicar que haja uma
limitao com relao aos eventos de integrao no locus PGK1. A ausncia de
seqncias que possam promover converses com alelos endgenos tambm contribui
para a ausncia de falsos positivos. Podemos presumir, pois, que no houve mltiplas
integraes do cassete de expresso, ou que o nmero de integraes, neste caso, no
afeta a quantidade de protena expressa. No foi observado qualquer atividade
enzimtica no sobrenadante dos controles negativos mostrando que a atividade de
coagulao do leite produzida pelos transformantes devido unicamente expresso do
gene CHYMb. Alm disto, estes resultados mostram que a enzima secretada no meio
funcionalmente ativa.
7. DISCUSSO
do clone A3 ocorreu por insero no locus AOX1, pois as bandas correspondentes a este
locus foram reveladas na membrana do Southern blotting indicando que no houve
substituio do gene AOX1 (Figura 14). No caso do clone P1, a comparao do perfil de
bandas observado no experimento de Southern blotting entre o clone transformado e a
linhagem X33 de P. pastoris (Figura 15), consistente com a integrao por insero do
cassete de expresso no locus PGK1 como j observado para os vetores de P. pastoris
baseados no promotor GAP (Sears et al., 1998). A Figura 25 mostra um modelo para a
integrao no locus GAP que poderia se aplicar no caso de integrao por insero no
locus PGK1. A integrao por substituio no locus PGK1 possivelmente evitaria o
crescimento da levedura uma vez que o gene PGK1 essencial e est presente em
apenas uma cpia no genoma de P. pastoris (Almeida et al., 2005). A Figura 26 mostra
esquematicamente o provvel perfil de integrao dos vetores pPZ-CHYM (clone P1)
e pPGKZ (C-) e que pde ser confirmado pelo Southern blotting (Figura 15).
79
7. DISCUSSO
X33
Bgl II
Bgl II
Bgl II
pPGK
PGK
5000 pb
3000 pb
P1
Bgl II
Kpn I
pPGK
3000
Bgl II
pPGK
1000
CHYMb
1000
1100 400
Kpn I
pUC ori
pPGK
1000
900
1000
Bgl II
Bgl II
pPGK
PGK
1000 30
2030
7691
CBgl II
Bgl II
Sac I
pPGK pPGK t
3000
Z
2849
1000
6849
pUC ori
Sac I
pPGK
pPGK
1825
1000
Bgl II
Bgl II
PGK
30
2855
80
7. DISCUSSO
vezes superior nas ltimas horas de cultivos analisadas. A melhor produo do clone A3
(96 horas de induo) foi atingida pelo clone P1 em apenas 48 horas de crescimento.
Em trabalho semelhante realizado por Vassileva et al. (2001), comparando o promotor
AOX1 com o promotor constitutivo GAP, tambm foi observado a produo de altos
nveis de expresso do clone com o promotor constitutivo logo no incio, permanecendo
em nveis constantes durante todo o experimento. O clone AOX, neste caso, atingiu
nveis similares apenas aps 3-4 dias de induo com metanol. Em outro trabalho, no
entanto, analisando os mesmos promotores para expresso do gene da lipase B de
Candida antarctica em P. pastoris, observou-se que a expresso desta protena em
frascos foi maior quando utilizado o promotor GAP, no entanto na fermentao em
biorreator, o promotor AOX1 promoveu maior expresso da protena (Wittrup et al.,
2007). provvel que, se a cultura do clone A3 tivesse sido estendida por mais horas,
os nveis proticos do clone A3 atingissem os mesmos nveis de produo do clone P1,
j que a cultura ainda estava em crescimento e reportado em diversos trabalhos que,
para a produo de protenas recombinantes usando o promotor AOX1, o tempo
requerido para atingir o pico de produo enzimtica geralmente muito longo (120240 horas) (Kuwae et al., 2005; Fang et al., 2007).
Foi observado no decorrer da cultura do clone P1 que a pr-quimosina era autoprocessada, no sendo necessria a etapa de ativao antes do ensaio de coagulao do
leite. A partir de 72 horas praticamente toda a enzima encontrada no sobrenadante
estava na sua forma ativa (~36 kDa). Isso j fora observado quando a pr-quimosina foi
expressa em P. pastoris (Espinosa et al., 1999) assim como em outros microrganismos
(Ward et al., 1990; Cullen et al., 1987). Esta auto-ativao est provavelmente
relacionada queda do pH (4) observada durante o cultivo em frasco. Todavia, no
podemos excluir a possibilidade da clivagem da pr-quimosina por uma protease
secretada de P. pastoris. Alm disso, o sobrenadante da cultura do clone P1 apresentouse menos contaminado com as protenas endgenas de P. pastoris que o sobrenadante
do clone A3, sendo a quimosina a principal protena secretada para o meio (Figura 13).
O crescimento em metanol foi acompanhado pela secreo de diversas outras protenas
alm da pr-quimosina, o que poderia dificultar o processo de purificao.
7. DISCUSSO
fermentao uma etapa fundamental para aplicao industrial. A otimizao feita,
tradicionalmente, variando-se um fator e mantendo os outros constantes. No entanto,
esta abordagem consome mais tempo e incapaz de detectar o melhor meio devido,
principalmente, ausncia da anlise de interaes entre os fatores (Damaso et al.,
2004). Uma das estratgias mais utilizadas para identificar a significncia relativa dos
fatores e encontrar as condies timas baseada em experimentos estatsticos, como os
planejamentos fatoriais. Na otimizao da cultura do clone A3 foram variados a
concentrao de metanol, a densidade celular inicial e a fonte de nitrognio, descritos
como fatores importantes na expresso protica em P. pastoris (Macauley-Patrick et al.,
2005). Como pode ser observado pelas anlises estatsticas (Tabela 7), o nico fator
realmente importante para o aumento da atividade enzimtica, dentro da faixa analisada,
foi a interao entre os fatores densidade celular inicial e concentrao de metanol. S
com o aumento de ambos os fatores que a atividade pode ser aumentada. Enquanto
que em outros microrganismos o principal impacto no crescimento e custo das culturas
geralmente a fonte de nitrognio (Damaso et al., 2004), neste caso podemos reduzir
este fator sem ter queda na produo da protena. possvel que a utilizao de altas
concentraes de metanol em culturas com baixa densidade celular pode levar a um
efeito txico para o desenvolvimento da levedura ou afetar a estabilidade da protena.
Por outro lado, o emprego de altas densidades celulares com baixa concentrao de
metanol pode no ser suficiente para promover uma expresso significativa do gene da
pr-quimosina. Damaso et al. (2004), analisando a expresso de -1,4-xilanase em P.
pastoris e otimizando a expresso atravs de um planejamento fatorial 23 com as
mesmas variveis, concluram que a densidade celular inicial era o fator mais
importante para aumentar a produo da enzima. Neste caso, no houve influncia do
metanol ou da fonte de nitrognio na produo. Hong et al. (2004) observaram que
concentraes elevadas de metanol foram danosas para a expresso heterloga de
lacase, enquanto que concentraes elevadas de metanol aumentaram os nveis de
expresso de -2-glicoprotena-I humana (Daly & Hearn, 2005). A acumulao do
metanol pode ter efeitos negativos no crescimento celular, e conduzir a menores nveis
de expresso da protena. Conseqentemente, o nvel timo de metanol necessita ser
avaliado para cada protena especfica. Os experimentos realizados no presente trabalho
so apenas estudos preliminares, havendo a necessidade de se estender os nveis dos
parmetros analisados e alterar as variveis para se chegar a um meio timo de induo
que promova maiores nveis proticos.
82
7. DISCUSSO
7. DISCUSSO
presena de bandas menores que 30 kDa a partir de 34 horas de induo e que,
provavelmente, correspondem a bandas de degradao pela ao de proteases
produzidas pela P. pastoris (Moralejo et al., 2000). Alguns ajustes podem ser feitos para
tentar evitar essa degradao, como a adio de alguns compostos ao meio de cultivo,
como casoaminocidos, peptona, extrato de levedura, assim como a modificao de
alguns parmetros, como temperatura e pH (Macauley-Patrick et al., 2005).
7. DISCUSSO
estmago de bezerros) foi possvel perceber uma grande diferena na pureza das
solues quando comparada com as enzimas recombinantes. Esses extratos apresentam
diversas outras protenas na soluo o que pode afetar a qualidade dos queijos pela ao
de outras proteases.
85
7. DISCUSSO
secretada por P. pastoris e uma enzima comercial demonstraram que houve apenas
ligeiras modificaes quanto s propriedades bioqumicas da enzima.
86
8. CONCLUSES e
PERSPECTIVAS
8. CONCLUSES E PERSPECTIVAS
Utilizando-se o gene sinttico CHYMb com otimizao dos cdons foi possvel
a expresso de quimosina B bovina funcional e especfica para a casena do leite em
P. pastoris. No conjunto, os resultados deste projeto mostram que a levedura P. pastoris
pode ser usada como plataforma gentica para a produo de quimosina B
recombinante.
87
9. REFERNCIAS
Dissertao
de
mestrado,
Departamento
de
Biologia
Celular,
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100
10. ANEXOS
BstB I
(Invitrogen).
Bgl II (2)
PstI (242)
pUC ori
EcoRI (474)
NdeI (747)
XhoI (828)
PGK
EcoRV (4984)
KpnI (1009)
CYC1 (TT)
XhoI (1262)
pPZ-Amy
SmaI (4636)
6.0 kb
PvuII (1493)
Zeocina
BamHI (4061)
BstB I (2001)
PvuII (3946)
AOX1 (TT)
S
XhoI (2252)
c-myc
EcoRI (2276)
NotI (3642)
Not I
DraI (3295)
DraI (3024)
AMY
5' AOX1
amp
pBR322
3' AOX
XhoI (1193)
pPIC9--Amy
AMY
AMY
11.5 kb
HIS4
NotI (4736)
24.1(
20.6(
15.6(
31.5(
1963)
1675)
1265)
2562)
UCU 24.4(
UCC 16.5(
UCA 15.2(
UCG 7.4(
1983)
1344)
1234)
598)
UAU 16.0(
UAC 18.1(
UAA 0.8(
UAG 0.5(
1300)
1473)
69)
40)
UGU 7.7(
UGC 4.4(
UGA 0.3(
UGG 10.3(
626)
356)
27)
834)
CUU 15.9(
CUC 7.6(
CUA 10.7(
CUG 14.9(
1289)
620)
873)
1215)
CCU 15.8(
CCC 6.8(
CCA 18.9(
CCG 3.9(
1282)
553)
1540)
320)
CAU 11.8(
CAC 9.1(
CAA 25.4(
CAG 16.3(
960)
737)
2069)
1323)
CGU
CGC
CGA
CGG
6.9(
2.2(
4.2(
1.9(
564)
175)
340)
158)
AUU
AUC
AUA
AUG
31.1(
19.4(
11.1(
18.7(
2532)
1580)
906)
1517)
ACU 22.4(
ACC 14.5(
ACA 13.8(
ACG 6.0(
1820)
1175)
1118)
491)
AAU
AAC
AAA
AAG
25.1(
26.7(
29.9(
33.8(
2038)
2168)
2433)
2748)
AGU 12.5(
AGC 7.6(
AGA 20.1(
AGG 6.6(
1020)
621)
1634)
539)
GUU 26.9(
GUC 14.9(
GUA 9.9(
GUG 12.3(
2188)
1210)
804)
998)
GCU 28.9(
GCC 16.6(
GCA 15.1(
GCG 3.9(
2351)
1348)
1228)
314)
GAU
GAC
GAA
GAG
35.7(
25.9(
37.4(
29.0(
2899)
2103)
3043)
2360)
GGU 25.5(
GGC 8.1(
GGA 19.1(
GGG 5.8(
2075)
655)
1550)
468)
Coding GC 42.73 % 1st letter GC 48.72 % 2nd letter GC 37.32 % 3rd letter GC 42.16 %