Clasificacion Fenotipica de Mycobacterias PDF

Manual de Procedimientos
Clasificacin fenotpica
de las micobacterias
Dra. Amelia Bernardelli

Referente en Paratuberculosis
Referente en Tuberculosis Bovina
OIE - Organizacin Mundial de Sanidad Animal
Referente en Tuberculosis Animal del Mercosur
Direccin de Laboratorio y Control Tcnico

Ciudad Autnoma de Buenos Aires
Ao 2007
SENASA
Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria
Av. Paseo Coln 367 C1063ACD
Ciudad Autnoma de Buenos Aires - Repblica Argentina.
Tel. (054) (011) 4121-5000
website: http://www.senasa.gov.ar
Edicin:
Coordinacin de Prensa y Comunicaciones Institucionales
Area de Diseo Grfico.
Fotografas de interior: Jos Huerga.
Marzo de 2007.
Autoridades del SENASA
Dr. Jorge Nstor Amaya

Presidente
Ing. Carlos Casamiquela
Vicepresidente
Autoridades de la
Lic. Vernica Torres Leedham

Directora de Laboratorio y Control Tcnico
Dr. Ramn Sanguinetti
Coordinador de Bacteriologa, Parasitologa, Patologa y Zooterpicos
Manual de Procedimientos / Clasificacin fenotpica de las micobacterias
Mi agradecimiento:
al Dr. Bernardo Alonso y al Sr. Julio Tinao,
por su inestimable colaboracin.
A mis hijos: Hernn Pablo y Javier Gonzalo,
por su infinita solidaridad.
Indice
Introduccin ......................................................................................................................... 7
Identificacin fenotpica ........................................................................................................ 9
Protocolo de identificacin bioqumica ............................................................................... 10
1. Temperatura de crecimiento ........................................................................................... 10
2. Produccin de pigmento ................................................................................................ 10
3. Reacciones bioqumicas ................................................................................................ 12
a. Produccin de niacina .................................................................................................... 12
b. Reduccin de nitratos .................................................................................................... 14
c. Actividad de catalasa ..................................................................................................... 15
c1. Catalasa semicuantitativa ............................................................................................. 16
c2. Catalasa cualitativa a 68C ........................................................................................... 17
c3. Mtodo a temperatura ambiente o de la gota. ............................................................. 17
d. Hidrlisis de Tween 80 ................................................................................................... 18
e. Mtodo de Arilsulfatasa .................................................................................................. 19
f. Toma de hierro. ............................................................................................................... 20
g. Reduccin del telurito. ................................................................................................... 21
h. Mtodo de la ureasa. ..................................................................................................... 22
i. Presencia de la fosfatasa cida. ...................................................................................... 22
j. Prueba de la pirazinamidasa. .......................................................................................... 23
k. Prueba de la -galactosidasa. ....................................................................................... 24
l. Inositol, Manitol o Citrato. ................................................................................................ 25
4. Crecimiento en presencia de drogas .............................................................................. 26
- Hidracida del cido 2-Tiofeno carboxlico (TCH)
- Cloruro de sodio
- Acido p-nitrobenzoico
- Acido pcrico
- Hidroxilamina (HA)
- Isoniacida (INH)
5. Plaqueo para el control de pureza en agar Dubos o Middlebrook 7H10 ........................ 29
6. Referencias .................................................................................................................... 30
7. Anexo. Formulaciones .................................................................................................... 33
8. Diagramas de flujo ......................................................................................................... 47
A. Clasificacin inicial de Micobacterias No Tuberculosas (NTM) de acuerdo con
el tiempo de crecimiento / produccin de pigmento.
B. No cromgenas - Lento crecimiento. Catalasa e Hidrlisis de Tween positiva.
C. Crecimiento lento. Catalasa y Nitrato reduccin negativa.
D. Crecimiento lento. Fotocromgena.
E. Crecimiento lento. Escotocromgena.

F. Crecimiento rpido. No cromgena.
9 . Ta b l a s .
N 1. Identificacin de Micobacterias No Tuberculosas (NTM).
N 2. Identificacin de Micobacterias No Tuberculosas (NTM). Rpido crecimiento.
N 3. Especies de lento crecimiento.
N 4. Especies de rpido crecimiento.
10. Fotos.
I n t ro d u c c i n
La tuberculosis es una enfermedad de importancia global.

Una tercera parte de la poblacin mundial ha sido infectada por el Mycobacterium tuberculosis y ocho millones de nuevos casos se producen en cada ao.
Un incremento importante en el nmero se ha detectado por la presencia del sndrome de
inmunodeficiencia adquirida (SIDA).
La tuberculosis mata 2 millones de personas por ao, por lo cual los anlisis diagnsticos son
relevantes para aminorar su transmisin.
Por otro lado, Mycobacterium bovis, que produce la enfermedad en el bovino, puede tambin infectar a una amplia variedad de especies y ello nos hace reconocerla como una zoonosis clsica, al considerarla como una infeccin que es transmisible naturalmente entre los
animales y el ser humano.
El examen mediante la coloracin de Ziehl-Neelsen es rpido y econmico, pero siguen siendo
los cultivos bacteriolgicos los que proveen el resultado definitivo.
Dependiendo de los medios de cultivo y las tcnicas de decontaminacin utilizadas es posible incrementar entre 30% a 50 % los hallazgos de la clnica.
Los aislamientos proveen el material necesario para realizar las tipificaciones y las tcnicas de
sensibilidad a las drogas, por ello se debern estandarizar las metodologas, con el fin de lograr la armoni zacin de los resultados.
Clasificacin fenotpica de las micobacterias
Identificacin fenotpica
La denominacin de tuberculosis comprende a la producida por el complejo Mycobacterium
tuberculosis integrado por: M. bovis, M. africanum, M. microti, M. caprae, M. canetti y M. pinnipedii.
Otro nmero de micobacterias denominadas No Tuberculosas (NTM) han sido clasificadas por
Runyon en cuatro grupos de acuerdo con su velocidad de crecimiento y produccin de pigmento en la oscuridad o por exposicin a la luz.
Grupo I: Lento crecimiento Fotocromgenas
Crecimiento abundante de los cultivos que producen pigmentos: cristales amarillos de caroteno, por exposicin a la luz, pero que no lo generan en la oscuridad.
El desarrollo de las colonias se produce entre 2 a 6 semanas.
Ej.: M. kansasii, M. xenopi, M. marinum, M. simiae.
Grupo II: Lento crecimiento-Escotocromgenas
Los organismos desarrollan un pigmento amarillo brillante, en la luz y en la oscuridad.
Algunas cepas de M. scrofulaceum intensifican su coloracin por exposicin a la luz.
El desarrollo de las colonias se produce entre 2 a 6 semanas.
Ej.: M. xenopi, M. gordonae, M. flavescens, M. scrofulaceum, M. szulgai.
Grupo III: Lento crecimiento - No fotocromgenas
Incluye un nmero de especies que producen una pequea cantidad de pigmento amarillo
plido. Expuestas a la luz brillante no intensifican su coloracin.
La mayora presentan coloracin crema. El crecimiento es sumamente lento.
Ej.: Complejo M. avium-intracellulare, M. terrae, M. triviale, M. celatum, M. shimodei, M. gastri, M. malmoense, M. nonchromogenicum.
Grupo IV: Rpido crecimiento
Mientras que un grupo de las especies producen pigmento amarillo, otras no lo poseen: M.
fortuitum y M. chelonae.
El desarrollo de las colonias se produce entre 2 a 7 das.

Ej.: M. abscessus, M. mucogenicum, M. phlei, M. smegmatis, M. vaccae, M. peregrinum, M.
parafortuitum, M. chelonae, M. fortuitum.
P ro t o c o l o d e i d e n t i f i c a c i n b i o q u m i c a
1 . Te m p e r a t u r a d e c r e c i m i e n t o
Desarrollo a 25 C, 37 C y 45 C.
Diferentes especies con distinto significado clnico muestran variacin en el tiempo de crecimiento y la habilidad de desarrollarse a variadas temperaturas.
Medios y Reactivos
Para la determinacin de la temperatura de crecimiento se utiliza un medio de cultivo no selectivo el que se distribuye en tubos en pico de flauta o mejor en cajas de Petri donde es posible
observar detenidamente el desarrollo de las colonias y la posible contaminacin.
Se usan los medios de Lwestein-Jensen, Stonebrink, Middlebrook 7H10 7H11.
2. Produccin de pigmento
Medios y Reactivos
Se procede con medios de cultivo no inhibitorios. No se usan medios de cultivo selectivo o bien
conteniendo antimicrobianos ya que pueden interferir en la formacin del pigmento.
Lwestein-Jensen es el ms frecuentemente utilizado.
Procedimiento para el desarrollo de 1) y 2)
Preparacin del inculo
Cultivar en un medio lquido (7-10 das) o bien en una suspensin de colonias de un medio
slido en una solucin salina o en un medio lquido, con turbidez que no debe sobrepasar el
patrn turbidomtrico de Mac Farland 0.5 para obtener un crecimiento moderado, de modo
tal que la produccin de pigmento pueda ser observada.
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Inocular tres tubos con medio de Lwestein-Jensen y uno con Stonebrink.

Tubo N 1: dejar sin cubrir a 37 C.
Tubo N 2: cubierto con papel negro u hoja de aluminio, colocar a 37 C.
Tubo N 3: cubierto con papel negro u hoja de aluminio, colocar a 25 C.
Interpretacin
Cuando se controla el crecimiento en el Tubo N 1, observar tambin el desarrollo en los Tubos N 2 y N 3, los cuales estn creciendo en la oscuridad y anotar los resultados:
- Si las colonias en los Tubos N 2 y N 3 estn pigmentadas: escotocromgenas.
- Si las colonias en el tubo N 1 no estn pigmentadas, descubrir la mitad de los tubos N 2
y N 3 de manera tal que una parte del cultivo est expuesta a la luz y la otra mitad est
cubierta.
Los tubos deben ser ubicados debajo de una lmpara de 60 W o de luz blanca a una distancia de 20 a 25 cm, por un perodo de 3 a 5 horas.
Cubrir los tubos totalmente otra vez y observar la produccin de pigmentos a las 24, 48 y 72
horas y comparar las colonias expuestas a la luz con las que permanecieron en la oscuridad.
- Crecimiento de colonias no pigmentadas en los Tubos N 1, 2 y 3: no cromgenas.
- Crecimiento de las colonias pigmentadas en los tubos N 1 y N 2: escotocromgenas.
- Crecimiento de las colonias en la parte del tubo N 2 expuesta a la luz: fotocromgenas.
- Crecimiento de colonias pigmentadas en la parte del tubo N 3 expuesta a la luz: fotocromgena a 25 C (M. szulgai es escotocromgena a 37 C y fotocromgena a 25 C).
Controles
M. gordonae: escotocromgena.
M. kansasii: fotocromgena.
M. fortuitum: no cromgena.
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3. Reacciones bioqumicas
a. Produccin de niacina
La niacina (cido nicotnico) juega un papel vital en las reacciones de oxidacin-reduccin que
ocurren durante los procesos metablicos de todas las micobacterias.
A pesar de que todas estas bacterias producen niacina, estudios comparativos han demostrado de que en ocasiones est bloqueado el camino metablico. debido a la accin de una
enzima que transforma la niacina libre en niacina -ribonucletido.
M. tuberculosis acumula grandes cantidades de cido nicotnico y su determinaccin es utilizada como diagnstico definitivo. Son escasas las cepas de M. tuberculosis, niacina negativa, mientras que algunas otras especies de micobacterias pueden ser niacina positiva.
Medios y Reactivos
1 - Solucin acuosa de bromuro de ciangeno al 10 % y bencidina o anilina al 4 %.
2 - Alternativa: Tiras de papel reactivas comercial (BBLTM TaxoTM).
Lwestein-Jensen es el medio de cultivo recomendado.
Es muy importante la aireacin para la formacin de niacina. Aflojar las tapas durante el perodo de incubacin.
Procedimiento
1-- Agregar 1 mL de agua destilada a un cultivo de 3 a 4 semanas en el medio de LwesteinJensen, se necesita un desarrollo mnimo de 50 colonias. Cortar la superficie del medio con
una esptula para extraer la niacina. Colocar los tubos en forma horizontal para que la superficie del mismo est en contacto con el agua. Incubar por 15 a 30 minutos. Colocar el tubo
en posicin vertical durante 5 minutos para permitir que el fluido se ubique en el fondo del
tubo. Extraer 0.5 mL del mismo y colocar en un tubo limpio con tapa y agregar 0.5 mL de
solucin de bencidina o anilina y 0.5 mL de bromuro de ciangeno. Cerrar los tubos y observar en la solucin la formacin de color (resultado positivo) dentro de los 5 minutos que aparece como un anillo en la interfase de los dos reactivos, al agitar el tubo la coloracin pasa a
toda la columna del lquido.
Agregar a cada tubo 2 a 3 mL de Hidrxido de sodio al 4 % y descartar.
Si se utiliza la tira de papel con el reactivo impregnado, se deben colocar el extracto acuoso del cultivo y la tira en el tubo a rosca cerrado hermticamente.
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La reaccin consiste en la evolucin del bromuro de ciangeno de la parte superior de la tira

con la niacina ubicada en el fondo del tubo.
Interpretacin
Color amarillo, con la tira comercial.
Color prpura, con la solucin de bromuro de ciangeno bencidina.
Color amarillo, con la solucin de bromuro de ciangeno-anilina.
M. tuberculosis, M. simiae, ocasionalmente, algunas cepas de M. marinum y M. chelonae as
como un nmero de cepas de M. bovis, han perdido esta enzima y la niacina, soluble en agua
es acumulada en el medio de cultivo.
Un resultado negativo se observa cuando existe insuficiente cantidad de cultivo, para aumentar
la masa bacteriana, realizar una reincubacin adicional de 2 a 4 semanas y controlar la aparicin de por lo menos 50 colonias.
Asimismo se puede producir resultado negativo cuando el crecimiento bacteriano cubre por
completo la superficie del medio de cultivo, por ello es necesario romper la masa de colonias
para lograr liberar la niacina.
Controles
Mycobacterium tuberculosis: positivo.
Mycobacterium intracellulare: negativo.
2--Las tiras de papel reactivas permiten idntica determinacin de la niacina, se evitan la preparacin y almacenamiento de reactivos txicos, pero su costo es mayor.
Procedimiento
Realizar los pasos similares indicados para la tcnica anterior con los reactivos lquidos, hasta colocar 0.5 mL del extracto fluido en el tubo limpio, insertar la tira con la identificacin en
la parte inferior y cerrar inmediatamente el tubo. Dejar a temperatura ambiente durante 15 a
20 minutos. Ocasionalmente agitar.
Observar el color del lquido en el fondo del tubo (amarillo: positivo) contra una base blanca,
descartar si la tira tiene este color como propio, ello puede ocurrir por oxidacin qumica especialmente en la parte superior de la tira.
Neutralizar las tiras con hidrxido de sodio al 10%.
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b. Reduccin de nitratos
La presencia de la enzima nitratoreductasa es importante para la clasificacin de las micobacterias: M. tuberculosis, M. kansasii, M. szulgai, M. fortuitum las que reducen nitratos a
nitritos. Otras especies producen tambin nitratoreductasa tales como: M. flavescens, M.
terrae, M. triviale y M. chelonae.
Las micobacterias que contienen esta enzima pueden utilizar el oxgeno de los nitratos y de
otros productos de reduccin. La reaccin qumica es:
NO3 + 2
NO2 + H2O
La presencia de nitrito es detectada por la adicin de sulfanilamida y N-naftiletilendiamina a

pH cido.
Si el nitrito est presente se forma un compuesto rojo de diazonio.
La tcnica se efecta en cultivos de menos de un mes.
Medios y Reactivos
Buffer substrato de nitrato de sodio, cido clorhdrico al 10 %, solucin de sulfanilamida al 0.2
%, solucin de N-naftiletilendiamina al 0.1%.
Procedimiento
La reaccin se realiza en tubos de 16 mm x 125 mm con tapa rosca, a los que se agregan 4
5 gotas de agua destilada, luego se introduce con un anza aproximadamente 10 mg de masa
bacilar, tratando de homogeinizar la mezcla. El substrato lo constituyen 2 mL de la solucin
de nitrato de sodio en buffer de fosfato. Se incuba la suspensin 2 horas a 37 C.
Al cabo de ese tiempo, acidificar con una gota de cido clorhdrico dilucin 10 %. Agregar 2
gotas de solucin de sulfanilamida y 2 gotas de solucin de N-naftiletilendiamina.
Interpretacin
El desarrollo de color se produce entre 30 a 60 segundos. Si no se produce color se confirma el resultado como negativo por el agregado de pequea cantidad de polvo de zinc. Si el
color rojo desarrolla despus del agregado de zinc, significa que el nitrato est todava presente y es catalizado por el zinc con formacin del color, por lo cual la reaccin es verdaderamente negativa. Si el color no se produce despus del agregado de zinc, repetir la tcnica
para confirmar la reaccin.
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Por estas razones el mtodo no es altamente reproducible entre laboratorios y es conveniente

utilizar una escala de color estndar.
El problema entre las divergencias del mtodo se ha producido con M. szulgai, sobre el cual
algunos informes lo han reportado nitratoreductasa negativo.
Rosado plido: +/Rosado claro: 1+
Rosado intenso: 2+
Rojo:3+
Rojo intenso: 4+
Rojo prpura: 5+
Solamente son considerados positivos: 3+ y 5+.
Controles
M. tuberculosis H37: fuertemente positivo.
M. kansasii: dbilmente positivo.
M. intracellulare: negativo.
c. Actividad de catalasa
La mayora de las micobacterias producen la enzima catalasa, algunas ms que otras, la determinacin se puede realizar por tres tcnicas:
1- La catalasa semicuantitativa, indica el nivel de produccin de la enzima.
2- Prdida de la actividad a 68 C y pH.
3- Mtodo a temperatura ambiente o de la gota: realizado en ocasiones para una determinacin cualitativa rpida de catalasa.
Los organismos productores de esta enzima tienen la habilidad de descomponer el perxido
de hidrgeno en agua y oxgeno libre.
+2
+22
La reaccin en las micobacterias difiere de la utilizada en otros tipos de bacterias, por el empleo de perxido de hidrgeno al 30 % y una solucin concentrada de detergente: Tween 80
15
al 10 %, el cual ayuda a dispersar la masa bacteriana hidrofbica, hasta bacilos separados

individualmente, maximizando la determinacin de la enzima.
c1. Catalasa Semicuantitativa
Medios y Reactivos
- Agua oxigenada 110 volmenes (solucin de perxido de hidrgeno al 30 %). Debe conservarse en heladera.
- Solucin acuosa de Tween 80 al 10 %. En el momento de usar calentar ligeramente para
obtener una mejor disolucin, mantener en heladera.
Procedimiento
Distribuir 5 mL de medio de Lwestein-Jensen en tubos estriles de 18 mm x 150 mm con
tapa rosca.
Coagular el medio con los tubos en posicin vertical, lo cual puede efectuarse colocando los
tubos en un bao de agua termorregulado a 85 C, durante 40 minutos.
Inocular la superficie del medio con 0.1 mL de la suspensin bacilar en agua destilada incubar 2 semanas a 37 C.
Observar al cabo de ese tiempo que exista un buen desarrollo bacteriano.
Mezclar partes iguales de perxido de hidrgeno y solucin de Tween 80.
Mantener a temperatura ambiente.
Agregar 1.0 mL de la mezcla de soluciones Tween-perxido de hidrgeno al tubo de cultivo.
Dejar el tubo en posicin vertical durante 5 minutos.
Interpretacin
Medir en milmetros la altura de la columna de burbujas sobre la superficie del medio.
Menor de 31 mm: negativa muy dbil.
Entre 31 y 45 mm: resultado no concluyente.
Ms de 45 mm: catalasa francamente positiva.
Controles
M. terrae: positivo.
M. bovis: negativo.
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c2. Catalasa Cualitativa: a 68 C

Reactivos
Las soluciones de perxido de hidrgeno y Tween descritas para la prueba semicuantitativa.
Solucin reguladora de fosfatos M/15, pH 7
Procedimiento
Distribuir la solucin reguladora, 0.5 mL, en tubos de 12 mm x 100 mm. Agregar en cada uno
de ellos el contenido de un anza cargada de colonias tomada de un cultivo joven en medio a
base de huevo. Colocarlos en bao de agua termorregulado a 68 C durante 20 min. Retirar
y dejar enfriar a temperatura ambiente. Agregar a los tubos una mezcla de la solucin de Tween
y perxido de hidrgeno.
Interpretacin
Observar la formacin de burbujas en la superficie. Esperar 20 minutos antes de informar el
resultado negativo: no se han producido burbujas.
Controles
M. terrae: positivo.
M. tuberculosis: negativo.
c3. Mtodo a temperatura ambiente o de la gota
Procedimiento
Agregar 1 2 gotas de una solucin recientemente preparada de Tween 80-perxido de hidrgeno a las colonias ubicadas en un tubo con medio de cultivo. Observar en 4 a 5 minutos la aparicin de burbujas. En las bacterias fuertemente positivas aparecer rpidamente,
en las dbilmente, ms lentamente y en las negativas se observar la ausencia de burbujas.
Interpretacin
En cada uno de las tcnicas la presencia de catalasa es indicada por las burbujas. El mtodo de la gota es rpido y simple pero provee solamente una idea aproximada de la cantidad
de enzima presente.
La determinacin de catalasa estable a la temperatura es una muy buena ayuda caracterstica de la identificacin de micobacterias no pigmentadas.
La catalasa lbil a la temperatura es caracterstica de: M. tuberculosis, M. bovis, M. gastri, y
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ocasionalmente cepas del complejo M. avium-intracellulare.

El mtodo de catalasa semicuantitativa es utilizado para distinguir cepas que son fuertemente catalasa positiva y otras que la poseen en pequea cantidad y particularmente para la identificacin de M. tuberculosis - INH-resistente que es negativo.
Controles
- M. kansasii: fuertemente positivo, catalasa semicuantitativa y estable al calor.
- M. tuberculosis: H37Rv, ligeramente positivo, catalasa semicuantitativa y lbil al calor.
- M. tuberculosis: INH-resistente es negativo al mtodo de la gota y a la catalasa semicuantitativa.
d. Hidrlisis de Tween 80
La hidrlisis enzimtica del Tween 80 es una importante caracterstica de la diferenciacin de

micobacterias.
Con raras excepciones las especies que hidrolizan el Tween 80 en 10 das no son clnicamente
significativas, por ej. el bacilo del agua de canilla M. gastri, M. terrae y M. triviale, mientras que
las especies que tienen importancia clnica, M. scrofulaceum y el complejo M. avium-intracellulare, son negativas.
El Tween 80 es la marca registrada del detergente: monoloeato de polioxietileno sorbitan.
Medios y Reactivos
Sustrato: Solucin reguladora de buffer fosfato M/15, pH7, Tween 80 y rojo neutro.
Procedimiento
Suspender en el sustrato colonias de un cultivo joven en medio slido (aproximadamente, el
contenido de un anza de 3 mm de dimetro). Incubar a 37 C, sin contacto con la luz. Examinar a los 5 y a los 10 das. Incubar un tubo control sin inculo.
Interpretacin
Observar los tubos, comparativamente con el control de color mbar. Se considera positivo un cambio de color a rosa salmn. Tomar nota de la fecha en que observa ese cambio de color y seguir incubando hasta completar los 10 das para confirmar; el color puede intensificarse a rosado ms intenso y hasta rojo pajizo.
18
Los tubos no deben ser agitados antes de la lectura. Algunas clulas pueden tomar el colorante, lo que provoca un color rosado en el sedimento del tubo, mientras que el sobrenadante
continua mbar; en estos casos el informe es negativo.
Controles
- M. kansasii: rpido, positivo.
- M. gordonae: lento, positivo.
- M. scrofulaceum: negativo.
e. Mtodo de Arilsulfatasa
Miembros del complejo M. fortuitum-chelonae son los nicos que producen suficiente cantidad de enzima para resultar positivos dentro de los 3 das.
Pequeas cantidades son tambin producidas por M. xenopi, M. szulgai M. marinum, M.
kansasii, M. gordonae y miembros del complejo M. avium - intracellulare entre otros.
La reaccin positiva en menos de 3 das ayuda a identificar a las especies de lento crecimiento
y dentro de ellas los resultados son proporcionales a la masa bacteriana.
Esta tcnica es sumamente utilizada para la identificacin del complejo M. avium intracellulare. La arilsulfatasa es una enzima que produce fenolftalena libre del disulfato de fenolftalena sal tripotsica.
Medios y Reactivos
- Sustrato: Solucin 0.08 M de fenolftalena disulfato tripotsico.
- Preparar 200 mL de medio lquido de Dubos. Agregarle 2.5 mL de sustrato a la prueba de
3 das y 7.5 mL para la de 2 semanas. Distribuir estrilmente 2 mL, en tubos de 16 x 125
mm con tapa rosca.
- Solucin de carbonato de sodio 2N.
El mtodo tambin se puede realizar usando una solucin 0.001 M de fenolftalena, sal sdica en el caldo Middlebrook 7H9.
Una cantidad de solucin de disulfato de fenolftalena sal tripotsica 0.003 M ha sido propuesta para detectar pequeas cantidades de la enzima con perodos de incubacin superiores a 14 das.
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Procedimiento
Para cada cepa, colocar 0,1 mL de una suspensin bacilar concentrada de bacterias tomadas de colonias de un cultivo joven. Incubar a 37 C. A los 3 das, agregar en el tubo correspondiente 6 gotas de la solucin de Na2CO3. A las 2 semanas proceder en forma idntica en
el tubo restante.
Colocar un tubo control con sustrato y sin inculo.
Interpretacin
La aparicin de una coloracin roja o rosada en la parte superior del medio seala resultado
positivo indicando la liberacin de fenolftalena libre.
- Cuando el sustrato contiene fenolftalena libre, el tubo control no inoculado puede desarrollar color rojo al agregarle la solucin de carbonato de sodio.
Para resolver el problema hay que recristalizar el sustrato en etanol absoluto, donde la fenolftalena es soluble, en tanto que el disulfato de fenolftalena tripotsico es insoluble.
Controles
- M. fortuitum:: positivo.
- M. avium: negativo.
f. Toma de hierro
Medios y Reactivos
Solucin acuosa de citrato de hierro amoniacal al 4 %, esterilizada en autoclave.
Procedimiento
Inocular 2 tubos de medio Lwenstein-Jensen, cada uno con 0,1 mL de una suspensin
bacilar de aproximadamente 1 mg/mL de la cepa. Colocar los tubos inclinados, difundiendo
la siembra en toda la superficie del medio. Luego en posicin vertical y aadir en el fondo de
uno de ellos 1 mL de la solucin de citrato de hierro amoniacal. En el otro tubo, agregar 1 mL
de agua destilada estril.
Incubar en posicin vertical a 37 C.
20
Interpretacin
De ser la reaccin positiva aparece en el tubo con citrato, entre la primera y la tercera semana de incubacin, un color marrn que se va extendiendo a las colonias por encima del nivel
del lquido. Se compara con el tubo control.
Controles
M. fortuitum: positivo.
M. chelonae: negativo.
g. Reduccin del telurito
Medios y Reactivos
Middlebrook 7H9 distribuir 5 mL en tubos de 18 x 150 mm.
Solucin de Telurito de potasio al 2 %, esterilizada en autoclave.
Procedimiento
Colocar 2.5 ml del medio de cultivo en los tubos con tapa a rosca. Inocular 2 tubos con una
gota de suspensin bacteriana. Incubar a 35-37 C por 7 das (agitar para mejorar el crecimiento). Luego de 7 das agregue 2 gotas de solucin de telurito a los 2 tubos y agitar. Reincubar a 35-37 C (no agitar los tubos durante esta re-incubacin) y observar luego de 3 das.
Si a los 3 das la prueba da negativa, descartar este tubo y observar el segundo tubo re-incubando por 9 das.
Interpretacin
Formacin de un precipitado negro metlico: Positivo.
Tubo control sin inculo: Negativo.
No hay formacin de un precipitado negro: Negativo.
Algunas especies producen un precipitado marrn claro o gris, esto debe considerarse como
negativo.
No agitar los tubos. Observar la coloracin de la masa bacilar depositada en el fondo.
Controles
Complejo M. avium-intracellulare: positivo.
21
Complejo M. terrae: negativo.
h. Mtodo de la ureasa
Determina la capacidad del organismo para desdoblar la urea formando dos molculas de amonaco por accin de la enzima ureasa, que est clasificada como una amidasa, es decir que
cataliza la hidrlisis de las amidas, es capaz de romper la unin entre el carbono y el nitrgeno.
+ 1
XUHDVD
& 2+2+
&2+21+
1+&2
+ 1
Medios y Reactivos
Medio de cultivo, ver Anexo.
Procedimiento
Con el anza, agregar al tubo colonias de un cultivo joven en medio de huevo. No arrastrar
medio de cultivo. Incubar 3 das a 37 C.
Interpretacin
La aparicin de color rosa se interpreta como resultado positivo.
Controles
M. kansasii, M. scrofulaceum:: positivo.
M. avium: negativo.
i. Presencia de la fosfatasa cida
Medios y Reactivos
Ver Anexo.
Procedimiento
Variante1: Colocar dos anzas del cultivo joven de la micobacteria a ser identificada en un tubo
22
que contenga 1.5 mL de agua destilada estril. Agregar 0.5 mL de solucin sustrato difosfato de fenolftalena.
Llevar a 37 C durante 2 horas.
Adicionar 0,1 mL del reactivo revelador Carbonato de sodio 10%.
Variante 2: Utilizacin como sustrato sal magnsica de monofosfato de timolftalena.
Colocar dos anzas del cultivo joven en un tubo que contenga el sustrato. Mezclar bien llevar
a 37 C durante 6 hs.
Adicionar 0.1 mL del reactivo revelador Carbonato de sodio 10 %.
Interpretacin
Variante 1. La aparicin de color rojo indica que la prueba es positiva.
Incoloro o rosado plido indica que la prueba es negativa.
Variante 2. La aparicin de un color azul indica que la prueba es positiva.
La aparicin de color verde, celeste verdoso precipitado azul indica que es negativa.
Controles
M. terrae o M. fortuitum: positivo.
M. tuberculosis: negativo.
j. Prueba de la pirazinamidasa
Las cepas de M. tuberculosis que son sensibles a la pirazinamida poseen la enzima pirazinamidasa que metaboliza la pirazinamida en cido pirazinoico.
Las cepas pirazinamida - resistente han perdido la actividad pirazinamidasa.
Medios y Reactivos
Agar medio de cultivo, ver Anexo.
Solucin de sulfato ferroso al 1 %.
Procedimiento
Cultivar 5 a 10 mg de la masa bacteriana proveniente de un desarrollo joven en medio Lwestein-Jensen, en el medio de agar preparado para el mtodo, incubar a 37 C durante 4 das.
23
Agregar a cada tubo 1 mL de la solucin de sulfato ferroso amoniacal al 1 % y colocar los

tubos en el refrigerador. Luego de 4 horas se examina la presencia de una banda rosada de
difusin de la sal ferrosa.
Interpretacin
Banda rosa en la interfase, indica la hidrlisis de la pirazinamida con formacin de cido pirazinoico.
Controles
M. tuberculosis H37Rv: positivo.
M. bovis, BCG: negativo.
k. Prueba de la -galactosidasa
Se demuestra la presencia o ausencia de la enzima -galactosidasa, por utilizacin del compuesto orgnico: o-nitrofenil--D-galactopiransido (ONPG).
Bacteria + ONPG
(incoloro)
hidrlisis
-galactosidasa
o - nitrofenol
(amarillo)
NO2
OH
CH2OH
OH
hidrlisis
O
NO2
-galactosidasa
OH
OH
(ONPG)
o - nitrofenol
(ONP)
Medios y Reactivos
Medio de Dubos modificado.
Procedimiento
Se inoculan 0,5 mL de una suspensin bacilar de aproximadamente 1 mg/mL, en cada tubo
24
con medio de cultivo. La suspensin bacilar debe prepararse a partir de un cultivo joven. Se
incuba a 37 C, durante 4 a 6 semanas.
Interpretacin
La aparicin de color amarillo indica positivo, debido a la hidrlisis enzimtica del sustrato, con
liberacin de nitrofenol.
Controles
M. chelonae:: positivo.
M. bovis: negativo.
l. Inositol, Manitol Citrato
Utilizacin del carbono para el desarrollo.

Medios y Reactivos
Ver Anexo.
Procedimiento
Utilizar cultivos de 7 das en caldo ADC-Middlebrook 7H9 suspensin de un cultivo en LJensen, preparar diluciones en base 10 en solucin salina estril hasta no observar turbidez.
De la ltima dilucin inocular 0.1 mL en cada tubo con los medios suplementados. Colocar
un tubo de control, sin inocular, por cada medio. Incubar a 37 C, observar a los 14 das.
Interpretacin
Desarrollo en los medios con inositol, manitol citrato: positivo.
No se observa crecimiento: negativo.
Controles
M. smegmatis:: desarrolla en los tres medios.
M. fortuitum: no desarrolla en los tres medios.
25
4. Crecimiento en presencia de drogas

Los agentes qumicos recomendados para pruebas de tipificacin son: Hidracida del cido
2-Tiofeno carboxlico, Cicloserina, Acido p-aminosaliclico, Isoniacida, Estreptomicina, Etambutol y Rifampicina.
Medios y Reactivos
Estas drogas son agregadas en solucin concentrada al medio de Lwenstein-Jensen antes de su coagulacin y en cantidades establecidas para dar las siguientes concentraciones finales:
Hidracida del cido 2-Tiofeno carboxlico: 2 mg/L-1
Cicloserina: 30 mg/L-1
Acido p-aminosaliclico: 0,5 mg/L-1
Isoniacida: 0,2 mg/L-1
Estreptomicina: 4 mg/L-1
Etambutol: 2 mg/L-1
Rifampicina: 40 mg/L-1
El medio de cultivo debe agitarse, luego de la adicin de las drogas, para obtener una buena
dispersin de las mismas.
Procedimiento
Se prepara una suspensin bacilar, de aproximadamente 1 mg/ mL-1, a partir de un cultivo
en medio slido; de esta suspensin madre se realizan diluciones (10-3 y 10-5). Se inoculan
0,1 mL de cada dilucin en 2 tubos de medio sin droga y en otros 2 con droga. Se incuba
durante 4 semanas.
Interpretacin
La lectura se realiza contando el nmero de colonias en cada tubo. Se considera que una cepa
es resistente cuando el desarrollo en el tubo con droga es de 10 % de lo que se observa en
el tubo control.
- Hidracida del cido 2-Tiofeno carboxlico (TCH): 2 mcg/mL.
26
Materiales y Reactivos
Ver Anexo.
Procedimiento
Inocular con una gota de la suspensin bacteriana. Incubar a 35-37 C durante 2-3 semanas.
Interpretacin
Crecimiento en ambos medios (con y sin TCH): Micobacteria resistente al TCH.
Crecimiento solamente en medios sin TCH: Micobacteria sensible al TCH.
Controles
M. triviale: resistente, crecimiento en ambos tubos.
M. bovis: sensible, solamente crecimiento en el tubo control.
- Cloruro de sodio (NaCl): 5 %
Reactivos
Ver Anexo.
Procedimiento
Inocular una suspensin bacilar, de concentracin aproximada igual a 1 mg/mL-1, en agua
destilada, a 2 tubos de Lwenstein-Jensen, uno con NaCl y otro sin agregado. Incubar a 37
C y examinar una vez por semana, durante 28 das.
Interpretacin
En el tubo control normalmente se obtendr desarrollo de colonias incontables. Si, en esas
condiciones, en el tubo con NaCl se observa desarrollo de ms de 50 colonias, se considera
que la cepa es resistente o tolerante al NaCl. Si el desarrollo es menor de 50 colonias se considerar que es sensible.
Controles
M. triviale: resistente, crecimiento en ambos tubos.
M. avium: sensible, crecimiento solamente en el tubo control.
- Acido p-nitrobenzoico: 0.5 mg/mL.
27
Medios y Reactivos
Ver Anexo.
Procedimiento
Inocular una gota de suspensin bacteriana. Incubar 35-37 C durante 2 3 semanas.
Interpretacin
Crecimiento en presencia de PNB: Micobacteria No Tuberculosa (MNT).
Controles
M. fortuitum: resistente.
M. bovis: sensible.
- Acido pcrico: 0.2 %
Ver Anexo.
Procedimiento
Preparar una suspensin de la micobacteria a ser identificada a una concentracin de 1 mg/
mL y sembrar 0,2 mL en un tubo de agar Sauton como control de desarrollo de la micobacteria y 0,2 mL en un tubo de agar Sauton con cido pcrico al 0,2%.
Incubar a 37 C.
Leer observando la aparicin de crecimiento a los 6 das, si es negativo se lee nuevamente a
los mismos tiempos que para deteccin de tiempo de crecimiento.
Interpretacin
En el tubo de agar Sauton debe aparecer crecimiento y en el de agar Sauton con cido pcrico aparecer crecimiento si se trata de micobacterias de rpido crecimiento, mientras que no
habr desarrollo si es una micobacteria de crecimiento lento.
En caso de que no aparezca crecimiento en el tubo control de agar Sauton, repetir la prueba.
Controles
M. tuberculosis: sensible.
28
- Hidroxilamina (HA) 500 mg/mL.

Ver Anexo.
Procedimiento
Inocular una gota de la suspensin bacteriana. Incubar a 37 C durante 2 a 3 semanas.
Controles
M. fortuitum:: resistente.
M. flavescens: sensible.
- Isoniacida (INH) 10 mg/mL.

Ver Anexo.
Preparacin
Inocular una gota de la suspensin bacteriana. Incubar a 37 C durante 2 a 3 semanas.
Controles
M. bovis: sensible.
5. Plaqueo para el control de pureza en agar Dubos o

Middlebrook 7H10
Colocar el medio de cultivo en placas de Petri, dejar solidificar y realizar la inoculacin por el
agregado de 0.1 mL, distribuir homogneamente la suspensin, sellar la placa mediante cinta adhesiva para evitar la evaporacin excesiva. Realizar observacin semanal del desarrollo
para comprobar la aparicin de las colonias de micobacterias y/o contaminantes. Hacer coloracin de Gram y de Ziehl-Neelsen del cultivo.
29
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32
7. Anexo
Formulaciones
Se describen los insumos y metodologa de elaboracin correspondientes a las reacciones
condiciones de desarrollo prescritas.
a. Produccin de niacina
Solucin de anilina 4%
La anilina es oncognica y penetra a travs de la piel, trabajar con guantes y cuidadosamente.
La anilina cambia de color por exposicin al aire y a la luz, preparar solucin fresca cuando
sea necesario.
Anilina, fresca, clara, incolora.......................4 mL
Etanol 95 %...................................................96 mL
Mezclar la anilina con el etanol en una botella color mbar y conservar a oscuras y en la heladera, descartar la solucin si cambia a color amarillo.
Solucin de bromuro de ciangeno 10 %
El bromuro de ciangeno es txico y severo irritante de las mucosas cuando es
inhalado,trabajar en ambiente ventilado cuando se prepara la solucin y en cabina de seguridad biolgica cuando se procede con los cultivos.
En solucin cida el bromuro de ciangeno se hidroliza a cido cianhdrico el que es extremadamente txico Cuando se descartan todos los tubos de la reaccin, agregar previamente una solucin desinfectante alcalina, adicionando hidrxido de sodio.
Bromuro de ciangeno, cristales......................5 g
Agua destilada.................................................50 mL
Colocar los cristales de bromuro de ciangeno con el agua destilada en un vaso de vidrio,tapar
y dejar bajo campana a temperatura ambiente hasta disolucin de los mismos, aproximadamente 24 hs.
No calentar la solucin con mechero Bunsen.
Colocar dentro de un frasco de colocar mbar y mantener en el refrigerador.
33
Calentar a temperatura ambiente para disolver cualquier precipitado formado por el enfriamiento.
Preparar pequeas cantidades porque el bromuro de ciangeno es voltil y pierde potencia
a travs del tiempo. Soluciones dbiles pueden llegar a dar resultado falso-negativo.
En algunas regiones se prepara la solucin acuosa de cianuro de potasio al 4 % y bromo en
la siguiente forma:
Trabajar en una cabina de bioseguridad.
El agua de bromo es altamente corrosiva y voltil y deber mantenerse alejada de otros reactivos qumicos.
El cianuro de potasio es sumamente venenoso.
Abrir una ampolla de bromo (50 mL) en un frasco de vidrio oscuro de 1000 mL de capacidad
con tapn de vidrio,conteniendo 150 mL de agua destilada fra.
Preparar la solucin acuosa de cianuro de potasio al 4 %, disolviendo 4 g de la droga en 100
mL de agua destilada. El cianuro de potasio debe ser puro y no estar hidratado.
Retirar con una pipeta 1 mL de la capa de bromo por debajo de la superficie del agua de bromo
y transferir en el fondo de un frasco erlenmeyer de vidrio de 250 mL, agregar rpidamente,
gota a gota y con mezcla por rotacin, la solucin de cianuro de potasio, hasta total decoloracin de la solucin.
b. Reduccin de Nitrato
- Mtodo clsico con reactivos lquidos
-Sustrato de nitrato de sodio en buffer
Preparar una solucin de nitrato de sodio 0.01M en buffer fosfato 0.022 M, pH7, en la siguiente
forma:
KH2 PO4......................................3.02 g
Agua destilada......................... 1000 mL
Disolver el fosfato de potasio en agua destilada para obtener una solucin 0.022 M
..............Solucin 1.
Na2 HPO4...........................................3.16 g
Agua destilada................................1000 mL
Disolver el fosfato de sodio en agua destilada para obtener una solucin 0.022 M
...............Solucin 2.
34
Agregar 611 mL de la solucin 2 a 389 mL de la solucin 1 y mezclar bien, controlar el

pH7.............Solucin 3.
Preparar el sustrato de nitrato de sodio en buffer en la siguiente forma:
NaNO3 ...............................................0.85 g
Solucin 3.........................................1000 mL
Disolver el nitrato de sodio en el buffer y distribuir en alcuotas de 100 mL
Esterilizar por autoclavado a 121 C durante 15 minutos.
Cuando sea necesario, alicuotar la solucin del substrato en forma asptica en tubos con tapa
esterilizados en cantidad de 2 mL.
- Solucin de cido clorhdrico
Acido clorhdrico concentrado......................................10 mL
Agua destilada...............................................................10 mL
Agregar lentamente el cido clorhdrico al agua destilada, nunca a la inversa para obtener una
solucin 1:1. Mantener en un frasco color mbar, en la oscuridad, en la heladera.
- Solucin de sulfanilamida al 0.2 %
Sulfanilamida.......................0.2 g
Agua destilada.....................100 mL
Disolver la sulfanilamida en agua destilada y mantener en un frasco color mbar,en la oscuridad, en la heladera.
- Solucin de N-naftiletilendiamina 0.1 %..........................0.1 g
Agua destilada................................................................100 mL
Disolver la N-naftiletilendiamina en agua destilada y conservar en frasco color mbar en la
oscuridad, en la heladera.
- Mtodo con cristales como reactivo
El reactivo en seco, con cristales es fcil de preparar, tiene un tiempo una duracin de 6 meses y la ventaja de utilizar un solo compuesto para la determinacin de nitrato en lugar de los
tres reactivos lquidos utilizados en el mtodo qumico convencional.
Sustrato de nitrato de sodio en buffer
Prepararlo como fue indicado previamente.
35
Reactivo en cristales
Acido sulfanlico.............................................................1 parte.
Dihidrocloruro de N-(1naftil)-etilendiamina....................1 parte.
Acido tartrico L (+)....................................................10 partes.
Colocar los componentes en un frasco color caramelo y mezclar vigorosamente, mediante
agitacin manual durante 30 minutos.
El cido tartrico es de composicin difcil de mezclar, por ello es necesario colocarlo en un
mortero y disgregarlo fuertemente, para que su incorporacin a las otras dos drogas sea ms
integrada. La mezcla seca tiene una apariencia cristalina heterognea.
Conservar en frasco color mbar a temperatura ambiente.
- Tcnica de nitrato en tiras de papel
Es un material comercial con el cual se puede determinar la reduccin del nitrato.
Se obtienen resultados consistentes especialmente con fuertes reductores de nitrato, tal como
el M. tuberculosis.
Los resultados son reproducibles, la tcnica implica mucho menor trabajo que el mtodo
qumico, pero es ms oneroso.
Estndar de reduccin del nitrato
Para asegurar los resultados de la interpretacin de la reduccin del nitrato es recomendable
preparar una serie estndar donde la intensidad de color vara de +/- a 5+.
Se mantiene en forma indefinida y es posible utilizar cada vez que se realiza la tcnica.
Reactivos
- Solucin concentrada
a- Fosfato disdico 0.067 M
Na2 HPO4 anhidro.....................................9.47 g
H2O dest..............................................1000 mL
b- Fosfato monopotsico 0.067 M
KH2 PO4..................................................9.07 g
H2O dest............................................. 1000 mL
36
c- Fosfato trisdico 0.067 M

Na3 PO4 .2H2O......................................25.47 g
H2O dest..............................................1000 mL
d- Fenolftalena 1 % (1 g en 100mL de alcohol etlico)
e- Azul de bromotimol 1% (1 g en 100 mL de alcohol etlico)
f- Azul de bromotimol 0.01%: preparar mezclando 1.0 mL de la solucin e) en 100 mL de agua
destilada).
- Buffer solucin de trabajo
Mezclar 35 mL de la solucin concentrada a), 1.5 mL de la solucin concentrada b) y 100 mL
de la solucin concentrada c).
Procedimiento
-Colocar ocho tubos limpios en una gradilla, numerarlos de 1 a 8, usar el mismo tamao de
tubos que los utilizados en la tcnica de nitrato reduccin.
-Colocar 2 mL del buffer solucin de trabajo en los tubos 2 a 8.
-En 10 mL del buffer solucin de trabajo, agregar 0.1 mL de solucin d) y 0.2 mL de solucin
f)........... solucin g).
- Colocar 2 mL de la solucin g) en el tubo nmero 1.
Corresponde a 5+ del estndar de color.
- Al tubo 2, agregar 2 mL de la solucin g), mezclar bien y transferir 2 mL al tubo siguiente
nmero 3, proseguir con la serie de diluciones por el agregado de 2 mL, en todos los tubos
descartando 2 mL del ltimo tubo.
Estndar de color
Tubo 1: 5+
Tubo 2: 4+
Tubo 3: 3+
Tubo 5: 2+
Tubo 6: 1+
Tubo 8: +/Autoclavar los tubos, sellar y mantener a 5 C.
37
c. Prueba de catalasa cuantitativa y cualitativa

-Solucin buffer de fosfatos 0.067 M, pH 7
Mezclar 61.1 mL de una solucin de fosfato disdico M/15 (9.47 g. Na2PO4H en 1000 mL de
H2O), con 38.9 mL de una solucin de fosfato monopotsico M/15 (9.07 g de KPO4H2 en 1000
mL de H2O).
- Perxido de hidrgeno al 30 % (mantener en heladera)
No utilizar perxido de hidrgeno al 3 %, de venta en farmacias.
Manipular el reactivo con guantes y proteccin ocular.
- Tween 80 al 10 %
Disolver 10 mL de Tween 80 en 90 mL de agua destilada, mezclar y autoclavar 10 minutos a
121 C. Mantener en refrigeracin.
- Reactivo para catalasa
Mezclar inmediatamente antes de su uso, partes iguales de Tween 80 al 10 % y perxido de
hidrgeno al 30 %. Calcular la utilizacin de 0.5 mL de la solucin por cada cepa a analizar.
d. Hidrlisis de Tween 80
- Tween 80.
- Rojo neutro.
- Solucin reguladora de fosfato M/15, pH 7: Mezclar 61.1 mL de fosfato disdico M/15 (9.47
g en 1000 mL de agua) con 38.9 mL de una solucin de fosfato monopotsico M/15 (9.07 g
en 1000 mL de agua).
Disolver 0.5 mL de Tween 80 y 2.0 mg de rojo neutro en 100 mL de solucin reguladora.
Controlar el pH, que no debe ser menos de 7.0 y el color amarillo mbar. Distribuir en tubos
de 16 x 125 mm con tapa rosca (4 mL en cada uno). Autoclavar 15 minutos a 121 C. Conservar en refrigeracin y sin contacto con la luz, no ms de dos semanas.
e. Prueba de Arilsulfatasa
- Sustrato
Fenolftalena disulfato tripotsico.....................2.6 g
Agua destilada...................................................50 mL
38
Solucin 0.08 M
Esterilizar por filtracin. Mantener en refrigeracin.
CO3 Na2 anhidro...............................................10.6 g
Agua destilada..................................................100 mL
Solucin de Carbonato de sodio 2N
Medio de cultivo
Preparar 200 mL de medio lquido de Dubos. Agregar al medio 2,5 mL de la solucin del sustrato para la prueba de 3 das, y 7,5 mL para la prueba de 2 semanas. Distribuir aspticamente
en tubos de 16 mm x 125 mm con tapa rosca, a razn de 2,0 mL por tubo.
Reactivo
Solucin de carbonato de sodio 2,0 N (disolver 10,6 g de Na2CO3 anhidro en 100 mL de agua
destilada).
f. Toma de Hierro
Citrato de hierro amoniacal................................4 g
Agua destilada................................................100 mL
Esterilizar 15 minutos a 121 C
g. Reduccin del Telurito
Solucin de telurito de potasio 0.2 % (telurito de potasio 0.1 g en 500 ml de agua destilada). Colocar 2 ml en pequeos tubos o en viales y autoclavar (10 minutos x 121 C). Conservar a 4 C.
Procedimiento
Preparar medio Middlebrook 7H9 y suplementar con 0.5 mL de Tween 80 por cada 1000 mL
de medio, distribuir en volmenes de 180 mL y esterilizar en autoclave 15 minutos a 121 C,
a cada 180 mL del medio estril mantenido a 50-55 C suplementar con 20 mL de OADC
(cido oleico, albmina, dextrosa y catalasa) adquirido en el comercio o bien prepararlo en las
siguientes proporciones:
- Dextrosa 0.8 mL al 50 %, que se prepara disolviendo 50 gramos de la droga en 99 mL
de agua destilada. Se agrega 1 mL de solucin de cido ctrico al 10 %.
39
Se autoclava 10 minutos a 121 C.

- Catalasa 1000 mg/mL, agregar 0.4 mL
- Complejo albmina-cido oleico, preparado en la siguiente forma:
Disolver 0.12 mL de cido oleico en 20 mL de Hidrxido de sodio N/20.
Preparar una solucin de albmina bovina al 5 %, mezclando 95 mL de cloruro de sodio
al 0.85 % y 5 g de la fraccin V albmina bovina.
Agregar 5 mL de la solucin de cido oleico a 95 mL de solucin de albmina al 5 %, ajustar
el pH a 6.8. Filtrar por placa o membrana esterilizante. Repartir en tubos esterilizados e
incubarlos a 37 C, durante una noche.
Colocar en bao de mara a 56 C durante 30 minutos y conservar a 4 C.
Distribuir el medio resultante en tubos con tapa a rosca, de 16 x 160 mm, colocar en posicin inclinada y dejar solidificar.
h. Mtodo de la ureasa
Medio de cultivo
Peptona.............................................................1 g
Dextrosa............................................................1 g
ClNa..................................................................5 g
PO4H2K..............................................................2 g
Urea................................................................20 g
Rojo de fenol....................................................0.012 g
Agua destilada c.s.p......................................100 mL
Procedimiento
Realizar la mezcla de los componentes y esterilizar por filtracin.
Diluir 1:10 con agua destilada estril y distribuir en tubos esterilizados de 13 x 100 mm con
tapa a rosca. Mantener en oscuridad y en refrigeracin.
i. Presencia de la Fosfatasa cida
Reactivos
Variante 1
40
Sustrato: Fenolftalena difosfato 0.5 M.

Solucin 1: Acido actico 0.2 M
Acido actico 11.41 mL/1000 mL de agua destilada.
Mantener a 4 C por el plazo de 1 ao.
Solucin 2: Acetato de sodio 0.2 M
Acetato de sodio: 16.41 g/1000 mL de agua destilada.
Autoclavar, mantener a 4 C por el plazo de 1 ao.
Procedimiento
Mezclar 14.5 mL de la solucin 1 y 85.5 mL de la solucin 2, calentar durante 30 minutos. Enfriar a temperatura ambiente y agregar 100 mg de difosfato de fenolftalena por cada 100 mL
de la solucin. Mantener a 4 C por un plazo no mayor de 6 semanas.
Carbonato de sodio al 10 %
Autoclavar, mantener a 4 C por un tiempo no mayor de 1 ao.
Variante 2
Buffer de acetato de sodio
Soluciones concentradas
1. Acido actico glacial....................................................................30 mL
Agua desionizada.............................................................................470 mL
2. Acetato de sodio
Acetato de sodio.3H2O.....................................................................68 g
Agua desionizada...........................................................................500 mL
Buffer acetato pH 5.0
Solucin concentrada 1.....................................................................195 mL
Solucin concentrada 2.....................................................................300 mL
Agua desionizada..............................................................................505 mL
El pH final debe ser 5.0.
41
Sustrato Fosfatasa cida

Sal magnsica de monofosfato de timolftalena................................ 25 mg
Hidrxido de sodio 1 N..........................................................................2 mL
Disolver la sal completamente en el hidrxido de sodio, agregar el buffer acetato pH 5.0, hasta
un volumen final de 50 mL. Esterilizar por filtracin mediante placa membrana de 0.45 m.
Envasar en tubos con tapa rosca esterilizados volmenes de 2 mL.
Revelador de la reaccin
Hidrxido de sodio 5 N
Esterilizar en autoclave a 15 libras de presin durante 20 minutos.
j. Prueba de la pirazinamidasa
Medio de cultivo
Caldo base deshidratado de Dubos comercial.......................................6.5 g
Agua destilada.................................................................................1000 mL
Pirazinamida......................................................................................100 mg
Piruvato de sodio.....................................................................................2 g
Agar.......................................................................................................15 g
Procedimiento
Calentar la mezcla hasta fundir el agar, distribuir 5 mL en tubos con tapa rosca de 16 x 125
mm, esterilizar 15 libras, durante 15 minutos, dejar solidificar los tubos en posicin vertical.
Sulfato ferroso amoniacal.......................................................................1 g
Agua destilada.................................................................................100 mL
k. Prueba de la -galactosidasa
Medio de cultivo
Preparar medio de Dubos modificado segn la frmula siguiente:
Fosfato monopotsico anhidro............................ 1 g
42
Fosfato disdico.12 H2O................................. 0.25 g

Sulfato de magnesio.7 H2O............................... 0.6 g
Citrato de sodio............................................... 1.5 g
Asparragina......................................................2.0 g
Tween 80 solucin acuosa 10 %......................5.0 mL
Procedimiento
Se disuelven los componentes, cada uno por separado, en un volumen de 100 mL de agua.
Mezclar y completar a 1000 mL, pH 7.2
Se distribuye en frascos, 100 mL en cada uno. Autoclavar 20 minutos a 121 C.
Se prepara una solucin al 20 % de fraccin V de albmina bovina en solucin fisiolgica. Esta
solucin debe calentarse a 56 C durante 30 minutos y esterilizarse por filtracin.
Se disuelven en 100 mL del medio basal anteriormente descrito, 100 mg del sustrato 2-nitrofenil -D-galactopiransido, agregndose luego 4 mL de la solucin de albmina.
Se esteriliza por filtracin nuevamente y se distribuye en tubos con tapa a rosca, 5 mL en
cada tubo.
l. Citrato, Manitol e Inositol

Medios de cultivo
(NH4)2SO4......................................................................2.4 g
KH2PO4 ..0.5 g
MgSO4.7 H2O... 0.5 g
Agar 2 %.20 g
Agua destilada..950 mL
Citrato de sodio................................................................5.6 g
Manitol.............................................................................5.0 g
Inositol.............................................................................5.0 g
43
Procedimiento
Medio basal
Disolver en agua destilada todos los reactivos excepto, citrato de sodio, manitol e inositol.
Ajustar a pH 7, con NaOH 10% ClH 10 %, autoclavar durante 20 minutos a 121 C.
Medio con Citrato
Enfriar a 56 C en bao de agua, disolver 5.6 g de citrato de sodio en 50 mL de agua destilada esterilizar mediante filtracin por membrana, agregar aspticamente al medio basal, distribuir 8 mL por tubo, solidificar en pico de flauta.
Medio con Manitol
Ajustar el medio basal a pH 7 antes de autoclavar, dejar enfriar a 56 C en bao de agua, disolver 5.0 g de manitol en 50 mL de agua destilada, esterilizar mediante filtracin por membrana, agregar aspticamente al medio basal, distribuir 8 mL por tubo, dejar solidificar en pico
de flauta.
Medio con Inositol
Ajustar el medio basal a pH 7 antes de autoclavar, dejar enfriar a 56 C en bao de agua disolver 5.0 g de inositol en 50 mL de agua destilada estril, esterilizar mediante filtracin por
membrana, agregar aspticamente al medio basal, distribuir 8 mL por tubo, dejar solidificar
en pico de flauta.
4. Crecimiento en presencia de drogas

- Hidracida del cido 2-Tiofeno carboxlico (TCH) 2 mcg/mL
Preparar TCH 2 mcg/mL: 20 mg de TCH en 20 mL de agua destilada estril. Transferir 0.1
mL de esta solucin a un tubo con 9 mL con agua destilada. Agregar 1 mL a 100 mL de medio
de L.-Jensen. Distribuir en tubos y coagular en pico de flauta a 80 C durante 45 minutos.
O bien: dividir 4 cuadrantes en una caja de Petri, colocar en 2 medios de cultivo con TCH y
en los otros dos sin TCH.
- Cloruro de sodio 5 %
Preparar un lote con la concentracin final de cloruro de sodio al 5 %, asegurar que la mezcla sea homognea.
44
- Acido p-nitrobenzoico 0.5 mg/mL

Preparar una solucin madre de 25 mg/mL: disolver 2,5 g de PNB en 15 mL de NaOH 1 N,
completar el volumen con agua destilada estril, agregar 1 2 gotas de fenolftalena al 0.1 %
(solucin en etanol) y agregar 3 mL aproximadamente y gota a gota de solucin de HCl 1 N
hasta que el color desaparezca. Si aparece un precipitado es debido al exceso de cido, agregar entonces otro volumen de NaOH. Completar con agua destilada estril hasta 100 mL.
Preparar alcuotas de 5 mL, la solucin es estable a 20 C durante 3 meses. Agregar 4 mL
de PNB 25 mg/mL a 200 mL de medio de L-Jensen antes de la coagulacin.
- Acido pcrico 0.2 %
Preparar un lote de medio de Sauton con cido pcrico al 2 % disuelto en agua.
- Hidroxilamina (HA) 500 mg/mL
Pesar 0.5 mg de Hidroxilamina y diluir en 10 mL de agua destilada estril. Agregar 1 mL de la
solucin a 100 mL de medio base de L-Jensen. Distribuir 2 mL en tubos de 12 x 120 mm,
coagular en pico de flauta, durante 50 minutos a 85 C.
- Isoniacida (INH) 10 mg/mL
Pesar 100 mg de isoniacida y diluir en 10 mL de agua destilada estril. Colocar 1 mL de esta
solucin en 9 mL de agua destilada estril. Agregar 1mL de esta solucin a 100 mL de medio base de L-Jensen. Distribuir 2 mL en tubos de 12 x 120 mm. Coagular durante 50 minutos a 85 C.
45
8. Diagramas de Flujo
A.
Clasificacin inicial de Micobacterias No Tuberculosas (NTM) de acuerdo con el tiempo

de crecimiento / produccin de pigmento.
B.
No cromgenas - Lento crecimiento.

Catalasa e Hidrlisis de Tween positiva.
C.
No cromgena - Lento crecimiento.

Catalasa y Nitrato reduccin negativa.
D.
Fotocromgena - Lento crecimiento.
E.
Escotocromgena - Lento crecimiento.
F.
No cromgena - Rpido crecimiento.
9 . Ta b l a s .
N 1. Identificacin de Micobacterias No Tuberculosas (NTM).
N 2. Identificacin de Micobacterias No Tuberculosas (NTM) Rpido Crecimiento.
N 3. Especies de Lento Crecimiento.
N 4. Especies de Rpido Crecimiento.
10. Fotos.
46
8. Diagramas de flujo
A. Clasificacin inicial de Micobacterias No Tuberculosas (NTM)
de acuerdo con el tiempo de crecimiento / produccin de pigmento.
Ref.: Practical handbook for phenotypic and genotypic identification of mycobacteria INCO-DEV-CA-2004.
B. No cromgenas - Lento crecimiento. Catalasa e Hidrlisis de Tween positiva.
47
C. Crecimiento lento. Catalasa y Nitrato Reduccin negativa
D. Crecimiento lento. Fotocromgena
(*): M. szulgai es fotocromgena a 25 C.
48
E. Crecimiento lento. Escotocromgena
(*): M. flavescens se identifica como de crecimiento rpido.
F. Crecimiento rpido. No cromgena
M. smegmatis
M. mucogenicum
M. abscessus
M. chitae
M. chelonae
Ref.: Practical handbook for phenotypic and genotypic

identification of mycobacteria INCO-DEV-CA-2004.
M. peregrinum
M. fortuitum
49
50
+
+
+
+
+
+
+
+
M. flavescens
M. gordonae
M. scrofulaceum
M. szulgai****
Requiere hemina para su crecimiento.

Amarillo plido.
S/I
F a 25 C.
+
+
+
+
+
+
+
M.xenopi***
M. kansasii
M. marinum
M. simiae
*
**
***
****
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+/+
+
+
+
+
+
-
25C 37C
M. avium
M. gastri
M. intracellulare
M. malmoense
M. nonchromogenicum
M. shimoidei
M. terrae
M. triviale
M. celatum**
ESPECIES
+/-
+
-
+/-/+
-
45C
+:
-:
+/-:
-/+:
INH
Cat.Sc. Nitrato
Urea sa
PZA
+
-
3d
+/+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
Fos.
+
+
SI
-gal
+
+
+/-
+
+
-
+
+
+
+
+
+
-
Tween
-/+
+/-
+
+
+
-
3d
-/+
+
+/-
+
+
+
+
+
+
-
9d
Telurito
HA:
Hidroxilamina
INH:
Isoniacida
Cat Sc Catalasa Semicuantitativa
PZA:
Pirazinamidasa
Fos:
Fosfatasa
B-gal:
Beta-galactosidasa
Telurito 3d, 9d: Reduccin del telurito en 3 das, 9 das.
+
+/-
+
+
+
-
+/+
+/+
14d
Arilsulfatasa
Smbolos
R:
Rpido
M:
Moderado
L:
Lento
N:
No cromgena
Ec:
Escotocromgena
F:
Fotocromgena
S/I:
Sin Informacin
LENTO C RECIMIENTO NO CROMOGENAS

+
+
+
+/+/+
+/+
+
+
+/+/+
+
+
+/+
+
+
+
+/+/SI
+
+
+
+/SI
SI
+
LENTO CRECIMIENTO FOTOCROMOGENAS
+
+/+/+
+
+
SI
+/-/+
+
+
+
+/+
+
+
LENTO CRECIMIENTO ESCOTOCROMOGENAS
SI
+
+
+
+
SI
+
+/+
+
+
-/+
+
+
SI
+
+
+
+
+
HA
> 85% de las cepas positivo

< 15% de las cepas negativo
50% a 85% de las cepas positivo
15% a 49% de las cepas positivo
+
-
+
-
NaCI
N 1: Identificacin de Micobacterias No Tuberculosas (NTM)
9 . Ta b l a s
51
Smbolos
+ : > 85% de las cepas positivas.
- : <15% de las cepas negativas.
+/- : 50 a 85% de las cepas positivas.
-/+ : 15% a 49% de las cepas negativas.
Ec/F
M. parafortuitum
SI
45C
+/-
-/+
L:
Ec:
Ec/F:
SI:
SI
-/+
NaCI Pcrico
Hidroxilamina
Fosfatasa
Beta-galactosidasa
Arilsulfatasa 3 das
No cromgena
+/-
37C
HA:
Fos:
B-gal:
Aril 3d:
N:
M. smegmatis
M. mucogenicum
SI
M. abscessus
Ec
M. chelonae
Ec/F
M. peregrinum
M. vaccae
M.fortuitum
M. phlei
25C
Pigm.
ESPECIES
+/-
+/-
Nitrato
+/-
-/+
Aril.3d
HA
Lento
Escotocromgena
Escotocromgena / Fotocromgena
Sin Informacin
Fos.
gal.
SI
SI
-/+
-/+
Hierro Tween
Inositol
N 2: Identificacin de Micobacterias No Tuberculosas (NTM). Rpido crecimiento
Manitol
Citrato
52
+/-
M. tuberculosis
M. bovis
M. africanum
M. microti
M. avium
M. gastri
M. genavense
M. haemophilum**
M. intracellulare
M. malmoense
M. nonchrogenicum
M. paratuberculosis
M. shimodei
M. terrae
M. triviale
+/-
N/F
Ec
Ec
Ec
Ec
Ec
Ec
Ec/F
M. celatum
M. xenopi
M. asiaticum
M. intermedium
M. kansasii
M. marinum
M. simiae
M. cooki
M. flavescens
M. farcinogenes
M. gordonae
M. interjectum
M. scrofulaceum
M. szulgai
+/-
SI
TCH
SI
NaCI
Lento.
No cromognica.
Escotocromgena.
Fotocromgena.
Sin informacin.
+/-
-/+
+/-
45C
L:
N:
Ec:
F:
SI:
37C
Smbolos
+ : > 85% de las cepas positivas.
- : < 15% de las cepas negativas.
+/-: 50 a 85% de las cepas positivas.
-/+: 15% a 49% de las cepas negativas.
R: Rpido.
M: Moderado.
+/-
N*
M. ulcerans
+/-
25C
Pigm.
ESPECIES DE
LENTO
CRECIMIENTO
SI
SI
+/-
SI
+/-
SI
SI
SI
SI
+/-
PNB
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
+/-
HA
SI
+/-
+/-
SI
+/-
+/-
SI
SI
+/-
SI
INH
-/+
+/-
Niacina
+/-
+/-
+/-
+/-
-/+
+/-
Catalasa
68C
-/+
-/+
SI
Catalasa
SC
Convenciones
Pigm: Pigmentacin
25 C: Crecimiento a 25 C.
TCH: Hidracida del cido 2-tiofeno carboxlico 5mg/mL.
NaCl: Crecimiento en NaCl al 5%.
PNB: Crecimiento en cido p-nitrobenzoico 0.5 mg/mL.
Pcric.: Crecimiento en cido pcrico 0.2%.
INH:
Crecimiento en presencia de isoniacida 10 m/mL.
Catalasa a 68 C.
SI
SI
SI
SI
Pcrico
N 3: Especies de lento crecimiento
+/-
+/-
+/-
+/-
+/-
Ureasa
Catalasa Sc:
Nitrato:
PZA:
HA:
b-gal:
Hierro:
Tween:
Telurito 3d:
Telurito 9d:
-/+
+/-
+/-
+/-
Ni tr ato
+/-
SI
SI
SI
+/-
+/-
+/-
A r il.
3d.
+/-
SI
SI
SI
SI
+/-
+/-
A r il.
14d.
+/-
+/-
+/-
Fosfatasa
Catalasa semicuantitativa.
Reduccin de nitratos a nitritos.
Pirazinamidasa.
Hidroxilamina.
Beta-galactosidasa.
Toma de Hierro.
Hidrlisis de Tween.
Reduccin de telurito en 3 das.
Reduccin del telurito en 9 das.
+/-
SI
+/-
+/-
+/-
+/-
+/-
+/-
PZA
+/-
+/-
+/-
+/-
+/-
+/-
+/-
+/-
SI
-/+
SI
SI
SI
Telurito
3d.
+/-
SI
-/+
SI
SI
SI
Telurito
9d.
Utilizacin de inositol.
Utilizacin de manitol.
Utilizacin de citrato.
Arilsulfatasa a los 3 das.
Fosfatasa cida.
Tween
Inositol:
Manitol:
Citrato:
Aril 3d:
Aril 14d:
Fosfatasa:
SI
SI
SI
SI
SI
SI
gal .
53
Ec/F
Ec/F
Ec
Ec
M. vaccae
M. parafortuitum
M. thermoresistibile
M. duvalli
+/-
Smbolos
+: >85% de las cepas positivas.
-: <15% de las cepas negativas.
+/-: 50 a 85% de las cepas positivas.
-/+: 15% a 49% de las cepas negativas.
R: Rpido.
M: Moderado.
L: Lento.
N: No cromognica.
Ec: Escotocromgena.
F: Fotocromgena.
SI: Sin informacin.
Ec
M. phlei
SI
SI
SI
+/-
-/+
NaCI
PNB
SI
SI
-/+
Pcrico
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
INH Fosfatasa
SI
SI
-/+
+/-
Catalasa
68C
+/-
+/-
Nitrato
SI
SI
Ureasa
SI
SI
SI
SI
SI
SI
PZA
+/-
-/+
Ar i l
3d
HA
gal
Fosfatasa cida.
Catalasa a 68 C.
Catalasa Sc: Catalasa semicuantitativa.
Nitrato: Reduccin de nitratos a nitritos.
PZA:
Pirazinamidasa.
HA:
Hidroxilamina.
b-gal:
Beta-galactosidasa.
Hierro:
Toma de Hierro.
Tween:
Hidrlisis de Tween.
SI
Catalasa
SC
Convenciones
Pigm: Pigmentacin
TCH:
Hidracida del cido 2-tiofeno carboxlico 5mg/mL.
NaCl: Crecimiento en NaCl al 5%.
PNB:
Crecimiento en cido p-nitrobenzoico 0.5 mg/mL.
Pcric.: Crecimiento en cido pcrico 0.2%.
INH:
Crecimiento en presencia de isoniacida 10 m/mL.
25C 37C 45C TCH
M. smegmatis
M. chelonae
M. chitae
M. mucogenicum
M. abscessus
M. peregrinum
Pigm.
M. fortuitum
ESPECIES DE
RAPIDO
CRECIMIENTO
N 4: Especies de rpido crecimiento
SI
SI
SI
SI
SI
SI
Telurito
3d
SI
SI
SI
Inositol
Manitol

Utilizacin de inositol.
Utilizacin de manitol.
Utilizacin de citrato.
Fosfatasa cida.
SI
SI
-/+
-/+
Tw een
Telurito 3d:
Telurito 9d:
Inositol:
Manitol:
Citrato:
Aril 3d:
Aril 14d:
Fosfatasa:
SI
SI
Hi erro
Citrato
10. Fotos
1. Mycobacterium bovis AN5.
2. Niacina. Cepa H37 Rv:

reaccin positiva.
54
3. Reduccin de nitrato. Mycobacterium

phlei: reaccin positiva.
4. Reduccin de nitrato.
Mycobacterium fortuitum: reaccin
positiva.
55
5. Catalasa semicuantitativa. Lado

derecho: reaccin positiva.
6. Catalasa a temperatura
ambiente y a 68 C. Tubos 1 y 2:
negativo. Tubos 3 y 4: positivo.
56
7. Arisulfatasa - 3 das. Cepa 10: reaccin positiva.
8. Toma de hierro. Lado izquierdo:

reaccin positiva.
57
9. Reduccin del telurito. Tubo central:

reaccin positiva.
10. Reduccin del telurito. Lado

izquierdo: reaccin positiva.
58
11. Ureasa. Tubo color rojo: reaccin positiva.
12. Fosfatasa cida. Cepa

166: reaccin positiva.
59
13. Pirazinamidasa. Cepa 534. Reaccin

positiva: anillo rosado.
14. Reaccin de la beta-galactosidasa.

Lado izq.: tubo control negativo.
Lado der.: reaccin positiva.
60
15. Mycobacterium phlei: desarrollo en

presencia de ClNa.
16. Crecimiento en
presencia de drogas
PNB, HA, ClNa, INH,
TCH, cepa 2615.
17. Crecimiento en presencia

de drogas, cepa 2610.
61
18. Crecimiento en presencia de drogas, cepa Mycobacterium bovis AN5.
19. Crecimiento en presencia de drogas, cepa 2617.
62
63
Direccin
de Laboratorio
y Control Tcnico
Coordinacin
General de
Laboratorio Animal

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Manual de Procedimientos

Dra. Amelia Bernardelli

Direccin de Laboratorio y Control Tcnico

Direccin de Laboratorio y Control Tcnico

Autoridades del SENASA

Dr. Jorge Nstor Amaya

Lic. Vernica Torres Leedham

Manual de Procedimientos / Clasificacin fenotpica de las micobacterias

Direccin de Laboratorio y Control Tcnico

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E. Crecimiento lento. Escotocromgena.

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La tuberculosis es una enfermedad de importancia global.

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Clasificacin fenotpica de las micobacterias

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El desarrollo de las colonias se produce entre 2 a 7 das.

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Inocular tres tubos con medio de Lwestein-Jensen y uno con Stonebrink.

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La reaccin consiste en la evolucin del bromuro de ciangeno de la parte superior de la tira

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La presencia de nitrito es detectada por la adicin de sulfanilamida y N-naftiletilendiamina a

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Por estas razones el mtodo no es altamente reproducible entre laboratorios y es conveniente

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al 10 %, el cual ayuda a dispersar la masa bacteriana hidrofbica, hasta bacilos separados

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c2. Catalasa Cualitativa: a 68 C

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ocasionalmente cepas del complejo M. avium-intracellulare.

La hidrlisis enzimtica del Tween 80 es una importante caracterstica de la diferenciacin de

Direccin de Laboratorio y Control Tcnico

Manual de Procedimientos / Clasificacin fenotpica de las micobacterias

Direccin de Laboratorio y Control Tcnico

g. Reduccin del telurito

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Complejo M. terrae: negativo.

i. Presencia de la fosfatasa cida

Direccin de Laboratorio y Control Tcnico

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Agregar a cada tubo 1 mL de la solucin de sulfato ferroso amoniacal al 1 % y colocar los

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l. Inositol, Manitol Citrato

Utilizacin del carbono para el desarrollo.

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4. Crecimiento en presencia de drogas

Direccin de Laboratorio y Control Tcnico

Manual de Procedimientos / Clasificacin fenotpica de las micobacterias

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- Hidroxilamina (HA) 500 mg/mL.

- Isoniacida (INH) 10 mg/mL.

5. Plaqueo para el control de pureza en agar Dubos o

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Direccin de Laboratorio y Control Tcnico

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Agregar 611 mL de la solucin 2 a 389 mL de la solucin 1 y mezclar bien, controlar el

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