INVESTIGATION TOXICOLOGIQUE

A) GENERALITES
1-But :
valuer le danger dun xnobiotique
En fonction de lutilisation : mdicament, pesticide, additifs
Importance et type dtudes

2- Moyens
a) modles
Pertinents extrapolation rsultats au rgne

animaux (in vivo) :

Espce : rongeurs, lapins, chien Beagle, primates
Doit tre prdictive : mtabolisation !
Souche bien tablie, nombre suffisant, et
Charte
Souffrance : euthanasie

modles in vitro :
C* procaryotes, eucaryotes, modles sub-cellulaires
Mthodes alternatives lutilisation danimaux de labo
Rgle des 3 R :
Raffiner
Rduire
Remplacer
Raffiner ltude en cours pour que lanimal souffre
Rduire le nombre danimaux, trouver test qui utilise le danimaux
Remplacer les animaux de laboratoires

b- Exposition
doses : min 3 doses effet /dose
+ Tmoin (excipient)
voie dexposition :
Voie dusage (si mdicament)
Systmique (usage dont on est sur que le mdicament passe dans circulation sanguine
Per os (si produit chimique, gaz voie respiratoire)
Effet toxique les + rapides et les + importants
IV> voie respiratoire> IP >IM >Per os >voie cutane

Priodicit : traitement 7J/7 par administrations rptes

Dure : 3 niveaux
-toxicit aigu :<24H
Administration unique : per os, parentrale
-subaigu : exposition rpte (ritre) jusqu 1 mois
- chronique : longue priode de1 mois toute la vie
N.B. : les effets sont trs souvent diffrence entre expositions rptes et aigus

c- Principales observations :
Dlai de rponse :
effet immdiat : rapidement aprs lexposition
Ex : CN-, inhalation dHCN (270 ppm) mort en quelques minutes
Ricine : quelque mg/kg mort en 2 3 jours
effet retard : aprs un certain laps de temps
Ex : les effets cancrignes : souvent aprs 20 30 ans

Type de dommage/nature :
On cherche la symptomatologie, localisation (organe cible), troubles fonctionnels,
paramtre biologiques modifis et atteintes histologique (tude anatomo-pathologique)

Rversibilit
Rversibilit : effets disparaissant aprs arrt
Irrversibilit : effets persistants /progressant aprs arrt
Ex : effet cancrogne

B) LES ETUDES TOXICOLOGIQUES : NON

CLINIQUES
Tous ce qui nest pas lhomme
1- Etudes de toxicit gnrale
Atteinte gnrale sur lorganisme
par administration unique
par administration ritre
2-Etudes spcifiques
-sur fonction de reproduction
-cancrogense
-mutagense
-tolrance locale

1- Etude de toxicit aigu par administration unique

a- Principe
Etude qualitative et quantitative des phnomnes toxiques qui se manifestent pendant une
priode donne rsultant dune administration unique dun xnobiotique

b- Buts :
Prvoir la symptomatologie aprs exposition massive chez lhomme
CAT (conduite tenir en cas dintoxication)
Doses mortelles : DL 100, DL 50, DL0
NB : concentration ltale CL /voie respiratoire
Classification et tiquetage
niveau de doses des essais ultrieurs

c- Protocole
Actuellement seulement technique in vivo
1/ Animal : au 2 espces (mammifre : rongeurs (rats, souris))
2/ Dose : nombre suffisant : min 3 doses gamme de mortalit (DL 0, DL50, DL 100)
3/ Voie dadmin pour mdt : usage prvue
exposition systmique voie intra pritonale IP
Per os si produit chimique
4/ Dure : 1 administration puis observation animal pendant 14 jours
4 h pour produit gazeux
5/ Etude :
observation priodique de lanimal
Consommation alimentaire, hydrique; poids, comportement
Signes cliniques (symptomatologie)
Condition de la mort (date)
Euthanasie des animaux qui souffrent
Perte de poids =1er indice de toxicit
Autopsie
Examen macroscopique des organes, poids des organes
si + tude anatomo-pathologique (recherche plus prcise au niveau du tissu)

d- Rsultats
Statistiques : effet pour chaque espce, sexe, dose, voie
Dtermination DL50
Dtermination de la DL50 :
Trevan 1927
Courbe sigmode
Relation dose /effet

% mortalit
50%

Min 200 animaux

DL50

dose mg/kg

Evolution : loi normale

Frequence cumule
%mortalit

Probit

50min 50
animaux

Mort% :
Probit :

-3
0.5
2

m
+3
DL50 99.5
5
8

DL50

dose

DL50 : spcifique d1 espce animale et de la voie dadministration

Classification des produits chimiques en fonction dun critre objectif : Mort
Avant : DL50 EC (cart type)
6 classes :
DL50 per os
-extrmement toxique >1 mg/kg relativement sans danger >15g/kg
Mais inconvnient de la DL50
Importance de la pente

A
B
C

A, B et C ont la mme DL50 mais 3 pentes tes

A est le + dangereux car en augmentant lgrement la dose, on de manire importante
leffet
Surtout grande variabilit:
espce, souche, ge, poids, sexe, aliments, hbergement
+ mauvaise reproductibilit inter laboratoires:
80 labo / conditions standardises:
ex: phencyclidine
74 620 mg/kg
labo 1 labo 2
Actuellement : 3 classes
DL 50 per os
Trs toxique <25 mg/kg

tiquetage
T+

Toxique
Nocif

25 200 mg/kg
200 2000 mg/kg

T
Xn

Niveau de prcision demand :

DL50 approximative
On sattache + aux symptmes qu la mort
Nombre danimaux
3 doses au lieu de 5

e- Autres mthodes (produits chimiques)

Essais limite : transport 2 g/kg ,1 espce ,1 sexe
Si rien : arrt pas de classification
Si mort : tude complte
Intrt thique
Mthode de la dose fixe : 2 tapes
tude prliminaire : choix de la dose discriminante
4 doses pr fixes :
Dose qui nentrane pas la mort mais toxicit manifeste on cherche
symptmes et non mort
5 animaux max.
tude principale : transport la dose choisie
5 observs 14 jours
NB : classification particulire : en fonction de la dose et des effets observs
Classification : 80 % identique au protocole classique

2- Etudes par administrations ritres

mime lexposition dans le tps
toxicit sub-aigu (<1 mois) et chronique (> 3 mois)

a- Principe et buts :
1/ Mise en vidence des altrations fonctionnelles et/ou anatomo-pathologique conscutives
ladministration ritre du xnobiotique organes cibles
2/Dterminer la limite dinnocuit exprimentale
NOAEL =No observe adverse effect level
Ou DES dose sans effet
= valeur toxicologique de rfrence

effet toxique

50

250 500
NOAEL

dose (mg/kg)

b- Protocole :
Animal : mdicament au moins 2 espces (dont 1 nest pas un rongeur :chien
Beagle***ou primate)
rongeur : 10 20 animaux /sexe /dose
+ 5 A/sexe/dose pour rversibilit
non rongeur : 4 6 A/sexe/dose +2
Dure : mdicament en fonction des essais cliniques :
Dure des tudes cliniques (H)

Dure min des tudes de toxicit par

administration ritre (animal)

1J
Jusqu 2 semaines
Jusqu 1 mois
Jusqu 3 mois
> 3 mois

2 semaines
1 mois
3 mois
6 mois
6 mois rongeurs ,9 mois non rongeurs

Scurit : dure + longue chez lanimal ( USA, Japon)

Dose :
3 + 1 lot tmoin (excipient) en ml/kg
Dose forte : dose max. tolre
Dose faible : effet pharmacologique ou concentration plasmatique
Dose intermdiaire :moyenne
Voie dadministration :mdicament sage prvu (per os)
Frquence :7J/7
Etude :examens To puis priodiquement (tous les J, semaine ,15J)
surveillance de lanimal :
consommation alimentaire ,hydrique ,comportementale
Examens cliniques :poids, temprature, symptmes
Examens biologiques :bilan sanguin, biochimique, urinaire..)
Examens para cliniques :ECG ,bilan radiologique, ophtalmo
(pas obligatoire, sur choix du clinicien)
Fin :Euthanasie (sauf rversibilit :Euthanasie + tardive (~4 semaine ou 8 si
traitement de 9 mois)
-Autopsie :

+ de 40 organes et tissus examins :poids ,examen

macroscopique
inclusion dans blocs de paraffine puis examen anatomopathologique lsion /tissu/animal
Etude statistiques : lot/tmoin
effets induits par le traitement ;
organes cible ,effet/dose, sexe, dure, rversibilit
NOAEL ventuelle

C) ETUDES SPECIFIQUES :
I- Etude des fonctions de reproduction
Pendant longtemps ,placenta = barrire
Mais :
Agents physiques :Nagasaki ,Hiroshima
25% des enfants ns vivants de mres irradies anomalies du SNC
Cas du virus de la rubole
Epidmie en Autriche en 1941
+ de 20000 enfants ont eu malformations (cur, yeux et oreilles)
+ retard mental

Cas de la Thalidomine :
PA mis sur le march en 1956, utilis comme sdatif et entre nauses pendant
grossesses
En 1960 : malformation exceptionnelles :
Phocomlie (raccourcissement des membres)
Amlie (absence de membres)
~10000 enfants ns mal forms
Fin 1961 : arrt de la commercialisation

Cas du dithylstilbestrol :
400 cas de cancer chez les filles de mres traites (1946- 1970)
Ncessit absolue dun haut niveau de scurit

Buts :
-Information en particulier sur :
-tat des gamtes
-aptitude laccouplement
-fcondation*
-nidation, implantation
-embryogense
-croissance in utero
-parturition (accouchement chez lanimal)

160000 filles

-lactation, sevrage
-effets tardifs sur la progniture

Protocole :
Animal :
Espces identiques ltude par administration ritre, manipulation aises, nombreuses
portes et temps de gestation courts
Le + souvent :
-rongeurs : rat gestation 21 22J ,14 petits /porte
-non rongeurs : lapingestation 28 34J ,8 animaux/porte

Doses
1 lot tmoin + 3 doses :
dose la + forte
toxicit pour la mre =perte de poids de 10%
pas embryoltale (effet tratogne masqu ?)
pas trop faible (au dessous du seuil efficacit =toxique)
Dose la + faible =effet recherch

Voie :
Voie urinaire en thrapeutique, sinon per os
a. Etudes :3 segments
Mles
To
Conception

gestation

parturition

sevrage

Femelles
Segment 1
2) embryo et organo gense
Implantation
de luf

3) fin de gestation ,parturition

Lactation, sevrage

segment 1 :Etude de fertilit et du dveloppement embryonnaire prcoce

1 espce :rongeur (rat) :24 et 24 /lot
[ traite x non trait et non traite x trait] ou [ traite x trait]
70J
C
14 J
Suivi des , :

J7
P
Implantation

-poids
-Comportement
-Consommation
-Symptomatologie

Fin dtude :
1/2 gravides :csarienne la fin de la gestation :21J
-nombre de ftus ms , vivants ,
sexe ,poids, examen morphologique
-Index de Fertilit : gestantes / non gestantes
1/2 mettent bas normalement :nombre, sexe, mortalit
Suivi des petits (F1) : -poids
-dveloppement moteur et comportement
Suivi jusqu F2 (F1 xF1)
Sacrifice des mres et des pres :
examen spcial des organes gnitaux
S2 :Dveloppement embryofoetal : embryo et foeto toxicit
valuation du pouvoir tratogne
au moins 2 espces rongeur :20/lot
Lapin albinos : 12/lot
Traitement :pendant la priode dorganogense
6 rattes
15
P
6 lapines
18
pendant ltude : suivi des mres

Fin de ltude :
Csarienne 24H avant de mettre bas (cannibalisme) :rattes J20 ,lapines J28
nombre de ftus vivants, morts
poids, taille, sexe, aspect
anomalies morphologiques (viscres, squelette) et histologique (coloration
spcifique)
S3 : Dveloppement pri et post natal
1 espce rongeur :12 /lot
J15

P
S
Fermeture du palais
Pendant ltude :
1/2 porte est sacrifie (avec les mres) : examen
1/2 :pour les effets retards :
-suivi de la gnration F1, viabilit,
-volution pondrale,
-dveloppement physique, fonctionnel, comportemental,
-valuation des capacits de reproduction
Pour chaque segment :tude statistique /lot tmoin

D) CONCLUSION
Pb dextrapolation de lanimal lhomme
Pas de modle animal satisfaisant
Ex : Thalidomine
Tratogne chez lhomme :.5 1 mg/kg
Chez le rat, souris :4 g/kg =rien
Chez le lapin et le hamster :1mg/kg
Lgre embryopathie
Seules certaines souches de lapins blancs sont trs sensibles cest pourquoi on demande test
sur rat et sur lapin mais possibilit de toxicit sur autre espces
Lextrapolation ncessite la + grande prudence !
Exemple de produits tratognes :
Dithylstilbestrol, thanol, cocane, radiation ionisantes
Mercure organique, isotrtinone, antipileptique, chloroquine, antinoplasique
Lisotrtinode :utilis contre lacn

10

ETUDE DE LA CANCEROGENESE
A) INTRODUCTION
Cancrogense chimique :cancer induit suite une exposition un produit chimique (idem
physique)
Repose sur plusieurs faits :
90 % des cancers sont des cancers pithliaux (en contact avec lextrieur :peau, poumon,
tractus gastro intestinal)
pidmiologie :exemples
1775 Percival Pott chez les ramoneurs, des cancers du Scrotum
1916 :suie =goudron de houille
peau de lapin cancer
1920 : identification du contenu =HAP dont B[a]pyrne
1895 des cancers des voies urinaires chez ouvriers teinturiers
colorants de synthse : amines aromatiques
1950 : x10 leucmies :radiologues
Lien entre analyse de mutation (ex : gne p53) et la carcinogense
Mutation sur un codon spcifique due :
Aflatoxines B1 et hpatocarcinome
Tabac et cancer broncho-pulmonaire
UV B et cancer cutan
ce jour :CIRC : 836 produits tudis sont cancrogne chez lhomme 75
28 produits chimiques, physiques, processus industriels
25 mdicaments
5 habitudes (tabac..)
7 produits biologiques (virus)

B) PROCESSUS
en plusieurs tapes
Initiation

Promotion

Progression

chimique
RX
Virus
1/ Initiation : Agent gnotoxique
c* normale c* initie (potentiellement maligne)
Altration irrversible du gnome (si pas rpar)
2/Promotion : Agent promoteur de tumeur (pigntique)
c* initie
hyperplasie

Prolifration
dysplasie

11

X c* immatures
cancer in situ

Expansion clonale dune c* dont le gnome est altr

3/ Progression :facteurs gntiques ou pigntiques
envahissement des tissus voisin ganglions satellites
mtastase cancer invasif
Evnement rare =0.1% des c* arrivent au terme de ce processus
min 2 + mutations sur une mme c* pour quil y ait volution

C) MECANISME
agents gnotoxiques interaction avec ADN
1/ Mutation : gnique :substitution, dltion, addition
Chromosomique :
modification de structure macrolsion
Modification de nombre
2/ Rparation :

pas de rparation
rparation fautive
division cellulaire avant rparation
altration permanente de lADN
Il faut des mutation permanentes pour quun cancer survienne
Gnes cibles :
1/ Proto oncognes :rgulateurs de la croissance et division
Mutation activs en oncogne division c*
gain de fonction =activation
ex :c-myc
cancer du poumon petites c* :
amplification jusqu 50 x c-myc
Lymphome de Burkitt :translocation
8

14
c-myc

14
IgG
c-myc

2/ Gnes suppresseurs de tumeurs :gardien de lintgrit du gnome

perte de fonction =inactivation
ex : p53
Brac 1 et 2
Facteurs pigntiques :
cytotoxicit, inflammation chronique
environnement c* :hormone, facteurs immunologiques
promoteurs :mcanisme ?
dfinit comme incidence
2- Investigations toxicologiques

12

A Etude long terme in vivo

1- But : Dpister les agents capables :
induire des tumeurs non spontanes (/tmoins)
lincidence des tumeurs spontanes
raccourcir le temps de latence de tumeurs spontanes
2- Quand :
-Structure chimique effet potentiel
-Classe thrapeutique dont certains composs sont +
-tude de toxicit chronique lsions suspectes
-tudes de mutagense produits suspect
-traitement prvu >6 mois
3- Protocole :
Animal :

2 espces :rongeurs (rats, souris)

tumeurs spontanes connues
Doses :
3 lots tmoins
dose suprieure :dose max. tolre
dose infrieure :2 3 x dose thrapeutique
dose intermdiaire : moyenne
Nombre : 50/ sexe/ dose + 100 /sexe pour lot tmoin (tumeurs rares)
Voie :usage prvue
Dure : toute la vie
rat : 24 mois
souris :18 mois
Frquence :7J/7
Etude :
consommation :aliments, eau
comportement, poids, observation clinique (palpation) date
dapparition clinique
la fin :autopsie
examen macroscopique
examen anatomo-pathologique (+ 40 organes)
Etude statistique par rapport au lot tmoin
Problmes :alimentation (contaminants)
environnement :lumire, bruit, stabulation (position et nombre danimaux /cage)

D)

ETUDE IN VIVO A COURT TERME

Ex : souris transgnique
Exemple :Souris p53 +/gnotoxique

inactivation du seul gne fonctionnel

protection dveloppement de tumeurs
Animaux :souris et
2 lots tmoins :sauvage +/+ et +/au moins 3 lots traits +/Dure :24 semaines de traitement + observation 4 6 semaines
Fin dtude :idem : autopsie
examen macroscopique
examen anatomo-pathologique (+ 40 organes)

13

Avantages : tps
nombre danimaux cot
mme localisation des cancers que sur le modle long terme
Inconvnients :
souris p53 :mise en vidence seulement composs gnotoxiques
trop sensible ? misse en vidence + de produit + que sur tude de
cancro-traduction
p53 peu impliqu dans la cancrogense du rongeur (famille gne rats
touch et non p53)
en cours de validation : protocole pas encore stricte ou codifi
(variable)
Cot ~1m peu par rapport tude clinique mais quand mme cher

14

ETUDE DE LA MUTAGENESE
DEFINITION
Agent mutagne agent physique ou chimique capable de provoquer une mutation
dite induite
Mutagense
processus qui produit une mutation

Mutation obtenues naturellement =mutants spontans

LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATION

I- Mutation gnique 1 plusieurs paires de base
Substitution ,dltion ,insertion de bases

II- Mutation chromosomiques =macrolsion

gnes, segments de chromosomes ou chromosomes entiers
Altration de la structure :exemples
-dltion et insertion dun segment dADN (de qlq pb des millions de pb)
-cassures :simple brin ou double brin
discontinuit de la double hlice :agent clastogne (casse les
fragments dADN)
Variation du nombre
-aneuplodie agent aneugne (variation nombre 1 chromosomes)
-polyplodie :2n, 3n
systme de rparation
Si anomalie importante mort c*

INVESTIGATION TOXICOLOGIQUE
But : prdire la cancrogense (1re tape

=mutation :atteinte ADN)

test rapides, sensibles, peu onreux
Tests in vitro et in vivo
dossier

AMM :bactrie rglementaires : min 3 tests

-test de mutation gnique mev de lsions
Test dAmes sur bactrie sur c* procaryotes
-Test in vitro de mutation gnique et chrsq sur c*
Test du Mouse Lymphoma Assay (MLA)
-Test in vivo de mutation chrsq
Test du micro noyau in vivo

bactrie min si prod - ,si 1 test + autres tests

15

3.1 Test dAmes :

test de mutation gnique rverse sur bactrie (ut bact mutantes ,obs effet mutagne par
passage de mutantes sauvages
Souches bactriennes :
Salmonella tryphimurium modifies :His (incap $ his)
Pls types :
Mutation /dcalage de lORF
Mutation /substitution
Dltion de syst de rparation
sensibilit
Permabilit mb
Protocole :
Salmonella his
mutagne

prod X /solvant

fraction mtab (hpatique ) effet

concentration

test avec et sans activation mtab

glose pauvre en his

prod X

incubation
37C ,48H

tmoin solvant
colonie His +

dnombrement du nbre de colonie

+

rvertants spontans

tte colonie cap de se dvper en de 48H sur milieu pauvre en his

Corrlation mutagense /cancrogense
Cancrogense rongeur
10%

90%

87%

13%

Test dAmes
90% des prod + ds Ames sont cancrognes chez le rongeurVP
87% des prod sont non cancrognes VN
13% des + ne sont pas cancrognes FP
10% des cancrognes ne sont pas + /Ames FN
16

3.2 Test in vitro de mutations gniques et chromosomiques (macrolsions) sur cellules

eucaryotes
MLA :Mouse Lymphoma Assay
c* eucaryotes : lymphome murin L5178 Y TK+/6 (locus thymidine kinase )
thymidine
TK
ou analogue
pyrimidiques

autres Kinases
Monophosphate
DP
TP puis intgration ds lADN

Protocole :
Prod X/solvant
Pls conc

mort c* : c* TK+/5 BrdU

fraction mtab

Prolifration c*a :c* TK -/-

5 BrdU =5 bromo desoxy uridine

analogue pyrimidique antimtabolite toxique
/TK 5 BrdU MP intgration ds ADN mort c*
Si TK +/- na pas mut c* capable dintgrer 5Brdu mort c*
Si prod X toxique mutation Tk -/- le prod ne peut plus etre intgrer ds lADN et la c*
va prolifrer
dnombre nbre de clone petmet prvoir amplification /prod X
Locus TK / chrs 11
Locus gne prolif c*
Locus TK
Chrs 11
Les prod qui entrane une mutation sur le locus TK croissance normal
Si prod casse le chrs avant le gne TK perte gne TK + gne de prolif c* c* se dvpt bcp
vite petits clones
Selon nbre et taille des colonies
mutation gnique
mutation chrsq
(une c* de lymphome ne possde pas de cyp450 elle nest pas capable dactiver)
On expose c* prod X fraction mtab mutagense activation mtab ncessaire

17

3.3 Test du micro nayau in vivo

Souris : 5 5 /lot
Protocole : prod X :pls conc + lot tmoin
2 tps dexposition :24 et 48H
Euthanasie (1 trt 24H, 2 trt 48H)
Puis obs sur moelle osseuse frottis ,coloration ,microscopie optique
Dnombrement de la ligne rythroblastes rythroblastes
polychromatophiles
Normalement : division c* puis expulsion du noyau vers la circulation sanguine
Qd prod X : morceau de chrs cass ds cytoplasme
migration des chrs le long du fuseau, cytokinse 2 c* filles
le fragment de chrs nest pas inclus ds noyau
Qd expulsion :le petit bout dADN reste ds cyto Micronoyau
Si poison du fuseau (vinblastine, vincristine) pls noyaux
Lecture : on prend 1000 rythrocytes polychromatophiles (c* sans noyaux) et on dtermine le
% de c* micronucles /tmoin
Avantage :
Test in vivo donc pas de pb de mtabolisation
Prod inject par intrapritonale mtabolisation normale
Inconvnients : vise moelle osseuse ncessite vrif conc ds MO mais on vrifie slmt conc
plasmatique
tout le monde possde ts des micronoyauxtest ut en dpistage

18

Etude de la tolrance locale

mdt usage topique ou parentral
prod cosmtique :peau ,proche de lil ,muqueuse buccale
prod chimiques
phno dirritation (inflammation) et de corrosion (ncrose)
I Tolrance oculaire
1.1 Test dirritation oculaire de Draize 9/6/92
Cible :

partie antrieure du globe oculaire (pas nerf ou rtine)

corne ,iris, conjonctive
Protocole :
3 lapins albinos (au lieu de 9) visualisation sur coloration de liris
produits :0.1 ml (liq) ou 100 mg (poudre) ds le cul de sac conjonctival (prod pures)
on laisse en contact pdt 1 H
puis examen oculaire :1 H ,1, 2, 3, 4 et 7 jours (ncrose , rversibilit )
examen visuel sur conjonctive, corne, iris
Notation :
Conjonctive
/20
chemosis (infiltration oedmateuse) ,larmoiement, rougissement
Iris
/10
modif couleur ,dimensions
Corne /80
opacit :intensit et surface
Rsultat =moyenne des 3 lapins chaque tps dobservation
Note max (110) indice dirritation oculaire max = IO max
Classification :
IO max >15 faiblement irritant
10 30 moyennement irritant
30 50 irritant
IO max >50 trs irritant
Pb dthique : Souffrance de lanimal (rduction 10 mg)
Cosmtique ?
Interdiction dutiliser des animaux pour les produits finis (shampooing,
mascara...)
Produits chimiques :

pas de produits pH extrmes

Pas si irritant cutan ( forcment irritant oculaire)
Sur 1 animal dabord (si peu irritant 3 animaux)

II Mthodes alternatives
Test du HET cam
Hens egg test chorio allantoc mb =mb chorio allantodienne de luf de poule de 10 j
300 l de prod tester
Rinage 20 sec
Observation ds les 5 minutes qui suivent
Hyperthermie
Hmorragie
Coagulation
Tps dapparition Classification
3 ufs /conc

Rapide, peu coteux

19