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Bioqumicas y Farmacuticas
Gua de ejercicios
Qumica Biolgica
2014
0
0.01
20
0.140
40
0.267
60
0.400
70
0.750
80
0.525
100
0.638
125
0.760
150
0.775
Se analizaron por este mtodo una serie de soluciones desconocidas de cido pirvico (1 ml de cada
una) obtenindose las siguientes lecturas de absorbancia a) 0.565; b) 0.125; c) 0.683; d) 0.889. Por
otro lado, 100 l de una solucin patrn 5 mM de cido pirvico (PM=88.06) mostr una lectura de
0.335 (considerar bco. de reactivos de 0.01) en un volumen final de 3 ml. Grafique la curva de
calibracin con los resultados mostrados en la tabla. Calcule la concentracin en g/ml de las
soluciones desconocidas usando la curva previamente realizada y el valor de la solucin patrn como
nico dato. Compare los resultados.
AMINOCIDOS
1.
Cada uno de los grupos ionizables de un aminocido tiene dos estados posibles de ionizacin:
cargado y no cargado (por ejemplo, -COOH, -COO-). Por lo tanto una molcula con n de tales grupos
tiene 2n estados posibles de ionizacin. a) Escriba los cuatro estados posibles de ionizacin del
aminocido Ser. b) A simple vista, indique cul estado de ionizacin predomina a valores de pH=1,
pH=3, pH=pI, pH=7, pH=11.
2.
a) Una mezcla de los siguientes aminocidos se somete a electroforesis a pH=3,9: Ala, Ser, Phe,
Leu, Arg, Asp, e His. Cul ir hacia el nodo (positivo)? Cul ir hacia el ctodo (negativo)? b) A
menudo los aminocidos con cargas idnticas se separan ligeramente durante la electroforesis: por
ejemplo la Gly se separa de la Leu. Puede sugerir una explicacin para esto?
1
3.
El grupo -amino de la Lys tiene un pKa de 10,8. a) Qu fraccin de estos grupos estar
protonada (es decir, -NH3+ en vez de -NH2) en una solucin diluida de Lys a pH=9,5? b) A pH=11.5?
c) Explique por qu el pKa del grupo -amino es mayor que el de un grupo -amino.
4.
El grupo -carboxilo del Glu tiene un pKa de 4,3. a) Qu fraccin de estos grupos podra estar
no protonada (es decir -COO- en vez de -COOH) en una solucin diluida de Glu a pH=5,0? b) A
pH=3,8? c) Explique por qu este pKa es mayor que el grupo -carboxilo.
PPTIDOS
Tabla de pKas de los grupos ionizables:
Aminocido Carboxilo Amino Grupo R
Alanina
2.3
9.9
Glicina
2.4
9.8
Fenilalanina
1.8
9.1
Serina
2.1
9.2
Valina
2.3
9.6
Aspartico
2.0
10.0
3.9
Glutamico
2.2
9.7
4.3
Histidina
1.8
9.2
6.0
Cisteina
1.8
10.8
8.3
Tirosina
2.2
9.1
10.9
Lisina
2.2
9.2
10.8
Arginina
1.8
9.0
12.5
1.
Cul de los siguientes oligopptidos es ms soluble en agua?
a)Phe20 o Gly20; b) Asp20 o Glu20 a pH = 6.0; c) Phe20 o Tyr20
2.
Escriba en frmulas el pentapptido Phe-His-Met-Leu-Asp. Calcule su punto isoelctrico.
Sometido el mismo a una electroforesis, hacia qu electrodo migrar, a pH = 7? y a pH = 2? Indique
en cada caso si el aminocido es polar, apolar, cido, bsico, aliftico, aromtico, etc
3.
Un tetrapptido de punto isoelctrico 7,7 posee un nico aminocido cargado en su estructura.
Considere los siguientes valores pKa -COOH :2,3; -NH2 :9,5. a) Prediga el pKa del grupo lateral de
dicho aminocido; b) En base al dato anterior deduzca de qu aminocido se trata y escriba su frmula
estructural; c) Enuncie qu propiedad especial tiene el aminocido en cuestin.
Escisin especfica de cadenas polipeptdicas:
H H
H H
N C C N C C
R1 O
Aminocido 1
R2 O
Aminocido 2
Mtodo
Tripsina
Quimotripsina
Termolisina
Bromuro de ciangeno
V8
Carboxipeptidasa
4.
Considere el pptido cuya estructura primaria aparece en la figura: a) Qu fragmentos son
producidos por la digestin con tripsina? b) Qu fragmentos son producidos por la digestin con
tripsina despus de la reduccin y la alquilacin del enlace disulfuro? c) Qu fragmentos son
producidos por la digestin con termolisina?
Ala-Val-Lys-Leu-Phe-Arg-Cys-Tyr
|
S-S
|
Glu-Met-Lys-Val-Trp-Gly-Cys-Ala
5.
Ud. asla un pptido del cerebro que posee la propiedad de unirse a receptores del opio. Su
intencin es encontrar la estructura primaria del pptido aislado. Para ello recurre a mtodos utilizados
en la qumica de pptidos y encuentra que: a) Luego de la hidrlisis cida del pptido, la composicin
en aminocidos es: Arg(1) Phe(2) Gly(2) Met(1) Tyr(1). b) El tratamiento del pptido con
quimotripsina gener un aminocido libre, Phe y dos pptidos cuya composicin en aminocidos
result: Gly(2) Tyr(1) y Arg(1) Phe(1) Met(1). c) El tratamiento del pptido con Bromuro de
ciangeno, seguido de separacin cromatogrfica de los productos, arroja la presencia de dos pptidos
cuya composicin en aminocidos resulta ser: Arg(1) Phe(1) Met(1) y Gly(2) Phe(1) Tyr(1). Cuando
ambos pptidos fueron tratados con Cloruro de dansilo, solamente se encontr Phe dansilada. Deduzca
Ud. la secuencia del pptido.
6.
En base a los datos que se detallan, determine la estructura de un antibitico polipeptdico del
Bacilus brevis. Este antibitico forma complejos con iones metlicos y aparentemente destruye el
transporte inico a travs de las membranas, matando a ciertas especies bacterianas. En el anlisis de la
estructura Ud. encuentra que: a) La hidrlisis cida completa del pptido seguida del anlisis de
aminocidos dio cantidades equimoleculares de Leu, Pro, Phe, Orn, Val. b) La estimacin del PM dio
1200 aprox. c) No se hidroliz con Carboxipeptidasa. d) El tratamiento del pptido con
Fluorodinitrobenceno seguido de hidrlisis completa y cromatografa no gener ningn derivado
dinitrofenilado en N alfa. e) La hidrlisis parcial del pptido seguida de separacin cromatogrfica y
secuenciacin gener los pptidos siguientes:
Leu-Phe
Val-Orn-Leu
Phe-Pro
Orn-Leu
Phe-Pro-Val
Val-Orn
Pro-Val-Orn
7.
Ud. aisl de un homogenado de cerebro un pptido con actividad de encefalina (opioide). Estos
se unen a receptores localizados en el cerebro, que unen drogas derivadas del opio (morfina) que
disminuyen el dolor. Al analizarlo encuentra que: a) La hidrlisis completa en HCl 6 M, 110C
seguida del anlisis de aminocidos indica la presencia de Gly, Leu, Phe y Tyr en una relacin 2:1:1:1.
b) El tratamiento del pptido con 2,4-dinitrofluorobenceno seguido de hidrlisis completa y
cromatografa indic la existencia de Tyr-DNP. No se encontr Tyr libre. c) La hidrlisis con
quimotripsina seguida de cromatografa indic la presencia de Leu y Tyr libres, y un pptido cuya
composicin en aminocidos indic la presencia de Gly y Phe en una relacin 2:1. Determine la
secuencia de esta encefalina.
PROTENAS
1.
Mientras la mayora de las bacterias mueren a temperaturas superiores a 50 C, algunas especies
termoflicas sobreviven entre 70 y 80C. De qu modo(s) general(es) esperara que las protenas de
las bacterias termoflicas difieran de las protenas anlogas de las bacterias comunes?
2.
Suponga que le han dado cantidades pequeas de tres protenas desconocidas, A, B y C. Su
instructor de Bioqumica le informa que una protena es predominantemente hlice alfa, otra hoja beta
y la tercera de triple hlice de colgeno. Su laboratorio est equipado con un analizador de
aminocidos.
Protenas
Residuos no polares
Residuos polares
Glicina
Prolina + Hidroxiprolina
A
35
20
45
--
B
16
59
8
1
C
17
25
33
22
3.
Como parte de un proyecto de laboratorio de Bioqumica de pregrado, Ud. purific tres
polipptidos de aproximadamente igual peso molecular, a partir de plasma humano. Usando varias
tcnicas fsicas Ud. estableci que en sus estados nativos uno de los polipptidos es monomrico (una
molcula en forma de cigarro), el segundo es monomrico y casi esfrico y el tercero es la subunidad
de un tetrmero de subunidades esfricas idnticas. Su compaero de laboratorio determin las
composiciones aminoacdicas de las tres protenas. Sin embargo, cuando le trae los datos indicados en
la TABLA, Ud. descubre que l no anot la posicin correspondiente a cada protena. Su profesor le
dice que Ud. debera deducir cul es cul, simplemente a partir de las mismas composiciones de
aminocidos. Qu composicin le asignara a cada protena y por qu?
Protena
Residuos polares
Residuos no polares
Glicina
Prolina + Hidroxiprolina
4.
A
131
54
9
8
B
59
118
9
13
C
99
88
8
10
Solvente
Buffer
Cloruro de Guanidina
Cloruro de Guanidina + 2-Mercaptoetanol
PM
200.000
100.000
25.000 + 75.000
Teniendo en cuenta que el cloruro de guanidina es un agente caotrpico (desnaturalizante) y el 2mercaptoetanol es un agente reductor, caracterice la estructura cuaternaria de esta protena.
5.
El desplegado de la hlice alfa de un polipptido para formar un ovillo al azar est acompaado
por un gran descenso de la rotacin especfica de la luz polarizada. Estudiando a los pptidos
poliglutamato y polilisina se obtuvo la siguiente grfica:
a) Asigne cual de los grficos corresponde a cada pptido. Prediga las conformaciones de la poliLys y
el poliGlu a pH 2 y 12. b) Explique el efecto de los cambios de pH en la conformacin de los pptidos.
c) Por qu las transiciones conformacionales ocurren en un rango tan estrecho de pH?
Un analista determin la concentracin de una solucin pura de una protena desconocida
empleando el mtodo del Biuret y la absorbancia a 280 nm, utilizando para ambos procedimientos una
solucin de albmina srica bovina de 0,5 mg/ml como patrn. Los resultados que obtuvo se muestran
en las tablas siguientes:
6.
Testigo(patrn)
50 l
1 cm
0,080 UA
0,550 UA
Muestra Incgnita
40 l
1 cm
0,080 UA
0,350 UA
Absorbancia a 280 nm
Cubeta (paso de luz)
Lectura
Testigo
0,5 cm
0,310 UA
Muestra Incgnita
0,5 cm
0,285 UA
a) Calcule la concentracin proteica por ambos mtodos. b) Interprete los resultados considerando
errores experimentales inferiores al 10 %.
7.
Un investigador purifica una protena monomrica estructural de msculo a homogeneidad. Con
el objeto de determinar la concentracin de la solucin obtenida, aplica el mtodo de Sedmark y
Grossberg sobre 0.5 ml de la solucin proteica y sobre 0.1 ml de un testigo de albmina, obteniendo
valores de absorbancia (Abs620/Abs465) de 0.2 y 0.3, respectivamente. La solucin de albmina usada
como testigo present un valor de absorbancia a 280 nm de 0.05 (280 = 6.65 (g%)-1 cm-1). a) Exprese
la concentracin de la protena purificada por el investigador en M, sabiendo que el PM de la misma
es 25.000 Da. b) Alcuotas de 1.0 ml de la solucin proteica purificada son sometidos a oxidacin o
reduccin, y luego incubadas con un reactivo especfico de restos sulfhidrilos (-SH)
(Eosin-5-maleimida, 523 = 85.000 M-1 cm-1), que reacciona en relacin estequiomtrica 1:1 con los
mismos. Luego de que las alcuotas reaccionan totalmente con el reactivo, se las dializa para eliminar
la eosin-5-maleimida que no se uni a la protena (sin cambiar el volumen de la muestra proteica
dializada), y se realizan medidas de absorbancia a 523 nm, obtenindose valores de absorbancia de
0.034 (protena oxidada) y 0.105 (protena reducida). Indique cuntos moles de residuos de cistena
reaccionan por mol de protena. A qu se debe la diferencia de absorbancia obtenida en las distintas
condiciones?
SEPARACIN DE BIOMOLCULAS
1.
La cromatografa de filtracin en gel o de tamiz molecular es un mtodo de separacin proteica
basado en sus tamaos (o, ms precisamente, en sus radios efectivos en solucin, los cuales son
proporcionales, para protenas esfricas, a la raz cbica del peso molecular). Una solucin proteica se
coloca en una columna empacada con pequeas esferas de polmeros suficientemente hidratados y
entrecruzados (Sephadex). Las protenas de tamaos diferentes varan en su capacidad de penetrar los
poros hidratados de las esferas. Las protenas ms pequeas penetran ms rpidamente estos poros y a
medida que bajan en la columna lo hacen ms lentamente que las protenas de mayor tamao. Una
segunda tcnica de separacin de protenas es la electroforesis en gel de poliacrilamida donde las
protenas se someten a un campo elctrico. Cuando se lleva a cabo la electroforesis en presencia de un
agente desnaturalizante, el dodecil sulfato de sodio (SDS), las molculas proteicas se separan por
tamao, las ms pequeas migran ms rpidamente. (El SDS desnaturaliza las protenas unindose a
ellas en forma no especfica y dndoles una relacin constante de carga/masa).
6
Ambos procedimientos separan las protenas con base en el tamao y utilizan polmeros entrecruzados
como medio de soporte. Cmo es posible que en la filtracin en gel, las molculas pequeas se
retarden con respecto a las mayores, mientras que en electroforesis en gel de poliacrilamida ocurre lo
contrario?
2.
Una mezcla de dos protenas se sembr en una columna cromatogrfica y se obtuvo el perfil de
elucin mostrado. Las dos fracciones correspondientes a los mximos de los dos picos (n 10 y 26) se
sometieron a ensayos de Gornall (0,2 ml muestra + 0,8 ml de H2O + 4 ml de reactivo) y Bradford (0,1
ml muestra + 0.4 ml de H2O + 0,5 ml de reactivo) para medir la concentracin de protenas, dando los
resultados mostrados en la tabla.
0.4
0.35
Abs 280 nm
Fraccin
10
26
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0
10
15
20
25
30
35
N fraccin
a) Utilizando las siguientes curvas de calibracin calcule las concentraciones de protenas en mg/ml de
las dos fracciones mencionadas. Si esto no fuera posible, explique cmo procedera experimentalmente
para determinar la concentracin de protenas en dicho caso. b) La muestra con mayor concentracin
de protenas es la que presenta menor absorbancia 280nm? Explique esta aparente contradiccin.
Bradford
Gornall
0.30
0.5
0.25
0.4
Abs 595
Abs 530
0.20
0.3
0.2
0.15
0.10
0.1
0.05
0.00
0.0
0
500
1000
1500
proteina (g)
2000
2500
3000
10
15
20
25
30
35
proteina (g)
3.
Usted tiene una mezcla de tres protenas A, B, C, con pI de 3.5, 6.5 y 10 respectivamente y
quiere separarlas por una columna de DEAE-celulosa. Teniendo en cuenta que el grupo DEAE tiene
un pKa = 9,5. Qu pH usara para la separacin? Qu orden de elucin esperara encontrar eluyendo
con un gradiente de KCl entre 0 a 1 M?
4.
La Carboximetilcelulosa es una resina de intercambio catinico con un pKa de 4.5. Ud. tiene
tres protenas A, B y C de pI 5, 8 y 10 (no estrictamente en ese orden). Al sembrarlas en esta resina y
eluir con un gradiente de pH de menor a mayor eluyeron en el siguiente orden: B A C. Estas mismas
protenas, en una columna de Sephadex G-100 eluyeron cmo de un peso molecular 50.000, 100.000 y
75.000 y en el siguiente orden: A, B y C. En un gel con SDS, A y C presentaron una nica banda de
PM 50.000 y B present dos bandas de PM 50.000 y 25.000. Identifique A, B y C.
5.
Suponga que desea purificar por cromatografa de intercambio inico una enzima del
metabolismo del ADN, cuyo sustrato es ADN. Seleccionara una resina de intercambio aninico o
catinico? Por qu?
6.
a) Determine la carga neta de la molcula a pH=3, 8 y 12. b) Estime el punto isoelctrico del pptido.
c) Se somete al pptido a la accin de la termolisina. Escriba la frmula estructural de los pptidos
resultantes. d) Los pptidos obtenidos en el item anterior se someten a una cromatografa de
intercambio inico en sulfonil-celulosa (pKa=1,2). Si la columna est equilibrada a pH=5, qu
pptido eluir y cul quedar retenido? Cmo hara para eluir este ltimo?
7.
a) Escriba la frmula del aminocido X si el pI del pptido es 6,7. b) Determine a que pH no migrara
en una electroforesis para X = Ser. c) Indique que fragmentos obtendra por digestin con:
i)Termolisina para X = Leu, ii) Quimotripsina para X = Phe. d) Los pptidos obtenidos en el tem
anterior (en ambas digestiones) se encuentran en una mezcla con un 3er pptido (Pptido A con pI = 5)
Mediante que mtodo separara el pptido A. Explique.
8.
Tres protenas de puntos isoelctrico 5,0; 7,3 y 6,5 se denominaron con las tres primeras letras
del alfabeto griego segn su posicin en un isoelectroenfoque, siendo alfa la ms cercana al nodo y
gamma la ms cercana al ctodo. a) Cul es el pI de cada uno? b) Cul de las protenas eluir
primero durante una cromatografa en carboximetilcelulosa a pH 5,8? Por qu? c) Si alguna protena
quedara retenida, cul o cules seran y cmo las eluira? d) Durante una electroforesis en
poliacrilamida a pH 8, beta present la mayor movilidad electrofortica. Es posible? Por qu?
9.
Para corroborar que realmente se trata de dicho pptido y para chequear su pureza, decide realizar un
isoelectroenfoque empleando 4 alcuotas que fueron sometidas a distintos procedimientos: A) en
medio oxidante dbil; B) en medio reductor; C) en presencia de tripsina (escinde enlaces peptdicos
del lado carboxilo de Lys o Arg); D) en presencia de tripsina en medio reductor. En base a estos datos
prediga cuales sern los resultados obtenidos al sembrar las 4 alcuotas en un gel de isoelectroenfoque
y esquematice el patrn de bandas que observara finalizada la corrida electrofortica en cada caso.
Justifique su respuesta.
10.
Gliceraldehdo
3-P-Deshidrogenasa
Concentracin
de protena
en el eludo
Aldolasa
Mioglobina
Catalasa
Ovoalbum.
175
213
234
244
285
N fraccin
PM (x104)
16
6
4
1.6
N de fraccin
175
213
234
285
Se recogieron fracciones de 1,6 ml. y el volumen vaco de la columna previamemte determinado con
azul de dextrano fue de 200 ml. VT = 500 ml. Se quiso determinar el PM de
gliceraldehdo-3-P-dehidrogenasa. Utilizando la misma columna, en las mismas condiciones se
observ que la enzima apareci en la fraccin 244.
Indique el peso molecular de la misma. Cmo procedera experimentalmente si quisiera estudiar la
estructura cuaternaria de dicha protena?
11. Las protenas denominadas histonas juegan un papel clave en el empaquetamiento del DNA: ste
se enrolla alrededor de las histonas para formar los nucleosomas, partculas engarzadas como las
cuentas de un collar. Una mezcla de tres protenas globulares, entre ellas la histona H4, presenta la
siguiente composicin de aminocidos:
Protena
A
B
C
blanco. Como testigo se utilizaron 40 l de BSA 1mg/ml (PM 66 kDa) y se obtuvo una absorbancia de
0,85. Exprese la concentracin en g/l de la protena en la muestra.
13. Una alcuota de 0.1 ml de una mezcla de triglicridos y una protena pura se agit en
benceno:agua (3 ml:2 ml). a) En qu fases se distribuyen los distintos componentes de la mezcla? Se
sembr una alcuota de la fase que contena la protena en una columna de Sepharosa 6-B previamente
equilibrada. Se recogieron fracciones de 2 ml. Las protenas marcadoras fueron: A, B, C, D y E con
pesos moleculares de 160, 90, 60, 40, 16 kDa, respectivamente. La curva de calibracin resultante se
muestra a continuacin. El valor de Kav de la muestra se calcul en 0.28. Adems, se corri una
electroforesis con SDS en las siguientes condiciones: I) la protena se hirvi previamente con DTT
(agente reductor), II) la protena se hirvi sin agente reductor. El patrn electrofortico se muestra en
la figura. b) Indique el peso molecular de la protena nativa. c) Infiera la composicin cuaternaria de la
protena. Por otro lado se estim la concentracin de protena por absorbancia a 280 nm, utilizando un
testigo de BSA de 0.5 mg / ml, con una alcuota de 1 ml y una cubeta de 0,5 cm de paso. Se obtuvo
una Abs. de 0,4 para el testigo y de 0,295 para la muestra. d) Teniendo en cuenta que toda la protena
pas a la fase correspondiente, determine la concentracin de la misma en la mezcla original.
kDa
90
PM
II
I
2.4
60
2.2
2.0
40
Log
PM
1.8
1.6
1.4
16
1.2
1.0
0.25
0.3
0.35
0.40
0.45
Kav
14. A) Usted copurific 2 enzimas ( y ) que catalizan la misma reaccin (isoenzimas) y con el fin
de separarlas utiliza una columna de exclusin molecular en las siguientes condiciones: i) en presencia
de glicerol 20 % (un estabilizante de la estructura cuaternaria) y ii) en ausencia de ste. Usted
determina el perfil de elucin de estas proteinas a travs de absorbancia a 280 nm.
Esta columna fue previamente calibrada con diferentes protenas generando la siguiente curva de
calibracin. a) Prediga cul sera el peso molecular y la probable estructura de ambas isoenzimas,
sabiendo que es la de mayor peso molecular. b) Qu otra tcnica utilizara para confirmar este
resultado o bien para obtener ms informacin? Explique.
B) Ud. realiza un isoelectro-enfoque de las protenas puras y determinando los puntos isoelctricos
de ambas protenas. Usted sabe por bibliografa que , tiene un rango de estabilidad de pH entre 6 y
11. a) Como paso alternativo en la purificacin de ambas protenas podra usarse una columna de
CM-celulosa (pKa=4.5) para separar ambas protenas? Si es as, explique qu pH usara para equilibrar
esta columna. b) Cmo hara para elurlas?
ABS.
280 nm.
Con Glicerol
Sin glicerol
V. elucin
19
27 (ml)
10
15. Se purific una protena estructural a partir de dos bacterias (A y B) aislados de diferentes
fuentes. Con las protenas purificadas se corri una electroforesis de poliacrilamida en presencia de
SDS en las siguientes condiciones, (+): la protena se hirvi 10 minutos en presencia de
2-mercaptoetanol, (-): la protena se hirvi 10 minutos sin agente reductor. Luego de la corrida
electrofortica, el gel se tio con Coomassie Blue y se observ el patrn indicado. Por otro lado, las
preparaciones proteicas se sembraron en una columna de exclusin molecular. La masa molecular de
los marcadores utilizados para calibrar esta columna fueron: 30, 100, 210 y 440 kDa. El cromatograma
obtenido es mostrado abajo. La protena de inters eluy en ambos casos en la fraccin 133. Se
recogieron fracciones de 1,5 ml. a) Indique la masa molecular nativa de las protenas aisladas.
b) Infiera la estructura de ambas protenas c) considerando las estructuras propuestas en el tem
anterior, y teniendo en cuenta que una de las bacterias fue extrada de una fuente termal, prediga cul
protena fue aislada de cada bacteria.
A
+
B
-
Abs 280 nm
210
70
50
30
117
142
156
190
N de Fraccin
LogPM(KDa)
16. Le han entregado una muestra supuestamente pura de la protena monomrica lactato
deshidrogenasa. Para establecer su PM inyecta la muestra en una columna de Sephacryl (exclusin
molecular) y obtiene un nico pico a un Ve de 34 ml, el cual es comparado con los datos obtenidos
para las protenas marcadoras (fig1). Como paso siguiente realiza una electroforesis en dos
dimensiones de la muestra y luego de tincin por azul de Coomassie para protenas totales, obtiene el
resultado indicado en la fig 2. Para calcular el pI grafica los valores de pH del gel en funcin de la
distancia desde el nodo segn los datos de la tabla. En base a estos experimentos: a) Exprese el PM
aparente de la protena. b) A qu puede deberse el resultado obtenido en base al gel 2D. Qu puede
decir acerca de su muestra? Podra calcular el pI de la lactato deshidrogenasa? Calcule un valor
probable. c) Agregara algn paso en la purificacin de la lactato deshidrogenasa? Cal?
Distancia PH
desde
el
nodo
(cm)
2
1
24
26
FIG 1
28
30
32
Ve (ml)
34
36
38
40
6
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
8.5
8.0
7.6
7.1
6.4
6.0
5.6
5.4
4.5
4.0
3.4
3.0
11
2.4
-DTT
A
90
60
2.2
2.0
1.8
Log PM
40
1.6
1.4
16
1.2
1.0
0
10
20
30
Ve
40
18. Ud. recibe una muestra pura de protena y procede a determinar su concentracin por el mtodo
de Bradford. Prepara 2 ml de un testigo de albmina pesando 2 mg de la misma. Toma 5 l de esta
solucin y la diluye hasta 500 l de agua destilada y utiliza 150 l de esta solucin como testigo
obteniendo una absorbancia a 595 nm de 0,22. Para 25 l de la solucin proteica en estudio se obtiene
una abs de 0,25. Cuando se realiza una electroforesis en condiciones nativas se obtiene un PM de
600.000 daltons, mientras que cuando se prepara la muestra con cloruro de guanidina se obtiene una
nica banda de 150.000 daltons. El mismo resultado es obtenido si, adems, la muestra se trata con 2mercaptoetanol. Una alcuota de 1,5 ml de la solucin proteica se incub con eosinmaleimida
(reacciona con grupos -SH, 523= 85.000M-1 cm-1) obtenindose, luego de dilisis exhaustiva, un valor
de absorbancia a 523 nm de 0,0384. Posteriormente, se trat una alcuota de 1,5 ml de la protena con
un agente reductor y luego con eosinmaleimida, obtenindose, en este caso, un valor de absorbancia a
523 nm de 0,1153 luego de dilisis exhaustiva de la muestra. a) Exprese la concentracin de la
protena en M. b) Indique la estructura cuaternaria de la protena sealando el estado de xidoreduccin de cada Cys y el nmero de Cys por molcula.
19. Usted tiene una mezcla de 4 protenas con las siguientes caractersticas (cada crculo representa
un polipptido y todos los residuos de cistenas se encuentran indicados):
12
A
-S-SPI
PM nativo (kDa)
PM subunidades (kDa)
6
60
30
B
-SH
4,5
60
60
SHSH7,1
400
100
C
-SH
-SH
D
S-S
S-S
5,2
650
2x 150
2x 175
y = -0.01x + 6
log PM
6
5.5
5
4.5
4
30
50
70
90
110
130
150
170
190
Ve (ml)
13
ENZIMOLOGA
DETERMINACIN DE LOS PARMETROS CINTICOS
2.
a) La constante de Michaelis, Km
* Vara con la velocidad de la reaccin enzimtica
* Es constante para una enzima determinada sea cual fuera el sustrato usado.
* Es la constante de velocidad para la descomposicin del complejo ES.
* Es la concentracin de sustrato a la cual se obtiene una velocidad igual a la mxima.
b) Usando una concentracin de sustrato equivalente al 20% de Km, se obtuvo en una reaccin
enzimtica una velocidad de reaccin de 1 mol/min. Para esta reaccin enzimtica, el valor de Vmax:
* es igual a 2 mol/min
* es igual a 2Km
* es igual a 6 mol/min
Se estudi para una protena X la dependencia de la actividad enzimtica con la concentracin de
sustrato y se obtuvieron los siguientes valores de velocidad (moles/min.mg):
3.
[S] (mM)
V
0,25
33
0,50
50
0,67
57
1,00
67
Teniendo en cuenta que el peso molecular de la protena es 300.000: a) Calcule los valores de Km,
Vmax. b) Exprese el valor de velocidad mxima en Katal/mg. c) Calcule el nmero de recambio y
explique el significado del mismo.
Dos estudiantes (A y B) aislaron independientemente la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) de
msculo de caballo. Esta enzima cataliza la siguiente reaccin:
4.
2.10-6
5.10-6
1.10-5
5.10-5
1.10-4
2.10-4
1.10-3
16
25
33
50
50
75
83
125
90
136
99
148
100
150
14
a) Sin graficar, estime aproximadamente Km y Vmax. Justifique. b) Proponga una explicacin para la
discrepancia observada entre los parmetros cinticos estimados por A y B. c) Qu variables
graficara para obtener Km y Vmax? Justifique.
La actividad de una muestra de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) pura, de concentracin
2 mg/ml, se ensay por un mtodo discontinuo midiendo la aparicin de piruvato mediante un ensayo
colorimtrico. La dinitrofenilhidrazina (DNFH) y el piruvato forman una hidrazona que luego del
agregado de NaOH presenta un mximo de absorbancia a 505 nm. As, 10 l de la muestra se
incubaron a 30C con concentraciones saturantes de lactato y NAD+ en un volumen final de 3 ml.
Luego de 3 min la reaccin enzimtica se detuvo por el agregado de 0,5 ml de DNFH. Despus de
10 min se adicionaron 1,5 ml de NaOH 0,4 N y se midi absorbancia de la hidrazona formada a 505
nm, obtenindose un valor de absorbancia de 0,6 una vez restado el blanco.
Para realizar la curva de calibracin del mtodo colorimtrico se trabaj en idnticas condiciones
utilizando una solucin de cido pirvico (PM = 88) 4,4 mg/ml. Los valores obtenidos se muestran en
la tabla.
5.
ml de testigo
Abs (505 nm)
0
0,05
0,05
0,15
0,10
0,25
0,20
0,44
0,30
0,66
0,40
0,85
15
Una enzima cataliza la reaccin S P. Con los siguientes datos estime el valor de Km para dicha
enzima: I) ndice de recambio: 3800 min-1, II) PM de la enzima: 62 kDa. III) Nmero de sitios activos
por molcula de enzima: 3 IV) la actividad enzimtica, ensayada en un medio de reaccin de 1,5 ml
que contena 10 l de una solucin del sustrato 200 mM y una concentracin de enzima de 1,5 mg/ml,
dio un valor de 12 UI/ml de la preparacin enzimtica.
8.
En mamferos existen 5 isoenzimas LDH, cada una de ellas con diferentes propiedades cinticas
y movilidad electrofortica. Una de las isoenzimas se localiza en corazn (H4-LDH) y otra en msculo
(M4-LDH). Se han determinado las siguientes propiedades cinticas para ambas isoenzimas de origen
humano purificadas a homogeneidad:
9.
Isoenzima
H4-LDH
Km Piruvato (mM)
0,300
M4-LDH
0,025
Ante un dao sufrido por un determinado tejido, hay liberacin hacia el torrente sanguneo de la
correspondiente isoenzima. Es as que suele ser importante, para realizar un diagnstico, no solo
determinar un aumento de LDH en suero, sino establecer qu isoenzima est incrementada. Suponga
que usted est en un laboratorio clnico de guardia y le traen un paciente inconsciente, debiendo usted
determinar si ha sufrido un infarto cardaco o si slo se trata de un agotamiento por ejercicio muscular
excesivo. Luego de determinar que los niveles de LDH en suero estn elevados usted realiza un
estudio cintico de la actividad LDH srica. Utilizando alcuotas de 10 l de suero que contena
50 mg/ml de protena usted mide la actividad LDH a distintas concentraciones de piruvato obteniendo
los siguientes resultados:
Piruvato (mM)
Actividad LDH (U/ml)
0,0125
0,33
0,0166
0,40
0,0250
0,50
0,0500
0,66
En base a estos datos indique qu diagnstico hara del paciente: infarto de miocardio o
agotamiento por ejercicio muscular excesivo. Justifique su respuesta.
Se procedi a purificar a homogeneidad la enzima Glutamato-piruvato transaminasa a partir de
hgado de rata. La enzima cataliza la reaccin:
-cetoglutarato + alanina glutamato + piruvato
10.
Luego de varios pasos de purificacin se midi actividad enzimtica de la preparacin, para lo cual se
contaba con dos mtodos alternativos.
a) El primer mtodo de medida acopla una segunda reaccin catalizada por la enzima Lactato
deshidrogenasa (LDH): Piruvato + NADH + H+ Lactato + NAD+, midindose la disminucin de la
absorbancia a 340 nm ( NADH = 6,22 mM-1 cm-1). Se incubaron 200 l de la preparacin enzimtica en
un volumen final de 1 ml que contena -cetoglutarato, Ala, NADH y LDH. La disminucin de la
16
absorbancia obtenida fue de 0,62 por minuto. Calcule las UI/ml de la preparacin enzimtica; b) Por el
otro mtodo alternativo de medida se preincubaron 100 l de la preparacin enzimtica en un volumen
final de 1 ml con -cetoglutarato y Ala. A los 10 minutos, la reaccin se detuvo con el agregado de
0,5 ml de 2,4 dinitrofenilhidrazina y adems se agregaron 5 ml de NaOH. Sabiendo que 1 ml de testigo
de piruvato 1 mM presenta con el mismo mtodo de medida una absorbancia de 0,2, calcule la
absorbancia que obtendra en este caso; c) Describa las diferencias entre los mtodos utilizados.
La acetil-CoA carboxilasa (ACCasa) cataliza la carboxilacin, dependiente de ATP, del acetilCoA para formar malonil-CoA, primer intermediario en la sntesis de cidos grasos:
Acetil-CoA + ATP + CO2 Malonil-CoA + ADP + Pi.
La enzima fue aislada a partir de hojas de trigo y se llevaron a cabo los siguientes estudios cinticos:
Se determin la actividad enzimtica en un volumen final de 200 l en las siguientes condiciones:
100 mM Tricina-KOH (pH 8,0), 40 mM ATP, 2,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 1mM DTT, 30 mM acetilCoA, 30 mM [14C] NaHCO3 (3,33x 108 cpm; cpm=cuentas por minuto) y 1,8 g de la protena
purificada. La reaccin comenz con el agregado de la enzima, transcurri durante 10 minutos a 30C
y se interrumpi por la adicin de 50 l de 6 N HCl. La acidificacin del medio provoca la
inactivacin de la enzima y la eliminacin del HCO3- remanente por conversin en CO2. Alcuotas de
50 l de la mezcla de reaccin fueron transferidas a discos de papel de filtro. Los papeles se secaron a
temperatura ambiente y su radioactividad se cont en un contador de centelleo. El valor promedio de
radioactividad por disco correspondi a 3,5 x 106 cpm. Determine la velocidad de reaccin en U/mg.
11.
TABLAS DE PURIFICACIN
2.
Se parti de 200 g de hgado de bovino obtenindose un extracto inicial de 1200 ml, que tena una
concentracin de protena de 10 mg/ml. Para medir actividad enzimtica se incub una alcuota de 50
17
l con el sustrato a 30C en 1 ml de medio. La reaccin se cort directamente a los 10 min por el
agregado de 2 ml de reactivo de color para fosfato. La reaccin de color se lee a 740 nm en una cubeta
de 1 cm de camino ptico. La Abs740 fue de 0,49 con un blanco de medida de 0,12. El coeficiente de
extincin del producto de la reaccin de color es de 3700 M-1.cm-1.
Se realiza luego un corte con (NH4)2SO4 al 50 % rescatndose la fosfatasa en el precipitado, el que fue
redisuelto en 80 ml, recuperndose 1680 mg de protena con una actividad total de 504 U.
Posteriormente, se realiz una cromatografa en Sephadex G-25 recogindose 10 tubos de 12 ml cada
uno con actividad enzimtica. La concentracin de protena en el conjunto fue de 10,8 mg/ml con un
rendimiento, respecto del paso anterior del 80%. Como ltimo paso se efectu una cromatografa de
afinidad y se obtuvieron 144 U de enzima con actividad especfica de 3,6 U/mg en un volumen de
20 ml.
En base a estos datos a) Construya la Tabla de Purificacin. b) Cul es la purificacin y el
rendimiento total alcanzados? c) Cul es la etapa individual que dio mayor purificacin y cul la de
mayor rendimiento? d) Describa el fundamento del ltimo paso de purificacin empleado. e) Seale si
todas las etapas empleadas se justifican. Fundamente su respuesta f) Explique la importancia de
realizar la cromatografa de exclusin molecular Sephadex G-25.
La dihidropicolinato sintetasa (DHDPSasa) se purific y caracteriz a partir de cultivos de trigo
en suspensin. Dicha enzima cataliza la siguiente reaccin, donde ASA y DHDP representan a
aspartato -semialdehdo y cido 2,3 dihidropicolnico, respectivamente.
3.
18
Se parte de 500 g de hojas de espinaca, obtenindose 1.500 ml de un extracto crudo con una
concentracin de protena de 20 mg/ml. La medida de actividad se determin con una alcuota de 30 l
por un mtodo continuo, midindose la aparicin de NADPH (NADPH = 6200 M-1.cm-1) en una cubeta
de 3 ml y 1 cm de camino ptico, obtenindose un A/10 min= 1,24.
Se realiz luego una cromatografa en DEAE-celulosa, recogindose 180 ml que contenan 1800 U de
actividad enzimtica y 2250 mg de protena. El volumen total de este paso (180 ml) fue dividido en
dos volmenes iguales. I) Una de las fracciones fue sometida a cromatografa de adsorcin
(hidroxilapatita), recogindose 5 tubos de 4 ml cada uno, con actividad deshidrogenasa. La
concentracin de protena en el conjunto fue de 0,94 mg/ml, con un rendimiento respecto al paso
anterior del 50%. II) La otra fraccin de la columna de DEAE-celulosa fue sometida a una
cromatografa de afinidad; en la que se recuperaron 800 U de enzima y 4 mg de protena en un
volumen de 15 ml.
a) Calcule el rendimiento y la purificacin para cada uno de los procedimientos alternativos empleados
b) La electroforesis en gel de poliacrilamida mostr que la enzima proveniente de uno de los
procedimientos migraba como una nica banda de protena (Rf = 0,33), mientras que la proveniente
del otro procedimiento mostraba la presencia de tres bandas proteicas (Rf = 0,25; Rf = 0,325 y Rf =
0,65). En base a la tabla de purificacin podra adjudicar a qu procedimiento de purificacin
corresponde cada electroforesis obtenida. Justifique su respuesta.
Dos grupos de trabajo presentan independientemente protocolos para la purificacin de una
enzima desde un mismo tejido de plantas. Para medir la actividad enzimtica se incuba una alcuota de
30 l de enzima con el sustrato en 1 ml de medio de reaccin. La reaccin se corta a los 5 minutos por
el agregado de 2 ml de reactivo de color especfico para el producto de la reaccin ( =3700 M-1 cm-1)
Se utiliza una cubeta de 1 cm de camino ptico. La medida del blanco de reaccin da un valor = 0,1.
Los volmenes indicados se refieren a la cantidad recuperada en cada paso.
5.
Protocolo 1: I) Extracto Crudo: 200 ml, Abs=0,56, [protena]= 50 mg/ml; II) Fraccionamiento con
PEG: 300 ml. Se purifica 10 veces la enzima, con un rendimiento de 80%; III) Cromatografa en
DEAE-celulosa: 280 ml, Act Especfica = 5 y 280 U de enzima; IV) Cromatografa en columna de
Hidroxilapatita: 25 ml, 84 U de enzima y 8,4 mg de protenas.
Protocolo 2: I) Extracto Crudo: 400 ml 2,5 U/ml y una Act Especfica = 0,05; II) Columna de
Sephadex: 500 ml Se purifica 2 veces la enzima, con un rendimiento del 50%; III) Precipitacin con
(NH4)2SO4 y desalado: 200 ml, 1 U/ml y 0,3 U/mg; IV) Cromatografa en Affigel Blue: 30 ml.
Purificacin parcial de 10 veces, y un rendimiento parcial del 80%
a) Indique la purificacin y rendimiento de cada protocolo y comprelos. b) Indique la purificacin
parcial y rendimiento parcial de cada paso. c) Proponga un posible protocolo alternativo (consistente
en extracto crudo ms tres pasos) para mejorar la purificacin. Justifique brevemente.
Durante la purificacin de la enzima ureasa (Urea + H2O 2 NH4+ + CO2) se obtuvo 900 ml de
Extracto Crudo (EC) con una concentracin de protena de 3,33 mg/ml. Su actividad se midi
siguiendo la disminucin de la Absorbancia a 340 nm utilizando la reaccin acoplada NH4+ + KG +
NADH + H+ Glu + NAD+ ( NADH = 6200 M-1 cm-1). El agregado de 20 l de EC a 1 ml de la mezcla
de reaccin produjo un A = - 0,800 en 4 minutos en una cubeta de 1 cm de camino ptico. Un corte
con (NH4+)2SO4 dio lugar a un precipitado que se redisolvi con buffer hasta 150 ml de volumen final.
De esta manera la ureasa se purific 10 veces con un rendimiento del 82,8 %. Luego de pasados por
una columna de Sephadex G-25 se recolectaron 80 ml con 45 mg de protena, purificndose 50 veces
respecto del EC con un rendimiento del 90 % respecto del paso anterior. Su actividad se determin por
el mtodo discontinuo (NH4+ + Fenol + Hipoclorito Azul de Indofenol) cuya curva de calibracin
de NH4+ present una pendiente de 0,6557 UA/mol NH4+. Las condiciones de la colorimetra fueron
6.
19
las mismas para la curva y la muestra. a) Cul fue la absorbancia medida por este ltimo mtodo para
la muestra si se emplearon 40l de ureasa obtenida en la ltima etapa? Tenga en cuenta que para la
ureasa una unidad de actividad enzimtica (1 UI) se define como la cantidad de enzima que cataliza el
consumo de 1 mol de sustrato (urea) por minuto en las condiciones especificadas. b) Realice la tabla
de purificacin.
La enzima mlica cataliza la reaccin: Malato + NADP+ Piruvato + CO2 + NADPH + H+. Se
intent purificar esta enzima a partir de hojas de maz. Para ello se realizaron distintas etapas que
incluyeron la preparacin de un extracto crudo, precipitacin con (NH4)2SO4, cromatografa de
exclusin molecular en Sephadex G-100 y cromatografa de intercambio inico en DEAE-celulosa. La
medicin de protenas se realiz por el mtodo de Gornall. Para ello, alcuotas de 20 l de la
preparacin enzimtica se incubaron con 2 ml del reactivo de Biuret durante 15 min a 37C. El testigo
de ovoalbmina (10 mg/ml) procesado de la misma manera produjo un valor de absorbancia de 0,650
medido a 545 nm. La actividad enzimtica se determin en 1 ml de medio de reaccin que contena
50 mM Tris-HCl pH 8,0, cantidades saturantes de los sustratos y 10 l de la preparacin enzimtica. A
los 10 min de incubacin a 30C, la reaccin se detuvo por el agregado de 2 ml de
dinitrofenilhidracina. Como testigo se utiliz 1 ml de piruvato (PM=88) de 0,5 mg/ml que produjo un
valor de absorbancia de 0,040 medido a 505 nm. En base a los datos suministrados, a) Construya la
tabla de purificacin calculando el rendimiento y la pureza total alcanzados; b) Proponga otros dos
mtodos de medida de la actividad enzimtica. Explquelos brevemente.
7.
Etapa
Abs 505 nm
Extracto crudo
30
0,390
0,050
(NH4)2SO4
Sephadex G-100
DEAE-celulosa
8
4
2
0,253
0,163
0,097
0,166
0,208
0,375
Con el fin de elegir qu paso era ms conveniente para continuar la purificacin, se toman
distintas alcuotas de la muestra y se procede de la siguiente manera:
1.
40 ml fueron sometidos a una cromatografa de exclusin molecular en la que se recuperaron
100 ml que contenan 100 U de actividad y 80 mg de protena.
2.
25 ml fueron sometidos a una cromatografa de adsorcin obtenindose un rendimiento del 50%
y recogindose 10 tubos de 1 ml, con una concentracin de protena de 0.03125 mg/ml.
3.
Con los ltimos 10 ml se realiz una DEAE-celulosa obtenindose 5 ml con una actividad
especfica de 2.5 U/mg y 5 mg de protena.
9.
20
En base a los datos: a) Calcule rendimiento y purificacin para cada uno de los tres procedimientos.
b) Qu procedimiento elegira si su objetivo fuera obtener la enzima lo ms pura posible?
INHIBICIN ENZIMTICA
Luego de purificar la enzima gliceraldehdo 3-fosfato deshidrogenasa se procedi a determinar el
valor de Vmax y Km para el gliceraldehdo 3-fosfato a pH 8,0. Los valores obtenidos fueron los
siguientes: Vmax = 20 U/ml; Km = 1 mM. Luego se volvieron a determinar estos parmetros cinticos
en presencia de cuatro sustancias conocidas A, B, C y D, obtenindose en cada caso los siguientes
valores:
1.
En presencia de A
En presencia de B
En presencia de C
En presencia de D
Km (mM)
2,0
0,5
1,0
6,0
Vmax (U/ml)
20
10
10
10
Glucosa (mM)
0,1
0,2
0,3
0,4
Piruvato (mM)
0
Actividad (U/mg)
9,98
15,02
17,89
20,05
0,4
7,14
10,72
12,86
14,28
a) Determine qu tipo de inhibicin presenta el piruvato con respecto a la glucosa sobre la enzima y
esquematice el mecanismo de inhibicin. b) Calcule Km, Vmax y la constante de disociacin del
complejo hexoquinasa-piruvato. c) Calcule la velocidad de reaccin cuando la concentracin de
glucosa es igual al valor de Km aparente, si el piruvato est presente a una concentracin de 0,4 mM.
Sobre una enzima que cataliza la reaccin S P se prueba el efecto de dos inhibidores X e Y,
obtenindose los siguientes datos de velocidad. Determine la naturaleza de cada inhibidor haciendo un
esquema de la inhibicin. Calcule Km, Vmax y Ki.
3.
21
Velocidad (U/ml)
[S] (mM)
2,00
2,50
3,33
4,00
5,00
Sin agregado
50,00
55,56
62,47
66,67
71,42
+ 12 M X
40,00
45,45
52,63
57,14
62,50
+ 60 M Y
37,03
41,67
47,62
51,28
55,56
Cuando la reaccin enzimtica catalizada por la LDH (lactato deshidrogenasa) se lleva a cabo en
presencia de una concentracin 0,3 mM de un inhibidor X, tanto Km como Vmax disminuyen a un
tercio del valor obtenido en ausencia del inhibidor. Responda el siguiente cuestionario: a) Qu tipo de
inhibicin presenta X sobre el sistema enzimtico? b) Cmo es la afinidad aparente de la enzima por
su sustrato en presencia del inhibidor, comparada con la afinidad real que se observa en ausencia del
inhibidor? Por qu se produce ese cambio en la afinidad? c) Estime Ki del inhibidor X lo ms
exactamente que pueda con los datos disponibles. Si usted necesitase calcular Ki con una exactitud
mayor qu experimentos realizara?
4.
NADPH (mM)
GMP (mM)
0,0
1,0
3,0
4,0
5,0
0,25
0,50
0,67
1,00
0,365
0,248
0,151
0,127
0,109
A340 nm/min
0,564
0,654
0,413
0,497
0,270
0,336
0,230
0,289
0,200
0,254
0,775
0,620
0,443
0,388
0,344
22
de inhibidor es el succinato con respecto a malato y calcule su Ki. c) Represente los grficos
secundarios y de Dixon para ste sistema.
succinato
(mM)
malato
(mM)
0,1
0,2
0,3
0,4
Tabla
0,4
0,8
1,2
1,6
Actividad (U/mg)
9,98
7,14
5,55
15,02 10,72
8,33
17,89 12,86 10,02
20,05 14,28 11,11
4,55
6,82
8,18
9,09
3,85
5,77
6,92
7,69
Se estudia el efecto de dos inhibidores X e Y sobre la actividad de una enzima. Los resultados
del ensayo utilizando 5 l de la solucin enzimtica se muestran en el grfico. Adems, se determina la
actividad en funcin de la cantidad de enzima en presencia de una concentracin constante de cada
inhibidor y se obtienen los datos de velocidad que se detallan en la tabla. Explique los resultados
obtenidos.
8.
23
1/v
Actividad (U)
[X]=100M
l de Enzima 100 M X
1
2
3
4
5
6
[Y]=100M
Sin inhibidor
0
0
0
10
20
30
10
20
30
40
50
60
1/[S]
1.
El grfico adjunto muestra el efecto de la temperatura sobre la actividad de una enzima.
a) Indique las causas por las que vara la actividad enzimtica en funcin de la temperatura
estableciendo efectos directos y efectos indirectos. b) Qu experimento le permitira distinguir entre
efectos reversibles e irreversibles? c) Indique que zona del grfico utilizara para obtener la energa de
activacin (Ea) de la reaccin y como la calculara. Defina Q10. Cul metodologa considera ms
apropiada para el clculo de la Ea?
Actividad (mol/min.mg)
40
30
20
10
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Temperatura (C)
2.
Al ensayar la actividad de una enzima a diferentes temperaturas se obtuvieron los datos
mostrados en la lnea A. Cuando la enzima se preincub a distintas temperaturas durante 15 min y
luego se determin actividad a temperatura ptima, se obtuvieron los datos de la lnea B. Ambos
experimentos se realizaron a concentraciones de sustratos iguales a 100 veces los valores de Km.
T (C) 5
Act. (U/mg)
A
B
1,1
2,5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
2
2,5
4
5
10
30
15
30
22
30
30
30
30
20
20
10
12
7,5
6
2,5
1,5
2,5
24
En base a estos datos: a) Indique la T ptima de la enzima. b) Por qu la actividad enzimtica cuando
se ensay a la temperatura ptima no fue constante para todas las muestras previamente incubadas a
las distintas temperaturas? c) Calcule el Q10 y la energa de activacin.
3.
La ureasa cataliza la hidrlisis de la urea para dar CO2 y NH4+. Cuando se realiz el estudio de
dependencia de la actividad enzimtica con la temperatura, se obtuvieron los datos que figuran en la
grfica. Los experimentos se llevaron a cabo bajo las siguientes condiciones: I- en un medio
medianamente reductor, II- en un medio fuertemente reductor y III en un medio no reductor. En base
al grfico de Arrhenius que se muestra, hipotetice acerca del comportamiento de esta enzima en las
distintas condiciones.
2.6
No Reductor
Reductor Fuerte
Reductor Moderado
2.4
Log Vmax
2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
310
320
330
340
350
360
1/T (*105)
4.
La enzima nucletido pirofosfatasa de Proteus vulgaris es completamente inactivada cuando se
la incuba durante 10 minutos a 70oC y puede ser completamente reactivada por enfriamiento a 37oC.
Se ha establecido que un inhibidor de la enzima copurifica con la misma. Debido a que el mencionado
inhibidor es termolbil, se decide calentar a 100oC para eliminarlo. Un estudiante realiza este
procedimiento y encuentra que la enzima se desnaturaliza. Decide repetir el procedimiento, esta vez en
presencia de una sustancia X (cuya unin a la enzima ha sido previamente descripta), observando que
en esta ocasin la enzima no pierde su actividad. a) Explique estos resultados. b) Qu tipo de
sustancia puede ser X?
5.
Se ha purificado a homogeneidad la enzima ATPasa de hgado de rata (ATP ADP + Pi) y se
midi su actividad a concentraciones de ATP subsaturante (10 M) a distintas temperaturas. Los
resultados obtenidos se indican en la Tabla. En un experimento de preincubacin de la enzima a
distintas temperaturas y medida de la actividad a 25C, se concluye que la enzima pierde actividad a
temperaturas mayores a 35C. a) Sabiendo que el ndice de recambio de la enzima a 30C es de
104 min-1 y que la enzima (PM=50 kDa) posee un solo sitio activo, estime el valor de Km para ATP a
30C. b) Podra estimar el valor de Energa de Activacin de la enzima a partir de estos datos? Si es
as, indique el valor obtenido. (R=2 cal/mol.K).
Temperatura
20C
30C
40C
Act. (mol/min.mg)
25
40
20
6.
El grfico adjunto muestra el efecto del pH sobre la actividad de una enzima medida a
concentraciones de sustrato constante y saturante. a) Enumere las causas por las que la actividad
25
enzimtica puede variar en funcin del pH. b) Plantee un diseo experimental para distinguir entre los
posibles efectos del pH. c) De acuerdo al grfico a qu pH trabajara para realizar los estudios
cinticos de esta reaccin enzimtica? d) Si la enzima es estable y el sustrato no sufre cambios de
ionizacin en el rango de pH estudiados, a qu corresponderan los puntos de inflexin de la curva
(pH 4 y 8)?
7.
Indique si los grficos que se muestran sugieren ionizacin de la enzima libre o ionizacin del
complejo enzima-sustrato. Suponga que en ese rango de pH no hay desnaturalizacin de la enzima,
como as tampoco del sustrato. Justifique brevemente.
Actividad (U/mg)
-1
10
8
6
2 4 6 8 10 12
pH
pH
1/actividad (U/mg
actividad (U/mg)
1/Actividad (U/mg)-1
8.
Un investigador purifica a homogeneidad la enzima malato deshidrogenasa y realiza un estudio
de la actividad de la enzima en funcin del pH utilizando una concentracin de sustrato subsaturante.
Obtiene la grfica A. Sin embargo cuando preincuba la enzima a distintos valores de pH entre 2 y 10 y
luego mide la actividad a pH ptimo observa que la enzima presenta actividad mxima entre pH 4.0 y
8.0. Con el fin de determinar qu aminocidos estaban implicados en la catlisis determina la actividad
de la enzima a concentraciones variables de sustrato y a tres valores de pH, obteniendo el grfico B.
Teniendo en cuenta que el sustrato no sufre cambios de protonacin en el rango de pH estudiado,
indique: a) El rango de estabilidad de la malato deshidrogenasa, el pH ptimo de la enzima. b)
Proponga un modelo (con un esquema) que explique los resultados obtenidos en la grfica B.
c) Cuando el investigador grafica los distintos valores de Km a distintos valores de pH, obtiene que un
grupo con un pKa de 6,2 est implicado en la catlisis. Sin embargo, al estudiar la secuencia primaria
de la enzima y compararla con otras secuencias encuentra que, de todos los residuos ionizables, slo
un residuo de Glu est conservado (pKa COO-=4,0). Podra ser dicho grupo el responsable de los
cambios de la actividad de la enzima? Por qu podra presentar ese valor de pKa?
12
pH 4.0
pH 6.0
6
pH 8.0
3
0
0
1/[S] (mM)-1
26
9.
El grfico A muestra los resultados de los estudios de la estabilidad de la enzima malato
deshidrogenasa purificada de mitocondrias y glioxisomas a distintos pH. Cuando se procedi a realizar
la determinacin del pH ptimo se obtuvo el grfico B a) Indique el pH ptimo de las isoenzimas y
establezca el rango de pH en el cual ambas enzimas son estables. b) Analice las posibles causas de la
disminucin de la actividad a pH mayores y menores al pH ptimo en cada caso. c) Explique cmo
realizara el estudio de estabilidad en funcin del pH, especificando todos los parmetros a tener en
cuenta. d) Segn los resultados obtenidos en el caso de la enzima mitocondrial a pH mayores a 8,5
indique qu grupo/s ionizable/s de la enzima podra/n estar implicado/s en los cambios de actividad
observados. Qu estado de ionizacin presenta dicho grupo en la enzima activa?
120
MDH mitocondrial
100
80
60
40
MDH mitocondrial
MDH glioxisomal
100
Actividad (%)
Actividad (%)
MDH glioxisomal
80
60
40
20
20
0
3
10
11
12
10
11
pH
pH
1.
Describa tres modelos cinticos para una reaccin enzimtica en la que participan dos sustratos.
Describa tambin mtodos de diagnstico para determinar el modelo cintico seguido por una reaccin
enzimtica que involucre dos sustratos.
2.
La glutamato-oxaloacetato aminotransferasa, llamada comnmente transaminasa GOT, es una
enzima que interviene en el metabolismo de los aminocidos y posee importancia clnica para el
diagnstico de patologas hepticas. La enzima posee fosfato de piridoxal como grupo prosttico y
cataliza la siguiente reaccin:
Glutamato + Oxaloacetato Aspartato + 2-Cetoglutarato.
En una investigacin sobre el mecanismo cintico se analiz la dependencia de la actividad enzimtica
con la concentracin de glutamato, a dos concentraciones diferentes de oxaloacetato. Los resultados
obtenidos se resumen en la tabla:
Glutamato (mM)
Experimento
+ 0,1 mM oxaloacetato
+ 0,2 mM oxaloacetato
0,1
2,0
2,2
0,2
3,4
4,2
0,3
0,4
Velocidad (U/mg)
4,4
5,0
5,8
6,6
0,5
5,8
8,0
0,8
6,6
10,0
27
Por otra parte, el aspartato se comport como un inhibidor competitivo respecto del glutamato, cuando
se agreg oxaloacetato en concentraciones saturantes. Proponga en forma esquemtica un modelo
cintico que sea compatible con estas observaciones experimentales.
3.
Una enzima cataliza la reaccin S1 + S2 P1 + P2. Cuando se mide la actividad a
concentraciones variables de S2, manteniendo constante la concentracin de S1 se obtienen los valores
de velocidad (moles/min.mg) que se presentan en la siguiente tabla:
[S2] (mM)
[S1] (mM)
5
10
10
Velocidad (moles/min.mg)
14,5
21,5
25,6
22,5
32,5
38,2
8,7
13,9
30,3
44,4
P1
P2
S1 Variable
S2 Subsat.
S2 Sat.
NC
--NC
NC
S2 Variable
S1 Subsat.
S1 Sat.
C
C
NC
AC
0,5
0,67
2,00
1,0
1,5
2,0
2,5
4,0
1,10
3,35
V (U/mg)
1,45
1,65
4,15
5,00
1,85
5,55
2,2
6,65
Por otra parte, el citrato se comport como un inhibidor competitivo tanto respecto a oxaloacetato
como respecto a acetil-CoA, y otro tanto ocurri con la Coenzima A. Proponga en forma esquemtica
un modelo cintico que sea compatible con estas observaciones experimentales.
5.
Un estudiante purifica una quinasa de un sustrato A (A + ATP A-P + ADP) y decide estudiar
su mecanismo de reaccin. As, incuba la enzima con ATP marcado con 32P. Al cabo de 1 h precipita
28
Una vez purificada la enzima L-Aspartato aminotransferasa, enzima que cataliza la reaccin:
aspartato + oxoglutarato glutamato + oxaloacetato
Se procedi a estudiar el efecto de la concentracin de aspartato a concentraciones constantes de
Oxoglutarato sobre la velocidad inicial. Los valores de velocidad inicial obtenidos (mol/min.mg) se
transcriben a continuacin:
[Aspartato] 0,5 mM
[Oxoglutarato]
Saturante
5 mM
1 mM
18,2
16,7
15,4
1 Mm
2,5 mM
5 mM
Velocidad (mol/min.mg)
33,4
66,6
100,0
28,6
50,0
66,6
25,0
40,0
50,0
10 mM
125,0
77,0
55,0
a) Determine grficamente los valores de Vmax y Km para el aspartato. Indique el valor de Vmax en
UI/mg y en katal/mg. b) Cul es el ndice de recambio, asumiendo que la enzima posee un PM de 50
kDa y que posee 2 sitios activos por molcula? c) Indique el mecanismo de reaccin de esta enzima.
Fundamente brevemente.
7.
Para caracterizar el mecanismo de reaccin y el sitio activo de la enzima se llevaron a cabo dos
experimentos. En el 1 experimento se estudi el efecto de los productos de la reaccin sobre la
actividad enzimtica a concentraciones subsaturantes de malato obtenindose los datos que figuran en
la Tabla 1. En el 2 experimento, 150 g de enzima preincubada durante 30 min en presencia de los
productos de la reaccin o en ausencia de los mismos fueron tratadas 2 hs con N-etilmaleimida (agente
modificador de residuos de cistena) obtenindose los datos de la Tabla 2. El control de la enzima sin
tratar con N-etilmaleimida dio un valor de actividad de 100U/ml. En base a los resultados: a) indique
29
Tabla 1
NAD (mM)
0,025
0,033
0,050
0,100
Sin agregados
33,3
40,0
50,0
66,7
Tabla 2
Sin agregados
+ NADH
+ OAA
Actividad (U/ml)
+ NADH
20,0
25,0
33,3
50,0
+ OAA
16,7
20,0
25,0
33,3
Actividad (U/ml)
16
91
34
las tablas. a) Qu puede decir sobre la cintica seguida por cada enzima? b) Sabiendo que la enzima
tiene un solo sitio de unin del sustrato por subunidad, qu puede decir acerca de las interacciones
de los sitios activos en cada caso? c) Qu grfico realizara para avalar su propuesta? d) Encuentra
alguna diferencia sobre la regulacin que cada enzima podra presentar in vivo por la concentracin
de sustrato? Explique.
Enzima II
V (U/mg)
S (mM)
0
0
0,5
0,5
1
5
2
9,5
4
10
10
10
log (Vmax-v)/v
Enzima I
[S] (mM)
V (U/mg)
0,1
0,9
0,5
3,3
1
5
2
6,6
4
8
10
9,1
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
-0,2
-0,4
-0,8
B
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
log [S]
5. En el esquema siguiente se indica una va metablica donde dos de las enzimas estn sujetas a
regulacin alostrica por el intermediario metablico E.
Las letras maysculas simbolizan los sustratos y los nmeros
1
2
3
4
5
las enzimas que catalizan las reacciones. a) Defina efector
ABCDEF
alostrico. b) Indique cuales de las enzimas de esta va podran
ser las reguladas y que efecto tendra E sobre ellas.
6. Con la finalidad de estudiar una enzima homotetramrica, la misma fue incubada con un
modificador de residuos de cistena en ausencia y en presencia de concentraciones saturantes de
los sustratos de la reaccin. Peridicamente, se extrajeron alcuotas para la determinacin de la
actividad enzimtica y composicin de aminocidos. Los resultados se indican en la Tabla.
a) Qu puede concluir acerca de los aminocidos involucrados en el sitio cataltico? b) Indique
cuantos residuos de cistena son modificados por sitio activo.
31
30,0
16,8
8,6
4,5
0,5
0,5
moles de residuos
Actividad
moles de residuos
Cys no modificados / (U/mg) Cys no modificados /
mol enzima
mol enzima
28,0
30,0
28,0
24,2
29,3
28,0
22,3
28,5
28,0
20,5
27,8
27,9
19,9
27,0
27,8
19,8
27,0
27,8
32
1.
Se obtienen soluciones de cada uno de los siguientes azcares en las concentraciones detalladas
en cada caso: glucosa 1,8 mg/ml; maltosa 1,71 mg/ml y trealosa 1,71 mg/ml. Si 0,2 ml de un testigo
1 mM de glucosa dio una absorbancia de 0,180 al hacer la reaccin de Somogyi-Nelson, calcule la
absorbancia que se obtendra al hacer la determinacin con 0,1 ml de las soluciones indicadas antes y
despus de la hidrlisis.
2.
Una muestra que ha dado negativa la reaccin de Fehling se ensaya en una alcuota de 0,1 ml
para la reaccin de Roe, obtenindose un valor de absorbancia de 0,11 descontado el blanco.
Despus de sometida a un tratamiento con HCl concentrado una alcuota idntica a la anterior
present una absorbancia de 0,24 para el mtodo de Somogyi-Nelson. Un testigo de fructosa 1 mM
ensayado en alcuotas de 0,2 ml dio una absorbancia de 0,21 para el mtodo de Somogyi-Nelson y
0,19 para el mtodo de Roe. a) Indique qu tipo de sustancias presenta la muestra. Fundamente su
respuesta. b) Exprese su concentracin en mM.
3.
Ud. dispone de tres tubos (A, B y C) conteniendo sacarosa, fructosa y glucosa (no
necesariamente en este orden). Usando un testigo de fructosa 1 mM, decide hacer determinaciones
por las tcnicas de Somogyi-Nelson y Roe sobre los distintos tubos, obtenindose los valores de
absorbancia que se muestran en el cuadro. Las alcuotas utilizadas en las determinaciones fueron de
0,1 ml para el testigo y 0,3 ml para todas las muestras.
Tcnica
Roe
Somogyi-Nelson
HCl + Somogyi-Nelson
Testigo
0,25
0,37
0,37
A
0,11
0,16
0,16
B
0,33
0
0,96
C
0
0,30
0,30
a)
Indique en qu tubo est cada sustancia. b) Calcule la concentracin de sacarosa en el tubo
correspondiente.
4.
Una muestra de un oligosacrido que ha dado negativa la reaccin de Fehling, se ensaya para
la reaccin de Roe y presenta un valor de absorbancia de 0,60 para una alcuota de160 l. Luego se
lo somete a una hidrlisis cida y una alcuota de 50 l registr una absorbancia de 0,95 para el
mtodo de Somogy-Nelson. Adems, un testigo de fructosa 1,5 mM present las siguientes
caractersticas:
Alcuota
0,2 ml
0,1 ml
Mtodo
Roe
S. N.
Absorbancia
0,30
0,25
absorbancia de 0,2; mientras que un testigo de fructosa 5 mM present una absorbancia de 0,15
cuando se ensay una alcuota de 0,15 ml. ii) Somogyi-Nelson: 0,4 ml de muestra dieron un valor de
absorbancia de 0. iii) Somogyi-Nelson luego de hidrlisis cida completa: 0,05ml de alcuota dieron
una absorbancia de 0,60. Un testigo de fructosa 5 mM present una absorbancia de 0,40 cuando se
ensay una alcuota de 0,2 ml. b) Escriba la frmula estructural del compuesto si los productos de su
metilacin exhaustiva e hidrlisis fueron los que se detallan aqu:
CH2OH
CH2OCH3
OH
OCH3
O
H3CO
OCH3
OCH3
H3CO
H3COH2C
OH
H3CO
OH
OCH3
CH2OCH3
OCH3
c)
d)
4.
-3200
-11000
Keq = 2,21.103
GLUCLISIS. FERMENTACIN
1.
a) Escriba las ecuaciones balanceadas del catabolismo de la glucosa en dos molculas de
gliceraldehdo-3-P, indicando las reacciones que son irreversibles bajo condiciones intracelulares
tpicas. Luego escriba la ecuacin final de la primera fase de la gluclisis. b) El gliceraldehdo-3-P es
convertido a piruvato durante la segunda fase de la gluclisis. Escriba las ecuaciones balanceadas de
este proceso y la ecuacin neta.
Se incuba glucosa marcada en el 14C1 con las enzimas glucolticas y los cofactores y sustratos
necesarios. Cul es la distribucin de 14C en el piruvato? Realice el mismo seguimiento con
glucosa marcada en C2, C3, C4, C5 y C6.
2.
3.
La hexoquinasa muscular y la glucoquinasa heptica son isoenzimas ya que ambas catalizan la
fosforilacin de la glucosa en el primer paso de la gluclisis. La enzima de msculo tiene una Km de
0,1 mM y la de hgado una Km de 10 mM. Teniendo en cuenta que la concentracin de glucosa
normal en sangre es cercana a 5 mM, cul es la importancia fisiolgica de esta diferencia?
4.
La gliceraldehdo-3-P deshidrogenasa puede reemplazar al fosfato por arseniato como sustrato.
El producto resultante es el 1-arseno-3-fosfoglicerato, un compuesto inestable que se hidroliza a
arseniato y 3-fosfoglicerato. Escriba una ecuacin balanceada para la gluclisis en presencia de
arseniato reemplazando al fosfato. Analice el rendimiento de ATP del proceso en estas condiciones.
5.
Se incubaron en condiciones estrictamente anaerbicas 0,5 ml de extracto de levaduras
(conteniendo 4,8 mg/ml de protena) en 50 mM MES pH 5,5, NaPi en exceso y con glucosa como
nica fuente de carbono en un volumen final de 2 ml. A los 20 minutos se tomaron dos alcuotas
determinndose 30 moles de etanol en 0,1 ml y 80 moles de glucosa en 0,2 ml. a) Calcule la
concentracin de glucosa inicial en mM, considerando que la nica va de la degradacin de la
glucosa es la fermentativa. b) Determine los moles de 14CO2 producidos a los 30 minutos si la
36
glucosa estaba marcada con 14C1.y, alternativamente, en C3. c) Explique cmo se afectara la
velocidad de consumo de glucosa si las levaduras son incubadas en condiciones aerbicas.
6.
La fructosa se encuentra en el semen de humanos y bovinos en concentraciones superiores a 12
mM. Los espermatozoides usan la fructosa anaerbicamente para producir el ATP necesario para el
movimiento flagelar. La ruta catablica ms importante de fructosa a lactato en estas clulas
cortocircuita la reaccin de la fosfofructoquinasa de la gluclisis mediante el uso de una enzima que
rompe la fructosa-1-P en dos compuestos de tres tomos de carbono. Escriba las ecuaciones para la
secuencia de transformaciones qumicas involucradas. Escriba la ecuacin neta para el catabolismo
anaerbico de la fructosa a lactato en los espermatozoides.
7.
En dos tubos diferentes se incubaron extractos celulares de msculo de conejo (tubo A) y de
levaduras (tubo B) con fosfato y glucosa marcada isotpicamente (14C) en forma uniforme en un
medio anaerbico (con NaN3) a pH 5 y 30C. Las medidas de radiactividad, en alcuotas iguales de
medio, a tiempo cero (antes de agregar las clulas) y luego de 1 hr de incubacin se muestran en la
siguiente tabla:
Tiempo (min)
0
60
% de RADIOACTIVIDAD
Tubo A
100
98
Tubo B
100
65
a)
Qu explicacin encuentra para estos resultados?
b)
Construya una tabla con los valores tericos de % de radioactividad que esperara encontrar si
el experimento se realizara en idnticas condiciones pero con (14C1) glucosa.
c)
Igual que en b) pero con (14C3) glucosa.
8.
Se prepararon varios tubos de ensayo que contenan 1 ml de levaduras (2.107 clulas/ml), 1 ml
de una solucin reguladora y 3 ml de una solucin de glucosa 5 mM. A tiempo 0 se les hicieron los
agregados (volmenes despreciables) que se detallan en la columna A de la tabla y se tom una
alcuota de cada mezcla (volumen despreciable), la cual se hizo reaccionar por el mtodo de la
glucosa oxidasa obtenindose los valores que se indican en la columna B. Luego de 30 minutos se
repiti la operacin (los datos obtenidos figuran en la columna C). Todos los valores de absorbancia
han sido obtenidos en idnticas condiciones de ensayo.
a)
Una con flechas los datos de la columna C a los de las columnas A y B segn lo esperado para
el consumo de azcar en cada condicin. Determine la velocidad de consumo de glucosa en
mol/min.106 clulas para cada caso. Compare los resultados obtenidos.
b)
Teniendo en cuenta que el consumo de glucosa es lineal en funcin del tiempo, cundo ser
consumida totalmente la glucosa en los casos anteriores?
A
AGUA
Pi 50 Mm
Pi + NaN3
Pi + NaF
B
0,80
0,79
0,82
0,80
C
0,20
0,78
0,78
0,47
9.
Se desea estudiar el efecto de tres compuestos (A, B y C) sobre la va glucoltica. Para ello, se
utiliza una suspensin de levaduras aplicando el protocolo que se muestra en la tabla (todos los
37
volmenes estn expresados en ml). Despus de incubar 30 minutos a 30C, se midi la absorbancia
obtenida por el mtodo de la glucosa oxidasa en alcuotas de 0,4 ml (volumen final de lectura de 3
ml).
Tubo
1
2
3
4
Glucosa
50 mM
1
1
1
1
Buffer
Cl. (x106)
0,2
-
0,7
-
1
1
1,5
0,3
0,8
0,5
1,5
1,5
1,5
1,5
AAbco.
0,50
0,50
0,18
0,32
Se realiz una curva de calibracin a partir de una solucin de glucosa 50 mM utilizndose el mismo
mtodo de dosaje (volumen final de lectura de 3 ml).
Tubo
Glucosa (50 mM)
A - Abco.
1
0,2 ml
0,99
2
0,15 ml
0,74
3
0,10 ml
0,50
4
0,05 ml
0,26
a) Calcule la velocidad de consumo de glucosa en cada tubo expresada en mol por minuto. b)
Proponga que compuestos podran ser A, B y C. c) Determine el sitio y modo de accin de estos
compuestos.
10. Un investigador desea estudiar el metabolismo de hidratos de carbono en Brassica nigra, una
variedad de mostaza. Para ello prepara suspensiones celulares partiendo de hojas, separa la
preparacin en dos fracciones de 250 ml y las coloca en agitacin. Una de las muestras es la control,
con un medio de cultivo adecuado para que las clulas realicen sus funciones normales; y la otra es
sometida a un tratamiento de privacin de fosfato (Pi). Cuando luego de unos das realiza
mediciones de actividades enzimticas en la muestra tratada encuentra que se han inducido las
enzimas indicadas en la tabla:
Enzima
PFP
G3PdH no fosforilante
PEP fosfatasa
En base a estas observaciones: a) Escriba la ecuacin neta balanceada de la gluclisis desde glucosa6-P hasta piruvato en ambas muestras. Qu diferencia encuentra? Qu ventajas confiere a estas
plantas la induccin de las mencionadas actividades enzimticas teniendo en cuenta el estrs al que
estn sometidas? b) Partiendo de una [glucosa inicial] en el medio de 20 mM, se determina la
concentracin de glucosa a los 25 por el mtodo de la Glucosa Oxidasa utilizando una dilucin 1/50
de las muestras. Se obtiene una A= 0,259 para el control y una A= 0,478 para la muestra tratada. Un
testigo 0,5 mM dio una lectura de 0,724. Considere en todos los casos una A blanco= 0,005. Cul fue
el consumo de glucosa en cada caso si el contenido de protenas es de 1,1 y 0,88 mg/ml en la muestra
control y en la muestra tratada, respectivamente? Exprese el resultado en moles/min.mg de
protena.
38
CICLO DE KREBS
1.
El ciclo del cido ctrico utiliza 8 enzimas para catabolizar el acetil-CoA. a) Escriba la
ecuacin balanceada para la reaccin catalizada por cada enzima. b) Qu cofactores se requieren en
cada reaccin enzimtica? c) Para cada enzima indique el tipo de reaccin que cataliza: condensacin
(formacin de un enlace C-C), deshidratacin, hidratacin, descarboxilacin, xido-reduccin,
fosforilacin a nivel de sustrato, isomerizacin. d) Escriba la ecuacin neta balanceada para el
catabolismo del acetil-CoA a CO2.
2.
Un cultivo bacteriano respirando activamente es incubado con glucosa 14C1 y, posteriormente,
se aslan los intermediarios de la gluclisis y del ciclo del cido ctrico. Dnde estar el 14C en cada
una de las siguientes sustancias? Considerar slo la incorporacin inicial de 14C en tales compuestos:
a) Fructosa-1,6-bisP; b) Gliceraldehdo-3-P; c) Fosfoenolpiruvato; d) Acetil-CoA; e) Citrato; f) Cetoglutarato; y g) Oxaloacetato. Cuntas vueltas del ciclo son necesarias para que todo el 14C se
desprenda como CO2?
3.
Se incuba piruvato marcado en el 14C2 con una suspensin de mitocondrias. Determine: a) el
nmero de carbono en que aparecer inicialmente marcado el fumarato. b) cuntas molculas de CO2
se generan en la secuencia de reacciones desde piruvato a fumarato. c) en esa misma secuencia,
cuntas molculas de alta energa (ATP y GTP) se generan, considerando la oxidacin de NADH y
FADH2 en la cadena de transporte de electrones. d) Explique qu efecto tendra sobre el
funcionamiento del ciclo de Krebs si se somete a condiciones anaerbicas esta suspensin
mitocondrial. e) De un ejemplo de una reaccin (indicar nombre, sustratos y productos) que sirva
para re-abastecer el ciclo de Krebs de intermediarios que se utilizan para reacciones biosintticas.
4.
La respiracin celular puede ser estudiada usando preparaciones de mitocondrias aisladas y
midiendo su consumo de O2 bajo diferentes condiciones. Si se agrega 10mM de malonato de sodio a
mitocondrias que se encuentran respirando activamente usando piruvato como fuente combustible, la
respiracin se detiene rpidamente. Explique por qu sucede esto, indicando el efecto del malonato
sobre la gluclisis, el ciclo de Krebs y el consumo de O2.
5.
El transporte de malato y -cetoglutarato a travs de la membrana mitocondrial interna es
bidireccional e inhibido por n-butilmalonato. a) De acuerdo a sus conocimientos sobre metabolismo,
explique en qu proceso(s) est involucrado este sistema de transporte; b) Considerando que la
lanzadera Malato/Asp es la nica presente en hgado, determine el rendimiento de ATP en una
suspensin aerbica de clulas hepticas que oxidan completamente la fructosa en los siguientes
casos: CASO 1: 1mol de fructosa; CASO 2: 1mol de fructosa + n- Butilmalonato; c) Prediga el
efecto del n-butilmalonato sobre la gluclisis.
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1.
Es posible obtener sntesis neta de oxaloacetato agregando acetil-CoA en un homogenado
mitocondrial que contiene las enzimas y cofactores del ciclo del cido ctrico? Fundamente su
respuesta mediante ecuaciones balanceadas.
2.
Un procedimiento usado para determinar la efectividad de compuestos no glucosdicos como
precursores de glucosa es ayunar al animal hasta que sus reservas de glucgeno heptico se agoten y
luego administrar el sustrato a estudiar. Un sustrato que conduce a un incremento neto en el
glucgeno heptico es denominado glucognico, ste debe primeramente ser convertido en glucosa6-P. a) Demostrar por medio de reacciones enzimticas conocidas cul o cules de los siguientes
sustratos son glucognicos.
a) Piruvato b) Lactato c) Glicerol d) Succinato e) Aspartato
b) Si la relacin NADH/NAD+ en el citosol fuera muy alta (como por ejemplo luego de la ingesta de
alcohol), a partir de cul de estos compuestos (a-d) se bloqueara la gluconeognesis?
3.
Si en un extracto de hgado de rata que lleva a cabo gluconeognesis a partir de piruvato se
adiciona HCO3- marcado (14C), cul o cules carbonos de la glucosa resultarn marcados? Si en el
experimento anterior se suprime el HCO3- marcado y se adiciona piruvato marcado uniformemente
con 14C, cul o cules tomos de la glucosa resultarn marcados?
4.
La avidina es un potente inhibidor de las reacciones que requieren biotina.Qu reacciones
involucradas en la gluconeognesis sern inhibidas en un extracto de hgado de rata al adicionar
avidina?
5.
Un homogenado de hgado fue incubado en un medio que contena lactato 10 mM como nica
fuente de carbono y ATP 500 mM (volumen final de 3 ml). Al cabo de 30 minutos la concentracin
de lactato fue 0,13 mM. a) Calcule la velocidad de consumo de lactato expresndola en moles/min.
En base a este dato y suponiendo que todo el lactato se convierte en glucosa, qu velocidad de
produccin de glucosa esperara encontrar? b) Luego de 25 minutos de incubacin mediante el
mtodo de glucosa oxidasa se obtuvo un valor de absorbancia 0,150 utilizando una alcuota de 0,2 ml
de la muestra, mientras que una alcuota de 0,1 ml de un testigo de glucosa 2 mM dio una
absorbancia de 0,100. Calcule la velocidad de produccin de glucosa expresndola en moles/min. c)
En base a los datos obtenidos en los tems a) y b), qu destinos metablicos tuvo el resto del lactato
consumido?
6.
Ciertas cepas mutantes de levaduras pueden crecer en un medio mnimo utilizando como nica
fuente de carbono el etanol. Esto lo logran invirtiendo la direccin de la reaccin de la ltima enzima
de la fermentacin alcohlica (E1). El producto de esta reaccin es oxidado por una deshidrogenasa
(E2) a un cido carboxlico de dos carbonos que finalmente se condensa con la coenzima-A por E3.
a) Esquematice la ruta de reacciones desde etanol hasta el producto condensado con CoA,
nombrando las enzimas (E1, E2 y E3) y sus productos. b) El producto de E3 es utilizado por la
levadura para generar intermediarios de cuatro carbonos para la biosntesis de aminocidos y
glucosa. Qu ruta anaplertica le permite a la levadura crecer en etanol?. Esquematice la ruta hasta
la generacin de succinato e indique la ecuacin global balanceada. c) Si la levadura crece con etanol
marcado con 14C en el C2. Dnde aparecer la marca en el succinato?
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7.
Bacterias como Escherichia coli pueden vivir en medios conteniendo acetato como nica
fuente de carbono y energa. Parte del acetil-CoA generado (reaccin de la enzima acetil-CoA
sintetasa) es utilizado para generar ATP y NADH y parte para sintetizar glucosa. a) Cul es la
cantidad mnima de acetato que necesitan estas bacterias para sintetizar 1 mmol de glucosa,
considerando que la energa y el poder reductor requeridos provienen de la oxidacin completa del
acetato a CO2?. Justifique. b) Cul es la importancia del ciclo del glioxilato en semillas en
germinacin?
8.
En un experimento, se incuba durante 1 hora un extracto heptico con un pulso de los
siguientes compuestos marcados: I) oxaloacetato marcado con 14C en C4 y II) acetil-CoA marcado
con 14C en el grupo metilo.
a) Indique si en algn tubo obtendr glucosa marcada. En caso afirmativo, indique las enzimas
involucradas en la sntesis de glucosa marcada. En caso negativo, justifique mediante ecuaciones la
prdida de la marca radiactiva.
b) En qu caso obtendr la sntesis de glucosa de manera neta? Justifique.
c) Indique si la sntesis neta de glucosa del caso b es inhibida por: i) avidina; ii) un inhibidor de la
malato deshidrogenasa; iii) Fructosa2,6-biP; iv) inhibidor del transporte de glucosa6P del retculo
endoplasmtico. Justifique en cada caso.
d) Podra aislar glucosa marcada radiactivamente si el extracto fuera de E. coli?
1.
Indique cuntos enlaces fosfato de alto contenido energtico se consumen durante la sntesis de
glucgeno a partir de: a) 1 mol de glucosa-1-fosfato, b) 1 mol de fructosa 1,6 bisfosfato, c) 1 mol de
glucosa, d) 1 mol de oxaloacetato.
2.
a) Cul es el destino de un residuo de glucosa almacenado como glucgeno en el msculo
durante ejercicio vigoroso? Especifique el rol del hgado en este proceso. b) Describa un ejemplo de
regulacin covalente y uno de regulacin alostrica de enzimas implicadas en el metabolismo del
glucgeno, especificando la relevancia fisiolgica de dichas regulaciones.
3.
Considerando una molcula de glucgeno de masa molecular 105 (PM residuo glucosa: 162) y
en la cual el 10% de los residuos son puntos de ramificacin, indique: a) la cantidad de ATP total
que se formara al degradarla hasta piruvato; b) cunto ATP sera necesario para sintetizar dicha
molcula de glucgeno a partir de piruvato? c) Analice el balance neto de ATP entre las dos vas.
4.
Un homogenado de hgado (Vf = 3mL) es incubado con glicerol marcado en el carbono 2.
Luego de 20 minutos se determin la formacin de 0,8 moles de glucgeno en una alcuota de 1ml.
a) Cuntos enlaces de alta energa fueron necesarios para la sntesis de dicha cantidad de glucgeno
(masa molecular promedio de glucgeno: 105)? b) En qu carbonos se encuentran marcados los
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