Laboratorio: RT-PCR Curva Estndar y Expresin Gentica

Introduccin
Dentro de los mtodos ms ampliamente utilizados para anlisis y cuantificacin de secuencias de
transcritos podemos citar: northern blot, hibridacin in situ, ensayos de proteccin con RNAsas y RT-PCR
cuantitativa. La principal limitante de estos mtodos (excluyendo RT-PCR) es su baja sensibilidad, el
tiempo empleado y mltiple manipulacin de las muestras adems de ser mtodos muy laboriosos. RTPCR, es uno de los mtodos ms sensibles y flexibles actualmente disponibles, y puede ser utilizada para
comparar niveles de mRNAs en muestras de distintas poblaciones, para caracterizar patrones de
expresin, discriminar entre mRNAs estrechamente relacionados. La especificidad, sensibilidad y
reproducibilidad son las caractersticas ms importantes de esta tcnica y altamente deseables en las
aplicaciones previamente mencionadas. El RT-PCR combinado con los nuevos sistemas automticos para
la purificacin de cidos nuclecos, ofrece una mejor tcnica para la cuantificacin de los genes bajo
estudio. Esta tcnica tiene como ventajas la facilidad de empleo, la mayor rapidez o el menor riesgo de
contaminacin, el RT-PCR, ir reemplazando el PCR convencional y se aplicara a mas usos en los
laboratorios.
En el RT-PCR, los procesos de amplificacin y deteccin se producen de manera simultnea en el mismo
vial cerrado, sin necesidad de ninguna accin posterior. Adems, mediante deteccin por fluorescencia
se puede medir durante la amplificacin la cantidad de DNA sintetizado en cada momento, ya que la
emisin de fluorescencia producida en la reaccin es proporcional a la cantidad de DNA formado. Esto
permite conocer y registrar en todo momento la cintica de la reaccin de amplificacin.
Los termocicladores para llevar a cabo la reaccin de RT-PCR incorporan un lector de fluorescencia y
estn diseados para poder medir, en cualquier momento, la fluorescencia emitida en cada uno de los
viales donde se realice la amplificacin. Los sistemas de deteccin por fluorescencia empleados en el RTPCR pueden ser de dos tipos: agentes intercalantes y sondas especficas marcadas con fluorocromos.
Actualmente los agentes reporteros utilizados para ensayos de tiempo real son SYBR green, que igual
que el bromuro de etidio es un intercalante de bases de DNA y las sondas TaqMan que son fragmentos
de DNA especficos que tienen unida una molcula de fluorocromo y un apagador. Durante la reaccin
de PCR, al generarse una nueva molcula de DNA, esta inmediatamente incorpora SYBR green, que al
intercalarse y ser excitado mediante una fuente luminosa, genera fluorescencia, que es detectada por el
sistema ptico de los diferentes equipos de RT-PCR. Debido a que el SYBR