BIOQUIMICA

EAP MEDICINA HUMANA

PRACTICA N 1
FOTOCOLORIMETRA
INTRODUCCIN:
Se denomina Mtodo Fotocolormtrico al mtodo ptico de absorcin molecular que nos
permite cuantificar sustancias y est basado en la medicin de la intensidad de la luz
monocromtica transmitida a travs de una solucin coloreada, ya sea que se trate de sustancias
naturalmente coloreadas o que se han hecho de tal calidad mediante reacciones qumicas
adecuadas.
La mayora de los cuerpos en solucin tienen una capacidad de absorcin selectiva sobre
determinadas radiaciones luminosas, cuando sta absorcin se realiza en la zona espectral
visible, las soluciones las ve el observador de un color que es producido por las radiaciones que
no han sido absorbidas.
COMPETENCIAS:
Al finalizar la prctica, el alumno ser capaz de:
1.- Construye e interpreta una curva de calibracin
2.- Determina la longitud de onda de mxima absorbancia para soluciones coloreadas.
3.- Reconoce los 2 mtodos para la determinacin de la concentracin de una solucin
coloreada.
4.- Determina la concentracin de una muestra problema haciendo uso de los dos mtodos.

FUNDAMENTOS:
Cuando un haz de luz (LUZ Incidente, lo) atraviesa una solucin, una parte de la radiacin queda
absorbida por las molculas del soluto coloreado, sufriendo una reduccin de su intensidad (LUZ
Transmitida, lt), proporcional a la capacidad de absorcin de dichas molculas, otra parte de la
radiacin se pierde por fenmenos fsicos como reflexin, refraccin y difraccin de la luz.
La longitud de onda en la que las molculas de dicha sustancia absorbe con mayor intensidad la
luz, se denomina "Longitud de Mxima Absorcin" o "Lambda Mximo".
Si consideramos que cada molcula absorbe una determinada cantidad de luz, la intensidad de la
luz transmitida por una solucin disminuir en relacin con el nmero de molculas que se
interpongan entre la fuente luminosa y el observador. Este nmero vara de acuerdo con la
concentracin del soluto y el espesor del recipiente que contiene la solucin, estos
factores estn considerados en la "Ley de Lambert y Beer", que rige los principios de la
Colorimetra y cuyas formas de expresin son:

Log (Io / It) = l c = A = D.O. = 2 Log % T

Io = Intensidad de luz incidente

It = Intensidad de luz transmitida
= Coeficiente de extincin molar
l = longitud (ancho) de la cubeta de lectura (cm).
C = Concentracin Molar
A = Absorbancia
D.O. = Densidad ptica
% T = porcentaje de transmitancia

Calculo de Concentracin de una muestra problema

Existen dos formas.
a) Mtodo de la curva estndar
Este mtodo consiste en utilizar varios Standares de concentraciones conocidas y
progresivas para luego construir un grfico en un sistema de coordenadas en el que se
colocan las lecturas en las ordenadas (Eje Y) y las concentraciones en las abscisas (Eje
X). En la recta obtenida (Funcin Lineal), se puede extrapolar la Absorbancia o
Densidad ptica de la muestra problema, hallando la concentracin de la misma en el
eje de las abscisas.
b) Mtodo del factor de calibracin (Mtodo analtico
El Factor de calibracin es un trmino que relaciona .la cantidad o peso de una
sustancia o la concentracin de la misma con su Absorbancia, es decir la intensidad
de luz que absorbe una sustancia de concentracin conocida Standard o patrn. M
Puede expresarse en peso (Fcw) o en concentracin (Fc[ ]), siendo para el primer cas
el peso que existe de la sustancia que da color en el tubo que se est midiendo la
Absorbancia. As:

Fcw = masa / Ast

la masa suele ser mg de St

VR= Vol real MP (ml)

Fc[ ] = [St] / Ast

Fc[ ]
Recordar algunos trminos
Dilucin = d = v / V

v = volumen separado

Factor de Dilucin Fd = d-1

V = Volumen total

Si se realiza varias soluciones. Ejemplo 4 diluciones.

Dilucin equivalente = d1. d2. d3 . d4 El producto de todas las diluciones

PARTE EXPERIMENTAL
1.- Preparar la siguiente batera de tubos.
Solucin stock: Permanganato de potasio (KMnO4) 10 mg%.
Tubos N
ml KMnO4
ml Agua destilada
Concentracin mg%
A410
A525
A650
Fc[ ]

2.
3.
4.

5.
6.

7.

1
2
0,5
1
Csp 5 ml

3
2

4
4

Leer las absorbancias de los 4 tubos a las siguientes longitudes de onda () 410 nm,
525 nm y 650 nm en el espectrofotmetro.
Con los datos obtenidos: Construir en un papel milimetrado las grficas de
absorbancias versus concentracin de KMnO4 en las 3 longitudes de onda.
Con las grficas elegir la longitud de onda ptima para el KMnO4
En la grfica para el optimo representar la curva de calibracin.
Medir la absorbancia de la muestra problema haciendo la dilucin apropiada para la
muestra.
Obtener el Factor de calibracin (Fc) promedio de las soluciones estndares de la curva
de calibracin.
Calcular la concentracin de la muestra problema por los mtodos:
a) Grficamente, interpolando la absorbancia en la curva de calibracin.
b) Analticamente, multiplicando la absorbancia por el Fc promedio y el factor de
dilucin.
Comparar ambas medidas y analizar los resultados.

CUESTIONARIO
1.- Porqu es necesario hacer dilaciones en algunas muestras
2.- Mencione los factores que afectan la Ley de Lambert y Beer
3.- Hallar los %T cuando se conoce las absorbancias: A1 = 0.005 A2 = 0.05
A3 =0.5
Hallar la Absorbancia cuando se cono el % T siguientes: 0.1 % , 1% T, 10 %, 100 %
4.- Una solucin coloreada presenta una A de 0.450 en una cubeta de 2 cm, hallar la A
cuando la sustancia se ha diluido 5 veces y se lee en una cubeta de 1 cm.
5.- Hallar el coeficiente de extincin molar del KMnO4 realizado en la prctica.