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DNA
recombinante
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Captulo
19
Alimentos transgnicos
NGEL GIL HERNNDEZ
DANIEL RAMN VIDAL
Objetivos
nicos.
n Comprender los procedimientos utilizados para la clonacin de animales.
n Conocer el protocolo que debe seguirse para solicitar la comercializacin de los nuevos
alimentos.
n Conocer las aplicaciones de las normas vigentes sobre el etiquetado y la trazabilidad de
C
T T
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DNA
recombinante
A
A
A
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C
Contenido
n INTRODUCCIN
T
T
G
T
n CONCEPTO Y CLASIFICACIN
n DNA RECOMBINANTE E INGENIERA
GENTICA
n Clonado molecular
n COMERCIALIZACIN DE ORGANISMOS
n Enzimas de restriccin
n Ligado de fragmentos de DNA
n Otras enzimas de inters en la tecnologa del DNA
recombinante
n Vectores de clonacin
n Seleccin del DNA recombinante
MODIFICADOS GENTICAMENTE
O DE PRODUCTOS QUE LOS CONTENGAN
n Solicitud de autorizacin de comercializacin
de un alimento transgnico en el mbito comunitario
Dictamen de la Autoridad
Autorizacin
n Libreras genmicas
n Tcnicas de visualizacin y cuantificacin
de fragmentos de cidos nucleicos
n APLICACIONES DE LA INGENIERA
GENTICA EN LA PRODUCCIN
DE ALIMENTOS
n Agricultura: plantas transgnicas
Obtencin de plantas transgnicas
Aplicaciones de la ingeniera gentica
en agricultura
n SITUACIN LEGISLATIVA
DE LOS ALIMENTOS MODIFICADOS
GENTICAMENTE EN ESTADOS UNIDOS
Y LTIMOS AVANCES
EN LA UNIN EUROPEA
n LEGISLACIN RELEVANTE
SOBRE ORGANISMOS MODIFICADOS
GENTICAMENTE
n RESUMEN
n BIBLIOGRAFA
n SITIOS WEB DE INTERS
Alimentos transgnicos
n INTRODUCCIN
Los organismos modificados genticamente (OMG)
pueden definirse como organismos en los cuales el material
gentico, formado por el cido desoxirribonucleico (DNA),
ha sido alterado de un modo artificial mediante el uso de la
denominada tecnologa del DNA recombinante o ingeniera
gentica. Esta tcnica permite aislar genes de cualquier organismo vivo donador, seleccionarlos y transferirlos a otro
organismo de una especie receptora que en la escala filogentica puede estar relacionada o distante de la donadora. En
los pases hispanoparlantes los OMG tambin se denominan
organismos transgnicos.
Desde hace ms de tres dcadas se han desarrollado
nuevos microorganismos, plantas y animales mediante
estas tcnicas genticas, las que han permitido crear nuevos alimentos con distintas propiedades. As, se han desarrollado nuevas variedades de plantas con resistencia a
insectos, virus o herbicidas, leguminosas con contenido
mejorado de algn aminocido o cereales con un mayor
valor biolgico de sus protenas. Tambin se han creado
plantas de cuyas semillas se obtienen aceites con composicin nutricional mejorada u otras cuyos frutos presentan
un retraso en la maduracin o tienen mejorada su textura
o color. Por otra parte, se han generado nuevos microorganismos que pueden producir aditivos alimentarios, como
colorantes y edulcorantes ms eficaces, y se han obtenido
microorganismos modificados tiles en los procesos fermentativos destinados a la produccin de alimentos. Estas
nuevas cepas de bacterias lcticas, levaduras y hongos filamentosos posibilitan el desarrollo de nuevos productos
o la prevencin de problemas industriales, al estar limitada
su infeccin por virus, especialmente en el caso de las bacterias lcticas. Aunque el desarrollo de animales modificados genticamente es ms difcil y plantea mayores
problemas ticos, tambin se han desarrollado razas transgnicas para producir peces de mayor tamao, mejorar la
composicin de la carne y de la leche en los mamferos o
aumentar la calidad de la lana, as como para producir protenas con fines teraputicos. Por otra parte, la clonacin
de animales de granja es un hecho y, aunque es un proceso an muy complejo no exento de riesgos, en el futuro
podr permitir mayores producciones de alimentos con
mejor calidad.
Todos estos alimentos transgnicos han de pasar un proceso de evaluacin complejo antes de llegar al consumidor.
Dicho proceso incluye el estudio de la mejora gentica introducida (caractersticas del organismo donante y del receptor, sitio de insercin, patrn de expresin del gen transgnico y consecuencias potenciales de la modificacin), la
seguridad alimentaria del alimento (caractersticas nutricionales, composicin e inocuidad, toxicidad y alergenicidad
posibles, cambios potenciales en la ingesta e impacto nutricional a largo plazo) y el potencial impacto en el medio ambiente. Adems, desde el 18 de abril de 2004 la nueva regulacin sobre trazabilidad y etiquetado de los OMG es de
obligado cumplimiento en todos los estados miembros de la
CAPTULO
19
n CONCEPTO Y CLASIFICACIN
Los alimentos transgnicos, tambin llamados alimentos
modificados genticamente, son los diseados para cubrir
cualquier necesidad de mejora en los que se ha incorporado
material gentico distinto del original mediante tcnicas de
ingeniera gentica. Segn el derecho alimentario, se considera que se ha creado un nuevo alimento cuando: a) se trata
de una materia prima nueva, b) es el resultado del uso de una
nueva tecnologa de fabricacin o de tratamiento, o c) se establece un nuevo uso a un producto ya existente. Al respecto,
los alimentos obtenidos por modificacin gentica se consideran nuevos alimentos por pertenecer a una nueva tecnologa de fabricacin. De hecho, el Reglamento (CE) n. 258/97
del Parlamento Europeo y del Consejo clasifica los nuevos alimentos en seis categoras, quedando los alimentos transgnicos incluidos en dos de ellas. Por un lado, la categora que
considera nuevo alimento o nuevo ingrediente alimentario al
que contenga OMG o que consista en dichos organismos, por
ejemplo, un yogur producido con bacterias de cido lctico
modificadas genticamente o una lechuga transgnica. Por
otro, la categora que comprende a los alimentos que contengan ingredientes alimentarios producidos a partir de OMG,
por ejemplo, una galleta que contenga harina de maz proveniente de una variedad de maz transgnico.
Histricamente, en la normativa jurdica de la Unin Europea, la definicin de OMG ha tenido un tratamiento especial. As, la Recomendacin de la Comisin de 29 de julio de
1997 realizaba una clasificacin cientfica de los nuevos alimentos con miras a la evaluacin de su salubridad, en la
cual aparecan seis clases de nuevos alimentos, quedando
los alimentos modificados genticamente encuadrados en
tres de ellas, denominadas clases 3, 4 y 5, correspondientes
respectivamente a vegetales, animales y microorganismos
modificados genticamente y sus productos. En las tres
clases se incluan dos subclases relativas a organismos receptores con historial de uso como alimento en la Comunidad en condiciones de preparacin e ingesta comparables
o sin dicho historial de uso.
TOMO
II
Alimentos transgnicos
n Clonado molecular
Un clon es una poblacin de molculas, bacterias, clulas o individuos idnticos que derivan de un ancestro
comn. El clonado molecular permite la produccin de gran
nmero de molculas idnticas de DNA. Esta tcnica se
basa en la posibilidad de construir molculas de DNA hbrido
o molculas quimricas utilizando vectores de clonado,
como plsmidos, fagos, csmidos o cromosomas artificiales,
que se pueden replicar de forma autnoma en una clula
hospedadora utilizando sus propios sistemas de control. De
esta manera se puede amplificar el DNA quimrico.
Cualquier procedimiento de clonacin tiene cuatro partes
esenciales: a) un mtodo de obtencin de fragmentos de
DNA; b) la unin del DNA a un vector, con la consiguiente obtencin del DNA recombinante; c) la introduccin del DNA recombinante en un hospedador, y d) la disponibilidad de un
mtodo de seleccin del clon que ha adquirido el DNA recombinante. La figura 19-1 ilustra el procedimiento general
de obtencin de DNA recombinante y la figura 19-2, el de
clonado de DNA.
Para la obtencin de fragmentos de DNA se utiliza preferentemente la digestin con enzimas de restriccin (v. Enzimas de restriccin, ms adelante), pero tambin se pueden
obtener por rotura mecnica, sntesis de cDNA y sntesis qumica directa de oligonucletidos. La unin al vector (v. Vectores de clonacin, ms adelante) se lleva a cabo mediante la
ligacin de extremos cohesivos, la ligacin de extremos
romos, el encolado mediante homopolmeros o el empleo de
molculas espaciadoras, utilizando varias enzimas (v. Ligado
de fragmentos de DNA y Otras enzimas de inters en la tecnologa del DNA recombinante, ms adelante).
La introduccin del DNA recombinante se lleva cabo mediante procedimientos de transformacin bacteriana con
DNA plasmdico, transduccin con fagos o csmidos y, en
el caso de clulas eucariotas, mediante transformacin o
CAPTULO
19
transfeccin con vectores diversos (v. Vectores de clonacin, ms adelante). La seleccin de los clones se realiza
mediante mtodos microbiolgicos, inmunoqumicos y de
hibridacin con cidos nucleicos
n Enzimas de restriccin
Las endonucleasas son enzimas que cortan el DNA en secuencias especficas dentro de la molcula, en oposicin a
las exonucleasas, que digieren los extremos terminales de
las molculas de DNA. Un tipo de endonucleasas, denominadas genricamente enzimas de restriccin porque su presencia en una bacteria determinada restringe el crecimiento
de bacterifagos, representa una herramienta clave en la tecnologa del DNA recombinante. Estas enzimas cortan el DNA
de cualquier origen en secuencias muy especficas, al contrario que otras enzimas o mtodos qumicos o fsicos que lo
hacen al azar. En la naturaleza protegen a la bacteria hospedadora de la infeccin por fagos, impidiendo la replicacin del
DNA forneo. Actualmente se conocen miles de estas enzimas, as como la secuencia especfica de corte. Las enzimas
de restriccin estn acompaadas en las clulas de otras enzimas que metilan el DNA del hospedador, lo que impide la digestin por la propia enzima de restriccin. As, las metilasas
especficas de sitio y las enzimas de restriccin siempre estn
en las bacterias de forma apareada.
Las enzimas de restriccin se denominan mediante varias letras que hacen mencin a la bacteria de la que proceden. Las tres primeras letras sirven para nombrar el gnero
(primera letra) y la especie (segunda y tercera letras). Estas
pueden ir seguidas de una letra que designa la cepa y de un
nmero romano que indica el orden del descubrimiento. Por
ejemplo, EcoRI se ha obtenido de la cepa R de la bacteria Escherichia coli, y BamHI, de la cepa H de Bacillus amyloliquefaciens. La enzima EcoRII se obtuvo despus de la EcoRI
(tabla 19-1).
Cada enzima de restriccin corta una secuencia especfica de DNA de doble cadena de 4 a 7 pares de bases (pb),
dando lugar a la aparicin de extremos romos, como es el
caso de EcoRII o HpaI o de extremos solapantes o cohesivos,
por ejemplo BamHI. La figura 19-3 muestra el mecanismo de
accin de la enzima de restriccin EcoRI. Teniendo en cuenta
que el DNA est constituido por cuatro bases diferentes (A, C,
G y T), una enzima de restriccin que reconoce una secuencia
de 4pb corta una media de cada 4 4 pb (256pb) y una que reconoce una secuencia de 6pb corta cada 46 pb (4.096pb). Por
lo tanto, se puede elaborar en una determinada secuencia o
fragmento de DNA un mapa de restriccin utilizando varias
enzimas. Los fragmentos producidos pueden separarse y, posteriormente, aislarse por electroforesis en gel de agarosa o
poliacrilamida, siendo ste un paso esencial para la clonacin.
TOMO
II
DNA vector
DNA enteros
DNA digeridos
Ligacin
Productos
de la mezcla
de ambos DNA
con T4 DNA ligasa
Molcula
recombinante
Figura 19-1. Obtencin de DNA recombinante. T4 DNA ligasa: DNA ligasa procedente del bacterifago T4.
enzima DNA ligasa une los fragmentos complementarios de
los DNA heterlogos, dando lugar a la formacin de una molcula de DNA recombinante (fig. 19-4). Sin embargo, los extremos de un vector pueden reconectarse por s mismos des-
pus del tratamiento con una enzima de restriccin. Asimismo, tambin pueden aparearse formando concatmeros
heterogneos. Para solventar estos problemas se usan diluciones extremas de los fragmentos. En el caso de molculas
In vitro
Escherichia coli K12
portadora del vector
In vivo
Escherichia coli K12
para transformar
Clulas
competentes
1
Purificacin
rificaci
del DNA
4
sformac
Transformacin
2
Digestin
gestin
5
3
igacin
Ligacin
cin de clones
Seleccin
transformantes
6
n de cl
Deteccin
clones
recombinantes
Alimentos transgnicos
BamHI
Secuencia
de corte
AGATCT
TCTAGA
19
Sitio de reconocimiento
CAPTULO
Fuente bacteriana
G-A-A-T-T-C
C-T-T-A-A-G
Bacillus
amyloliquefaciens H
BgIII
C-T-T-A-A
Bacillus globigii
AGATCT
TCTAGA
EcoRI
3
5
EcoRI
GAATTC
CTTAAG
EcoRII
A-A-T-T-C
Colas complementarias
G A A T T C
G A A T T C
C T T A A G
C T T A A G
CCTGG
GGACC
HindIII
Haemophilus influenzae Rd
Generacin de
extremos cohesivos
AAGCTT
TTCGAA
HhaI
Haemophilus haemoliticus
GCGC
CGCG
A A T T C
G
C T T A A
Extremo cohesivo
HpaI
GTTAAC
CAATTG
Haemophilus
parainfluenzae
MstII
Microcoleus strain
CCTNAGG
GGANTCC
G A A T T C
PstI
C T T A A G
CTGCAG
GACGTC
TaqI
TCGA
AGTC
con extremos romos se aaden nuevas colas de polinucletidos a los extremos 3. Esta enzima se denomina transferasa
terminal. Por ejemplo, si se aade poli-dG al extremo 3 de un
vector y poli-dC al extremo 3 del DNA, se aparearn entre s.
Este procedimiento se denomina encolado homopolimrico.
Tambin se pueden unir segmentos sintticos de DNA de
doble cadena con extremos romos, que contienen uno o ms
sitios especficos para enzimas de restriccin, denominados
DNA recombinante
Figura 19-3. Mecanismo de accin de la enzima de restriccin EcoRI y su aplicacin en la generacin de molculas de DNA recombinante.
espaciadores o polilinkers, a los extremos del DNA de cualquier
fragmento utilizando la DNA ligasa procedente del bacterifago T4. Esta tcnica permite unir cualquier par de extremos,
aunque no existe control de la orientacin de la insercin o del
nmero de molculas apareadas consigo mismas.
TOMO
II
G-A-A-T-T-C
G-A-A-T-T-C
C-T-T-A-A-G
C-T-T-A-A-G
C-T-T-A-A
A-A-T-T-C
Hibridacin de fragmentos
complementarios
Hueco
G A-A-T-T-C
C-T-T-A-A G
Hueco
DNA ligasa
G- A - A - T - T - C
C - T - T - A - A -G
n Vectores de clonacin
8
Los vectores de clonacin son plsmidos o fagos o variaciones de ellos. Los plsmidos son molculas de DNA de
doble cadena circulares cuya funcin natural ms importante es conferir ventajas adaptativas a las clulas que los
contienen. Los plsmidos tienen varias propiedades que
hacen que sean muy tiles como vectores de clonado. Por
ejemplo, estn presentes en las bacterias como copias nicas o mltiples que se replican independientemente del
DNA bacteriano. Actualmente se conoce la secuencia completa de numerosos plsmidos, as como la localizacin precisa de los sitios de corte para diferentes enzimas de restriccin y, por lo tanto, los lugares en los que es posible insertar
DNA de otros organismos. Adems, los plsmidos, al tener
un tamao muy distinto al del cromosoma bacteriano,
pueden aislarse con facilidad. La figura 19-5 muestra el
mapa de restriccin del plsmido pBR322 de E. coli, y la figura 19-6, la insercin de DNA extrao en un plsmido.
Los fagos son virus que atacan bacterias y estn constituidos usualmente por molculas de DNA lineal, con varios
sitios de corte para enzimas de restriccin especficas en
los cuales puede insertarse el DNA forneo, de forma que el
conjunto se empaqueta en la cabeza proteica del virus. El
DNA quimrico formado puede recogerse despus de que
se complete el ciclo de lisis celular, de modo que se produzcan numerosas partculas infectivas. La ventaja de los
fagos como vectores en el clonado molecular de DNA es
que pueden aceptar fragmentos de DNA de 10-20 kpb,
mientras que los plsmidos tan slo pueden aceptar fragmentos de 6-10kpb.
Los csmidos son plsmidos que contienen unas secuencias especficas, denominadas cos, necesarias para el empaquetamiento del DNA del fago l dentro de su cabeza. Estos
plsmidos combinan las ventajas de los propios plsmidos y
de los fagos, ya que crecen dentro de la bacteria como pls-
Alimentos transgnicos
CAPTULO
19
Ampr
Tetr
PstI
SalI
Sal
pBR322
4,4 kb
Pequeas molculas
de DNA autorreplicativas
(plsmidos o genomas
fgicos)
ColE1ori
Figura 19-5. Caractersticas de los vectores de clonacin. Se representa el plsmido pBR322 de E. coli que contiene un origen
de replicacin, varios sitios de restriccin nicos (EcoRI, HindIII, SalI) y dos marcadores de resistencia a antibiticos (ampicilina y tetraciclina). Amp: ampicilina; Tet: tetraciclina.
Coleccin Tratado de Nutricin 2010. Editorial Mdica Panamericana
TOMO
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EcoRI
Plsmido
EcoRI
A A T T
C
T T A A
C
G
EcoRI
G A AT T C
TTC
G AA
EcoRI
CT T AA G
Extremos
cohesivos
EcoRI
CT T AA G
EcoRI
Recombinacin
y ligacin de DNA
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DNA
recombinante
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C
n Libreras genmicas
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recombinantes que constituyen el genoma global se denomina genoteca o librera genmica. De forma similar, una librera de cDNA comprende todos los cDNA complementarios de la poblacin de mRNA presentes en un organismo o
tejido determinado.
Las libreras genmicas se preparan por digestin parcial del DNA genmico utilizando una enzima de restriccin,
con objeto de generar fragmentos suficientemente largos
de DNA de manera que contengan genes completos intactos. Estos fragmentos se reinsertan en vectores que permiten la insercin de fragmentos largos de DNA como los
YAC o los vectores basados en el bacterifago P1 de E. coli.
Para detectar la funcin de genes presentes en el cDNA
de las libreras genmicas se utilizan vectores de expresin,
algunos de ellos con genes que codifican para inhibidores
de proteasas, con lo que la produccin de la protena final
aumenta.
Las sondas marcadas con 32P o con una molcula fluorescente se utilizan para reconocer secuencias complemen-