Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
EN REPRODUCCIN
BOVINA
Yael Filipiak y Clara Larocca
Universidad de la Repblica
Facultad de Veterinaria
rea de Biotecnologa de la Reproduccin Animal
Montevideo , Uruguay
BIOTECNOLOGA EN REPRODUCCIN
BOVINA
MANUAL TERICO-PRCTICO
Dras. Yael Filipiak y Clara Larocca, MsC.
INTRODUCCIN......................................................................................................................... 1
TECNICA Y METODOLOGIA DE LA FECUNDACION IN VITRO EN EL BOVINO ............................. 2
CULTIVO Y MEDIOS ................................................................................................................... 2
RECUPERACION DE LOS COMPLEJOS CUMULUS-OVOCITOS (COC) .......................................... 3
MADURACIN IN VITRO............................................................................................................ 7
FERTILIZACIN IN VITRO O INSEMINACIN.............................................................................. 9
DESARROLLO IN VITRO:........................................................................................................... 11
TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN BOVINOS ........................................................ 15
INTRODUCCIN....................................................................................................................... 15
BASES FISIOLGICAS DEL FUNCIONAMIENTO OVRICO: ....................................................... 16
PREMISAS Y DESCRIPCIN DE LA TCNICA ............................................................................. 17
SUPEROVULACION DE LAS DONANTES DE EMBRIONES: ........................................................ 17
RECOLECCIN DE EMBRIONES................................................................................................ 18
AISLAMIENTO Y EVALUACION DE EMBRIONES ....................................................................... 21
IMPLANTE DE EMBRIONES...................................................................................................... 23
CRIOPRESERVACIN DE EMBRIONES ....................................................................... 25
INTRODUCCIN....................................................................................................................... 25
AGENTES CRIPROTECTORES: ................................................................................................... 27
MTODO CONVENCIONAL ...................................................................................................... 28
METODO DE LEIBO .................................................................................................................. 31
METODO CON ETILENGLICOL.................................................................................................. 31
ANEXO ........................................................................................................................ 33
PREPARACIN DE LAS SOLUCIONES STOCK ............................................................ 33
FERTILIZACIN IN VITRO EN
BOVINOS
INTRODUCCIN
El trmino Fecundacin In Vitro (FIV), implica que esta se realiza en un laboratorio, ella involucra el
control de los mecanismos de maduracin e interaccin de los gametos femeninos y masculinos en
un ambiente artificial con el fin de producir embriones.
El objetivo de este manual es proporcionar tcnicas bsicas de la FIV y su aplicacin en el bovino.
Han pasado ms de 100 aos que Hermann Fol, un Zoologista suizo, observ por primera vez un
espermatozoide penetrando a un ovum de estrella de mar y la formacin de la primera clula del
futuro embrin (Fol, H, 1877). Las primeras investigaciones se hicieron en especies de
invertebrados marinos. La razn de esto, es que la fecundacin ocurre afuera de la hembra (en agua
de mar), al contrario de los mamferos, en los que ocurre dentro del organismo.
Desde 1950, las tcnicas de FIV han sido desarrolladas y perfeccionadas de tal forma que el cultivo,
la fecundacin y el desarrollo embrionario se lleva a cabo in vitro. Esto ha permitido estudiar y
entender en mejor forma las interacciones ovum-espermatozoide en los animales mamferos
(Iritani A y Niwa K, 1997; Benau DA y Storey BT, 1988).
La primera cra nacida por FIV fue reportada en el conejo en 1959 (Barros C y col, 1993) y en 1968
en ratn de laboratorio (Del Campo MR y col, 1990). En 1977, se obtuvo el primer bovino por FIV,
con semen capacitado en el oviducto de la vaca o tero de la coneja (McKinnon AO y col, 1992). El
primer ternero resultado de un ovocito madurado y fecundado in vitro naci en 1986 despus que
el embrin fue cultivado en el oviducto de una oveja por 5 das (Del Campo MR, 1995). Sin embargo,
los primeros terneros nacidos de ovocitos madurados in vitro, fecundados in vitro y cultivados
(desarrollo temprano) in vitro se report en 1987 (Kruip AM y Dieleman SJ, 1982). Un ao ms
tarde en Latinoamrica, se produjo en Uruguay, el primer nacimiento de dos terneros obtenidos de
FIV, en el Laboratorio de Biotecnologa de la Reproduccin, dirigido por la Dra Clara Larocca,
apoyado por JICA, Japn.
1) Recuperacin y clasificacin de los complejos cmulus ovocitos (COC) obtenidos de los ovarios,
ya sea de especmenes colectados en el matadero o recuperados de hembras vivas.
2) Maduracin de los COC
3) Fertilizacin
Hay que distinguir que en la tcnica de FIV desarrollada rutinariamente en los laboratorios de
investigacin se usan ovarios (para la recuperacin de ovocitos) de hembras que han sido faenadas
en el matadero, que no tienen prcticamente ningn valor gentico.
Por supuesto, en programas reproductivos, los embriones producidos in vitro provienen de
hembras de alto valor gentico.
CULTIVO Y MEDIOS
En la produccin in vitro de embriones, los elementos constitutivos de los medios, son de
importancia capital.
El mayor componente de los medios de cultivo es el agua, conteniendo tambin iones inorgnicos
(con funciones catalticas y fisiolgicas) (Palasz AT y col, 2000); aminocidos, implicados en la
sntesis proteica y vitaminas, que juegan un papel importante como coenzimas en el metabolismo
(Lehninger AL, 1975).
Diversos autores han estudiado el efecto de la adicin de hormonas, tales como LH, FSH y 17
estradiol, en los medios de maduracin y desarrollo. Como alternativa, se pueden emplear suero de
vaca en celo (SVC) y/o licor folicular bovino (LFb), componentes biolgicos, ms econmicos
(Larocca y col; 1993; 1997). Se ha estudiado el efecto de adicionar LFb a diferentes concentraciones
y proveniente de diferentes fuentes al medio de maduracin y/o de desarrollo, encontrndose
efectos positivos (Larocca y col, 2004). El LFb contiene esteroides, glucosaminoglicanos y muchos
otros metabolitos sintetizados por las clulas de la teca folicular (Romero y Sidel, 1994; Sirard y col,
1995).
Una forma de suplementar protenas a los embriones in vitro es mediante la adicin al medio de
suero fetal bovino (SFb) o de albmina de suero bovino (BSA). (Palasz AT y col, 2000). El SFb y la
BSA afectan al pH del medio y actan como quelantes de iones metlicos, contienen factores de
crecimiento y ciertas cantidades variables de hormonas que inciden el la diferenciacin y
proliferacin celular (Ball y col, 1985).
Los medios de cultivo suelen ser complementados de forma estandarizada con antibiticos para
suprimir el crecimiento de microorganismos contaminantes.
Otros requerimientos de cultivo son la temperatura, el pH, dixido de carbono y tensin de oxgeno,
osmolaridad y humedad relativa.
La osmolaridad ptima en medios de cultivo de embriones bovinos est en el rango de 275 a 285
mOsm. (Gordon, 1994).
El pH del medio de cultivo debe estar entre 7,2 y 7,4, mientras que en los medios de fecundacin, se
recomienda ligeramente superior (7,6-7,8) (Palasz AT y col, 2000).
La temperatura de cultivo utilizada en general por los investigadores es de 38,5C con 100% de
humedad.
OPU. Aspiracin con agujas especiales y bomba de vaco, guiada por ultrasonografa. Las tcnicas de
recuperacin de ovocitos in vivo se han desarrollado recientemente. La "calidad" de los COCs
recuperados de folculos de tamao mediano y grande (>5 mm) es muy buena. El nmero que se
recupera es bastante menor que el que se obtiene de los ovarios de frigorfico. (Critser, ES y col,
1986).
La recuperacin de los ovocitos se realiza mediante puncin in vivo de los folculos ovricos, siendo
este procedimiento guiado por ultrasonografa transvaginal. La ablacin de todos los folculos de >5
mm induce la emergenciad de una nueva onda folicular dos das despus, por esta metodologa se
puede aspirar con frecuencias de 1 o dos veces por semana (Van der Schans y col, 1991)
De material de matadero:
Los ovarios, colectados de hembras faenadas son transportados en termos que contienen suero
isotnico a 35-37 C. La aspiracin de los COCs, se realiza aproximadamente dentro de 4 a 6 horas
despus de faenados los animales.
Todos los folculos que no presentan indicios de atresia folicular, entre 2 y 8 mm de dimetro, son
aspirados (Parrish JJ y col, 1986; Bielanski A y col, 1993). La recuperacin es moderada y la
"calidad" (capacidad de los ovocitos de completar la meiosis) es "buena", en comparacin con la
tcnica de desmenuzamiento (con una hoja de afeitar, se corta la superficie del ovario) en la cual la
recuperacin es alta, pero la calidad de los ovocitos es baja. Esto se debe ms que nada a que se
recuperan ovocitos de folculos muy pequeos no antrales que no han alcanzado el tamao
adecuado para ser madurados in vitro (Brogliatti GM y col, 1995).
Metodologa de trabajo
Primer da (se reciben los ovarios)
Preparar las soluciones de trabajo (entre 3 y 12 horas antes):
El aceite mineral y los medios de cultivo se coloca en la estufa a 38 C, con 5% de CO2 en aire, para
se equilibre en temperatura y el pH (por lo menos 3 horas antes de su uso)
Metodologa para la obtencin y clasificacin de COCs (complejo ovocito
cmulus)
El laboratorio debe estar asptico y con los equipos preparados, previamente al ingreso del
material de trabajo. Se limpia y desinfectan las superficies de trabajo con alcohol 70 y se verifica
que estn todos los materiales necesarios.
Se preparan los medios y se colocan en estufa para que se templen y equilibren.
Se enciende el bao mara.
6) Cuando el lquido llena la jeringa, se transfiere suavemente a cajas de Petri de 90 mm con fondo
cuadriculado, sobre la platina caliente.
7) Se Prepara una placa de Petri pequea con medio m-PBS para colocar los COC obtenidos y
seleccionarlos bajo microscopio estereoscpico.
8) Se colectan los COCs con una pipeta Pasteur de dimetro adecuado, clasificndolos segn
calidad (A, B, C, D) y seleccionar los de calidad A o los A y B, segn el criterio del experimento.
Ovarios de Vaca
Recuperacin de ovocitos
Calidad
Caractersticas a evaluar
Bueno
B
C
D
Regular
Malo
Degenerado
COCs de calidades A y B
Es bastante difcil seguir una regla fija en lo que se refiere a la clasificacin morfolgica bajo un
microscopio estereoscpico, ya que por un lado, hay una gran variabilidad entre los COCs y por
otro, la cantidad de COCs que un tcnico debe manipular hace difcil categorizarlos adecuadamente.
A continuacin se muestra un esquema de las diferentes categoras de COCs.
Esquema de Clasificacin de los COCs
Los COCs seleccionados, se lavan dos o tres veces en placas de Petri de 40 mm con medio m-PBS.
Se utilizan diferentes medios para el cultivo de desarrollo. Los ms utilizados son el
CR1aa y el TCM-199.
MADURACIN IN VITRO
La maduracin del ovocito in vitro que incluye la maduracin nuclear y citoplasmtica fue
reportada en 1965 en diferentes especies (Del Campo y col, 1995; Hinrichs K, 1993).
La meiosis permanece detenida en los ovocitos que se encuentran en los folculos hasta que estos
son expuestos a gonadotrofinas que permiten su continuacin. La meiosis in vivo es detenida por
sustancias foliculares que an no estn bien definidas. Sin embargo, los COCs que son removidos
desde los folculos, comienzan la meiosis espontneamente.
En el mtodo de una gota, se transfieren 60 COCs juntos a una sola gota de 600 l.
El rango de COCs a madurar es de unos 10 ovocitos por cada 100 l de medio M-TCM-199.
Para la maduracin se preparan cajas de Petri numeradas en la parte inferior para identificar los
grupos de ovocitos mantenindolos siempre en gotas separadas.
m-PBS
m-PBS
M-TCM-199
1
C
2
3
M-TCM-199
GOTAS DE
MADURACIN
M-TCM-199
CUBIERTAS
CON ACEITE
MINERAL
Una vez puestos a madurar los ovocitos, el da anterior a la fertilizacin, componemos las
soluciones de BO lavado de semen, BO lavado de ovocitos y BO dilucin de semen. Se explica en el
anexo.
El ovocito maduro, detenido en la Metafase de la meiosis II, permanece en este estado hasta su
fertilizacin. Al ser fecundado por el espermatozoide capacitado, completa la Meiosis II y extrude el
2 cuerpo polar. La cabeza del espermatozoide forma el proncleo masculino y el ncleo del vulo
el proncleo femenino, los cuales se fusionan para completar el nmero diploide de cromosomas en
el embrin. Este proceso fisiolgico se puede realizar in vitro.
Una vez madurados los COCs, se lavan y se colocan en gotas de inseminacin que contengan la
concentracin de espermatozoides por ml. deseada. La relacin es de 10 COCs / 100 l de medio de
fecundacin.
El medio que utilizamos para inseminar se conoce como medio Brackett and Oliphant (Brackett BG
y Oliphant G, 1975), el cual contiene heparina y cafena que son necesarias para la capacitacin
espermtica.
10
2
3
Se coloca la caja con los ovocitos y el semen en la estufa a incubar por 5 hs (mtodo japons) (Norio
S, 1994) o 24 hs (Uruguay y Argentina) (Cabbio, 2006).
Despus de la inseminacin, preparamos el medio de desarrollo, que consiste en CR1aa (o TCM199) adicionado, como se explica:
Se coloca en estufa el aceite mineral, con 5% de CO2, para se equilibre la temperatura y el pH.
DESARROLLO IN VITRO:
Una vez finalizada la etapa de inseminacin, se remueven los cmulos de los ovocitos y se lavan en
el medio seleccionado para el cultivo (CR1aa), luego se incluyen en gotas con este medio, cubiertas
de aceite mineral y se colocan en la estufa.
Para realizar la remocin de los cmulus se forma una gota de 300 l del medio TCM-199 con
Hepes suplementado con 5% de SFb, en una caja pequea y se pipetea 40 veces con micropipeta
automtica de 100 l, cuidando que no se formen burbujas.
Luego se lavan los ovocitos en el medio CR1aa dos veces y se pasan a las gotas de cultivo. Se coloca
la caja de Petri en la incubadora a 38C, con 5% CO2.
A las 48 a 72 horas se realiza la primera evaluacin de divisin celular. Posteriormente cada 48
horas hasta los das 9-10 en los cuales los ovocitos fecundados deben encontrarse en el estado de
blastocisto y/o blastocisto expandido.
11
12
El estado de desarrollo embrionario se clasifica segn los cdigos de clasificacin de las normas
IETS (International Embryo Transfer Society), en manera numrica del 1 al 9:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Embrin de 1 clula
2 clulas
4 clulas
8 clulas
16 clulas
Mrula temprana
Mrula compacta
Blastocisto temprano
Blastocistos
Blastocisto expandido
Blastocisto protrudo
Blastocisto protrudo expandido
das 0-2
das 1-3
das 2-3
das 3-5
das 3-5
das 5-6
das 6-7
das 6-8
das 6-8
das 8-9
das 9-11
das 10-11
Se consideran para implante los estados de desarrollo desde mrula compacta hasta blastocisto
expandido, estados de desarrollo 4, 5, 6 y 7. Los resultados de preez con mrulas compactas son
menores que implantando blastocistos. Los blastocistos eclosionados o protrudos no se implantan.
Clasificacin de embriones segn su desarrollo:
Mrulas compactas
13
14
2
3
Otra forma en que se puede proceder es conservando la caja de petri en la que hicimos la
maduracin, como se propuso en esa etapa, la cual tiene algunas clulas del cmulus que han
quedado al retirar los ovocitos. Si optamos por este mtodo, debemos cambiar el medio de las gotas
para renovarlo con medio nuevo, pero usando la misma caja de Petri. Siempre cuidando que no se
produzca contaminacin.
Las clulas de la granulosa crecen y se extienden sobre la superficie del fondo de la gota como una
red.
Cada 48 horas se chequea para evaluar desarrollo de los embriones y se realizan cambios parciales
del medio de cultivo.
TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN
BOVINOS
INTRODUCCIN
La Transferencia de Embriones (TE) consiste en el transplante de embriones provenientes de una
vaca donadora del valor deseado, al tero de vaquillonas o vacas receptoras, de menor inters,
sincronizadas.
Los programas de TE tienen la capacidad de diseminar la riqueza de la gentica superior en el
ganado y acortar los intervalos generacionales en los programas de seleccin.
Permite difundir los genes de una hembra valiosa en mayor medida que la reproduccin fisiolgica,
esto hace de la tcnica un instrumento de seleccin tanto para la creacin de lneas genticas como
para la difusin del progreso gentico. Por ejemplo de una vaca se obtienen un promedio de 5
terneros en su vida reproductiva. Si superovulamos y realizamos la transferencia de embriones se
puede aumentar como mnimo 5 veces por ao, lo que es muy importante sobre todo en madres de
toros.
En las razas productoras de carne, se puede incrementar la productividad, en trminos de calidad y
kilogramos de carne por animal, seleccionando un ganado eficiente para las condiciones de
explotacin y mercado, as como en ganado de carne, permite producir gemelos y con ello aumentar
el ndice de procreo.
En razas lecheras es posible incrementear la produccin de leche, grasa y protenas lcteas que
requiere la industria y prolongar la vida til de vacas mediante mejoras en la fortaleza y tipo
funcional, adpatadas al sistema de manejo.
La TE combinada con OPU y aplicando la FIV disminuye los costos de los embriones y aumenta
significativamente su nmero.
Por otra parte la TE es una herramienta para salvaguardar genotipos en extincin, de especies
silvestres, de especies de inters zootcnico, as como la introduccin de nuevas razas.
Avance gentico:
- Aumento de la presin de seleccin. Debido a que se produce un aumento en el nmero de
descendientes por hembra, se reduce el nmero de madres seleccionadas de una
generacin para dar lugar la generacin siguiente de reproductores que renovarn el
rebao.
- Reduccin del Intervalo Intergeneracional. Al aumentar en forma rpida las hembras
jvenes, se reduce el intervalo entre las generaciones, se difunden los reproductores de
alto valor gentico y por tanto se acelera el progreso gentico.
- Difusin de la mejora gentica. Aumentando la descendencia de hembras de alto valor
gentico el TE es un medio eficaz para la difusin del potencial gentico por va materna.
Vientres inferiores producirn terneros superiores.
- Ganancia gentica: Para los ndices de ganancia gentica, en produccin de leche, medidos
en porcentaje/ao, es posible evaluar el impacto de sta tecnologa. Con los test de
progenie, a travs de un sistema eficiente, la ganancia gentica vara de 1,5 a 2,0% al ao.
Con un esquema de Transplante de Embriones (TE) con hembras seleccionadas, este ndice
vara entre 1,8 a 2,4%. Si se utilizan vaquillonas seleccionadas por el pedigree, el ndice
sube de 2,6 a 3,5%.
Seguridad sanitaria.
- Numerosos estudios han demostrado que mediante el TE logramos impedir la transmisin
de enfermedades vricas o bacterianas siguiendo las normas de la IETS. La zona pelcida es
una barrera natural (Stringfellow y col.1991). Desde el punto de vista comercial esto es
fundamental en el comercio de embriones congelados.
15
16
Las desventajas estaran dadas bsicamente por una mayor inversin en equipos, insumos y
recursos humanos.
17
18
RECOLECCIN DE EMBRIONES
Actualmente, la recoleccin transcervical, no quirrgica es la tcnica utilizada.
Las vacas donantes deben ser manejadas de forma de evitarles cualquier factor de estrs.
Se las coloca en un cepo en el que se realizar la operacin. La base de la cola es rasurada, lavada
con jabn antisptico y enjuagada con alcohol al 70; luego, se administra una inyeccin epidural de
5ml de lidocana al 2%. Se comprueba la buena administracin de la inyeccin, observando la
flacidez de la cola. El rea alrededor de la vulva es lavada y esterilizada. Mediante palpacin rectal,
se detecta el nmero de cuerpos lteos que tiene cada ovario.
El paso siguiente es apartar los labios vulvares y si es necesario, introducir un dilatador, a travs de
la vagina y colocarlo en el lmen del crvix. Ejerciendo poca presin, el dilatador se pasa a travs
del crvix, con sumo cuidado, para facilitar ms tarde, el paso del baln catter.
Una sonda con baln inflable (baln catter) de calibre francs 18 24 (dependiendo del tamao
del tero), con una varilla de acero inoxidable en su interior, se introduce por la vagina y se pasa a
travs del lmen del crvix dilatado. El catter, luego, es manipulado en el cuerno uterino
seleccionando el lugar adecuado y as el baln inflable es situado lo ms craneal posible.
El baln deber estar ajustado a la pared del cuerno uterino, para evitar cualquier escape del medio
que se va a inyectar. Sin embargo, si el baln est muy ajustado, el endometrio, fcilmente, es
daado y dificultar la bsqueda de los embriones.
Generalmente, 10 a 15 ml de aire son necesarios para vaquillonas y 18 a 22 ml para vacas. Para el
lavado uterino se utiliza 1 litro (500 ml para cada cuerno uterino) de medio PBS (fosfato buffer
salino) o solucin Ringer lactato. Se calienta a 37 C y se acondiciona en un transfusor de suero y se
le adapta a un tubo de drenaje. Este tubo se conecta con el tubo de entrada del baln catter y un
adaptador en forma de Y. Una parte del tubo de goma de 0,5 m de largo se conecta al tubo de salida
del baln catter a travs del adaptador en Y y se conecta a un dispositivo con filtro Em-Com que
permite pasar el lquido, reteniendo los embriones.
Mediante la palpacin rectal se hace un masaje en la unin tero tubrica con los dedos ndice y
pulgar y se controla el ingreso y salida de medio, lo que se repite de 6 a 10 veces utilizando entre
500 a 800 ml por cada cuerno uterino. La entrada y salida del medio utilizado para la colecta se
regula mediante el uso de pinzas de Mohr o similares (hemostticas, etc).
Despus que se lava un cuerno uterino, se retira el baln catter, se higieniza bien y se desinfecta
con alcohol 70 y se cambia al cuerno opuesto repitiendo el mismo procedimiento realizado en el
primer cuerno.
El filtro Em-Com, se lleva a un laboratorio que cuente con una lupa estereoscpica.
19
20
Filtro
Em Com
Canulacin de la donante
Cdigo
Calidad
Descripcin
Excelente
Bueno
Regular
Malo
21
22
Blastocistos
IMPLANTE DE EMBRIONES
Transferencia no quirrgica:
Es la tcnica de eleccin en la actualidad. Hasta los aos 60 el implante se haca por va quirrgica.
La primera transferencia no quirrgica con xito en bovinos fue lograda por Mutter y col. en 1964,
atravesando el cervix con una pipeta de inseminacin. Al comienzo de la dcada del 80 se estableci
como lugar ptimo para la transferencia quirrgica del embrin el tercio anterior del cuerno
uterino, basado en que los embriones del da 7 y 8 se localizan en el tero a 56 cm de la unin
tero tubrica (Strabberger, 1982). Esto no es posible en la transferencia no quirrgica con un
catter rgido, como consecuencia de la curvatura uterina (Newcomb, 1982). Trabajos posteriores
no encontraron diferencias en el xito de la transferencia comparando el tercio anterior con el
medio y estimaron que el intento de transferir los embriones por delante del tercio medio con un
catter rgido poda conducir a traumatismos de la mucosa uterina con muerte embrionaria
(Sreenan y Diskin, 1987). El lugar de eleccin para obtener resultados aceptables es por delante del
ligamento intercornual, a la altura de la curvatura del cuerno. (Mitchell, West y Donaldson, 1984).
El procedimiento de transferencia no quirrgica tiene la desventaja de requerir destreza,
experiencia y particularmente mucho cuidado en la manipulacin del catter en el cuerno y el
cuerpo del tero. El trauma provocado provoca liberacin de prostaglandinas, respuesta
inflamatoria, descenso de los niveles de progesterona, que finalmente intervienen en la sobrevida
del embrin. Esto provoca que la receptora retorne al celo entre los 24 y 39 das post transferencia.
Para evitar el efecto traumtico de la manipulacin sobre el endometrio se pusieron a prueba
drogas para inducir la relajacin de la musculatura lisa del tero (relajantes uterinos) y/o
anestsicos locales (anestesia epidural); sobre los primeros hay opiniones contradictorias acerca de
su efectividad.
Procedimiento:
El embrin se carga en la pajuela de 0.25 ml. La pajuela es cargada en primer lugar con medio de
cultivo (m-PBS) (aprox. 3.5 cm de su longitud), se deja un espacio con aire (1 cm) y luego se carga el
embrin contenido en el medio. Posteriormente una nueva columna de aire y otra con medio. La
columna con medio de cultivo ubicada en el extremo abierto de la pajuela, limpia a esta en el
momento de la descarga. La presencia de las columnas con aire impiden el desplazamiento de la
columna central que contiene el embrin. La ltima garantiza la descarga del embrin por efecto de
arrastre. La pajuela es colocada en el catter de transferencia estril, que ser cubierto
posteriormente por una camisa sanitaria o vaina protectora plstica. Esto representa una ventaja ya
que permite mantener el catter libre del contacto con secreciones que puedan contaminarlo
cuando lo introducimos hasta la porcin cervical del tero.
Hasta la transferencia el catter puede ser conservado a temperatura ambiente (20C). El traslado
al lugar de transferencia debe hacerse evitando cambios de temperatura y en posicin horizontal.
Antes de la transferencia deber ser evaluada la presencia del cuerpo lteo y su calidad.
Una vez realizada la palpacin genital y el vaciado del recto, un asistente deber lavar y secar la
vulva y la zona perineal. Para los animales indciles se recomienda la administracin de anestesia
epidural (Lidocana 2%, 4 7 ml), para impedir las contracciones rectales y poder manipular el
tero eficazmente.
Para introducir el catter en la vagina se deben separar los labios de la vulva a fin de colocar ste
directamente en el vestbulo. Cuando la punta del catter est frente al cervix es importante que el
asistente tome los bordes de la camisa sanitaria y tire hacia atrs para liberar el catter. Si se
emplea vaina protectora plstica, el procedimiento puede realizarlo el mismo operador. E catter es
introducido en el cervix, su penetracin debe hacerse manipulando el rgano siempre por delante
del instrumento. Los movimientos son similares a los de IA, de dorsal a ventral y viceversa y a
ambos lados mientras se empuja, simultneamente, el catter.
La presin debe ser suave y sobre todo controlable, ya que si no corremos el riesgo de perforar el
cuerpo del tero.
Con los cuernos en posicin adecuada, el operador podr atravesar el ltimo anillo cervical e
ingresar al cuerno uterino ipsilateral a la ovulacin. Para ello se deber tomar suavemente el
cuerno y presentarlo frente a la punta del instrumento, algo ms levantado que el cervix.
Luego fijamos el cuerno uterino y estirando y empujando ligeramente el catter avanzamos hacia
craneal.
23
24
La operacin debe repetirse introduciendo el catter en el cuerno lo necesario para superar la lnea
transversal que establece el ligamento ancho y tan profundamente como sea posible sin resistencia
alguna. Por ltimo depositamos el embrin y retiramos el catter.
TASA DE PREEZ:
La tasa de preez con esta tcnica vara entre 60 y 70% con embriones frescos y de buena calidad
(Schneider y col., 1980; Mc Evoy y Sreenan, 1990), 5060% con embriones producidos in vitro
(Liebrich, 1991) y obtenidos in vivo congelados/descongelados.
Infecciones provocadas al introducir el catter de transferencia, via vagina, en el tero,
particularmente susceptible de infecciones entre el da 6 8 del ciclo (Wright, 1981) y el grado de
sincronizacin que se establece entre la donante y las receptoras se suman a la lista de factores que
condicionan el xito de una transferencia. La probabilidad de gestacin depende tambin del
estadio en que se encuentra el embrin en el momento de la recoleccin. La transferencia de
mrulas tempranas, por ejemplo, alcanz una tasa de preez significativamente inferior (p< 0,05)
frente a otros estadios ms desarrollados (Schneider y col., 1980).
La transferencia de un solo embrin se lleva a cabo en el cuerno ipsilateral de acuerdo a la relacin
establecida entre el cuerpo lteo y el cuerno uterino adyacente. La transferencia de ms de un
embrin es posible llevarla a cabo en forma bilateral. Esto significa que un embrin debe ser
colocado siempre en el cuerno ipsilateral a la ovulacin.
La transferencia de un solo embrin en el cuerno contralateral provoca una alta mortalidad
embrionaria dado que las seales luteotrficas y antiluteolticas del embrin fallan en alcanzar el
CL del lado opuesto a la transferencia (Sreenan y Diskin, 1987).
El empleo reiterado de receptoras abre el interrogante sobre cuntas veces puede repetirse la
transferencia a una misma receptora.
La transferencia de los embriones obtenidos o producidos constituye el ltimo paso de la tcnica,
su xito depender del grado de idoneidad y experiencia requeridos tambin para el resto de las
actividades. La tasa de preez obtenida no ser solo el producto de la transferencia por s sino de la
suma de las actividades realizadas hasta el momento y de los factores dependientes de la donante,
el semen, el embrin, la receptora. La competencia profesional en ejecutar con xito cada uno de los
diferentes pasos permitir alcanzar resultados ptimos y repetibles.
El mayor costo de un porgrama de transferencia de embriones est dado por el mantenimiento de
las receptoras (lugar, alimentacin, cuidados sanitarios y manejo), hasta que queden preadas.
Los resultados dependern de diversos factores, entre ellos: un correcto manejo de las donantes y
de las receptoras, la cantidad de embriones obtenidos por donante y su calidad y el porcentaje de
preez. Estos resultados se pueden ver afectados por las prdidas embrionarias.
La TE conduce a que vientres inferiores produzcan terneros superiores.
CRIOPRESERVACIN DE EMBRIONES
INTRODUCCIN
Es tambin mal llamada congelacin de embriones (simple paso de la fase lquida a slida).
Ha adquirido importancia debido a la libre importacin de embriones y a la difusin de esta
tecnologa con embriones nacionales, as como para transportar los embriones producidos por FIV
y por OPU-FIV.
Se destaca la importancia que tiene el hecho de conocer la teoria y los diferentes mtodos de
congelacin embrionaria.
Existen 2 elementos fundamentales a tener en cuenta con referencia al embrin:
1) Tiene un contenido de 80 % de H20.
2) Se comporta como una membrana semi-permeable, por tanto reacciona a las diferencias
de concentraciones osmticas que hay en el medio en el cual se encuentra.
Por ej. tenemos un blastocisto excelente y lo sometemos a un proceso de congelacin ultrarpido
(de temperatura de laboratorio directamente a N2 lquido), debido al alto contenido de H20 en su
interior, hay cristalizacin y muerte de la unidad embrionaria como tal.
25
26
AGENTES CRIPROTECTORES:
Permeables:
Glicerol - D.M.S.O. - Etilenglicol
Accin: reducen el efecto solucin
reducen la cristalizacin intracelular
Condiciones:
para actuar deben permanecer en fase lquida cuando la temperatura
disminuya
no deben cristalizar cuando se formen los primeros cristales de hielo en el
medio extracelular.
No permeables:
Sucrosa (sacarosa)
Accin: modifican el balance osmtico del embrin
Condiciones:
concentracin= 1 - 2 M
son efectivos en congelacin lenta controlada
no son efectivos en congelacin rpida
27
28
MTODO CONVENCIONAL
Proceso de GLICEROLIZACION (incorporacin del glicerol o DMSO al embrin):
Se coloca el embrin en una solucin de PBS-glicerol 1.36 M (es el mejor agente crioprotector). El
embrin en PBS y SFb tiene una osmolaridad de aproximadamente 300 miliosmoles. Si colocamos
el embrin en el lquido, pasa de 300 a 2300 a una solucin hiperconcentrada. Como el embrin se
comporta como una membrana semipermeable, pierde agua y entra glicerol. A la temperatura (T)
ambiente (20-25 C), la velocidad de difusin del H20 es mucho mayor que la del glicerol y el
coefeciente de permeabilidad del H20 es tambin mayor.
A mayor T mayor velocidad de difusin del H20.
A menor T menor velocidad de difusin del H20.
La velocidad de difusin del agua a travs de la membrana embrionaria es directamente
proporcional a la temperatura.
Primero sale mucha H20 y entra poco glicerol pero como va a tender al equilibrio vuelve a entrar
H20 al embrin para equilibrar. De todos modos se logra que entre glicerol.
Tcnica:
La deshidratacin que se produce en la glicerolizacin puede ser tan grande que disminuya la
vitalidad del embrin, por eso en un principio se recomienda hacerla en 3 etapas:
- PBS-Glicerol (PBS-G) 0.4 M hasta el equilibrio 5 minutos
- PBS-G 0.8 M hasta el equilibrio - 4 a 10 minutos
- PBS-G 1.36 M 10 minutos (9 ml de PBS - 1 ml glicerol)
Esto significa que debemos realizar varias concentraciones de PBS-G y pipetear el embrion en cada
una de ellas y dejarlo tiempo para que equilibre, maniobra que se hace laboriosa cuando hay que
preparar las soluciones y ms an cuando trabajamos con varios embriones.
Este paso se puede realizar mediante la adicin a una solucin de m-PBS de Glicerol (G) a 1,36 M,
durante 15 minutos a temperatura ambiente de laboratorio.
3- Colocacin del embrin en pajuela de 0.25 ml (Francia). El embrin est en la columna central de
solucin de PBS - G. La pajuela tendr tres columnas separadas por burbujas de aire, 2 solamente
de solucin y la central con el embrin en la solucin crioprotectora.
Disposicion de las columnas en metodo convencional:
tapn
PBS-G
PBS-G + embrin
PBS-G
sello
29
30
Proceso de criopreservacin de embriones en mquina programable (a); seeding (b) e inmersin en nitrgeno lquido (c)
8- Descongelacin:
Se descongelan las pajuelas al aire a la temperatura de laboratorio, pero no menor de 25 C. Se
coloca en Bao Mara, no menos de 25 C, 30 segundos.
Luego secamos la pajuela, cortamos los extremos y ponemos su contenido en una caja de Petri.
Si colocamos el embrin directamente en PBS isotnico, al estar el medio extracelular hipotnico,
sucede lo inverso a cuando se gliceroliza, es decir que entra agua al embrin y como lo hace en
forma rpida el embrin se rompe. Esto se evita lavando el embrin en baos sucesivos de
concentraciones decrecientes de PBS-Glicerol, para controlar la entrada de agua y que no "estalle"
el embrin.
9- Extraccin del Crio-protector:
Se introduce el embrin en concentraciones decrecientes de PBS-Glicerol:
- 0.5 M PBS Glicerol 6 minutos
- 0.3 M PBS Glicerol 6 minutos
- PBS + 10% de SFb.
31
METODO DE LEIBO
A travs de este mtodo, se evita la manipulacin en el laboratorio para extraer el glicerol. Su
objetivo final es que este proceso ocurra dentro de la misma pajuela donde se congela el embrin.
Se realiza la extraccin del glicerol dentro de la propia pajuela mezclando las columnas mediante
un pequeo golpe con los dedos en las burbujas de aire o agitndolas y se coloca la pajuela
directamente en la pistola para implantar.
Tiene la desventaja de disminuir los porcentajes de gestacin a un 30%, en tanto que con el otro
sistema es del 45 al 50%.
Ventajas:
- No utiliza lupa
- Transferencia similar a la inseminacin artificial practicable a condiciones de campo
Tcnica:
Se carga la pajuela con una gran columna de PBS-Sucrosa 1,08 M, luego una pequea columna de
aire seguida de otra columna con PBS-Glicerol con el embrin, otra columna de aire y una pequea
de PBS-Glicerol 1,5 M.
Disposicion de las columnas en metodo de leibo:
tapn
PBS-Sucrosa 1,08 M
PBS-G + embrin
PBS-G
sello
Para el implante, cuando la pajuela est pronta (descongelada), se da un golpecito con 2 dedos en
las burbujas de aire para mezclar las columnas y la ponemos vertical con el tapn hacia abajo para
que el embrin descienda. Abajo queda la sucrosa y arriba el glicerol, el embrin queda en contacto
con PBS-Sucrosa y pierde el glicerol que tiene en su interior. Se debe dejar 20 minutos para que se
realice el proceso.
La rehidratacin se da directamente en el tero, que le aporta agua.
32
tapn
PBS
PBS-EG + embrin
PBS
sello
ANEXO
Preparacin de las soluciones stock
Las soluciones stock servirn para componer los medios para las respectivas etapas.
Las soluciones a preparar son:
SOLUCIONES STOCK
MEDIOS DE CULTIVO
BO de lavado de semen
BO de lavado de ovocitos
BO de dilucin de semen
CR1aa (Soluciones A y B)
1 ltr
500 ml
800 ml
400 ml
10,6 g
5,3 g
0,1 g
200 ml
0,05 g
100 ml
PBS Buffe r
Para preparar la solucin a partir de los reactivos (en caso de no haber sobres de PBS); PBS Buffer de fosfatos pH
7.4 (1%) (para 500 ml).
1). Agua ultra pura
400 ml
3). KCl
0.1 g
2). NaCl
4). Na2HPO4
5). KH2PO4
8). Conservar a 4 - 5 C
4g
0.72 g
0.12 g
500 ml
33
34
50 ml
Penicilina
5.000 UI
Aclaracin:
Dosificacin del
antibitico: partiendo
de una solucin
Penicilina-Estrepto de
10.000 UI/ml de
Penicilina y 10 mg/ml
de Estreptomicina,
usar 500 l
48.50 ml
5 mg
1.5 ml
Esta preparacin debe utilizarse dentro de las 24 hs de preparado, lo que no se usa en este perodo se descarta. Se
guarda en heladera sellado con parafilm hasta el momento de la obtencin de los COCs, se pone en bao Mara
antes del trabajo para templarlo.
M-TCM-199 Medio de mad uraci n
Para preparar
20 ml
40 ml
Penicilina
2.000 UI
4.000 UI
17 ml
2 mg
1 ml
2 ml
34 ml
4 mg
2 ml
4 ml
Filtrar (0.22 )
Antes de llevarlo a estufa se puede preparar las cajas de Petri con solucin para lavado y las gotas para
maduracin cubiertas con aceite mineral y se colocan de inmediato en la estufa con atmsfera controlada.
Preparac in del l icor folicular:
Se puncionan folculos preovulatorios de ms de 8 mm de dimetro y se transfiere a tubos de centrfuga. Se
centrifuga a 800 G (2.500 rpm) durante 30 minutos. Se decanta. El lquido sobrenadante se inactiva en bao Mara
a 56 C durante 30 minutos; se fracciona en tubos pequeos o crioviales y se almacena congelado.
Soluci n BO (Brac kett a nd Ol ipha nt) (Sol ucin Stock) (Brackett and Oliphant, 1975)
Soluci n A (250 ml)
Se disuelven en orden los siguientes componentes:
Agua ultra pura
200 ml aprox
KCl
0,0987 g
NaCl
CaCl2-2H2O
NaH2PO4-2H2O
MgCl2-6H2O
2,1546 g
0,1085 g
0,0420 g
0,03485 g
50 l
enrazar a 250 ml
35
80 ml aprox
20 l
NaHCO3
1,2937 g
enrazar a 100 ml
Luego de componer la solucin se burbujea con CO2 hasta que adquiera un color salmn, se sella con parafilm y se
guarda en heladera.
Las soluciones A y B, son soluciones stock, al igual que todas las soluciones almacenadas, se guardan selladas con
parafilm y refrigeradas, se pueden conservar hasta 30 45 das en esas condiciones.
Preparac in de las Soluc iones BO (Norio S, 1994 ).
Soluci n BO inicial ( 60 ml) (no stoc k):
Solucin A
46 ml
Penicilina
6.000 UI
Piruvato de Sodio
Estreptomicina
Solucin B
0,0083 g
6 mg
14 ml
Para la preparacin se agrega a la solucin A el piruvato de sodio y los antibiticos, luego se agrega la solucin B y
se homogeiniza.
De esta solucin se preparan los medios de lavado de semen, de lavado de ovocitos y de dilucin de semen, como
se explica a continuacin:
BO de lavado de semen (5 0 ml):
Solucin BO
20 ml
Cafena benzoato de Na
0,0777 g
20 ml
200 mg
20 ml
400 mg
Estos medios se colocan en la estufa con tapa floja para equilibrar con el CO2 y la temperatura, por lo menos 60
minutos antes de la fertilizacin.
36
15 ml
Estreptomicina
2 mg
Penicilina
2.000 UI
1 ml
Aclaracin:
Dosificacin del antibitico:
partiendo de una solucin
Penicilina-Estrepto de
10.000 UI/ml de Penicilina
y 10 mg/ml de
Estreptomicina, usar 200 l
3 ml
3.3505 g
Na Pyruvate
0.0220 g
KCl
NaHCO3
0.1155 g
1.1005 g
250 l
enrazar a 385 ml
0.2998 g
enrazar a 100 ml
Las soluciones A y B, son soluciones stock, se guardan selladas con parafilm y refrigeradas, se pueden conservar
hasta 30 45 das en esas condiciones.
Para 20 ml:
Solucin A
38.5 ml
15 ml
0.5 ml
0,2 ml
Solucin B
Estreptomicina Sulfato
10 ml
0.5 ml
0.5 ml
5.000 UI
5 mg
150 mg
4 ml
0,2 ml
0,2 ml
2.000 UI
2 mg
60 mg
El lquido es amarillo.
Antes de su uso se adiciona con 5% de SFb y se forman las gotas de maduracin previo remocin de los cmulus.
37
38
MTODO CONVENCIONAL
Referencias bibliogrficas:
BALL G.D., COULAN C.B., FIELD C.S., HARMS R.W., THIE J.T., BYERS A.P. Effects of serum source on human fertilization and
embryonic growth parameters In vitro. Fertil Steril, 44: 75-79. 1985.
BARROS, C., VALDIVIA, M., YUNES, R., MELNDEZ, J. Acrosina en la penetracin espermtica en mamferos. Progresos en
Biologa Celular J Becerra M Prez-Figares, P Fernndez-Llevrez Eds Universidad de Mlaga. Pp 113-119. 1993.
BENAU, D.A., STOREY, B.T. Relationship between two types of mouse sperm surface sites that mediate binding of sperm to
the zona pelucida. Biol Reprod; 39: 235-244. 1988.
BETTERIDGE, K. J. Ed. Embryo Transfer in Farm Animals. A Review of Techniques and Applications. Monograph 16, Canada
Dept. of Agriculture. 1977.
BETTERIDGE, KJ., SUGDEN, E.A. & EAGLESOME, M.D. Synchronization of estrus and ovulation in cattle with prostaglandin
analogue AY 24655. Can. J. Anim. Sci. 57, 23-32. 1977.
BIELANSKI, A., LOEWEN K., DEL CAMPO M.R., BETTERIDGE K., SIRARD M. AND S. WILLADSEN. Isolation of bovine
herpesvirus-1 (BHV-1) and bovine viral diarrhea virus (BVDV) in association with the in vitro production of bovine
embryos. Theriogenology; 40: 531-538. 1993.
BRACKETT B.G. AND OLIPHANT. Capacitation of rabbit spermatozoa in vitro. Biology of Reproduction. 12: 260-274. 1975.
BROGLIATTI, G.M., SWAN, C.D., ADAMS, G.P. Transvaginal ultrasound-guided oocyte collection in 10 to 16 weeks of age
calves. Theriogenology; 43:177 abst. 1995.
CABBIO. Manual para la produccin in vitro y criopreservacin de embriones bovinos. Laboratorio Biotecnologa de la
Reproduccin. INTA Balcarce. Junio 2006.
CARNEY, E.W., BAVISTER, B.D. Increased atmospheric carbon dioxide stimulates hamster embryo development In vitro. Biol
Reprod. 34, suppl. 1: 199. 1986.
CASIDA, L. E., NALBANDOV A. , MCSHAN W. H. , MEYERS R. K. AND WISNICKY W. Potential fertility of artificially
matured and ovulated ova in cattle. Proc. Amer. Soc. Anim. Prod. 302. 1940.
CASIDA, L. E., MEYER, R. K., MCSHAN, W. H. & WISNICKY, W. Effects ofpituitary gonadotrophins on the ovaries and the
induction of superfecundity in cattle. Amer. J. vet. Res. 4, 76. 1943.
CRISTER J.K., ROWE R.F., DEL CAMPO M.R., GINTER O.J. Embryo transfer in cattle:Factors affecting superovulatory
response,number of transferable embryos and lenght of post treatment estrus cycle. Theriogenology 13:397, 406,
1980.
CRITSER, E.S., LEIBFRIED-RUTLEDGE, M.L., EYESTONE, W.H., NORTHEY, D.L., FIRST, N.L. Acquisition of developmental
competence during maturation in vitro. Theriogenology; 25: 150 abst. 1986.
DEL CAMPO, M.R., DEL CAMPO, C.H., ADAMS, G.P., MAPLETOFT, R.J. The application of new reproductive tecnologies to South
American camelids. Theriogenology; 43: 13-20. 1995.
DEL CAMPO, M.R., DONOSO, M.X., PARRISH, J.J., GINTHER, O.J. In vitro fertilization of in vitro-matured equine oocytes. Equine
Vet Sci;10: 18-22. 1990.
DOCHI, O., IMAI, K. AND H.TAKAKURA. 1995. Birth of calves after direct transfer of thawed bovine embryos stored frozen in
ethylenglycol. Ani.Rep. Sci., 38:179-185.
DCKE, F. Veterinary medizinische Endokrinologie, 2. Aufle. Verlag, Jena 1981.
DCKE, F. Zur Bedeutung des Gn-RH fur die Regulation des Ovarialzykus. Vet. Med. 39: 150. 1984.
FOL, H. Sur le commencement de LHnognie chez divers animaux. Archives des Sciences Physiques et naturelles. Geneve,
Paris. 1877.
GINTER O.J., KNOPF LKASTELIC J.P. Temporal Association among ovarian events in cattle during oestrus cycles with two or
three follicular waves. J. Reprod. Fertil. 87:223-230. 1989.
GORDON I. Cattle twinning by the egg transfer approach En: Egg transfer by cattle, Rowson LEA (ed), Commission of the
European Communities, Luxemburg, 305-319. 1976.
GORDON, I. Laboratory production of cattle embryos. CAB International, Wallingford, UK. pp 102. 1994.
HAFEZ, E. S. E. Reproduccin e Inseminacin en Animales. 6ta. Edicin. Nueva Editorial Interamericana. 2000.
HASLER J.F., MCCAULEY A.D., SCHERMERHORN E.C., FOOTE R.H. Superovulatory responses of Holstein cows. Proceedings
Ninth Annual Conference of the International Embryo Transfer Society. Theriogenology. Volume 19, Issue 1, January
1983, Pages 8399. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/0093-691X(83)90125-5, 1983.
HASLER J.F., McCAULEY A.D., SCHERMERHORN E.C., FOOTE R.H. Superovulatory Responses of Holstein Cows.
Theriogenology 19: 83-99, 1983.
IRITANI, A., NIWA, K. Capacitation of bull spermatozoa and fertilization in vitro of cattle follicular oocytes matured in
culture. J Reprod Fertil; 50: 119-121. 1977.
ISHIMORI, H., MIKI, Y., KISHI, M., SAEKI, K., SEIKE, N., AND H. KAINUMA. 1992 Vitrification of Bovine Embryos.
Theriogenology 37, 1.
39
40
KRUIP, A.M., DIELEMAN, S.J. Macroscopic classification of bovine follicles and its validation by micromorphological and
steroid biochemical procedures. Reprod Nutr Develop; 22: 465-473. 1982.
LAROCCA C.S., KMAID AND CALVO. Effect of follicular fluid and oestrus cow serum on maturation, fertilization and
development of the bovine oocyte in vitro. Theriiogenology, 39: 253. 1993
LAROCCA C.S., KMAID, LAGO, I., ROSS, G., FILA, D., VIQUEIRA, M., AND BERGLAVAZ A. Influence of follicular fluid from
different sources on in vitro development of bovine embryos produced in vitro. Theriogenology, 47: 292. 1997
LAROCCA, C., CALVO, J., LAGO, I., ROSES, G Y VIQUEIRA, M. Diferentes fuentes de lquido folicular en el desarrollo in vitro de
embriones bovinos. Separata de Archivos de Zootecnia. Vol 53, n 203, pp: 329-332. 2004.
LAROCCA, C., FERNANDEZ, A., LANZA, R., ROSES G., ARMANDUGON, P., CRISPO, M., LAGO, I., KAJIHARA, Y. Differents
superovulatory treatments in bovines with PMSG, Anti PMSG. XIII reunin anual de la Sociedad Brasilera de
Transferencia de Embriones. Atibaia. San Pablo. Brasil. 1998.
LAROCCA, C.E., FERNANDEZ TUBINO, A. Congelacin de embriones bovinos con etilenglicol vs glicerol. Archivos de
zootecnia, vol. 46, n1 176, pp.: 295 - 300, 1997.
LEHNINGER, A.L. Biochemistry. Worth Publishers, New York. 1975.
LEIBO, S.P. 1984. Osmotic responses of bovine embryos iun solutions of Sucrose, Glycerol or glycerol - Sucrose. Cryobiology,
21:711 abst.
LEIBO,S.P. 1984. A one step method for direct non surgical transfer of frozen - thawed bovine embryos. Theriogenology,
21:767 - 790.
LEIBO,S.P. 1986. Comercial production of pregnances from one - step TM diluted frozen - thawed bovine embryos.
Theriogenology, 25:186.
LERNER S. P., THAYANE W.E., BAKER R.D., HENSCHE T., MEREDITH S., INSKEEP E.K., DAILEY R.A., LEWIS P.E., BUTCHER R.L.
Age, dose of FSH and othter factors affecting superovulation in Holstein cows. J. Anim. Sci., 63: 176-183, 1986.
LIEBFRIED, L., FIRST, N.L. Characterization of bovine follicular oocytes and their ability to mature in vitro. J Anim Sci; 48: 7686. 1979.
LIEBRICH, J. Untersuchung zur In-vitro Weiterentwicklungskapazitt nach Transfer produzierter Rinderembryonen. Diss.
Mnchen, 1-129. 1991.
MAPLETOFT R.J., PAWLYSHYN V., GARCIA A., BO G.A., WILLMOTT N., SAUNDERS J., SCHMUTZ S. Comparison of four different
gonadotropin treatments for inducing superovulation in cows with 1,29 translocation. Theriogenology 33:282, 1990.
MAPLETOFT R.J., PIERSON R.A. Factors Affecting Superovulation in The Cow:Practical Consideration. Relaciones EmbrioMaternas y Biotecnologas Reproductivas. Univ. Austral de Chile, pag. 36-38. Chile. 1995.
MASSIP,A. AND P.VAN DER SWALMEN, 1984. Direct transfer of frozen cow embryos in glycerol - sucrose. Vet. Rec., 115:327328.
MASSIP,A., VAN DER SWALMEN,P. AND F.ECTORS. 1987. Recent progress in cryopreservation of cattle embryos.
Theriogenology, 27:69-79.
MCEVOY T.G., SREENAN J.M. Effect of embryo quality and stage of development on the survival of zona pellucida-free cattle
demi-embryos.
Theriogenology.
Volume
33,
Issue
6,
June
1990,
Pages
12451253.
DOI:
http://dx.doi.org/10.1016/0093-691X(90)90042-R . 1990.
MCKINNON, A.O., CARNEVALE, E.M., SQUIRES, E.L., VOSS, J.L., SEIDEL, G.E. Heterogeneous and xenogenous fertilization of
equine oocytes. Proc 10th Equine Nutrition and Physiology Symposium, San Antonio, TX, Society for Theriogenology,
Hastings, NE; pp 197-201. 1992.
MITCHELL WEST G. AND DONALDSON L.E. Non-surgical Embryo transfer In: Embryo transfer in cattle. Lloyd E Donaldson
(eds), 91-94. 1984
MUTTER LR, GRADEN AP AND OLDS D. Successful non-surgical bovine embryo transfer. AJ Digest. 12, 1150. 1964
NEWCOMB R. Egg recovery and transfer in cattle In: Mammalian egg transfer Adams CE (ed) CRC press, 81-118. 1982
NORIO S. Manual of Embryo Transfer and in vitro fertilization in cattle. Jica, Japan. 1994.
PALASZ, AT., Y DE LA FUENTE, J. Produccin de embriones bovinos: Efecto de los medios de cultivo y de los requerimientos
fisiolgicos sobre la calidad de los embriones producidos in vitro. http://es.scribd.com/doc/6137003/9-Cultivo-deEmbriones-Bovinos. 2000.
PARRISH, J.J., SUSKO-PARRISH, J.L., LEIBFRIED-RUTLEDGE, M.L., CRITSER, E.S., EYESTONE, W.H., FIRST, N.L. Bovine in vitro
fertilization with frozen-thawed semen. Theriogenology; 25: 591-600. 1986.
ROMERO, A. AND SEIDEL J.E. Jr. Effects of bovine follicular fluid on the maturation of bovine oocytes. Theriogenology, 41:
383-394. 1994.
SATO, E., MATSUO, M., MIYAMOTO, H. Meiotic maturation of bovine oocytes in vitro: Improvement of meiotic competence by
dibutyryl cyclic adenosine 3', 5'-monophosphate. J Anim Sci; 68: 1182-1187. 1990.
SIRARD, M.A., FLORMAN, H.M., LEIBFRIED-RUTLEDGE, M.L., BARNES, F.L., SIMS, M.L., FIRST, N.L. Timing of nuclear
progression and protein synthesis necessary for meiotic maturation of bovine oocytes. Biol Reprod; 40: 1257-1263.
1989.
SREENAN J. M. AND DISKIN M. G. Effect of a unilateral or bilateral twin embryo distribution on twinning and embryo
survival rate in the cow. J Reprod Fertil. 1989 Nov;87(2):657-64. 1989.
SREENAN, J.M. Ed. Control of Reproduction in the Cow. Martinus Nijhoff, The Hague. 1978.
STRABBERGER G. Die Plazierung des Embryos im Uterus In: Verfahren und Probleme des Embryotransfers beim Rind
Zulassungsarbeit Weihenstephan 59-60. 1982.
STRINGFELLOW D.A., RIDDEL K.P., ZUROVAC O. The Potential of Embryo Transfer for Infections Disease Control In
Livestock. New Zeland Vet. J., 8-17. 1991.
SUZUKI,T.M. , YAMAMOTO,M., OOE,M., SAKATA,A. MATSUOKA,Y. NISHIKATA, Y. AND K. OKAMOTO. 1990. Effect of sucrose
concentration used for one - step dilution on in vitro and in vivo survival of bovine embryo refrigerated in glycerol and
1,2 - propanediol. Theriogenology, 34:1051-1057.
THIBAULT, C. Are Follicular Maturation and Oocyte maturation independent proesse. J. Reprod. Fert. 51:1. 1977.
TORNESI, A.T., ARCHER M.B. AND MAPLETOFT, R.J. Media alternatives for the collection, culture AND freezing of Mouse
AND cattle embryos. Theriogenology 44:705-714. 1995.
VAN DER SCHANS, A., VAN DER WESTERLAKEN, L.A.J., DE WITT, A.A.C., EYESTONE, W.H., DE BOER, H.A. Ultrasound guided
transvaginal collection of oocytes in the cow. Theriogenology 35:288 abstr. 1991.
VOELKEL,S.A. AND Y. X.HU. 1992. Direct transfer of frozed - thawed embryos. Theriogenology, 37:23-37.
WRIGHT J.M.. Non-surgical embryo transfer in cattle embryo-recipient interactions. Theriogenology. Volume 15, Issue 1,
January 1981, Pages 4356. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/S0093-691X(81)80017-9 . 1981.
41
42
43