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Universidad Nacional de Rosario- Facultad de Ciencias

Bioqumicas y Farmacuticas

Gua de ejercicios
Qumica Biolgica
2014

QUMICA BIOLGICA - 2014


ESPECTROFOTOMETRA
1.
El coeficiente de extincin del NADH a 340 nm es de 6.22 mM-1.cm-1. Calcular las
concentraciones de las soluciones de NADH cuando los valores de absorbancia obtenidos son: a) 0.6;
b) 0.15. Exprese los resultados en nM y mM. Considere un paso ptico de 1 cm.
2.
Una solucin que se encuentra en una cubeta de 1 cm de espesor contiene 2 g/l de una sustancia
absorbente de luz y transmite el 75 % de la luz incidente a una determinada longitud de onda. Calcular
la absorbancia de una solucin que contenga a) 4 g/l; b) 1 g/l. Si el peso molecular del compuesto es
250, calcule el coeficiente de extincin molar.
3.
Una solucin de protena (0.3 ml) fue diluida con 0.9 ml de agua. A 0.5 ml de esa solucin
diluida se le agregaron 4.5 ml del Reactivo de Biuret y se esper hasta completarse la reaccin de
color. La absorbancia de la mezcla a 540 nm fue de 0.18 en un tubo de ensayo de 1 cm de dimetro,
luego de restar el blanco. Una solucin standard (0.5 ml conteniendo 4 mg de protena/ml) a la que se
agregaron 4.5 ml del Reactivo de Biuret dio una absorbancia de 0.12 en un tubo de ensayo de iguales
caractersticas. Calcular la concentracin de protena en la solucin desconocida.
4.
El cido pirvico puede determinarse colorimtricamente por conversin en su
2,4-dinitrofenilhidrazona seguido de la adicin de lcali. La reaccin se llev a cabo en un volumen
final de 3 ml, con soluciones que contenan 1 ml de diversas cantidades de cido pirvico,
obtenindose los siguientes resultados:
Ac. pirvico (g)
Lecturas

0
0.01

20
0.140

40
0.267

60
0.400

70
0.750

80
0.525

100
0.638

125
0.760

150
0.775

Se analizaron por este mtodo una serie de soluciones desconocidas de cido pirvico (1 ml de cada
una) obtenindose las siguientes lecturas de absorbancia a) 0.565; b) 0.125; c) 0.683; d) 0.889. Por
otro lado, 100 l de una solucin patrn 5 mM de cido pirvico (PM=88.06) mostr una lectura de
0.335 (considerar bco. de reactivos de 0.01) en un volumen final de 3 ml. Grafique la curva de
calibracin con los resultados mostrados en la tabla. Calcule la concentracin en g/ml de las
soluciones desconocidas usando la curva previamente realizada y el valor de la solucin patrn como
nico dato. Compare los resultados.
AMINOCIDOS
1.
Cada uno de los grupos ionizables de un aminocido tiene dos estados posibles de ionizacin:
cargado y no cargado (por ejemplo, -COOH, -COO-). Por lo tanto una molcula con n de tales grupos
tiene 2n estados posibles de ionizacin. a) Escriba los cuatro estados posibles de ionizacin del
aminocido Ser. b) A simple vista, indique cul estado de ionizacin predomina a valores de pH=1,
pH=3, pH=pI, pH=7, pH=11.
2.
a) Una mezcla de los siguientes aminocidos se somete a electroforesis a pH=3,9: Ala, Ser, Phe,
Leu, Arg, Asp, e His. Cul ir hacia el nodo (positivo)? Cul ir hacia el ctodo (negativo)? b) A
menudo los aminocidos con cargas idnticas se separan ligeramente durante la electroforesis: por
ejemplo la Gly se separa de la Leu. Puede sugerir una explicacin para esto?
1

3.
El grupo -amino de la Lys tiene un pKa de 10,8. a) Qu fraccin de estos grupos estar
protonada (es decir, -NH3+ en vez de -NH2) en una solucin diluida de Lys a pH=9,5? b) A pH=11.5?
c) Explique por qu el pKa del grupo -amino es mayor que el de un grupo -amino.
4.
El grupo -carboxilo del Glu tiene un pKa de 4,3. a) Qu fraccin de estos grupos podra estar
no protonada (es decir -COO- en vez de -COOH) en una solucin diluida de Glu a pH=5,0? b) A
pH=3,8? c) Explique por qu este pKa es mayor que el grupo -carboxilo.

PPTIDOS
Tabla de pKas de los grupos ionizables:
Aminocido Carboxilo Amino Grupo R
Alanina
2.3
9.9
Glicina
2.4
9.8
Fenilalanina
1.8
9.1
Serina
2.1
9.2
Valina
2.3
9.6
Aspartico
2.0
10.0
3.9
Glutamico
2.2
9.7
4.3
Histidina
1.8
9.2
6.0
Cisteina
1.8
10.8
8.3
Tirosina
2.2
9.1
10.9
Lisina
2.2
9.2
10.8
Arginina
1.8
9.0
12.5

1.
Cul de los siguientes oligopptidos es ms soluble en agua?
a)Phe20 o Gly20; b) Asp20 o Glu20 a pH = 6.0; c) Phe20 o Tyr20
2.
Escriba en frmulas el pentapptido Phe-His-Met-Leu-Asp. Calcule su punto isoelctrico.
Sometido el mismo a una electroforesis, hacia qu electrodo migrar, a pH = 7? y a pH = 2? Indique
en cada caso si el aminocido es polar, apolar, cido, bsico, aliftico, aromtico, etc
3.
Un tetrapptido de punto isoelctrico 7,7 posee un nico aminocido cargado en su estructura.
Considere los siguientes valores pKa -COOH :2,3; -NH2 :9,5. a) Prediga el pKa del grupo lateral de
dicho aminocido; b) En base al dato anterior deduzca de qu aminocido se trata y escriba su frmula
estructural; c) Enuncie qu propiedad especial tiene el aminocido en cuestin.
Escisin especfica de cadenas polipeptdicas:
H H

H H

N C C N C C
R1 O
Aminocido 1

R2 O
Aminocido 2

Mtodo
Tripsina
Quimotripsina
Termolisina
Bromuro de ciangeno
V8
Carboxipeptidasa

Enlaces peptdicos escindidos


Aminocido 1 = Lys o Arg
Aminocido 1 = Phe, Trp o Tyr
Aminocido 2 = Leu, Ile o Val
Aminocido 1 = Met
Aminocido 1 = Glu o Asp
Aminocido 2 = COO- terminal libre

4.
Considere el pptido cuya estructura primaria aparece en la figura: a) Qu fragmentos son
producidos por la digestin con tripsina? b) Qu fragmentos son producidos por la digestin con
tripsina despus de la reduccin y la alquilacin del enlace disulfuro? c) Qu fragmentos son
producidos por la digestin con termolisina?
Ala-Val-Lys-Leu-Phe-Arg-Cys-Tyr
|
S-S
|
Glu-Met-Lys-Val-Trp-Gly-Cys-Ala

5.
Ud. asla un pptido del cerebro que posee la propiedad de unirse a receptores del opio. Su
intencin es encontrar la estructura primaria del pptido aislado. Para ello recurre a mtodos utilizados
en la qumica de pptidos y encuentra que: a) Luego de la hidrlisis cida del pptido, la composicin
en aminocidos es: Arg(1) Phe(2) Gly(2) Met(1) Tyr(1). b) El tratamiento del pptido con
quimotripsina gener un aminocido libre, Phe y dos pptidos cuya composicin en aminocidos
result: Gly(2) Tyr(1) y Arg(1) Phe(1) Met(1). c) El tratamiento del pptido con Bromuro de
ciangeno, seguido de separacin cromatogrfica de los productos, arroja la presencia de dos pptidos
cuya composicin en aminocidos resulta ser: Arg(1) Phe(1) Met(1) y Gly(2) Phe(1) Tyr(1). Cuando
ambos pptidos fueron tratados con Cloruro de dansilo, solamente se encontr Phe dansilada. Deduzca
Ud. la secuencia del pptido.
6.
En base a los datos que se detallan, determine la estructura de un antibitico polipeptdico del
Bacilus brevis. Este antibitico forma complejos con iones metlicos y aparentemente destruye el
transporte inico a travs de las membranas, matando a ciertas especies bacterianas. En el anlisis de la
estructura Ud. encuentra que: a) La hidrlisis cida completa del pptido seguida del anlisis de
aminocidos dio cantidades equimoleculares de Leu, Pro, Phe, Orn, Val. b) La estimacin del PM dio
1200 aprox. c) No se hidroliz con Carboxipeptidasa. d) El tratamiento del pptido con
Fluorodinitrobenceno seguido de hidrlisis completa y cromatografa no gener ningn derivado
dinitrofenilado en N alfa. e) La hidrlisis parcial del pptido seguida de separacin cromatogrfica y
secuenciacin gener los pptidos siguientes:
Leu-Phe
Val-Orn-Leu
Phe-Pro

Orn-Leu
Phe-Pro-Val
Val-Orn
Pro-Val-Orn

Deduzca la secuencia del pptido


3

7.
Ud. aisl de un homogenado de cerebro un pptido con actividad de encefalina (opioide). Estos
se unen a receptores localizados en el cerebro, que unen drogas derivadas del opio (morfina) que
disminuyen el dolor. Al analizarlo encuentra que: a) La hidrlisis completa en HCl 6 M, 110C
seguida del anlisis de aminocidos indica la presencia de Gly, Leu, Phe y Tyr en una relacin 2:1:1:1.
b) El tratamiento del pptido con 2,4-dinitrofluorobenceno seguido de hidrlisis completa y
cromatografa indic la existencia de Tyr-DNP. No se encontr Tyr libre. c) La hidrlisis con
quimotripsina seguida de cromatografa indic la presencia de Leu y Tyr libres, y un pptido cuya
composicin en aminocidos indic la presencia de Gly y Phe en una relacin 2:1. Determine la
secuencia de esta encefalina.

PROTENAS
1.
Mientras la mayora de las bacterias mueren a temperaturas superiores a 50 C, algunas especies
termoflicas sobreviven entre 70 y 80C. De qu modo(s) general(es) esperara que las protenas de
las bacterias termoflicas difieran de las protenas anlogas de las bacterias comunes?
2.
Suponga que le han dado cantidades pequeas de tres protenas desconocidas, A, B y C. Su
instructor de Bioqumica le informa que una protena es predominantemente hlice alfa, otra hoja beta
y la tercera de triple hlice de colgeno. Su laboratorio est equipado con un analizador de
aminocidos.
Protenas
Residuos no polares
Residuos polares
Glicina
Prolina + Hidroxiprolina

A
35
20
45
--

B
16
59
8
1

C
17
25
33
22

Asigne la estructura ms probable para cada una de las tres protenas.

3.
Como parte de un proyecto de laboratorio de Bioqumica de pregrado, Ud. purific tres
polipptidos de aproximadamente igual peso molecular, a partir de plasma humano. Usando varias
tcnicas fsicas Ud. estableci que en sus estados nativos uno de los polipptidos es monomrico (una
molcula en forma de cigarro), el segundo es monomrico y casi esfrico y el tercero es la subunidad
de un tetrmero de subunidades esfricas idnticas. Su compaero de laboratorio determin las
composiciones aminoacdicas de las tres protenas. Sin embargo, cuando le trae los datos indicados en
la TABLA, Ud. descubre que l no anot la posicin correspondiente a cada protena. Su profesor le
dice que Ud. debera deducir cul es cul, simplemente a partir de las mismas composiciones de
aminocidos. Qu composicin le asignara a cada protena y por qu?

Protena
Residuos polares
Residuos no polares
Glicina
Prolina + Hidroxiprolina

4.

A
131
54
9
8

B
59
118
9
13

C
99
88
8
10

El anlisis del PM de una protena suministra la siguiente informacin:

Solvente
Buffer
Cloruro de Guanidina
Cloruro de Guanidina + 2-Mercaptoetanol

PM
200.000
100.000
25.000 + 75.000

Teniendo en cuenta que el cloruro de guanidina es un agente caotrpico (desnaturalizante) y el 2mercaptoetanol es un agente reductor, caracterice la estructura cuaternaria de esta protena.

5.
El desplegado de la hlice alfa de un polipptido para formar un ovillo al azar est acompaado
por un gran descenso de la rotacin especfica de la luz polarizada. Estudiando a los pptidos
poliglutamato y polilisina se obtuvo la siguiente grfica:

a) Asigne cual de los grficos corresponde a cada pptido. Prediga las conformaciones de la poliLys y
el poliGlu a pH 2 y 12. b) Explique el efecto de los cambios de pH en la conformacin de los pptidos.
c) Por qu las transiciones conformacionales ocurren en un rango tan estrecho de pH?
Un analista determin la concentracin de una solucin pura de una protena desconocida
empleando el mtodo del Biuret y la absorbancia a 280 nm, utilizando para ambos procedimientos una
solucin de albmina srica bovina de 0,5 mg/ml como patrn. Los resultados que obtuvo se muestran
en las tablas siguientes:
6.

Mtodo del Biuret


Alcuota
Cubeta(paso de luz)
Blanco de Rvos.
Lectura

Testigo(patrn)
50 l
1 cm
0,080 UA
0,550 UA

Muestra Incgnita
40 l
1 cm
0,080 UA
0,350 UA

Absorbancia a 280 nm
Cubeta (paso de luz)
Lectura

Testigo
0,5 cm
0,310 UA

Muestra Incgnita
0,5 cm
0,285 UA

a) Calcule la concentracin proteica por ambos mtodos. b) Interprete los resultados considerando
errores experimentales inferiores al 10 %.
7.
Un investigador purifica una protena monomrica estructural de msculo a homogeneidad. Con
el objeto de determinar la concentracin de la solucin obtenida, aplica el mtodo de Sedmark y
Grossberg sobre 0.5 ml de la solucin proteica y sobre 0.1 ml de un testigo de albmina, obteniendo
valores de absorbancia (Abs620/Abs465) de 0.2 y 0.3, respectivamente. La solucin de albmina usada
como testigo present un valor de absorbancia a 280 nm de 0.05 (280 = 6.65 (g%)-1 cm-1). a) Exprese
la concentracin de la protena purificada por el investigador en M, sabiendo que el PM de la misma
es 25.000 Da. b) Alcuotas de 1.0 ml de la solucin proteica purificada son sometidos a oxidacin o
reduccin, y luego incubadas con un reactivo especfico de restos sulfhidrilos (-SH)
(Eosin-5-maleimida, 523 = 85.000 M-1 cm-1), que reacciona en relacin estequiomtrica 1:1 con los
mismos. Luego de que las alcuotas reaccionan totalmente con el reactivo, se las dializa para eliminar
la eosin-5-maleimida que no se uni a la protena (sin cambiar el volumen de la muestra proteica
dializada), y se realizan medidas de absorbancia a 523 nm, obtenindose valores de absorbancia de
0.034 (protena oxidada) y 0.105 (protena reducida). Indique cuntos moles de residuos de cistena
reaccionan por mol de protena. A qu se debe la diferencia de absorbancia obtenida en las distintas
condiciones?

SEPARACIN DE BIOMOLCULAS

1.
La cromatografa de filtracin en gel o de tamiz molecular es un mtodo de separacin proteica
basado en sus tamaos (o, ms precisamente, en sus radios efectivos en solucin, los cuales son
proporcionales, para protenas esfricas, a la raz cbica del peso molecular). Una solucin proteica se
coloca en una columna empacada con pequeas esferas de polmeros suficientemente hidratados y
entrecruzados (Sephadex). Las protenas de tamaos diferentes varan en su capacidad de penetrar los
poros hidratados de las esferas. Las protenas ms pequeas penetran ms rpidamente estos poros y a
medida que bajan en la columna lo hacen ms lentamente que las protenas de mayor tamao. Una
segunda tcnica de separacin de protenas es la electroforesis en gel de poliacrilamida donde las
protenas se someten a un campo elctrico. Cuando se lleva a cabo la electroforesis en presencia de un
agente desnaturalizante, el dodecil sulfato de sodio (SDS), las molculas proteicas se separan por
tamao, las ms pequeas migran ms rpidamente. (El SDS desnaturaliza las protenas unindose a
ellas en forma no especfica y dndoles una relacin constante de carga/masa).
6

Ambos procedimientos separan las protenas con base en el tamao y utilizan polmeros entrecruzados
como medio de soporte. Cmo es posible que en la filtracin en gel, las molculas pequeas se
retarden con respecto a las mayores, mientras que en electroforesis en gel de poliacrilamida ocurre lo
contrario?
2.
Una mezcla de dos protenas se sembr en una columna cromatogrfica y se obtuvo el perfil de
elucin mostrado. Las dos fracciones correspondientes a los mximos de los dos picos (n 10 y 26) se
sometieron a ensayos de Gornall (0,2 ml muestra + 0,8 ml de H2O + 4 ml de reactivo) y Bradford (0,1
ml muestra + 0.4 ml de H2O + 0,5 ml de reactivo) para medir la concentracin de protenas, dando los
resultados mostrados en la tabla.
0.4
0.35

Gornall (Abs 530nm) Bradford (Abs 595nm)


0.01
0.2
0.6
1.2

Abs 280 nm

Fraccin
10
26

0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0

10

15

20

25

30

35

N fraccin

a) Utilizando las siguientes curvas de calibracin calcule las concentraciones de protenas en mg/ml de
las dos fracciones mencionadas. Si esto no fuera posible, explique cmo procedera experimentalmente
para determinar la concentracin de protenas en dicho caso. b) La muestra con mayor concentracin
de protenas es la que presenta menor absorbancia 280nm? Explique esta aparente contradiccin.
Bradford

Gornall
0.30

0.5

0.25

0.4

Abs 595

Abs 530

0.20

0.3

0.2

0.15

0.10

0.1

0.05

0.00

0.0
0

500

1000

1500

proteina (g)

2000

2500

3000

10

15

20

25

30

35

proteina (g)

3.
Usted tiene una mezcla de tres protenas A, B, C, con pI de 3.5, 6.5 y 10 respectivamente y
quiere separarlas por una columna de DEAE-celulosa. Teniendo en cuenta que el grupo DEAE tiene
un pKa = 9,5. Qu pH usara para la separacin? Qu orden de elucin esperara encontrar eluyendo
con un gradiente de KCl entre 0 a 1 M?
4.
La Carboximetilcelulosa es una resina de intercambio catinico con un pKa de 4.5. Ud. tiene
tres protenas A, B y C de pI 5, 8 y 10 (no estrictamente en ese orden). Al sembrarlas en esta resina y
eluir con un gradiente de pH de menor a mayor eluyeron en el siguiente orden: B A C. Estas mismas
protenas, en una columna de Sephadex G-100 eluyeron cmo de un peso molecular 50.000, 100.000 y
75.000 y en el siguiente orden: A, B y C. En un gel con SDS, A y C presentaron una nica banda de
PM 50.000 y B present dos bandas de PM 50.000 y 25.000. Identifique A, B y C.
5.
Suponga que desea purificar por cromatografa de intercambio inico una enzima del
metabolismo del ADN, cuyo sustrato es ADN. Seleccionara una resina de intercambio aninico o
catinico? Por qu?

6.

Un pptido aislado de cerebro tiene la siguiente secuencia:


Lys-Ser-His-Glu-Leu-Asp-Pro-Tyr-Glu-Gly

a) Determine la carga neta de la molcula a pH=3, 8 y 12. b) Estime el punto isoelctrico del pptido.
c) Se somete al pptido a la accin de la termolisina. Escriba la frmula estructural de los pptidos
resultantes. d) Los pptidos obtenidos en el item anterior se someten a una cromatografa de
intercambio inico en sulfonil-celulosa (pKa=1,2). Si la columna est equilibrada a pH=5, qu
pptido eluir y cul quedar retenido? Cmo hara para eluir este ltimo?

7.

Se aisl un pptido con actividad biolgica a partir de una cepa de un bacilo:


Tyr-Gly-Arg-Ala-X-Val

a) Escriba la frmula del aminocido X si el pI del pptido es 6,7. b) Determine a que pH no migrara
en una electroforesis para X = Ser. c) Indique que fragmentos obtendra por digestin con:
i)Termolisina para X = Leu, ii) Quimotripsina para X = Phe. d) Los pptidos obtenidos en el tem
anterior (en ambas digestiones) se encuentran en una mezcla con un 3er pptido (Pptido A con pI = 5)
Mediante que mtodo separara el pptido A. Explique.
8.
Tres protenas de puntos isoelctrico 5,0; 7,3 y 6,5 se denominaron con las tres primeras letras
del alfabeto griego segn su posicin en un isoelectroenfoque, siendo alfa la ms cercana al nodo y
gamma la ms cercana al ctodo. a) Cul es el pI de cada uno? b) Cul de las protenas eluir
primero durante una cromatografa en carboximetilcelulosa a pH 5,8? Por qu? c) Si alguna protena
quedara retenida, cul o cules seran y cmo las eluira? d) Durante una electroforesis en
poliacrilamida a pH 8, beta present la mayor movilidad electrofortica. Es posible? Por qu?
9.

Usted recibe en su laboratorio una solucin conteniendo el siguiente pptido:


Glu Cys Lys Phe Cys Ala Gly

Para corroborar que realmente se trata de dicho pptido y para chequear su pureza, decide realizar un
isoelectroenfoque empleando 4 alcuotas que fueron sometidas a distintos procedimientos: A) en
medio oxidante dbil; B) en medio reductor; C) en presencia de tripsina (escinde enlaces peptdicos
del lado carboxilo de Lys o Arg); D) en presencia de tripsina en medio reductor. En base a estos datos
prediga cuales sern los resultados obtenidos al sembrar las 4 alcuotas en un gel de isoelectroenfoque
y esquematice el patrn de bandas que observara finalizada la corrida electrofortica en cada caso.
Justifique su respuesta.

10.

El cromatograma de una muestra de protenas en Sephadex G-200 fue el siguiente:

Gliceraldehdo
3-P-Deshidrogenasa
Concentracin
de protena
en el eludo

Aldolasa

Mioglobina
Catalasa
Ovoalbum.

175

213

234

244

285
N fraccin

Las protenas marcadoras fueron las siguientes:


Protena
Aldolasa
Catalasa
Ovoalbmina
Mioglobina

PM (x104)
16
6
4
1.6

N de fraccin
175
213
234
285

Se recogieron fracciones de 1,6 ml. y el volumen vaco de la columna previamemte determinado con
azul de dextrano fue de 200 ml. VT = 500 ml. Se quiso determinar el PM de
gliceraldehdo-3-P-dehidrogenasa. Utilizando la misma columna, en las mismas condiciones se
observ que la enzima apareci en la fraccin 244.
Indique el peso molecular de la misma. Cmo procedera experimentalmente si quisiera estudiar la
estructura cuaternaria de dicha protena?
11. Las protenas denominadas histonas juegan un papel clave en el empaquetamiento del DNA: ste
se enrolla alrededor de las histonas para formar los nucleosomas, partculas engarzadas como las
cuentas de un collar. Una mezcla de tres protenas globulares, entre ellas la histona H4, presenta la
siguiente composicin de aminocidos:
Protena
A
B
C

Nmero de Residuos (totales)


Asp y Glu
Arg, Lys e His
Otros AA
90
5
105
50
10
60
6
27
69

Mediante un isoelectroenfoque se determinaron los puntos isoelctricos de las tres protenas


obtenindose los siguientes valores: 3,0; 5,5 y 9,5 (no respectivamente). Los pesos moleculares
obtenidos por cromatografa de exclusin molecular fueron de 15 kD, 11,3 kD y 21,5 kD. a) lndique el
punto isoelctrico, el peso molecular y el orden de elucin de la columna cromatogrfica de las tres
protenas. b) En qu consiste la cromatografia de exclusin molecular y cmo se pueden obtener
pesos moleculares a partir de ella? c) En base a sus conocimientos, podra decir cul de las tres
protenas sera H4? Fundamente su respuesta.
12. Una protena bacteriana purificada y de PM conocido se someti a una filtracin por gel. Se
recogieron fracciones de 2,5 ml y la protena eluy en la fraccin 8. Previamente se determin que las
protenas marcadoras de 6, 35 y 250 kDa eluyeron en las fracciones 5, 10 y 14. El Vo determinado con
azul de dextrano fue de 1,8 ml, y el Vt de 45 ml. a) Cul es la masa estimada de la protena bacteriana
purificada? b) Para determinar la concentracin de la protena pura se diluye 1:100 la muestra y se
ensaya una alcuota de 20 l por el mtodo de Bradford dando una absorbancia de 0,25 descontado el
9

blanco. Como testigo se utilizaron 40 l de BSA 1mg/ml (PM 66 kDa) y se obtuvo una absorbancia de
0,85. Exprese la concentracin en g/l de la protena en la muestra.
13. Una alcuota de 0.1 ml de una mezcla de triglicridos y una protena pura se agit en
benceno:agua (3 ml:2 ml). a) En qu fases se distribuyen los distintos componentes de la mezcla? Se
sembr una alcuota de la fase que contena la protena en una columna de Sepharosa 6-B previamente
equilibrada. Se recogieron fracciones de 2 ml. Las protenas marcadoras fueron: A, B, C, D y E con
pesos moleculares de 160, 90, 60, 40, 16 kDa, respectivamente. La curva de calibracin resultante se
muestra a continuacin. El valor de Kav de la muestra se calcul en 0.28. Adems, se corri una
electroforesis con SDS en las siguientes condiciones: I) la protena se hirvi previamente con DTT
(agente reductor), II) la protena se hirvi sin agente reductor. El patrn electrofortico se muestra en
la figura. b) Indique el peso molecular de la protena nativa. c) Infiera la composicin cuaternaria de la
protena. Por otro lado se estim la concentracin de protena por absorbancia a 280 nm, utilizando un
testigo de BSA de 0.5 mg / ml, con una alcuota de 1 ml y una cubeta de 0,5 cm de paso. Se obtuvo
una Abs. de 0,4 para el testigo y de 0,295 para la muestra. d) Teniendo en cuenta que toda la protena
pas a la fase correspondiente, determine la concentracin de la misma en la mezcla original.
kDa
90

PM

II

I
2.4

60

2.2
2.0

40

Log
PM

1.8
1.6
1.4

16

1.2
1.0
0.25

0.3

0.35

0.40

0.45

Kav

14. A) Usted copurific 2 enzimas ( y ) que catalizan la misma reaccin (isoenzimas) y con el fin
de separarlas utiliza una columna de exclusin molecular en las siguientes condiciones: i) en presencia
de glicerol 20 % (un estabilizante de la estructura cuaternaria) y ii) en ausencia de ste. Usted
determina el perfil de elucin de estas proteinas a travs de absorbancia a 280 nm.
Esta columna fue previamente calibrada con diferentes protenas generando la siguiente curva de
calibracin. a) Prediga cul sera el peso molecular y la probable estructura de ambas isoenzimas,
sabiendo que es la de mayor peso molecular. b) Qu otra tcnica utilizara para confirmar este
resultado o bien para obtener ms informacin? Explique.
B) Ud. realiza un isoelectro-enfoque de las protenas puras y determinando los puntos isoelctricos
de ambas protenas. Usted sabe por bibliografa que , tiene un rango de estabilidad de pH entre 6 y
11. a) Como paso alternativo en la purificacin de ambas protenas podra usarse una columna de
CM-celulosa (pKa=4.5) para separar ambas protenas? Si es as, explique qu pH usara para equilibrar
esta columna. b) Cmo hara para elurlas?

ABS.
280 nm.
Con Glicerol
Sin glicerol

V. elucin

19

27 (ml)

10

15. Se purific una protena estructural a partir de dos bacterias (A y B) aislados de diferentes
fuentes. Con las protenas purificadas se corri una electroforesis de poliacrilamida en presencia de
SDS en las siguientes condiciones, (+): la protena se hirvi 10 minutos en presencia de
2-mercaptoetanol, (-): la protena se hirvi 10 minutos sin agente reductor. Luego de la corrida
electrofortica, el gel se tio con Coomassie Blue y se observ el patrn indicado. Por otro lado, las
preparaciones proteicas se sembraron en una columna de exclusin molecular. La masa molecular de
los marcadores utilizados para calibrar esta columna fueron: 30, 100, 210 y 440 kDa. El cromatograma
obtenido es mostrado abajo. La protena de inters eluy en ambos casos en la fraccin 133. Se
recogieron fracciones de 1,5 ml. a) Indique la masa molecular nativa de las protenas aisladas.
b) Infiera la estructura de ambas protenas c) considerando las estructuras propuestas en el tem
anterior, y teniendo en cuenta que una de las bacterias fue extrada de una fuente termal, prediga cul
protena fue aislada de cada bacteria.
A
+

B
-

Abs 280 nm

210

70
50
30

117

142

156

190
N de Fraccin

LogPM(KDa)

16. Le han entregado una muestra supuestamente pura de la protena monomrica lactato
deshidrogenasa. Para establecer su PM inyecta la muestra en una columna de Sephacryl (exclusin
molecular) y obtiene un nico pico a un Ve de 34 ml, el cual es comparado con los datos obtenidos
para las protenas marcadoras (fig1). Como paso siguiente realiza una electroforesis en dos
dimensiones de la muestra y luego de tincin por azul de Coomassie para protenas totales, obtiene el
resultado indicado en la fig 2. Para calcular el pI grafica los valores de pH del gel en funcin de la
distancia desde el nodo segn los datos de la tabla. En base a estos experimentos: a) Exprese el PM
aparente de la protena. b) A qu puede deberse el resultado obtenido en base al gel 2D. Qu puede
decir acerca de su muestra? Podra calcular el pI de la lactato deshidrogenasa? Calcule un valor
probable. c) Agregara algn paso en la purificacin de la lactato deshidrogenasa? Cal?

Distancia PH
desde
el
nodo
(cm)
2

1
24

26

FIG 1

28

30

32

Ve (ml)

34

36

38

40

6
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5

8.5
8.0
7.6
7.1
6.4
6.0
5.6
5.4
4.5
4.0
3.4
3.0

11

17. Se aislaron 2 isoenzimas (A y B) a partir de 2 bacterias provenientes de distintas fuentes. Con el


fin de caracterizarlas se llev a cabo una columna de exclusin molecular en presencia y ausencia de
glicerol. En ambas condiciones la protena A present un volumen de elucin (Ve) de 16 ml, mientras
que la protena B present Ve de 16 ml y 26 ml en presencia y ausencia de glicerol, respectivamente.
La curva de calibracin obtenida con diferentes marcadores de masa molecular se indica en el grfico.
Adems, se corri un gel de poliacrilmida en presencia de SDS en las siguientes condiciones: 1)
hirviendo las protenas con DTT (agente reductor), 2) sin DTT. El patrn electrofortico obtenido se
muestra en la figura. Con todos los datos obtenidos determine las posibles estructuras cuaternarias de
ambas isoformas.
La concentracin de protena determinada por Bradford considerando la masa molecular nativa fue de
0,25 M para ambas preparaciones. Alcutas de 1,5 ml de las soluciones proteicas fueron sometidas a
oxidacin y reduccin, y luego se incubaron con Eosin-maleimida (compuesto que reacciona en
relacin estequeomtrica 1:1con grupos SH-, 523= 85000 M-1 cm-1). Luego de que las alicuotas
reacionan totalmente con el reactivo, se las dializa y se realizan medidas de absorbancia. Las medidas
de absorbancia a 523 nm de las formas nativas de las enzimas fueron 0,042 para A y 0 para B.
Mientras que las formas reducidas de ambas proteinas presentaron un valor de absorbancia de 0,085.
Indique el estado redox de las Cys presentes en cada protena y la posible disposicin de los puentes
disulfuro.
+DTT
A

2.4

-DTT
A

90
60

2.2
2.0
1.8

Log PM

40

1.6
1.4

16

1.2
1.0
0

10

20

30

Ve

40

18. Ud. recibe una muestra pura de protena y procede a determinar su concentracin por el mtodo
de Bradford. Prepara 2 ml de un testigo de albmina pesando 2 mg de la misma. Toma 5 l de esta
solucin y la diluye hasta 500 l de agua destilada y utiliza 150 l de esta solucin como testigo
obteniendo una absorbancia a 595 nm de 0,22. Para 25 l de la solucin proteica en estudio se obtiene
una abs de 0,25. Cuando se realiza una electroforesis en condiciones nativas se obtiene un PM de
600.000 daltons, mientras que cuando se prepara la muestra con cloruro de guanidina se obtiene una
nica banda de 150.000 daltons. El mismo resultado es obtenido si, adems, la muestra se trata con 2mercaptoetanol. Una alcuota de 1,5 ml de la solucin proteica se incub con eosinmaleimida
(reacciona con grupos -SH, 523= 85.000M-1 cm-1) obtenindose, luego de dilisis exhaustiva, un valor
de absorbancia a 523 nm de 0,0384. Posteriormente, se trat una alcuota de 1,5 ml de la protena con
un agente reductor y luego con eosinmaleimida, obtenindose, en este caso, un valor de absorbancia a
523 nm de 0,1153 luego de dilisis exhaustiva de la muestra. a) Exprese la concentracin de la
protena en M. b) Indique la estructura cuaternaria de la protena sealando el estado de xidoreduccin de cada Cys y el nmero de Cys por molcula.

19. Usted tiene una mezcla de 4 protenas con las siguientes caractersticas (cada crculo representa
un polipptido y todos los residuos de cistenas se encuentran indicados):

12

A
-S-SPI
PM nativo (kDa)
PM subunidades (kDa)

6
60
30

B
-SH
4,5
60
60

SHSH7,1
400
100

C
-SH
-SH

D
S-S
S-S
5,2
650
2x 150
2x 175

i) Realiza una cromatografa de exclusin molecular en columna de Sephacryl (rango de exclusin:


25000-160000 Da) en las siguientes condiciones: a) con glicerol, b) sin glicerol y con urea, c) dem b)
ms tratamiento con 2-mercaptoetanol. Esquematice el cromatograma que obtendra en cada caso y
justifique. ii) Cmo procedera experimentalmente si quisiera separar la protena D en forma nativa
del resto de las protenas en la mezcla? Para ello, adems de la columna mencionada, Ud. dispone de:
otra columna de exclusin molecular (rango de exclusin es de 70000-350000 Da); resinas de DEAEcelulosa y carboximetil-celulosa y una solucin saturada de (NH4)2SO4. Justifique su eleccin. Los
valores de pKa de la DEAE- y carboximetil-celulosa corresponden a 9,5 y 4,5, respectivamente. iii) Si
lograra separarlas, qu protenas mostraran un valor positivo de absorbancia a =523 nm luego del
tratamiento con eosinmaleimida? Justifique.
20. Ud ha purificado a homogeneidad la enzima mlica dependiente de NAD, la cual cataliza la
siguiente reaccin: malato + NAD piruvato + CO2 + NADH. Al sembrar esta protena en presencia
de 20% glicerol en una columna de exclusin molecular (Sephadex) previamente calibrada (ver
figura), la protena eluy a los 70 ml (fraccin A). Cuando se repiti el procedimiento en ausencia de
glicerol se obtuvieron picos a 115 y 152 ml (fracciones B y C, respectivamente). La fraccin A
present actividad enzimtica, no as B y C. Por otra parte se analiz mediante una electroforesis en
condiciones desnaturalizantes una alcuota de la protena purificada previamentte tratada con SDS y mercaptoetanol, obtenindose una banda correspondiente a 70 kDa y otra de 30 kDa. En base a estos
datos caracterice estructuralmente lo mejor posible esta enzima.

y = -0.01x + 6

log PM

6
5.5
5
4.5
4
30

50

70

90

110

130

150

170

190

Ve (ml)

13

ENZIMOLOGA
DETERMINACIN DE LOS PARMETROS CINTICOS

Describa mtodos continuos y discontinuos para la determinacin de la actividad enzimtica y d


ejemplos. b) Indique y explique brevemente todos los mtodos a travs de los cuales usted puede
seguir la evolucin de esta reaccin, indicando si se trata de mtodos continuos o discontinuos.
NADH + H+ + 3 ADP + 3 Pi + O2 NAD+ + 3 ATP + H2O
1.

2.

Indique si las siguientes afirmaciones son verdaderas o falsas:

a) La constante de Michaelis, Km
* Vara con la velocidad de la reaccin enzimtica
* Es constante para una enzima determinada sea cual fuera el sustrato usado.
* Es la constante de velocidad para la descomposicin del complejo ES.
* Es la concentracin de sustrato a la cual se obtiene una velocidad igual a la mxima.
b) Usando una concentracin de sustrato equivalente al 20% de Km, se obtuvo en una reaccin
enzimtica una velocidad de reaccin de 1 mol/min. Para esta reaccin enzimtica, el valor de Vmax:
* es igual a 2 mol/min
* es igual a 2Km
* es igual a 6 mol/min
Se estudi para una protena X la dependencia de la actividad enzimtica con la concentracin de
sustrato y se obtuvieron los siguientes valores de velocidad (moles/min.mg):
3.

[S] (mM)
V

0,25
33

0,50
50

0,67
57

1,00
67

Teniendo en cuenta que el peso molecular de la protena es 300.000: a) Calcule los valores de Km,
Vmax. b) Exprese el valor de velocidad mxima en Katal/mg. c) Calcule el nmero de recambio y
explique el significado del mismo.
Dos estudiantes (A y B) aislaron independientemente la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) de
msculo de caballo. Esta enzima cataliza la siguiente reaccin:
4.

NAD + lactato NADH + piruvato


Una vez obtenida una solucin concentrada de enzima, midieron actividad (mol/min.mg protena) en
funcin de la concentracin de sustrato obteniendo los siguientes datos:
[S] (M)
Act.
A
B

2.10-6

5.10-6

1.10-5

5.10-5

1.10-4

2.10-4

1.10-3

16
25

33
50

50
75

83
125

90
136

99
148

100
150

14

a) Sin graficar, estime aproximadamente Km y Vmax. Justifique. b) Proponga una explicacin para la
discrepancia observada entre los parmetros cinticos estimados por A y B. c) Qu variables
graficara para obtener Km y Vmax? Justifique.
La actividad de una muestra de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) pura, de concentracin
2 mg/ml, se ensay por un mtodo discontinuo midiendo la aparicin de piruvato mediante un ensayo
colorimtrico. La dinitrofenilhidrazina (DNFH) y el piruvato forman una hidrazona que luego del
agregado de NaOH presenta un mximo de absorbancia a 505 nm. As, 10 l de la muestra se
incubaron a 30C con concentraciones saturantes de lactato y NAD+ en un volumen final de 3 ml.
Luego de 3 min la reaccin enzimtica se detuvo por el agregado de 0,5 ml de DNFH. Despus de
10 min se adicionaron 1,5 ml de NaOH 0,4 N y se midi absorbancia de la hidrazona formada a 505
nm, obtenindose un valor de absorbancia de 0,6 una vez restado el blanco.
Para realizar la curva de calibracin del mtodo colorimtrico se trabaj en idnticas condiciones
utilizando una solucin de cido pirvico (PM = 88) 4,4 mg/ml. Los valores obtenidos se muestran en
la tabla.
5.

ml de testigo
Abs (505 nm)

0
0,05

0,05
0,15

0,10
0,25

0,20
0,44

0,30
0,66

0,40
0,85

Calcule el nmero de recambio de la LDH, considerando que el peso molecular de la enzima es de


130.000 y que posee dos sitios activos por molcula.
La actividad de la enzima malato deshidrogenasa (MDH) purificada de maz fue medida por un
mtodo discontinuo. La enzima cataliza la siguiente reaccin:
Oxaloacetato + NADH Malato + NAD+
La reaccin se llev a cabo en 1 ml de medio de reaccin que contena 50 mM Tris-HCl pH 8;
concentracin saturante de NADH, 10 l de la preparacin enzimtica (0,1 mg/ml de protena) y
10 mM de oxaloacetato (OAA). Luego de 1 min de incubacin a 37C, se agregaron 5 ml de un
reactivo de color que se utiliza para dosar OAA, obtenindose luego de 10 min una absorbancia de 0,2
una vez restado el blanco. Como testigo se utiliz una alcuota de 1 ml de OAA 4,6 mM, al que se le
adicionaron 5 ml de reactivo de color, registrndose una absorbancia (ya restado el blanco) de 0,095
luego de 10 min. a) Calcule las U/ml de enzima que posee la preparacin. b) Sabiendo que el valor de
Km para el OAA de la enzima es 10 M, el peso molecular es 200.000 y que la enzima posee 4 sitios
activos por molcula, calcule el ndice de recambio. c) Proponga un mtodo continuo de medida de
actividad para esta enzima.
6.

Se purific a homogeneidad la enzima mlica dependiente de NADP (EM-NADP) de PM 15.000


Da que cataliza la siguiente reaccin:
malato + NADP piruvato + CO2 + NADPH.
Se estudi la actividad enzimtica a concentraciones de sustratos saturantes midiendo el aumento de
absorbancia a 340 nm ( NADPH = 6,22 mM-1 cm-1)
El medio de reaccin contena 20 l de Malato 200 mM, 2 l de NADP 50 mM y 20 l de la
enzima pura (2,2 mg/ml) en un volumen final de 1 ml. Al cabo de 2 min de reaccin enzimtica se
obtuvo una variacin de absorbancia de 0,78. El ndice de recambio de la protena es de 10,5 min-1.
a) Determine la concentracin (mM) de sitios activos de la preparacin enzimtica. b) Determine
cuntos sitios activos posee cada molcula.
7.

15

Una enzima cataliza la reaccin S P. Con los siguientes datos estime el valor de Km para dicha
enzima: I) ndice de recambio: 3800 min-1, II) PM de la enzima: 62 kDa. III) Nmero de sitios activos
por molcula de enzima: 3 IV) la actividad enzimtica, ensayada en un medio de reaccin de 1,5 ml
que contena 10 l de una solucin del sustrato 200 mM y una concentracin de enzima de 1,5 mg/ml,
dio un valor de 12 UI/ml de la preparacin enzimtica.
8.

En mamferos existen 5 isoenzimas LDH, cada una de ellas con diferentes propiedades cinticas
y movilidad electrofortica. Una de las isoenzimas se localiza en corazn (H4-LDH) y otra en msculo
(M4-LDH). Se han determinado las siguientes propiedades cinticas para ambas isoenzimas de origen
humano purificadas a homogeneidad:
9.

Isoenzima
H4-LDH

Km Piruvato (mM)
0,300

M4-LDH

0,025

Act. Especfica (U/mg)


2000
4800

Ante un dao sufrido por un determinado tejido, hay liberacin hacia el torrente sanguneo de la
correspondiente isoenzima. Es as que suele ser importante, para realizar un diagnstico, no solo
determinar un aumento de LDH en suero, sino establecer qu isoenzima est incrementada. Suponga
que usted est en un laboratorio clnico de guardia y le traen un paciente inconsciente, debiendo usted
determinar si ha sufrido un infarto cardaco o si slo se trata de un agotamiento por ejercicio muscular
excesivo. Luego de determinar que los niveles de LDH en suero estn elevados usted realiza un
estudio cintico de la actividad LDH srica. Utilizando alcuotas de 10 l de suero que contena
50 mg/ml de protena usted mide la actividad LDH a distintas concentraciones de piruvato obteniendo
los siguientes resultados:

Piruvato (mM)
Actividad LDH (U/ml)

0,0125
0,33

0,0166
0,40

0,0250
0,50

0,0500
0,66

En base a estos datos indique qu diagnstico hara del paciente: infarto de miocardio o
agotamiento por ejercicio muscular excesivo. Justifique su respuesta.
Se procedi a purificar a homogeneidad la enzima Glutamato-piruvato transaminasa a partir de
hgado de rata. La enzima cataliza la reaccin:
-cetoglutarato + alanina glutamato + piruvato
10.

Luego de varios pasos de purificacin se midi actividad enzimtica de la preparacin, para lo cual se
contaba con dos mtodos alternativos.
a) El primer mtodo de medida acopla una segunda reaccin catalizada por la enzima Lactato
deshidrogenasa (LDH): Piruvato + NADH + H+ Lactato + NAD+, midindose la disminucin de la
absorbancia a 340 nm ( NADH = 6,22 mM-1 cm-1). Se incubaron 200 l de la preparacin enzimtica en
un volumen final de 1 ml que contena -cetoglutarato, Ala, NADH y LDH. La disminucin de la
16

absorbancia obtenida fue de 0,62 por minuto. Calcule las UI/ml de la preparacin enzimtica; b) Por el
otro mtodo alternativo de medida se preincubaron 100 l de la preparacin enzimtica en un volumen
final de 1 ml con -cetoglutarato y Ala. A los 10 minutos, la reaccin se detuvo con el agregado de
0,5 ml de 2,4 dinitrofenilhidrazina y adems se agregaron 5 ml de NaOH. Sabiendo que 1 ml de testigo
de piruvato 1 mM presenta con el mismo mtodo de medida una absorbancia de 0,2, calcule la
absorbancia que obtendra en este caso; c) Describa las diferencias entre los mtodos utilizados.
La acetil-CoA carboxilasa (ACCasa) cataliza la carboxilacin, dependiente de ATP, del acetilCoA para formar malonil-CoA, primer intermediario en la sntesis de cidos grasos:
Acetil-CoA + ATP + CO2 Malonil-CoA + ADP + Pi.
La enzima fue aislada a partir de hojas de trigo y se llevaron a cabo los siguientes estudios cinticos:
Se determin la actividad enzimtica en un volumen final de 200 l en las siguientes condiciones:
100 mM Tricina-KOH (pH 8,0), 40 mM ATP, 2,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 1mM DTT, 30 mM acetilCoA, 30 mM [14C] NaHCO3 (3,33x 108 cpm; cpm=cuentas por minuto) y 1,8 g de la protena
purificada. La reaccin comenz con el agregado de la enzima, transcurri durante 10 minutos a 30C
y se interrumpi por la adicin de 50 l de 6 N HCl. La acidificacin del medio provoca la
inactivacin de la enzima y la eliminacin del HCO3- remanente por conversin en CO2. Alcuotas de
50 l de la mezcla de reaccin fueron transferidas a discos de papel de filtro. Los papeles se secaron a
temperatura ambiente y su radioactividad se cont en un contador de centelleo. El valor promedio de
radioactividad por disco correspondi a 3,5 x 106 cpm. Determine la velocidad de reaccin en U/mg.
11.

TABLAS DE PURIFICACIN

La enzima malato deshidrogenasa dependiente de NADP cataliza la siguiente reaccin:


Malato + NADP+ Oxaloacetato + NADPH
A partir de 500 g de hojas de espinaca se obtuvieron 1500 ml de un extracto crudo con una
concentracin de protenas de 20 mg/ml. La medida de actividad se determin con una alcuota de
30 l midindose, por mtodo continuo la aparicin de NADPH a 340 nm en un volumen final de
3 ml, obtenindose un A/10 min = 1,24, NADPH = 6200 M-1.cm-1
Se realiz luego una cromatografa en DEAE celulosa recogindose 180 ml que contenan 1800 U de
actividad enzimtica y 2.250 mg de protena. El paso posterior fue una columna de hidroxilapatita,
recogindose 10 tubos de 4 ml cada uno con actividad deshidrogenasa. La concentracin de protena
en el conjunto fue de 0,94 mg/ml con un rendimiento del 50 % respecto del paso anterior. Como
ltimo paso se realiz una cromatografa en columna de Sepharosa 6B y se recuperaron 760 U de
enzima y 31,4 mg de protena en un volumen de 15 ml.
En base a estos datos a) Construya la Tabla de Purificacin, b) Indique la purificacin y el rendimiento
total alcanzados; c) Cul es la etapa individual que dio mayor purificacin y cul la de mayor
rendimiento? d) Describa el mtodo empleado en el segundo paso de purificacin. e) Seale si todas
las etapas empleadas se justifican. Fundamente su respuesta.
1.

2.

Se realiz la purificacin de la enzima glucosa-6-fosfatasa que cataliza la siguiente reaccin:


Glucosa-6-fosfato Glucosa + Fosfato

Se parti de 200 g de hgado de bovino obtenindose un extracto inicial de 1200 ml, que tena una
concentracin de protena de 10 mg/ml. Para medir actividad enzimtica se incub una alcuota de 50
17

l con el sustrato a 30C en 1 ml de medio. La reaccin se cort directamente a los 10 min por el
agregado de 2 ml de reactivo de color para fosfato. La reaccin de color se lee a 740 nm en una cubeta
de 1 cm de camino ptico. La Abs740 fue de 0,49 con un blanco de medida de 0,12. El coeficiente de
extincin del producto de la reaccin de color es de 3700 M-1.cm-1.
Se realiza luego un corte con (NH4)2SO4 al 50 % rescatndose la fosfatasa en el precipitado, el que fue
redisuelto en 80 ml, recuperndose 1680 mg de protena con una actividad total de 504 U.
Posteriormente, se realiz una cromatografa en Sephadex G-25 recogindose 10 tubos de 12 ml cada
uno con actividad enzimtica. La concentracin de protena en el conjunto fue de 10,8 mg/ml con un
rendimiento, respecto del paso anterior del 80%. Como ltimo paso se efectu una cromatografa de
afinidad y se obtuvieron 144 U de enzima con actividad especfica de 3,6 U/mg en un volumen de
20 ml.
En base a estos datos a) Construya la Tabla de Purificacin. b) Cul es la purificacin y el
rendimiento total alcanzados? c) Cul es la etapa individual que dio mayor purificacin y cul la de
mayor rendimiento? d) Describa el fundamento del ltimo paso de purificacin empleado. e) Seale si
todas las etapas empleadas se justifican. Fundamente su respuesta f) Explique la importancia de
realizar la cromatografa de exclusin molecular Sephadex G-25.
La dihidropicolinato sintetasa (DHDPSasa) se purific y caracteriz a partir de cultivos de trigo
en suspensin. Dicha enzima cataliza la siguiente reaccin, donde ASA y DHDP representan a
aspartato -semialdehdo y cido 2,3 dihidropicolnico, respectivamente.
3.

Piruvato + ASA DHDP + 2 H2O


Durante la purificacin de la DHDPSasa se obtuvieron 200 ml de extracto crudo, que contenan 0,5 g
de protena. La actividad se ensay midiendo piruvato remanente. La reaccin se llev a cabo en 3 ml
de medio de reaccin, conteniendo 30 l de enzima, Tris-HCl 100 mM pH 8, 40 mM de piruvato
sdico y concentracin saturante de ASA. Luego de 10 minutos a 30C, la reaccin enzimtica se
detuvo por el agregado de 0,5 ml de DNFH (reactivo de color). Despus de 15 minutos se adicionaron
1,5 ml de NaOH 0,4 N y se determin la absorbancia de la hidrazona a 505 nm, en una cubeta de 1 cm
de paso ptico. La absorbancia obtenida fue de 0,8. Como testigo se utiliz una alcuota de 100 l de
una solucin de concentracin 31,55 mg/ml de piruvato a la que se le realiz el mismo tratamiento que
a la muestra, obtenindose una absorbancia A 505 nm de 0,25. PM Piruvato = 88.
A este extracto se le realiz un corte con (NH4)2SO4, precipitando la enzima entre el 30 y 60 % de
saturacin. El precipitado se redisolvi y luego de desalado se obtuvo un volumen final de 150 ml, con
una concentracin de protena de 2 mg/ml, y un rendimiento de 80 %. La muestra anterior se separ en
dos fracciones. El 60 % se sembr en una columna de DEAE-celulosa obtenindose 50 ml de muestra
conteniendo 75 mg de protena, y un rendimiento con respecto al paso anterior del 45%. El 40%
restante se sembr en una columna de afinidad, obtenindose 25 ml de muestra que contiene 20 mg de
protena, purificndose 5 veces con respecto al paso anterior.
En base a los datos: a) Realice la tabla de purificacin, b) Indique rendimiento y purificacin totales,
c) Justifique cul de las etapas alternativas elegira.
Se intenta purificar la enzima gliceraldehdo 3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP que
cataliza la reaccin:
4.

Gliceraldehdo 3-fosfato + NADP + Pi 1,3-Difosfoglicerato + NADPH + H+

18

Se parte de 500 g de hojas de espinaca, obtenindose 1.500 ml de un extracto crudo con una
concentracin de protena de 20 mg/ml. La medida de actividad se determin con una alcuota de 30 l
por un mtodo continuo, midindose la aparicin de NADPH (NADPH = 6200 M-1.cm-1) en una cubeta
de 3 ml y 1 cm de camino ptico, obtenindose un A/10 min= 1,24.
Se realiz luego una cromatografa en DEAE-celulosa, recogindose 180 ml que contenan 1800 U de
actividad enzimtica y 2250 mg de protena. El volumen total de este paso (180 ml) fue dividido en
dos volmenes iguales. I) Una de las fracciones fue sometida a cromatografa de adsorcin
(hidroxilapatita), recogindose 5 tubos de 4 ml cada uno, con actividad deshidrogenasa. La
concentracin de protena en el conjunto fue de 0,94 mg/ml, con un rendimiento respecto al paso
anterior del 50%. II) La otra fraccin de la columna de DEAE-celulosa fue sometida a una
cromatografa de afinidad; en la que se recuperaron 800 U de enzima y 4 mg de protena en un
volumen de 15 ml.
a) Calcule el rendimiento y la purificacin para cada uno de los procedimientos alternativos empleados
b) La electroforesis en gel de poliacrilamida mostr que la enzima proveniente de uno de los
procedimientos migraba como una nica banda de protena (Rf = 0,33), mientras que la proveniente
del otro procedimiento mostraba la presencia de tres bandas proteicas (Rf = 0,25; Rf = 0,325 y Rf =
0,65). En base a la tabla de purificacin podra adjudicar a qu procedimiento de purificacin
corresponde cada electroforesis obtenida. Justifique su respuesta.
Dos grupos de trabajo presentan independientemente protocolos para la purificacin de una
enzima desde un mismo tejido de plantas. Para medir la actividad enzimtica se incuba una alcuota de
30 l de enzima con el sustrato en 1 ml de medio de reaccin. La reaccin se corta a los 5 minutos por
el agregado de 2 ml de reactivo de color especfico para el producto de la reaccin ( =3700 M-1 cm-1)
Se utiliza una cubeta de 1 cm de camino ptico. La medida del blanco de reaccin da un valor = 0,1.
Los volmenes indicados se refieren a la cantidad recuperada en cada paso.
5.

Protocolo 1: I) Extracto Crudo: 200 ml, Abs=0,56, [protena]= 50 mg/ml; II) Fraccionamiento con
PEG: 300 ml. Se purifica 10 veces la enzima, con un rendimiento de 80%; III) Cromatografa en
DEAE-celulosa: 280 ml, Act Especfica = 5 y 280 U de enzima; IV) Cromatografa en columna de
Hidroxilapatita: 25 ml, 84 U de enzima y 8,4 mg de protenas.
Protocolo 2: I) Extracto Crudo: 400 ml 2,5 U/ml y una Act Especfica = 0,05; II) Columna de
Sephadex: 500 ml Se purifica 2 veces la enzima, con un rendimiento del 50%; III) Precipitacin con
(NH4)2SO4 y desalado: 200 ml, 1 U/ml y 0,3 U/mg; IV) Cromatografa en Affigel Blue: 30 ml.
Purificacin parcial de 10 veces, y un rendimiento parcial del 80%
a) Indique la purificacin y rendimiento de cada protocolo y comprelos. b) Indique la purificacin
parcial y rendimiento parcial de cada paso. c) Proponga un posible protocolo alternativo (consistente
en extracto crudo ms tres pasos) para mejorar la purificacin. Justifique brevemente.
Durante la purificacin de la enzima ureasa (Urea + H2O 2 NH4+ + CO2) se obtuvo 900 ml de
Extracto Crudo (EC) con una concentracin de protena de 3,33 mg/ml. Su actividad se midi
siguiendo la disminucin de la Absorbancia a 340 nm utilizando la reaccin acoplada NH4+ + KG +
NADH + H+ Glu + NAD+ ( NADH = 6200 M-1 cm-1). El agregado de 20 l de EC a 1 ml de la mezcla
de reaccin produjo un A = - 0,800 en 4 minutos en una cubeta de 1 cm de camino ptico. Un corte
con (NH4+)2SO4 dio lugar a un precipitado que se redisolvi con buffer hasta 150 ml de volumen final.
De esta manera la ureasa se purific 10 veces con un rendimiento del 82,8 %. Luego de pasados por
una columna de Sephadex G-25 se recolectaron 80 ml con 45 mg de protena, purificndose 50 veces
respecto del EC con un rendimiento del 90 % respecto del paso anterior. Su actividad se determin por
el mtodo discontinuo (NH4+ + Fenol + Hipoclorito Azul de Indofenol) cuya curva de calibracin
de NH4+ present una pendiente de 0,6557 UA/mol NH4+. Las condiciones de la colorimetra fueron
6.

19

las mismas para la curva y la muestra. a) Cul fue la absorbancia medida por este ltimo mtodo para
la muestra si se emplearon 40l de ureasa obtenida en la ltima etapa? Tenga en cuenta que para la
ureasa una unidad de actividad enzimtica (1 UI) se define como la cantidad de enzima que cataliza el
consumo de 1 mol de sustrato (urea) por minuto en las condiciones especificadas. b) Realice la tabla
de purificacin.
La enzima mlica cataliza la reaccin: Malato + NADP+ Piruvato + CO2 + NADPH + H+. Se
intent purificar esta enzima a partir de hojas de maz. Para ello se realizaron distintas etapas que
incluyeron la preparacin de un extracto crudo, precipitacin con (NH4)2SO4, cromatografa de
exclusin molecular en Sephadex G-100 y cromatografa de intercambio inico en DEAE-celulosa. La
medicin de protenas se realiz por el mtodo de Gornall. Para ello, alcuotas de 20 l de la
preparacin enzimtica se incubaron con 2 ml del reactivo de Biuret durante 15 min a 37C. El testigo
de ovoalbmina (10 mg/ml) procesado de la misma manera produjo un valor de absorbancia de 0,650
medido a 545 nm. La actividad enzimtica se determin en 1 ml de medio de reaccin que contena
50 mM Tris-HCl pH 8,0, cantidades saturantes de los sustratos y 10 l de la preparacin enzimtica. A
los 10 min de incubacin a 30C, la reaccin se detuvo por el agregado de 2 ml de
dinitrofenilhidracina. Como testigo se utiliz 1 ml de piruvato (PM=88) de 0,5 mg/ml que produjo un
valor de absorbancia de 0,040 medido a 505 nm. En base a los datos suministrados, a) Construya la
tabla de purificacin calculando el rendimiento y la pureza total alcanzados; b) Proponga otros dos
mtodos de medida de la actividad enzimtica. Explquelos brevemente.
7.

Etapa

Volumen Abs 545 nm


(ml)

Abs 505 nm

Extracto crudo

30

0,390

0,050

(NH4)2SO4
Sephadex G-100
DEAE-celulosa

8
4
2

0,253
0,163
0,097

0,166
0,208
0,375

Se intenta purificar la enzima Gliceraldehdo 3P deshidrogenasa que cataliza la siguiente


reaccin:
Gliceraldehdo-3P + NADP+ 3P-Glicerato + NADPH + H+
Luego de obtener el extracto crudo y realizar varios pasos de purificacin a partir de hojas de espinaca
se obtuvieron 75 ml con una concentracin de protena de 2 mg/ml. La medida de actividad se realiz
con una alcuota de 20 l midindose por mtodo continuo la aparicin de NADPH a 340 nm
(= 6200 M-1. cm-1) en una cubeta de 4 ml y 1 cm de camino ptico, obtenindose un A de 0,31 en
4 minutos.
8.

Con el fin de elegir qu paso era ms conveniente para continuar la purificacin, se toman
distintas alcuotas de la muestra y se procede de la siguiente manera:
1.
40 ml fueron sometidos a una cromatografa de exclusin molecular en la que se recuperaron
100 ml que contenan 100 U de actividad y 80 mg de protena.
2.
25 ml fueron sometidos a una cromatografa de adsorcin obtenindose un rendimiento del 50%
y recogindose 10 tubos de 1 ml, con una concentracin de protena de 0.03125 mg/ml.
3.
Con los ltimos 10 ml se realiz una DEAE-celulosa obtenindose 5 ml con una actividad
especfica de 2.5 U/mg y 5 mg de protena.
9.

20

En base a los datos: a) Calcule rendimiento y purificacin para cada uno de los tres procedimientos.
b) Qu procedimiento elegira si su objetivo fuera obtener la enzima lo ms pura posible?

INHIBICIN ENZIMTICA
Luego de purificar la enzima gliceraldehdo 3-fosfato deshidrogenasa se procedi a determinar el
valor de Vmax y Km para el gliceraldehdo 3-fosfato a pH 8,0. Los valores obtenidos fueron los
siguientes: Vmax = 20 U/ml; Km = 1 mM. Luego se volvieron a determinar estos parmetros cinticos
en presencia de cuatro sustancias conocidas A, B, C y D, obtenindose en cada caso los siguientes
valores:
1.

En presencia de A
En presencia de B
En presencia de C
En presencia de D

Km (mM)
2,0
0,5
1,0
6,0

Vmax (U/ml)
20
10
10
10

En base a estos datos, indique que tipos de sustancias son A, B, C y D. Justifique.


La enzima hexoquinasa cataliza la siguiente reaccin: Glucosa + ATP Glucosa-6-P + ADP.
Al observar que la enzima es inhibida por piruvato, se intent estudiar el mecanismo de la inhibicin.
Para ello se determin la velocidad de reaccin a distintas concentraciones de glucosa, en ausencia y
en presencia del inhibidor y a concentraciones saturantes de ATP. Los resultados obtenidos se
muestran en la tabla que sigue:
2.

Glucosa (mM)
0,1
0,2
0,3
0,4

Piruvato (mM)
0
Actividad (U/mg)
9,98
15,02
17,89
20,05

0,4
7,14
10,72
12,86
14,28

a) Determine qu tipo de inhibicin presenta el piruvato con respecto a la glucosa sobre la enzima y
esquematice el mecanismo de inhibicin. b) Calcule Km, Vmax y la constante de disociacin del
complejo hexoquinasa-piruvato. c) Calcule la velocidad de reaccin cuando la concentracin de
glucosa es igual al valor de Km aparente, si el piruvato est presente a una concentracin de 0,4 mM.
Sobre una enzima que cataliza la reaccin S P se prueba el efecto de dos inhibidores X e Y,
obtenindose los siguientes datos de velocidad. Determine la naturaleza de cada inhibidor haciendo un
esquema de la inhibicin. Calcule Km, Vmax y Ki.
3.

21

Velocidad (U/ml)
[S] (mM)
2,00
2,50
3,33
4,00
5,00

Sin agregado
50,00
55,56
62,47
66,67
71,42

+ 12 M X
40,00
45,45
52,63
57,14
62,50

+ 60 M Y
37,03
41,67
47,62
51,28
55,56

Cuando la reaccin enzimtica catalizada por la LDH (lactato deshidrogenasa) se lleva a cabo en
presencia de una concentracin 0,3 mM de un inhibidor X, tanto Km como Vmax disminuyen a un
tercio del valor obtenido en ausencia del inhibidor. Responda el siguiente cuestionario: a) Qu tipo de
inhibicin presenta X sobre el sistema enzimtico? b) Cmo es la afinidad aparente de la enzima por
su sustrato en presencia del inhibidor, comparada con la afinidad real que se observa en ausencia del
inhibidor? Por qu se produce ese cambio en la afinidad? c) Estime Ki del inhibidor X lo ms
exactamente que pueda con los datos disponibles. Si usted necesitase calcular Ki con una exactitud
mayor qu experimentos realizara?
4.

En un estudio de inhibicin por GMP de la malato deshidrogenasa dependiente de NADP


(MDH) que cataliza la reaccin:
5.

Oxaloacetato + NADPH + H+ Malato + NADP+


se obtuvieron los valores de A340 nm/min que figuran en la tabla. La actividad enzimtica se midi con
10 l de la MDH en una cubeta de 1 ml y 1 cm de camino ptico y concentraciones saturantes de
Oxaloacetato. En base a la misma: a) Indique qu tipo de inhibidor es GMP con respecto a NADPH. b)
Calcule Ki mediante grficos secundarios y de Dixon c) Calcule Km para NADPH y Vmax de la enzima
(U/ml). (0= 6200 M-1. cm-1).

NADPH (mM)
GMP (mM)
0,0
1,0
3,0
4,0
5,0

0,25

0,50

0,67

1,00

0,365
0,248
0,151
0,127
0,109

A340 nm/min
0,564
0,654
0,413
0,497
0,270
0,336
0,230
0,289
0,200
0,254

0,775
0,620
0,443
0,388
0,344

La enzima mlica dependiente de NADP es una protena homotetramrica que cataliza la


reaccin: L-malato + NADP CO2 + piruvato + NADPH.
Para determinar el modo de accin de succinato con respecto a malato, se estudi la velocidad de la
reaccin enzimtica en ausencia y en presencia de distintas concentraciones del mismo, a
concentraciones saturantes de NADP. Los resultados se resumen en la siguiente tabla. En base a los
datos: a) Determine grficamente los valores de Km Malato y Vmax de la enzima. b) Indique que tipo
6.

22

de inhibidor es el succinato con respecto a malato y calcule su Ki. c) Represente los grficos
secundarios y de Dixon para ste sistema.

succinato
(mM)
malato
(mM)
0,1
0,2
0,3
0,4

Tabla
0,4
0,8

1,2

1,6

Actividad (U/mg)
9,98
7,14
5,55
15,02 10,72
8,33
17,89 12,86 10,02
20,05 14,28 11,11

4,55
6,82
8,18
9,09

3,85
5,77
6,92
7,69

Para el tratamiento de una enfermedad, un laboratorio farmacutico est tratando de desarrollar


un nuevo medicamento consistente en un inhibidor que se combine nicamente con la forma libre de la
enzima E involucrada en dicha enfermedad. Para ello analiza a los inhibidores X e Y obteniendo los
siguientes resultados:
V (moles min-1 mg-1)
1/ S ( M )-1
X 0mM X 2 mM
0,33
10,4
6,0
0,20
14,5
9,1
0,10
22,5
15,15
0,03
33,8
28,4
0,01
40,5
37,9
7.

Al medir velocidad inicial de la reaccin enzimtica (U/mg) en funcin de la concentracin de sustrato


S en ausencia y en presencia de 2 mM de Y y luego de realizar la representacin de Lineweaver-Burk,
se obtuvieron dos rectas intersectantes en un mismo punto en el eje de las ordenadas. La pendiente de
la recta obtenida en presencia de Y fue de 0,66.
En base a los datos: a) Calcule Km y Vmx de la enzima E. b) Qu tipo de inhibidores son X e Y?
Justifique. Indique los valores de Km y Vmx en presencia de X e Y. C) Cul/es de los inhibidores sera
til para el tratamiento de la enfermedad? En caso de que ambos lo sean, diga cul sera el ms
efectivo. Justifique su respuesta teniendo en cuenta el valor de Ki.

Se estudia el efecto de dos inhibidores X e Y sobre la actividad de una enzima. Los resultados
del ensayo utilizando 5 l de la solucin enzimtica se muestran en el grfico. Adems, se determina la
actividad en funcin de la cantidad de enzima en presencia de una concentracin constante de cada
inhibidor y se obtienen los datos de velocidad que se detallan en la tabla. Explique los resultados
obtenidos.
8.

23

1/v

Actividad (U)

[X]=100M

l de Enzima 100 M X
1
2
3
4
5
6

[Y]=100M
Sin inhibidor

0
0
0
10
20
30

100 M Y Sin inhibidor


7,5
15
22,5
30
37,5
45

10
20
30
40
50
60

1/[S]

EFECTO DEL PH Y LA TEMPERATURA

1.
El grfico adjunto muestra el efecto de la temperatura sobre la actividad de una enzima.
a) Indique las causas por las que vara la actividad enzimtica en funcin de la temperatura
estableciendo efectos directos y efectos indirectos. b) Qu experimento le permitira distinguir entre
efectos reversibles e irreversibles? c) Indique que zona del grfico utilizara para obtener la energa de
activacin (Ea) de la reaccin y como la calculara. Defina Q10. Cul metodologa considera ms
apropiada para el clculo de la Ea?

Actividad (mol/min.mg)

40

30

20

10

0
0

10

20

30

40

50

60

70

80

Temperatura (C)

2.
Al ensayar la actividad de una enzima a diferentes temperaturas se obtuvieron los datos
mostrados en la lnea A. Cuando la enzima se preincub a distintas temperaturas durante 15 min y
luego se determin actividad a temperatura ptima, se obtuvieron los datos de la lnea B. Ambos
experimentos se realizaron a concentraciones de sustratos iguales a 100 veces los valores de Km.
T (C) 5
Act. (U/mg)
A
B

1,1
2,5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

2
2,5

4
5

10
30

15
30

22
30

30
30

30
20

20
10

12
7,5

6
2,5

1,5
2,5

24

En base a estos datos: a) Indique la T ptima de la enzima. b) Por qu la actividad enzimtica cuando
se ensay a la temperatura ptima no fue constante para todas las muestras previamente incubadas a
las distintas temperaturas? c) Calcule el Q10 y la energa de activacin.
3.
La ureasa cataliza la hidrlisis de la urea para dar CO2 y NH4+. Cuando se realiz el estudio de
dependencia de la actividad enzimtica con la temperatura, se obtuvieron los datos que figuran en la
grfica. Los experimentos se llevaron a cabo bajo las siguientes condiciones: I- en un medio
medianamente reductor, II- en un medio fuertemente reductor y III en un medio no reductor. En base
al grfico de Arrhenius que se muestra, hipotetice acerca del comportamiento de esta enzima en las
distintas condiciones.

2.6
No Reductor
Reductor Fuerte
Reductor Moderado

2.4

Log Vmax

2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
310

320

330

340

350

360

1/T (*105)

4.
La enzima nucletido pirofosfatasa de Proteus vulgaris es completamente inactivada cuando se
la incuba durante 10 minutos a 70oC y puede ser completamente reactivada por enfriamiento a 37oC.
Se ha establecido que un inhibidor de la enzima copurifica con la misma. Debido a que el mencionado
inhibidor es termolbil, se decide calentar a 100oC para eliminarlo. Un estudiante realiza este
procedimiento y encuentra que la enzima se desnaturaliza. Decide repetir el procedimiento, esta vez en
presencia de una sustancia X (cuya unin a la enzima ha sido previamente descripta), observando que
en esta ocasin la enzima no pierde su actividad. a) Explique estos resultados. b) Qu tipo de
sustancia puede ser X?
5.
Se ha purificado a homogeneidad la enzima ATPasa de hgado de rata (ATP ADP + Pi) y se
midi su actividad a concentraciones de ATP subsaturante (10 M) a distintas temperaturas. Los
resultados obtenidos se indican en la Tabla. En un experimento de preincubacin de la enzima a
distintas temperaturas y medida de la actividad a 25C, se concluye que la enzima pierde actividad a
temperaturas mayores a 35C. a) Sabiendo que el ndice de recambio de la enzima a 30C es de
104 min-1 y que la enzima (PM=50 kDa) posee un solo sitio activo, estime el valor de Km para ATP a
30C. b) Podra estimar el valor de Energa de Activacin de la enzima a partir de estos datos? Si es
as, indique el valor obtenido. (R=2 cal/mol.K).
Temperatura
20C
30C
40C

Act. (mol/min.mg)
25
40
20

6.
El grfico adjunto muestra el efecto del pH sobre la actividad de una enzima medida a
concentraciones de sustrato constante y saturante. a) Enumere las causas por las que la actividad
25

enzimtica puede variar en funcin del pH. b) Plantee un diseo experimental para distinguir entre los
posibles efectos del pH. c) De acuerdo al grfico a qu pH trabajara para realizar los estudios
cinticos de esta reaccin enzimtica? d) Si la enzima es estable y el sustrato no sufre cambios de
ionizacin en el rango de pH estudiados, a qu corresponderan los puntos de inflexin de la curva
(pH 4 y 8)?

7.
Indique si los grficos que se muestran sugieren ionizacin de la enzima libre o ionizacin del
complejo enzima-sustrato. Suponga que en ese rango de pH no hay desnaturalizacin de la enzima,
como as tampoco del sustrato. Justifique brevemente.

Actividad (U/mg)

-1

10
8
6

2 4 6 8 10 12

pH
pH

1/actividad (U/mg

actividad (U/mg)

1/Actividad (U/mg)-1

8.
Un investigador purifica a homogeneidad la enzima malato deshidrogenasa y realiza un estudio
de la actividad de la enzima en funcin del pH utilizando una concentracin de sustrato subsaturante.
Obtiene la grfica A. Sin embargo cuando preincuba la enzima a distintos valores de pH entre 2 y 10 y
luego mide la actividad a pH ptimo observa que la enzima presenta actividad mxima entre pH 4.0 y
8.0. Con el fin de determinar qu aminocidos estaban implicados en la catlisis determina la actividad
de la enzima a concentraciones variables de sustrato y a tres valores de pH, obteniendo el grfico B.
Teniendo en cuenta que el sustrato no sufre cambios de protonacin en el rango de pH estudiado,
indique: a) El rango de estabilidad de la malato deshidrogenasa, el pH ptimo de la enzima. b)
Proponga un modelo (con un esquema) que explique los resultados obtenidos en la grfica B.
c) Cuando el investigador grafica los distintos valores de Km a distintos valores de pH, obtiene que un
grupo con un pKa de 6,2 est implicado en la catlisis. Sin embargo, al estudiar la secuencia primaria
de la enzima y compararla con otras secuencias encuentra que, de todos los residuos ionizables, slo
un residuo de Glu est conservado (pKa COO-=4,0). Podra ser dicho grupo el responsable de los
cambios de la actividad de la enzima? Por qu podra presentar ese valor de pKa?

12

pH 4.0

pH 6.0

6
pH 8.0
3
0
0

1/[S] (mM)-1

26

9.
El grfico A muestra los resultados de los estudios de la estabilidad de la enzima malato
deshidrogenasa purificada de mitocondrias y glioxisomas a distintos pH. Cuando se procedi a realizar
la determinacin del pH ptimo se obtuvo el grfico B a) Indique el pH ptimo de las isoenzimas y
establezca el rango de pH en el cual ambas enzimas son estables. b) Analice las posibles causas de la
disminucin de la actividad a pH mayores y menores al pH ptimo en cada caso. c) Explique cmo
realizara el estudio de estabilidad en funcin del pH, especificando todos los parmetros a tener en
cuenta. d) Segn los resultados obtenidos en el caso de la enzima mitocondrial a pH mayores a 8,5
indique qu grupo/s ionizable/s de la enzima podra/n estar implicado/s en los cambios de actividad
observados. Qu estado de ionizacin presenta dicho grupo en la enzima activa?

120
MDH mitocondrial

100

80

60

40

MDH mitocondrial
MDH glioxisomal

100

Actividad (%)

Actividad (%)

MDH glioxisomal

80

60

40

20

20

0
3

10

11

12

10

11

pH

pH

CINTICA DE DOS SUSTRATOS

1.
Describa tres modelos cinticos para una reaccin enzimtica en la que participan dos sustratos.
Describa tambin mtodos de diagnstico para determinar el modelo cintico seguido por una reaccin
enzimtica que involucre dos sustratos.
2.
La glutamato-oxaloacetato aminotransferasa, llamada comnmente transaminasa GOT, es una
enzima que interviene en el metabolismo de los aminocidos y posee importancia clnica para el
diagnstico de patologas hepticas. La enzima posee fosfato de piridoxal como grupo prosttico y
cataliza la siguiente reaccin:
Glutamato + Oxaloacetato Aspartato + 2-Cetoglutarato.
En una investigacin sobre el mecanismo cintico se analiz la dependencia de la actividad enzimtica
con la concentracin de glutamato, a dos concentraciones diferentes de oxaloacetato. Los resultados
obtenidos se resumen en la tabla:
Glutamato (mM)
Experimento
+ 0,1 mM oxaloacetato
+ 0,2 mM oxaloacetato

0,1
2,0
2,2

0,2
3,4
4,2

0,3

0,4

Velocidad (U/mg)
4,4
5,0
5,8
6,6

0,5
5,8
8,0

0,8
6,6
10,0

27

Por otra parte, el aspartato se comport como un inhibidor competitivo respecto del glutamato, cuando
se agreg oxaloacetato en concentraciones saturantes. Proponga en forma esquemtica un modelo
cintico que sea compatible con estas observaciones experimentales.
3.
Una enzima cataliza la reaccin S1 + S2 P1 + P2. Cuando se mide la actividad a
concentraciones variables de S2, manteniendo constante la concentracin de S1 se obtienen los valores
de velocidad (moles/min.mg) que se presentan en la siguiente tabla:
[S2] (mM)

[S1] (mM)
5
10

10

Velocidad (moles/min.mg)
14,5
21,5
25,6
22,5
32,5
38,2

8,7
13,9

30,3
44,4

El efecto de los productos se resume en la tabla siguiente:

P1
P2

S1 Variable
S2 Subsat.
S2 Sat.
NC
--NC
NC

S2 Variable
S1 Subsat.
S1 Sat.
C
C
NC
AC

a) Indique si la reaccin sigue un mecanismo secuencial o ping-pong. Justifique brevemente. b) En


caso que corresponda indique el orden de adicin de sustratos y de salida de los productos.
Esquematice el modelo de reaccin.
4.
La enzima citrato sintasa de mitocondrias participa en el metabolismo catablico de los hidratos
de carbono en todos los organismos aerbicos, catalizando la siguiente reaccin:
Oxaloacetato + Acetil-CoA Citrato + CoA
En una investigacin sobre el mecanismo cintico de esta enzima se llev a cabo un estudio de la
variacin de la actividad enzimtica en funcin de la concentracin de oxaloacetato, a dos
concentraciones diferentes de Acetil-CoA. Los resultados obtenidos se resumen en la tabla:
OAA (mM)
Experimento
+ 0,1 mM Acetil-CoA
+ 0,2 mM Acetil-CoA

0,5

0,67
2,00

1,0

1,5

2,0

2,5

4,0

1,10
3,35

V (U/mg)
1,45
1,65
4,15
5,00

1,85
5,55

2,2
6,65

Por otra parte, el citrato se comport como un inhibidor competitivo tanto respecto a oxaloacetato
como respecto a acetil-CoA, y otro tanto ocurri con la Coenzima A. Proponga en forma esquemtica
un modelo cintico que sea compatible con estas observaciones experimentales.
5.
Un estudiante purifica una quinasa de un sustrato A (A + ATP A-P + ADP) y decide estudiar
su mecanismo de reaccin. As, incuba la enzima con ATP marcado con 32P. Al cabo de 1 h precipita
28

la enzima, observando que la radiactividad inicial en el sobrenadante ha disminuido un 50%,


detectndose tambin ADP no marcado. a) Plantee un mecanismo de reaccin posible de esta quinasa.
b) Indique qu tipo de grficos esperara obtener al graficar 1/v vs 1/[A] a distintas concentraciones de
ATP. c) Esperara obtener radiactividad en la fraccin proteica? Explique su respuesta.
6.

Una vez purificada la enzima L-Aspartato aminotransferasa, enzima que cataliza la reaccin:
aspartato + oxoglutarato glutamato + oxaloacetato
Se procedi a estudiar el efecto de la concentracin de aspartato a concentraciones constantes de
Oxoglutarato sobre la velocidad inicial. Los valores de velocidad inicial obtenidos (mol/min.mg) se
transcriben a continuacin:
[Aspartato] 0,5 mM
[Oxoglutarato]
Saturante
5 mM
1 mM

18,2
16,7
15,4

1 Mm

2,5 mM

5 mM

Velocidad (mol/min.mg)
33,4
66,6
100,0
28,6
50,0
66,6
25,0
40,0
50,0

10 mM

125,0
77,0
55,0

a) Determine grficamente los valores de Vmax y Km para el aspartato. Indique el valor de Vmax en
UI/mg y en katal/mg. b) Cul es el ndice de recambio, asumiendo que la enzima posee un PM de 50
kDa y que posee 2 sitios activos por molcula? c) Indique el mecanismo de reaccin de esta enzima.
Fundamente brevemente.
7.

En un sistema enzimtico multisustrato del siguiente tipo:


A

Los reactivos A y B se adicionan al enzima E completamente al azar. Cuando se representa 1/v vs


1/[A] a distintas concentraciones de B, se obtienen rectas que se intersectan en un punto cuyo valor
sobre el eje de las abscisas es de 10 mM-1. El valor de (el factor de interaccin entre A y B) es
0,28. a) Esquematice el mecanismo de la reaccin catalizada enzimticamente. b) Calcule el valor de
Km para A y el valor de KA. c) La enzima posee 4 subunidades de 200 kDa cada una, con 1 sitio activo
por subunidad. Calcule el nmero de recambio, sabiendo que Vmax es 500 M/min. Considere que la
velocidad de reaccin se mide por un mtodo continuo en una cubeta de volumen final de 1 ml, y que
se utilizaron 20 l de una preparacin enzimtica pura de concentracin 2 mg/ml. d) Qu otros
experimentos deben realizarse para confirmar el mecanismo de la reaccin enzimtica?
8.

La enzima malato deshidrogenasa (MDH) cataliza la reaccin:


Malato + NAD Oxaloacetato (OAA) +NADH

Para caracterizar el mecanismo de reaccin y el sitio activo de la enzima se llevaron a cabo dos
experimentos. En el 1 experimento se estudi el efecto de los productos de la reaccin sobre la
actividad enzimtica a concentraciones subsaturantes de malato obtenindose los datos que figuran en
la Tabla 1. En el 2 experimento, 150 g de enzima preincubada durante 30 min en presencia de los
productos de la reaccin o en ausencia de los mismos fueron tratadas 2 hs con N-etilmaleimida (agente
modificador de residuos de cistena) obtenindose los datos de la Tabla 2. El control de la enzima sin
tratar con N-etilmaleimida dio un valor de actividad de 100U/ml. En base a los resultados: a) indique

29

el posible mecanismo de reaccin de la enzima, justifique; b) Qu puede concluir acerca de los


aminocidos involucrados en el sitio cataltico?

Tabla 1
NAD (mM)
0,025
0,033
0,050
0,100

Sin agregados
33,3
40,0
50,0
66,7
Tabla 2
Sin agregados
+ NADH
+ OAA

Actividad (U/ml)
+ NADH
20,0
25,0
33,3
50,0

+ OAA
16,7
20,0
25,0
33,3

Actividad (U/ml)
16
91
34

REGULACIN, CINTICAS NO HIPERBLICAS Y ESTUDIO DEL SITIO ACTIVO

1. a) Describa 4 mecanismos diferentes para regular la actividad de las enzimas. b) Esquematice de


manera sencilla la regulacin de la actividad enzimtica por fosforilacin
2. La enzima malato deshidrogenasa dependiente de NADP cataliza la siguiente reaccin en
cloroplastos de clulas vegetales:
malato + NADP OAA + NADPH
La enzima presenta valores de Km para el malato de 15 M durante el da, mientras que a la noche
los valores de Km para el mismo sustrato aumentan 10 veces. Por otra parte, el dosaje de residuos de
Cys con eosinmaleimida mostr que en condiciones de iluminacin la enzima posee 7 residuos de
Cys libres por molcula de enzima, mientras que slo se detectan 5 residuos por el mismo mtodo en
condiciones de oscuridad. Proponga una posible causa del comportamiento descripto.
3. Un investigador purifica una enzima de una bacteria Gram-positiva (I) y de hgado de ratn (II).
Decide realizar la caracterizacin de la misma de ambas fuentes y realiza los siguientes estudios: a)
Determinacin de la masa molecular en columna de exclusin molecular en condiciones nativas:
I=200kDa; II= 200 kDa; b) Determinacin de la masa molecular en SDS-PAGE: I= 50 kDa; II= 50
kDa; c) Medicin de la velocidad de reaccin a concentraciones infinitas del sustrato (S): I=10U/mg;
II= 10U/mg; d) Determinacin de la concentracin de S que da una velocidad de 5U/mg: I= 1 mM;
II= 1 mM. Cuando estudia la cintica de la reaccin obtiene los siguientes resultados mostrados en
30

las tablas. a) Qu puede decir sobre la cintica seguida por cada enzima? b) Sabiendo que la enzima
tiene un solo sitio de unin del sustrato por subunidad, qu puede decir acerca de las interacciones
de los sitios activos en cada caso? c) Qu grfico realizara para avalar su propuesta? d) Encuentra
alguna diferencia sobre la regulacin que cada enzima podra presentar in vivo por la concentracin
de sustrato? Explique.

Enzima II
V (U/mg)
S (mM)
0
0
0,5
0,5
1
5
2
9,5
4
10
10
10

4. Caracterice a las enzimas A (crculos vacos) y B (crculos


llenos) lo mejor posible indicando para cada una de ellas: a)
comportamiento cintico, b) grfico de velocidad versus [S]; c)
ecuacin de velocidad; d) nmero de Hill.

log (Vmax-v)/v

Enzima I
[S] (mM)
V (U/mg)
0,1
0,9
0,5
3,3
1
5
2
6,6
4
8
10
9,1

1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
-0,2
-0,4
-0,8

B
-0,6

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

log [S]

5. En el esquema siguiente se indica una va metablica donde dos de las enzimas estn sujetas a
regulacin alostrica por el intermediario metablico E.
Las letras maysculas simbolizan los sustratos y los nmeros
1
2
3
4
5
las enzimas que catalizan las reacciones. a) Defina efector
ABCDEF
alostrico. b) Indique cuales de las enzimas de esta va podran
ser las reguladas y que efecto tendra E sobre ellas.

6. Con la finalidad de estudiar una enzima homotetramrica, la misma fue incubada con un
modificador de residuos de cistena en ausencia y en presencia de concentraciones saturantes de
los sustratos de la reaccin. Peridicamente, se extrajeron alcuotas para la determinacin de la
actividad enzimtica y composicin de aminocidos. Los resultados se indican en la Tabla.
a) Qu puede concluir acerca de los aminocidos involucrados en el sitio cataltico? b) Indique
cuantos residuos de cistena son modificados por sitio activo.

31

en ausencia de los sustratos


Tiempo
Actividad
(minutos) (U/mg)
0
15
30
45
60
90

30,0
16,8
8,6
4,5
0,5
0,5

en presencia de los sustratos

moles de residuos
Actividad
moles de residuos
Cys no modificados / (U/mg) Cys no modificados /
mol enzima
mol enzima
28,0
30,0
28,0
24,2
29,3
28,0
22,3
28,5
28,0
20,5
27,8
27,9
19,9
27,0
27,8
19,8
27,0
27,8

32

METABOLISMO DE HIDRATOS DE CARBONO


ESTRUCTURA Y CUANTIFICACIN DE HIDRATOS DE CARBONO

1.
Se obtienen soluciones de cada uno de los siguientes azcares en las concentraciones detalladas
en cada caso: glucosa 1,8 mg/ml; maltosa 1,71 mg/ml y trealosa 1,71 mg/ml. Si 0,2 ml de un testigo
1 mM de glucosa dio una absorbancia de 0,180 al hacer la reaccin de Somogyi-Nelson, calcule la
absorbancia que se obtendra al hacer la determinacin con 0,1 ml de las soluciones indicadas antes y
despus de la hidrlisis.
2.
Una muestra que ha dado negativa la reaccin de Fehling se ensaya en una alcuota de 0,1 ml
para la reaccin de Roe, obtenindose un valor de absorbancia de 0,11 descontado el blanco.
Despus de sometida a un tratamiento con HCl concentrado una alcuota idntica a la anterior
present una absorbancia de 0,24 para el mtodo de Somogyi-Nelson. Un testigo de fructosa 1 mM
ensayado en alcuotas de 0,2 ml dio una absorbancia de 0,21 para el mtodo de Somogyi-Nelson y
0,19 para el mtodo de Roe. a) Indique qu tipo de sustancias presenta la muestra. Fundamente su
respuesta. b) Exprese su concentracin en mM.
3.
Ud. dispone de tres tubos (A, B y C) conteniendo sacarosa, fructosa y glucosa (no
necesariamente en este orden). Usando un testigo de fructosa 1 mM, decide hacer determinaciones
por las tcnicas de Somogyi-Nelson y Roe sobre los distintos tubos, obtenindose los valores de
absorbancia que se muestran en el cuadro. Las alcuotas utilizadas en las determinaciones fueron de
0,1 ml para el testigo y 0,3 ml para todas las muestras.
Tcnica
Roe
Somogyi-Nelson
HCl + Somogyi-Nelson

Testigo
0,25
0,37
0,37

A
0,11
0,16
0,16

B
0,33
0
0,96

C
0
0,30
0,30

a)
Indique en qu tubo est cada sustancia. b) Calcule la concentracin de sacarosa en el tubo
correspondiente.
4.
Una muestra de un oligosacrido que ha dado negativa la reaccin de Fehling, se ensaya para
la reaccin de Roe y presenta un valor de absorbancia de 0,60 para una alcuota de160 l. Luego se
lo somete a una hidrlisis cida y una alcuota de 50 l registr una absorbancia de 0,95 para el
mtodo de Somogy-Nelson. Adems, un testigo de fructosa 1,5 mM present las siguientes
caractersticas:
Alcuota
0,2 ml
0,1 ml

Mtodo
Roe
S. N.

Absorbancia
0,30
0,25

a) Indique una probable estructura del compuesto. Fundamente su respuesta. b) Exprese la


concentracin en mM. c) Si las alcuotas usadas para los dosajes por ambos mtodos provienen de
una solucin 7 mg/ml del oligosacrido, calcule la pureza del mismo.
5.
En una muestra desconocida que ha dado positiva la reaccin de Fehling, se ensayan las
reacciones de Somogyi-Nelson y Roe en una alcuota de 0,3 ml dando los siguientes valores de
33

absorbancia (descontado el blanco): Somogyi-Nelson = 0,31 y Roe = 0. Despus de sometida a un


tratamiento con HCl concentrado, la reaccin de Somogyi-Nelson dio una absorbancia de 0,6
ensayada en la misma alcuota. Un testigo de fructosa 1 mM (0,4 ml) dio una absorbancia de 0,42
para el mtodo de Somogyi-Nelson. a) Qu tipo(s) de sustancia(s) contiene la muestra? Fundamente
su respuesta. b) Exprese la concentracin de la muestra en molar.
6.
Por hidrlisis cida de un trisacrido se obtiene D-glucosa y D-galactosa en relacin 2:1. La
metilacin exhaustiva seguida de hidrlisis produce 2,3,4,6-tetra-O-metilgalactosa; 2,3,4,6-tetra-Ometilglucosa y 2,3,4-tri-O-metilglucosa. a) Designe el trisacrido. b) Indique cules son los
productos de la metilacin exhaustiva seguida de hidrlisis de lactosa y sacarosa.
7.
Se metilaron exactamente 81 mg de glucgeno y posteriormente se hidrolizaron en medio
cido. Los productos metilados se separaron e identificaron por cromatografa en capa fina. Se
obtuvieron exactamente 62,5 moles de 2,3-di-O-metilglucosa. a) Qu porcentaje del total de
residuos de glucosa son puntos de ramificacin? b) Cules fueron los dems productos de
metilacin e hidrlisis y cunto se form de cada uno? c) Si el glucgeno descripto tiene un PM de
3.106, cuntos residuos de glucosa contiene una molcula de este glucgeno? d) Cuntos de estos
residuos estn en los puntos de ramificacin? e) Cuntos de estos residuos estn en los extremos no
reductores?
8.
El reactivo de Tollens consiste en una solucin de plata amoniacal que reacciona frente a
grupos aldehdos libres oxidndolos hasta formar los cidos carboxlicos correspondientes. El
tratamiento de 6 g de una muestra de glucgeno con el reactivo de Tollens seguido por metilacin
exhaustiva y posterior hidrlisis produce 3,1 mmoles de 2,3-di-O-metilglucosa y 0,0031 mmoles de
cido 2,3,6-tri-O-metilglucnico adems de otros productos. a) Qu fraccin de los residuos de
glucosa forman parte de los puntos de ramificacin y cul es el nmero promedio de residuos de
glucosa por ramificacin? b) Cules son los otros productos luego del tratamiento y en qu cantidad
se forman? c) Cul es la masa molecular promedio de la molcula de glucgeno?
9.
Con el objetivo de identificar el polisacrido predominante en una muestra de origen vegetal,
se realizaron determinaciones con diferentes tratamientos hidrolticos: I. La hidrlisis completa con
HCl gener nicamente restos de glucosa. II. No se observ hidrlisis con celulasa. III. El
tratamiento con alfa-amilasa produjo la liberacin de unidades de glucosa, maltosa y de un ncleo
grande y ramificado (dextrina). IV. El tratamiento con beta-amilasa produjo slo maltosa y dextrina.
Indique la posible identidad de la muestra, fundamentando su respuesta en base al modo de accin de
las enzimas utilizadas.
10. Por tratamiento con periodato, una muestra de 100 mg de celulosa produjo 1,5 moles de cido
frmico. Cul es la longitud aproximada de la cadena?
11. El almidn contiene generalmente alrededor de un 20% de una fraccin insoluble en agua
llamada amilosa y un 80% de una soluble llamada amilopectina. Se tratan 100 mg de grnulos de
almidn con 50 ml de agua tibia para que difunda la fraccin soluble. a) Dicha fraccin rinde 0,049
mmoles de 2,3-di-O-metilglucosa por metilacin e hidrlisis. Qu porcentaje de los restos de
glucosa se hallan en los puntos de ramificacin? Qu otros productos se han formado y en qu
porcentaje? b) Considerando despreciable los producidos por los extremos reductores, cuntos
moles de cido frmico se formarn luego de tratar con periodato de sodio la fraccin soluble?
12. a) Calcule la concentracin de un compuesto puro, que se encuentra disuelto en 2 ml de un
solucin que se somete a los siguientes ensayos: i) Roe: 0,1 ml de muestra presentaron una
34

absorbancia de 0,2; mientras que un testigo de fructosa 5 mM present una absorbancia de 0,15
cuando se ensay una alcuota de 0,15 ml. ii) Somogyi-Nelson: 0,4 ml de muestra dieron un valor de
absorbancia de 0. iii) Somogyi-Nelson luego de hidrlisis cida completa: 0,05ml de alcuota dieron
una absorbancia de 0,60. Un testigo de fructosa 5 mM present una absorbancia de 0,40 cuando se
ensay una alcuota de 0,2 ml. b) Escriba la frmula estructural del compuesto si los productos de su
metilacin exhaustiva e hidrlisis fueron los que se detallan aqu:
CH2OH

CH2OCH3

OH
OCH3

O
H3CO

OCH3

OCH3
H3CO

H3COH2C

OH

H3CO

OH
OCH3

CH2OCH3

OCH3

13. En cuatro tubos rotulados como A, B, C y D se encuentran 4 carbohidratos puros: sacarosa,


trealosa, lactosa y maltosa (no necesariamente en ese orden). Designe el compuesto presente en cada
tubo y exprese su concentracin en mM a partir de los siguientes datos: i) Despus de la metilacin
exhaustiva seguida de hidrlisis cida se obtuvo glucosa tetrametilada en los tubos B, C y D en
concentracin de 0,5; 1 y 0,5 mM, respectivamente; mientras que se obtuvo glucosa trimetilada en
los tubos A y D presentando en ambos una concentracin de 0,5 mM. ii) Utilizando 200 l para la
prueba de Roe, slo el tubo B present absorbancia siendo sta de 0,194. iii) La prueba de SomogyiNelson slo la dieron positiva los tubos A y D: 200l de los mismos presentaron una absorbancia de
0,206 y 0,207, respectivamente. iv) Para Somogyi-Nelson post-hidrlisis (150 l) se obtuvieron los
siguientes valores de absorbancia: A: 0,308; B: 0,310; C: 0,309 y D: 0,308. v) Un testigo de fructosa
1,5 mM rindi una absorbancia de 0,310 para S-N con 100 l y 0,580 para Roe con 200l.

INTRODUCCIN AL METABOLISMO Y PRINCIPIOS DE BIOENERGTICA


1.
El cambio de energa libre estndard para la hidrlisis de glucosa-6-P a pH 7 y 25C se ha
medido como -3300 caloras/mol. Sabiendo que el cambio de energa libre estndard para la
hidrlisis de glucosa-1-P en las mismas condiciones es de -5000 caloras/mol, calcule el G para la
siguiente reaccin a pH 7 y 25C.
Glucosa-1-P <------> Glucosa-6-P
2.
El G para la hidrlisis de un azcar-P (a pH 7 y 25C) es de -6,2 kcal/mol en una celda
homognea e hipottica en la cual las concentraciones del estado estacionario del azcar-P, el azcar
libre y el Pi son 10-3 M; 0,2 mM y 5.10-2 M, respectivamente. Cul es el G para la reaccin? El
estado estacionario se refiere a una situacin de no equilibrio que prevalece debido a un balance
entre las reacciones que proveen y eliminan estas sustancias.
Azcar-P + H2O <------> Azcar + Pi
3.
Cules de las reacciones dadas abajo sern candidatas probables para acoplarse a la
formacin de ATP a partir de ADP y Pi? (considere que las condiciones de reaccin son pH 7 y
25C). El G de hidrlisis del ATP a ADP y Pi es -7300 cal/mol.
G (cal/mol)
Keq
a)
Fosfoenolpiruvato + H2O Piruvato + Pi
2,5.1010
b)
3-fosfoglicerato 2-fosfoglicerato
1,8.10-1
35

c)
d)

Fructosa-6-P + H2O Fructosa + Pi


Succinil-CoA + H2O Succinato + HSCoA

4.

La hexoquinasa cataliza la reaccin:


ATP + Glucosa <----> Glucosa-6-P + ADP

-3200
-11000
Keq = 2,21.103

Calcular la concentracin mnima de glucosa-6-P necesaria para forzar a la reaccin de la


hexoquinasa a transcurrir en sentido contrario (en el sentido de la formacin de la glucosa y ATP) en
presencia de glucosa 10-5 M, ATP 10-3 M y ADP 10-4 M.
5. La combustin completa de la glucosa a CO2 + H2O tiene lugar con un G total de -686
kcal/mol. Cuando este proceso sucede en una clula tpica, se producen 30-32 moles de ATP en
forma concomitante a partir de ADP + Pi.
a) Suponiendo que el G de hidrlisis del ATP a ADP + Pi es de -10 kcal/mol y que el G es
aproximadamente igual al G para la oxidacin de la glucosa bajo condiciones intracelulares, qu
fraccin de la energa potencial de la glucosa se conserva en forma de ATP?
b) Qu le ocurre a la energa que no se conserva en forma de ATP?

GLUCLISIS. FERMENTACIN

1.
a) Escriba las ecuaciones balanceadas del catabolismo de la glucosa en dos molculas de
gliceraldehdo-3-P, indicando las reacciones que son irreversibles bajo condiciones intracelulares
tpicas. Luego escriba la ecuacin final de la primera fase de la gluclisis. b) El gliceraldehdo-3-P es
convertido a piruvato durante la segunda fase de la gluclisis. Escriba las ecuaciones balanceadas de
este proceso y la ecuacin neta.
Se incuba glucosa marcada en el 14C1 con las enzimas glucolticas y los cofactores y sustratos
necesarios. Cul es la distribucin de 14C en el piruvato? Realice el mismo seguimiento con
glucosa marcada en C2, C3, C4, C5 y C6.

2.

3.
La hexoquinasa muscular y la glucoquinasa heptica son isoenzimas ya que ambas catalizan la
fosforilacin de la glucosa en el primer paso de la gluclisis. La enzima de msculo tiene una Km de
0,1 mM y la de hgado una Km de 10 mM. Teniendo en cuenta que la concentracin de glucosa
normal en sangre es cercana a 5 mM, cul es la importancia fisiolgica de esta diferencia?
4.
La gliceraldehdo-3-P deshidrogenasa puede reemplazar al fosfato por arseniato como sustrato.
El producto resultante es el 1-arseno-3-fosfoglicerato, un compuesto inestable que se hidroliza a
arseniato y 3-fosfoglicerato. Escriba una ecuacin balanceada para la gluclisis en presencia de
arseniato reemplazando al fosfato. Analice el rendimiento de ATP del proceso en estas condiciones.
5.
Se incubaron en condiciones estrictamente anaerbicas 0,5 ml de extracto de levaduras
(conteniendo 4,8 mg/ml de protena) en 50 mM MES pH 5,5, NaPi en exceso y con glucosa como
nica fuente de carbono en un volumen final de 2 ml. A los 20 minutos se tomaron dos alcuotas
determinndose 30 moles de etanol en 0,1 ml y 80 moles de glucosa en 0,2 ml. a) Calcule la
concentracin de glucosa inicial en mM, considerando que la nica va de la degradacin de la
glucosa es la fermentativa. b) Determine los moles de 14CO2 producidos a los 30 minutos si la
36

glucosa estaba marcada con 14C1.y, alternativamente, en C3. c) Explique cmo se afectara la
velocidad de consumo de glucosa si las levaduras son incubadas en condiciones aerbicas.
6.
La fructosa se encuentra en el semen de humanos y bovinos en concentraciones superiores a 12
mM. Los espermatozoides usan la fructosa anaerbicamente para producir el ATP necesario para el
movimiento flagelar. La ruta catablica ms importante de fructosa a lactato en estas clulas
cortocircuita la reaccin de la fosfofructoquinasa de la gluclisis mediante el uso de una enzima que
rompe la fructosa-1-P en dos compuestos de tres tomos de carbono. Escriba las ecuaciones para la
secuencia de transformaciones qumicas involucradas. Escriba la ecuacin neta para el catabolismo
anaerbico de la fructosa a lactato en los espermatozoides.
7.
En dos tubos diferentes se incubaron extractos celulares de msculo de conejo (tubo A) y de
levaduras (tubo B) con fosfato y glucosa marcada isotpicamente (14C) en forma uniforme en un
medio anaerbico (con NaN3) a pH 5 y 30C. Las medidas de radiactividad, en alcuotas iguales de
medio, a tiempo cero (antes de agregar las clulas) y luego de 1 hr de incubacin se muestran en la
siguiente tabla:

Tiempo (min)
0
60

% de RADIOACTIVIDAD
Tubo A
100
98

Tubo B
100
65

a)
Qu explicacin encuentra para estos resultados?
b)
Construya una tabla con los valores tericos de % de radioactividad que esperara encontrar si
el experimento se realizara en idnticas condiciones pero con (14C1) glucosa.
c)
Igual que en b) pero con (14C3) glucosa.
8.
Se prepararon varios tubos de ensayo que contenan 1 ml de levaduras (2.107 clulas/ml), 1 ml
de una solucin reguladora y 3 ml de una solucin de glucosa 5 mM. A tiempo 0 se les hicieron los
agregados (volmenes despreciables) que se detallan en la columna A de la tabla y se tom una
alcuota de cada mezcla (volumen despreciable), la cual se hizo reaccionar por el mtodo de la
glucosa oxidasa obtenindose los valores que se indican en la columna B. Luego de 30 minutos se
repiti la operacin (los datos obtenidos figuran en la columna C). Todos los valores de absorbancia
han sido obtenidos en idnticas condiciones de ensayo.
a)
Una con flechas los datos de la columna C a los de las columnas A y B segn lo esperado para
el consumo de azcar en cada condicin. Determine la velocidad de consumo de glucosa en
mol/min.106 clulas para cada caso. Compare los resultados obtenidos.
b)
Teniendo en cuenta que el consumo de glucosa es lineal en funcin del tiempo, cundo ser
consumida totalmente la glucosa en los casos anteriores?
A
AGUA
Pi 50 Mm
Pi + NaN3
Pi + NaF

B
0,80
0,79
0,82
0,80

C
0,20
0,78
0,78
0,47

9.
Se desea estudiar el efecto de tres compuestos (A, B y C) sobre la va glucoltica. Para ello, se
utiliza una suspensin de levaduras aplicando el protocolo que se muestra en la tabla (todos los
37

volmenes estn expresados en ml). Despus de incubar 30 minutos a 30C, se midi la absorbancia
obtenida por el mtodo de la glucosa oxidasa en alcuotas de 0,4 ml (volumen final de lectura de 3
ml).
Tubo
1
2
3
4

Glucosa
50 mM
1
1
1
1

Buffer

Cl. (x106)

0,2
-

0,7
-

1
1

1,5
0,3
0,8
0,5

1,5
1,5
1,5
1,5

AAbco.
0,50
0,50
0,18
0,32

Se realiz una curva de calibracin a partir de una solucin de glucosa 50 mM utilizndose el mismo
mtodo de dosaje (volumen final de lectura de 3 ml).
Tubo
Glucosa (50 mM)
A - Abco.

1
0,2 ml
0,99

2
0,15 ml
0,74

3
0,10 ml
0,50

4
0,05 ml
0,26

a) Calcule la velocidad de consumo de glucosa en cada tubo expresada en mol por minuto. b)
Proponga que compuestos podran ser A, B y C. c) Determine el sitio y modo de accin de estos
compuestos.
10. Un investigador desea estudiar el metabolismo de hidratos de carbono en Brassica nigra, una
variedad de mostaza. Para ello prepara suspensiones celulares partiendo de hojas, separa la
preparacin en dos fracciones de 250 ml y las coloca en agitacin. Una de las muestras es la control,
con un medio de cultivo adecuado para que las clulas realicen sus funciones normales; y la otra es
sometida a un tratamiento de privacin de fosfato (Pi). Cuando luego de unos das realiza
mediciones de actividades enzimticas en la muestra tratada encuentra que se han inducido las
enzimas indicadas en la tabla:
Enzima
PFP
G3PdH no fosforilante
PEP fosfatasa

Reaccin que cataliza


Fru-6-P + PPi Fru-1,6-bP + Pi
Oxidacin de Gliceraldehdo-3-P sin incorporacin
de Pi utilizando NADP+ como aceptor de
electrones
Hidrlisis del enlace fosfato del PEP

En base a estas observaciones: a) Escriba la ecuacin neta balanceada de la gluclisis desde glucosa6-P hasta piruvato en ambas muestras. Qu diferencia encuentra? Qu ventajas confiere a estas
plantas la induccin de las mencionadas actividades enzimticas teniendo en cuenta el estrs al que
estn sometidas? b) Partiendo de una [glucosa inicial] en el medio de 20 mM, se determina la
concentracin de glucosa a los 25 por el mtodo de la Glucosa Oxidasa utilizando una dilucin 1/50
de las muestras. Se obtiene una A= 0,259 para el control y una A= 0,478 para la muestra tratada. Un
testigo 0,5 mM dio una lectura de 0,724. Considere en todos los casos una A blanco= 0,005. Cul fue
el consumo de glucosa en cada caso si el contenido de protenas es de 1,1 y 0,88 mg/ml en la muestra
control y en la muestra tratada, respectivamente? Exprese el resultado en moles/min.mg de
protena.

38

CICLO DE KREBS

1.
El ciclo del cido ctrico utiliza 8 enzimas para catabolizar el acetil-CoA. a) Escriba la
ecuacin balanceada para la reaccin catalizada por cada enzima. b) Qu cofactores se requieren en
cada reaccin enzimtica? c) Para cada enzima indique el tipo de reaccin que cataliza: condensacin
(formacin de un enlace C-C), deshidratacin, hidratacin, descarboxilacin, xido-reduccin,
fosforilacin a nivel de sustrato, isomerizacin. d) Escriba la ecuacin neta balanceada para el
catabolismo del acetil-CoA a CO2.
2.
Un cultivo bacteriano respirando activamente es incubado con glucosa 14C1 y, posteriormente,
se aslan los intermediarios de la gluclisis y del ciclo del cido ctrico. Dnde estar el 14C en cada
una de las siguientes sustancias? Considerar slo la incorporacin inicial de 14C en tales compuestos:
a) Fructosa-1,6-bisP; b) Gliceraldehdo-3-P; c) Fosfoenolpiruvato; d) Acetil-CoA; e) Citrato; f) Cetoglutarato; y g) Oxaloacetato. Cuntas vueltas del ciclo son necesarias para que todo el 14C se
desprenda como CO2?
3.
Se incuba piruvato marcado en el 14C2 con una suspensin de mitocondrias. Determine: a) el
nmero de carbono en que aparecer inicialmente marcado el fumarato. b) cuntas molculas de CO2
se generan en la secuencia de reacciones desde piruvato a fumarato. c) en esa misma secuencia,
cuntas molculas de alta energa (ATP y GTP) se generan, considerando la oxidacin de NADH y
FADH2 en la cadena de transporte de electrones. d) Explique qu efecto tendra sobre el
funcionamiento del ciclo de Krebs si se somete a condiciones anaerbicas esta suspensin
mitocondrial. e) De un ejemplo de una reaccin (indicar nombre, sustratos y productos) que sirva
para re-abastecer el ciclo de Krebs de intermediarios que se utilizan para reacciones biosintticas.
4.
La respiracin celular puede ser estudiada usando preparaciones de mitocondrias aisladas y
midiendo su consumo de O2 bajo diferentes condiciones. Si se agrega 10mM de malonato de sodio a
mitocondrias que se encuentran respirando activamente usando piruvato como fuente combustible, la
respiracin se detiene rpidamente. Explique por qu sucede esto, indicando el efecto del malonato
sobre la gluclisis, el ciclo de Krebs y el consumo de O2.
5.
El transporte de malato y -cetoglutarato a travs de la membrana mitocondrial interna es
bidireccional e inhibido por n-butilmalonato. a) De acuerdo a sus conocimientos sobre metabolismo,
explique en qu proceso(s) est involucrado este sistema de transporte; b) Considerando que la
lanzadera Malato/Asp es la nica presente en hgado, determine el rendimiento de ATP en una
suspensin aerbica de clulas hepticas que oxidan completamente la fructosa en los siguientes
casos: CASO 1: 1mol de fructosa; CASO 2: 1mol de fructosa + n- Butilmalonato; c) Prediga el
efecto del n-butilmalonato sobre la gluclisis.

39

GLUCONEOGNESIS. CICLO DEL GLIOXILATO

1.
Es posible obtener sntesis neta de oxaloacetato agregando acetil-CoA en un homogenado
mitocondrial que contiene las enzimas y cofactores del ciclo del cido ctrico? Fundamente su
respuesta mediante ecuaciones balanceadas.
2.
Un procedimiento usado para determinar la efectividad de compuestos no glucosdicos como
precursores de glucosa es ayunar al animal hasta que sus reservas de glucgeno heptico se agoten y
luego administrar el sustrato a estudiar. Un sustrato que conduce a un incremento neto en el
glucgeno heptico es denominado glucognico, ste debe primeramente ser convertido en glucosa6-P. a) Demostrar por medio de reacciones enzimticas conocidas cul o cules de los siguientes
sustratos son glucognicos.
a) Piruvato b) Lactato c) Glicerol d) Succinato e) Aspartato
b) Si la relacin NADH/NAD+ en el citosol fuera muy alta (como por ejemplo luego de la ingesta de
alcohol), a partir de cul de estos compuestos (a-d) se bloqueara la gluconeognesis?
3.
Si en un extracto de hgado de rata que lleva a cabo gluconeognesis a partir de piruvato se
adiciona HCO3- marcado (14C), cul o cules carbonos de la glucosa resultarn marcados? Si en el
experimento anterior se suprime el HCO3- marcado y se adiciona piruvato marcado uniformemente
con 14C, cul o cules tomos de la glucosa resultarn marcados?
4.
La avidina es un potente inhibidor de las reacciones que requieren biotina.Qu reacciones
involucradas en la gluconeognesis sern inhibidas en un extracto de hgado de rata al adicionar
avidina?
5.
Un homogenado de hgado fue incubado en un medio que contena lactato 10 mM como nica
fuente de carbono y ATP 500 mM (volumen final de 3 ml). Al cabo de 30 minutos la concentracin
de lactato fue 0,13 mM. a) Calcule la velocidad de consumo de lactato expresndola en moles/min.
En base a este dato y suponiendo que todo el lactato se convierte en glucosa, qu velocidad de
produccin de glucosa esperara encontrar? b) Luego de 25 minutos de incubacin mediante el
mtodo de glucosa oxidasa se obtuvo un valor de absorbancia 0,150 utilizando una alcuota de 0,2 ml
de la muestra, mientras que una alcuota de 0,1 ml de un testigo de glucosa 2 mM dio una
absorbancia de 0,100. Calcule la velocidad de produccin de glucosa expresndola en moles/min. c)
En base a los datos obtenidos en los tems a) y b), qu destinos metablicos tuvo el resto del lactato
consumido?
6.
Ciertas cepas mutantes de levaduras pueden crecer en un medio mnimo utilizando como nica
fuente de carbono el etanol. Esto lo logran invirtiendo la direccin de la reaccin de la ltima enzima
de la fermentacin alcohlica (E1). El producto de esta reaccin es oxidado por una deshidrogenasa
(E2) a un cido carboxlico de dos carbonos que finalmente se condensa con la coenzima-A por E3.
a) Esquematice la ruta de reacciones desde etanol hasta el producto condensado con CoA,
nombrando las enzimas (E1, E2 y E3) y sus productos. b) El producto de E3 es utilizado por la
levadura para generar intermediarios de cuatro carbonos para la biosntesis de aminocidos y
glucosa. Qu ruta anaplertica le permite a la levadura crecer en etanol?. Esquematice la ruta hasta
la generacin de succinato e indique la ecuacin global balanceada. c) Si la levadura crece con etanol
marcado con 14C en el C2. Dnde aparecer la marca en el succinato?
40

7.
Bacterias como Escherichia coli pueden vivir en medios conteniendo acetato como nica
fuente de carbono y energa. Parte del acetil-CoA generado (reaccin de la enzima acetil-CoA
sintetasa) es utilizado para generar ATP y NADH y parte para sintetizar glucosa. a) Cul es la
cantidad mnima de acetato que necesitan estas bacterias para sintetizar 1 mmol de glucosa,
considerando que la energa y el poder reductor requeridos provienen de la oxidacin completa del
acetato a CO2?. Justifique. b) Cul es la importancia del ciclo del glioxilato en semillas en
germinacin?
8.
En un experimento, se incuba durante 1 hora un extracto heptico con un pulso de los
siguientes compuestos marcados: I) oxaloacetato marcado con 14C en C4 y II) acetil-CoA marcado
con 14C en el grupo metilo.
a) Indique si en algn tubo obtendr glucosa marcada. En caso afirmativo, indique las enzimas
involucradas en la sntesis de glucosa marcada. En caso negativo, justifique mediante ecuaciones la
prdida de la marca radiactiva.
b) En qu caso obtendr la sntesis de glucosa de manera neta? Justifique.
c) Indique si la sntesis neta de glucosa del caso b es inhibida por: i) avidina; ii) un inhibidor de la
malato deshidrogenasa; iii) Fructosa2,6-biP; iv) inhibidor del transporte de glucosa6P del retculo
endoplasmtico. Justifique en cada caso.
d) Podra aislar glucosa marcada radiactivamente si el extracto fuera de E. coli?

VA DE LAS PENTOSAS FOSFATO


1.
Se realiza el siguiente experimento con istopos para determinar qu fraccin del catabolismo
de la glucosa procede va gluclisis vs va de las pentosas:
Clulas hepticas se dividen en dos fracciones; una de ellas se incuba con glucosa 14C1, y la otra con
glucosa 14C3. Se comparan las velocidades iniciales por las cuales la marca aparece como CO2. a)
Explique las bases qumicas del diseo experimental. b) Con qu extracto se obtendr mayor
cantidad de 14CO2, al incubarlo con glucosa 14C1?

Extracto de miocitos de msculo esqueltico que se encontraba realizando una contraccin


vigorosa.

Extracto de hepatocitos que se encontraban sintetizando cidos grasos.


2.
Cul es la estequiometra de la sntesis de NADPH desde glucosa-6-P, sin la formacin neta
de pentosa?
3.
Se incuba 2.9 ml de una solucin de glucosa 5 mM con 100 l de un extracto de tejido adiposo
(5.106 clulas/ml) cuyas clulas requieren grandes cantidades de NADPH para poder realizar
biosntesis reductoras. Es por eso que el 80% de la glucosa es metabolizada completamente a CO2
por la ruta de las pentosas fosfato en 1392 segundos. a) Calcule la velocidad de consumo de glucosa
y velocidad de produccin de NADPH y CO2 por dicha va (mol/min.106 clulas). b) Se observ
que se producen 23,2 moles de CO2 marcado en cuntos carbonos estaba marcada la glucosa?
4.
Cul es la estequiometra de la sntesis de ribosa-5-P desde glucosa-6-P, sin la generacin de
NADPH?
5.
Se agregan 75 nmoles de ribosa-5Pi marcada con 14C1 a una solucin que contiene las
siguientes enzimas: transcetolasa, transaldolasa, fosfopentosa epimerasa y fosfopentosa isomerasa.
41

a) Cul es la distribucin de la marca radiactiva en el gliceraldehdo-3-Pi y en la fructosa-6-Pi que


se forman en el medio de reaccin? b) Escriba una ecuacin de la reaccin global, suponiendo que a
los 30 minutos las reacciones son completas. c) Si la cantidad de fructosa-6-Pi producido en el tem a
se incubara en una cubeta de 1 ml con NADP+ 0,04mM y las enzimas hexosaisomerasa y glucosa-6Pi deshidrogenasa por un tiempo suficiente para completar las reacciones, cul sera la variacin de
la absorbancia que se registrara en la cubeta? 340 NADPH = 6,2mM -1 .cm-1.
6.
Se incub glucosa-14C6 con una suspensin de eritrocitos en presencia de un potente inhibidor
de la fosfoglucoisomerasa. Al cabo de un tiempo se detect la presencia de piruvato marcado con
14
C. Mediante qu va metablica se lleg a la produccin del piruvato marcado? Detalle la va e
indique qu % de la poblacin de piruvato espera encontrar marcado y en qu carbono.
7.
Leuconostoc mesenteroides es una bacteria que carece de la enzima aldolasa, por lo cual la va
de las pentosas fosfato es fundamental. Adems, posee ciertas enzimas extra que le permite generar
etanol y lactato. Una de estas enzimas es la fosfocetolasa que cataliza la siguiente reaccin: Ribulosa
5P + Pi Acetil-P + Gliceraldehdo 3P. El Acetil-P por una serie de enzimas da lugar a la
produccin de etanol, mientras que el Gliceraldehdo 3P formar lactato por la va glucoltica. Se
realiza un extracto de estas bacterias y 40 l del mismo se utilizan para determinar la concentracin
de protenas por el mtodo de Lowry (volumen final 5 ml), obtenindose una absorbancia de 0,6. Un
testigo de albmina (20 l) de una concentracin 2 mg/ml dio una absorbancia de 0,6 por el mismo
mtodo. 0,5 ml del extracto de bacterias se incuba, en condiciones anaerbicas, con 10 l de una
solucin de glucosa 1 M en un volumen final de 3 ml. Al cabo de 20 min se extrae una alcuota de
300 l y se determina una absorbancia de 0,40 por el mtodo de la glucosa oxidasa. Una alcuota de
0,5 ml de un testigo de glucosa 1 mM dio, por el mismo mtodo, una absorbancia de 0,50. Calcule la
velocidad de consumo de glucosa y las velocidades de produccin de CO2, lactato y etanol. Exprese
los resultados en mol/min.mg de protena.

METABOLISMO DEL GLUCGENO. DISTURBIOS METABLICOS

1.
Indique cuntos enlaces fosfato de alto contenido energtico se consumen durante la sntesis de
glucgeno a partir de: a) 1 mol de glucosa-1-fosfato, b) 1 mol de fructosa 1,6 bisfosfato, c) 1 mol de
glucosa, d) 1 mol de oxaloacetato.
2.
a) Cul es el destino de un residuo de glucosa almacenado como glucgeno en el msculo
durante ejercicio vigoroso? Especifique el rol del hgado en este proceso. b) Describa un ejemplo de
regulacin covalente y uno de regulacin alostrica de enzimas implicadas en el metabolismo del
glucgeno, especificando la relevancia fisiolgica de dichas regulaciones.
3.
Considerando una molcula de glucgeno de masa molecular 105 (PM residuo glucosa: 162) y
en la cual el 10% de los residuos son puntos de ramificacin, indique: a) la cantidad de ATP total
que se formara al degradarla hasta piruvato; b) cunto ATP sera necesario para sintetizar dicha
molcula de glucgeno a partir de piruvato? c) Analice el balance neto de ATP entre las dos vas.
4.
Un homogenado de hgado (Vf = 3mL) es incubado con glicerol marcado en el carbono 2.
Luego de 20 minutos se determin la formacin de 0,8 moles de glucgeno en una alcuota de 1ml.
a) Cuntos enlaces de alta energa fueron necesarios para la sntesis de dicha cantidad de glucgeno
(masa molecular promedio de glucgeno: 105)? b) En qu carbonos se encuentran marcados los
42

residuos de glucosa presentes en el glucgeno. c) Esquematice la va indicando los residuos


marcados, nombre las enzimas y sus cofactores.
5.
Existe una enfermedad gentica fatal en la cual la actividad fosforilasa del hgado es deficiente,
pero la actividad de la glucgeno sintasa es normal. Qu sntomas manifestara un paciente con esta
enfermedad?
1) Baja glucosa en sangre.
2) Alta glucosa en sangre.
3) Bajos niveles de glucgeno heptico.
4) Altos niveles de glucgeno heptico.
6.
Una muestra de tejido heptico fue obtenida post-mortem del cuerpo de un paciente,
probablemente con deficiencias genticas en una de las enzimas del metabolismo de carbohidratos.
El homogenado de la muestra de hgado tiene las siguientes caractersticas:
i. Degrada glucgeno a glucosa-6-P.
ii. Fue incapaz de sintetizar glucgeno a partir de cualquier azcar o utilizar galactosa como fuente
de energa.
iii. Sintetiz glucosa-6-P a partir de lactato.
Indique a cul de las siguientes enzimas podra atribuirse la deficiencia de este tejido:
a. Glucgeno fosforilasa.
b. Fructosa bisfosfatasa.
c. UDP-glucosa pirofosforilasa.
Explique el motivo de su eleccin.
7.
En un experimento, se suministra a un voluntario en reposo una pequea cantidad de lactosa
uniformemente marcada con 14C. Un estudio efectuado 24 horas despus demuestra que la marca
radiactiva se encuentra distribuida en 2 fracciones bien definidas: 40 % en gran parte de la masa
corporal, mientras que el 60 % restante se ubica en el hgado. Una muestra de sangre obtenida en ese
momento no presenta radiactividad. Luego de transcurridas 72 horas se somete al individuo a
actividad fsica intensa pero de corta duracin. Una muestra de sangre obtenida en este momento
presenta radiactividad. a) Explique la distribucin inicial de la radiactividad. b) Indique qu
compuesto(s) podra(n) ser responsables de la radiactividad en la sangre.
8.
Un nio de dos aos, de muy bajo desarrollo para su edad, es internado con convulsiones en el
servicio de terapia intensiva peditrica de un hospital. El nivel de glucosa en su sangre al ingreso es
de 24 mg/dl (valor normal: 70-110 mg/dl). El mdico comprueba, adems, que el nio presenta un
hgado aumentado de tamao. El paciente es tratado con una dieta hipertnica para aumentar su
glucosa sangunea, pero el valor de la misma se mantiene siempre muy por debajo del valor normal
(hipoglicemia). Ante la sospecha de una deficiencia enzimtica, se decide inyectar al nio por va
endovenosa glucosa marcada uniformemente con 14C. Al cabo de unas horas se practica biopsia
heptica y muscular, encontrndose en ambos tejidos glucgeno marcado radiactivamente y de
estructura normal. En hgado se encuentra, adems, la acumulacin de un azcar-P marcado
radiactivamente. Indique a qu deficiencia enzimtica podra correlacionar este caso: a) glucgeno
fosforilasa; b) -1,6 glucosidasa; c) glucosa-6-fosfatasa; d) UDP-glucosa pirofosforilasa. Explique el
por qu de su eleccin y por qu descarta las otras tres posibilidades. Indique la reaccin catalizada
por la enzima elegida y su localizacin subcelular.

43