Divisin de Ciencias Naturales y Exactas

Licenciatura en Qumico Farmacutico Bilogo

INMUNOQUMICA
DISCUSION
La citocina antiinflamatoria IL-4 inhibe la expresin del gen de la xido ntrico sintasa inducible en la lnea celular de macrfagos
de ratn RAW264.7 a travs de la represin de su transcripcin dependiente de OCT
Alumno
JOS LUIS ALONSO GRANADOS
Introduccin
Los macrfagos son la primera lnea de defensa de la respuesta inflamatoria, de la inmunidad innata y de la adquirida, tambin son
estimulados por el lipopolisacrido (LPS) y de los linfocitos T tipo Helper (Th1) derivados del interfern gamma (IFN).
Los macrfagos activados, producen grandes cantidades de citocinas proinflamatorias, productos intermedios del oxgeno reactivo y
algunos intermedios reactivos de nitrgeno como el xido ntrico (NO), que se genera por la molcula NO sintasa inducible (iNOS)
que es originada por el Gen Nos2. Las citocinas (IL-4 e IL-13) derivadas de las clulas Th2 inducen tambin de manera diferente la
activacin de los macrfagos que participan en la respuesta anti-inflamatoria, estas citocinas tambin inhiben la expresin de genes
pro-inflamatorios, incluyendo los genes Nos2.
El xido ntrico sintasa inducible (iNOS) es una protena implicada en la activacin clsica de macrfagos M1 por la expresin del
gen Nos2 despus que estos fagocitos fueron estimulados por las clulas Th1 que secretaron el interfern gamma (IFN) o por el
lipopolisacrido bacteriano (LPS).
La va de sealizacin intracelular para la IL-4, esta mediada en parte, por el transductor de seal y la activacin de la transcripcin 6
(Stat6), un factor de transcripcin citoplasmtico latente que est fosforilado en un residuo de tirosina (Tyr641) por la Janus quinasa
1 (Jak1) despus de que la IL- 4 sea unido al receptor de IL 4.
Los sitios Stat6 fosforilados se ensamblan para dar una forma dimrica, el ncleo se transloca, se une a una secuencia especfica
cisregulador, y media la activacin de la transcripcin de la IL-4 inducida por los genes.
La induccin por IL-4 de la STAT6 tambin funciona como un regulador negativo de la transcripcin inducida de los genes de
macrfagos dependientes del IFN dependiente de la Stat1, y anteriores estudios han demostrado que la STAT6 suprime
directamente y/o indirectamente la transcripcin inducida del IFN dependiente de la Stat1.
Aunque la activacin de Stat6 por la IL-4 parece ser indispensable para la regulacin negativa de la IL -4, los mecanismos moleculares
por los cuales Stat6 es activada por IL-4 e inhiben la expresin gnica de los macrfagos que es inducida por LPS y IFN an no son
totalmente aclarados.
La regin 5-proximal del gen Nos2 (regin I) contienen una caja TATA y sitios de unin para el factor de transcripcin del octmero
(OCT) y el factor nuclear kB (NF-kB), que median principalmente la activacin de la transcripcin inducida por LPS.

La IL-4 tambin regula la expresin negativamente del gen Nos2, y particularmente la expresin inducida por IFN de Nos2 en
macrfagos de ratn.
Se ha demostrado que los mecanismos involucrados en la inhibicin mediada por IL-4 de Nos2 dependen de la regulacin negativa
del IFN inducido por el IRF-1 a travs de la inhibicin de la expresin del IRF-1, a travs de la competencia por el IRF-1 unido con la
IL-4 inducida por el IRF-2, o por medio de una atenuacin de la interaccin con los Protena IFN en conclusin con la secuencia de
unin a protena (ICSBP, conocido como IRF-8).
Aunque los mecanismos implicados en la expresin inducida por el IFN del gen Nos2 por la IL-4 se han centrado en la regulacin
negativa del IRF-1, el mecanismo de la IL-4 mediado por la inhibicin del gen No2 inducido por el IFN y LPS an no se han aclarado
por completo.
Lo que se determin en este artculo:
En este estudio, se analizo el mecanismo molecular por el cual la IL-4 inhibe la activacin transcripcional del gen Nos2 en los
macrfagos de ratn de la lnea celular RAW264 estimulados por IFN y LPS .Adems se determin que el factor de transcripcin 6
(Stat6) bloquea la inhibicin mediada por IL-4 de NOS2 inducida por IFN/LPS.
La transfeccin de un gen reportero de luciferasa que contiene la regin 5- reguladora del gen Nos2 demostr que el factor de
transcripcin del octmero (OCT) se une a la regin promotora y que se requiere para la regulacin positiva por el IFN/LPS. Se
identifico una regin sensible a la represin de iNOS empleando el gen reportero. Estos datos indican que el Stat6 activado por la IL4 inhibe la activacin transcripcional dependiente de OCT del gen NOS2 en clulas RAW264.7.
Metodologa
El procedimiento que se sigui para llevar a cabo el experimento fue el siguiente:
Los reactivos que se utilizaron eran de la marca Sigma Aldrich
Se utilizaron anticuerpos policlonales de conejo
Se realizo tambin :
Un cultivo celular de macrfagos de ratn de la lnea celular RAW264.7.
Una determinacin de NO2 mediante el ensayo de Griess
Una preparacin de ARN total
Una PCR para sintetizar ADNc, a partir del ARN total
La construccin del gen indicador de luciferasa, mediante ADN genmico aislado de ratn
Un ensayo para determinar la actividad del gen reportero de luciferasa
La preparacin de extractos celulares nuclear y citoslico que se prepararon usando una modificacin del mtodo Dignam.
Un ensayo electrofortico para determinar los productos de unin
Un anlisis de Western Blot

Resultados

Los resultados son los siguientes:

La figura 1a muestra los resultados de un ensayo en el

que se evalu la actividad inhibitoria de la IL-4 en la
produccin de NO ya sea inducida por el INF o el LPS, de la
lnea celular de macrfagos RAW264.7 (en la figura 1a las
barras de color negro (+) indican la presencia de la IL-4,
mientras que las barras claras (-) indican su ausencia)
El grfico indica que la IL-4 inhibi significativamente la
produccin de NO en las clulas estimuladas con IFN o
con el LPS de la lnea celular de macrfagos RAW264.7

La figura 1 b Para examinar el efecto inhibitorio de la IL-4 en la expresin del

gen Nos2 en el ARNm despus de una induccin con IFN y LPS las clulas
fuern pretratadas con IL-4 durante 30 minutos y se estimularon con IFN y LPS
durante 8 horas.
La figura muestra los resultados del efecto inhibitorio de la IL-4 en la expresin
del gen Nos2 despus de haber sido estimulada por el IFN, el LPS y una
combinacin de estos dos, los signos negativos indican la ausencia de la IL-4 y
los signos positivos indican la presencia de la IL-4 en el medio.
En la que podemos ver que por s sola la IL-4 que fue en el medio solo (UT) no
puede inhibir la expresin del gen Nos2, esta necesita estar estimulada por el
IFN y el LPS o una combinacin de ambos. Se puede ver tambin que el IFN
por s solo no puede inhibir la expresin del gen Nos2 si no que necesita estar
la IL-4 presente aunque su poder de inhibicin es mayor en comparacin con el
LPS. Se utilizo como control positivo el marcador Gapdh (gliceraldehdo-3fosfato deshidrogenasa).
Adems se puede determinar que la IL-4 pretratada con LPS inhibe la funcin
del IFN y la expresin del gen Nos2.

La actividad biolgica de la IL-4 se ha demostrado que esta mediada en gran parte por el factor de transcripcin de Stat6. Por lo
tanto, para determinar si la inhibicin de la expresin gnica del Nos2 por la IL-4 est mediada por Stat6, se anulo el gen Stat6
utilizando un SmartPool de siRNA dirigido al Stat6 de ratn. Empleando tcnicas de PCR en tiempo real y Western Blot anlisis que
confirm que se silencio Stat6 ya que se redujo los niveles de transcripcin de Stat6 y expresin de protena en comparacin con el
tratamiento control sin siRNA.

En la figura 2 a Podemos ver que las clulas transfectadas con siRNA (control) presentan una inhibicin baja de la
expresin del gen Nos2 en las clulas de la lnea celular RAW26.4.7 de ratones, en comparacin con las clulas que
no fueron transfectadas con siRNA y que presenta una buena actividad biolgica del Stat6 que en combinacin con
la IL-4 presenta una buena inhibicin del gen Nos2.
En la figura 2b Podemos ver que las clulas transfectadas con siRNA presentan una baja expresin de la actividad
biolgica de la protena Stat6, en este experimento, se utilizo como control un anticuerpo anti-stat6 (-actina).
En la figura 2 c En esta figura los signos (+) indican la presencia de la IL-4, los signos (-) indican la presencia del
control siRNA y UT indica un medio solo, en la cual podemos ver que la inhibicin por la IL-4 en ausencia del control
siRNA es buena mientras que cuando el control est presente la expresin del gen Nos2 es muy marcada esto
sucede cuando se halla en presencia del IFN y en la combinacin del IFN y el LPS, ya que cuando est en presencia
del LPS solo su expresin no estn lejana de la inhibicin por la IL-4, al igual que el medio solo.
En la figura d Los signos (-) indican la presencia de la protena Stat6 en combinacin con la IL-4, en los signos (+)
indican la presencia del control siRNA y UT indica un medio solo. En este grfico podemos ver que en el medio solo,
en la estimulacin con IFN y con LPS la inhibicin tanto como la expresin son iguales esto quiere decir que la IL-4
y el siRNA afectan de la misma manera, mientras que cuando hay una combinacin del IFN y el LPS
Solo lo que cambia es que la presencia del siRNA afecta demasiado en la inhibicin del gen Nos2 cuando se trata de
una combinacin del IFN y del LPS.
Estos resultados indican que la inhibicin de la expresin del gen Nos2 esta mediada por la IL-4 dependiente de la
protena Stat6.
La inhibicin mediada por IL-4 de la expresin gnica del Nos2 inducida por IFN o LPS fue abolida en las clulas transfectadas con
ARNsi de Stat6 (Figura 2 (d)). Estos resultados indican que la inhibicin mediada por IL-4 de la expresin gnica del Nos2 depende de
Stat6.
Para examinar el mecanismo por el cual Stat6 inducida por IL-4 inhibe la expresin del gen Nos2, se aisl la regin reguladora 5del
gen Nos2 en el ratn (-996 ~ 104 desde el sitio de inicio de la transcripcin) a partir de ADN genmico de ratn utilizando PCR. Se
clon el fragmento amplificado en el plsmido con el gen reportero de la luciferasa pGL2 (designado como pNOS-996) y se analiz la
actividad luciferasa en el ensayo de transfeccin en clulas RAW264.7

En la figura 3ase observan los resultados que se obtuvieron despus de identificar la regin reguladora responsable de la
inhibicin mediada por IL-4 del gen Nos2, en la cual podemos ver que al inicio cuando se tiene el promotor completo la
actividad de la luciferasa inducida por el IFN y el LPS es mayor que cuando la regin 2 (NF-kB,GAS,ISRE) se suprime ya que
con esto disminuye la actividad de la luciferasa inducida por el IFN (PNOS-772, PNOS-333), sin embargo la actividad de la
luciferasa estimulada por LPS y una combinacin de LPS y INF son comparable con la actividad del promotor de longitud
completa. Adems el tratamiento previo con IL-4 inhibe la actividad de la luciferasa inducida por IFN y LPS en las clulas
transfectadas con estas regiones reporteras. Se puede ver que la lesin en el sitio NF-IL6 (pNOS-143) trae como consecuencia
una disminucin en la actividad constitutiva de la luciferasa inducida por el IFN y el LPS, lo cual indica que este sitio
contribuye a la actividad global del promotor, adems de que la inhibicin de la actividad de la luciferasa por la IL-4 es todava
observada.
La supresin del sitio NF-kB (pNOS-62) solo afecto un poco la actividad de la luciferasa, la supresin del octmero (OCT)
(pNOS-44) casi completamente disminuyo su actividad, aunque cuando se elimina el sitio de la caja TATA (pNOS-17) la
actividad de la luciferasa es casi nula.

En la imagen 3 a de la derecha, en el grfico podemos ver que cuando las clulas fueron estimuladas con el IFN, solo se
observo un significativo aumento en la actividad del gen reportero luciferasa, mientras que cuando hubo un pretratamiento
con IL-4 se ve inhibida la actividad de la luciferasa inducida por el IFN.
En este mismo grfico podemos ver que la actividad de la luciferasa es altamente inducida con la estimulacin del LPS, aunque
tambin se ve que la IL-4 inhibe esta actividad de la luciferasa aunque la inhibicin era ms baja en comparacin con el IFN.
Lo mismo se observo cuando las clulas se estimularon con una combinacin de IFN y LPS.
Estos resultados indican que un sitio ubicado entre el sitio OCT y la regin promotora proximal para el gen Nos2, se requiere
tanto para la activacin transcripcional inducida por el IFN y el LPS y la represin transcripcional por la IL-4 en las clulas de la
lnea celular RAW264.7.

En la figura 4 a podemos ver la importancia del

sitio OCT y del NF-kB para la transcripcin del gen
Nos2 para esto se cre un promotor de larga
duracin (pNOS-996) para analizar la actividad de la
luciferasa.
En la imagen de la derecha podemos ver que al
inicio cuando el sitio NF-kB no tiene mutacin la
actividad de la luciferasa inducida es mayor en
presencia de IFN-, el LPS y en una combinacin de
IFN-LPS que cuando presenta mutacin el sitio NFkB la actividad de la luciferasa inducida disminuye
en presencia del IFN-, el LPS y la combinacin de
IFN-LPS al igual que la inhibicin mediada por la IL4, aunque an se observ una mayor actividad de la
luciferasa estimulada por el LPS, que por las otras
clulas.
En esta imagen tambin podemos ver que la
mutacin en el sitio OCT disminuye an ms la
actividad de la luciferasa inducida por el IFN-, el
LPS y la combinacin de IFN-LPS, y el efecto
inhibidor por la IL-4. Esto sugiere que los sitios OCT
son los responsables de mediar el efecto inhibitorio
de la IL-4.

Para determinar la actividad del sitio OCT en el sentido positivo y su regulacin negativa del gen Nos2, el sitio NF-kB y los
sitios OCT se mutaron en el lugar pNOS-333 en el cual la porcin distal se haba eliminado.
En este promotor el sitio NF-kb fue mutado en el cual se observo que la actividad de la luciferasa inducida por el LPS fue
reducida notablemente en comparacin cuando este sitio no est mutado, aunque la inhibicin por la IL-4 se observ
todava en las clulas estimulas con el IFN-, el LPS y la combinacin de IFN-LPS. Cuando el sitio OCT fue mutado se ve que
la actividad de la luciferasa inducida por el IFN-, el LPS y la combinacin de IFN-LPS, y el efecto inhibitorio de la IL-4 fue
notoriamente reducida.
Se pude concluir que el sitio OCT parece influir en el efecto inhibitorio de la IL-4 y en la regulacin transcripcional del gen
Nos2 de la lnea de clulas RAW276.7.
Se realiz una mutacin dirigida para definir con mayor precisin el sitio de regulacin del gen de la Nos2 para obtener la secuencia
mnima del promotor del sitio OCT. Se evalu la capacidad de este constructor mediante la actividad de luciferasa en la respuesta a
IFN y / o LPS en presencia o ausencia de IL-4 (Figura 5).

El diagrama de la figura 5 a muestra el promotor de una cepa de tipo salvaje

(wt) y la secuencia del sitio OCT mutado (mOCT), en la regin mnima promotora
del gen Nos2. Los nmeros por encima de la regin promotora se refieren a las
posiciones de los nucletidos en relacin con la transcripcin del sitio de inicio del
gen Nos2 en el ratn. En este promotor (pNOS-62) el sitio OCT fue mutado para
confirmar aun ms la importancia del sitio OCT en la regulacin del gen Nos2.
En el grfico de abajo figura 5b se pude ver que el sitio OCT mutado anula por
casi completo la actividad de la luciferasa inducida por el IFN-, el LPS y la
combinacin de IFN-LPS, lo que indica que el sitio OCT es necesario para la
transcripcin y la activacin del promotor mnimo y que la represin
transcripcional por la IL-4 est mediada por este sitio.

Anlisis de la unin de OCT al ADN en extractos nucleares preparados de clulas RAW264. Para examinar si IL-4 induce o modula los
factores nucleares que se unen especficamente a la secuencia de OCT, se prepararon extractos nucleares a partir de clulas
RAW264.7 y se analizaron por EMSA utilizando oligonucletidos marcados radiactivamente correspondientes a la secuencia de OCT.
En la figura 6 a Se observa que en los carriles 1, 3 , 5 , y 7, la
actividad de unin del ADN constitutivo en extractos
nucleares en clulas no tratadas, esta actividad de unin no
presenta mejora para cualquiera de las clulas IFN, LPS o la
combinacin de ambos.
En consecuencia en los carriles 2, 4, 6 y 8 no se observa que la
actividad constitutiva de unin del sitio OCT fuera modificada
al ser tratada con IL-4.

En la figura 6 b podemos ver que no hay un incremento significativo en la actividad de unin del sitio OCT en las
clulas de la lnea celular RAW264.7 a partir de un tratamiento con IFN y LPS.

En la figura 6 "c Podemos ver la actividad de un OCT perteneciente al

gen NOS en un ratn salvaje (wt NOS OCT) (carril 2), adems de la
actividad de un OCT perteneciente al gen NOS en un ratn mutante
(mut NOS OCT) (carril 3) y la actividad de un OCT perteneciente una
cadena de inmunoglobulina kappa de un ratn salvaje (wt Igk OCT)
(carril 4), se puede observar que la actividad es menos competitiva en
las muestra con wt NOS OCT y con wt Igk OCT que con el mut NOS
OCT en este parte se utilizo como sonda al NOS OCT. Cuando se utilizo
como sonda a IgkOCT se observo que la actividad competitiva era
menos eficiente en el wt Igk OCT (carril 8) en comparacin con los wt
NOS OCT (carril 6) y mut NOS OCT (carril 7).
La figura d Se indican los resultados obtenidos despus de realizar un sper ensayo que se realiz para identificar el factor de
transcripcin que se une al sitio OCT del gen Nos2. En la figura 6 d se indica la actividad de un anticuerpo contra el factor de
transcripcin del octmero uno (Oct-1) que sper cambia la actividad de unin del OCT (carril 2) y un anticuerpo contra el OCT-2 que
disminuye las bandas de migracin de inicio del complejo OCT-1 (carril 3), Estos resultados indican que el complejo de unin de OCT
contiene principalmente la expresin de OCT-1 y algunos OCT-2 y que el tratamiento con IL-4 no tuvo efecto sobre la unin de la
protenas OCT al sitio OCT en el gen Nos2. Tambin confirmo que la IL-4 no tuvo efecto inhibitorio en la expresin del OCT-1 o OCT-2
mRNA y de protenas en las clulas RAW264.7.
La sobreexpresin de CBP atena parcialmente la
inhibicin mediada por IL-4 de Nos2. Se ha
demostrado que OCT-1 y OCT-2 que interactan con el
co-activador BOB.1/OBF.1 promueva la transcripcin
dependiente de OCT. Debido a que la actividad de
unin OCT a la regin promotora de Nos2 no se
modific por la IL-4, un co-activador y/o cofactor que
interacta con Oct-1 podra ser el objetivo de la
inhibicin mediada por IL-4. Para examinar los niveles
de protena BOB.1 endgena en las clulas RAW264.7,
se realiz ensayos de Western de lisados de las clulas
estimuladas con IFN y LPS (Figura 7 (a)). Aunque se
observ la expresin constitutiva de la protena BOB.1
en un ratn B lnea celular BCL1 - B20 (carril 1), no se
observaron niveles detectables de protena BOB.1 en
el IFN en clulas RAW264.7 estimuladas con LPS
(carriles 2 ~ 5 ). Estos resultados sugieren que un
coactivador/cofactor que no sea BOB.1 est implicado
en la activacin de la transcripcin dependiente de
OCT-1 y la inhibicin mediada por IL-4 del gen Nos2.

El factor de transcripcin STAT6 inducido por IL-4 interacta con la protena de unin CREB un coactivador (CBP) en los macrfagos,
adems de que la protena CBP se expresa en los macrfagos de ratn. Se transfectaron clulas RAW264.7 con un vector de
expresin conteniendo CBP y se investig el efecto inhibitorio de la IL-4 sobre la actividad del promotor Nos2. Como se muestra en
la Figura 7 (b), la transfeccin con el vector de expresin de CBP potenci el promotor Nos2 en el IFN inducida por LPS, atenuando
parcialmente la inhibicin mediada por IL-4.
Estos resultados sugieren un modelo en el que la inhibicin mediada por IL-4 de la actividad promotora Nos2 depende de un
coactivador/cofactor que promueve funcionalmente la activacin de la transcripcin del gen Nos2 dependiente de OCT-1. Adems,
la represin transcripcional por la IL-4 podra esta mediado por el secuestro de este coactivador/cofactor inducida por IL-4 por la va
de Stat6.
Conclusin
En este experimento se demuestra que la regulacin negativa del gen Nos2 en el ratn, por la IL-4 en los macrfagos de la lnea
celular RAW264.7 de ratn depende de Stat6.
Tambin se demostr que el sitio OCT es importante para la regulacin negativa de la IL-4.
Los resultados sugieren un modelo en el que un coactivador/cofactor que interacta funcionalmente con el Oct-1 es una diana
molecular para la IL-4 que media la inhibicin del gen Nos2 y que la IL-4 activa al Stat6 que reprime al OCT-1-dependiente de la
transcripcin al competir con estos coactivador/cofactor.