TINCION GRAM

La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin diferencial

empleado en Bacteriologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en
muestras clnicas. Debe su nombre al bacterilogo dans Christian Gram, que
desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la
morfologa celular bacteriana, como para poder realizar una primera
aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram
positiva a las bacterias que se visualizan de color morado, y Bacteria Gram
negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella.
METODOLOGA

Recoger muestras.
Hacer el extendido con un palillo de madera.
Dejar secar a temperatura ambiente o fijarlas utilizando un mechero.
Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado 3
veces aprox.)
Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar 1
minuto. Todas las clulas gram positivas se tien de color azul-prpura.
Enjuagar con agua.
Agregar lugol y esperar entre 1 minuto.
Enjuagar con agua.
Agregar alcohol acetona y esperar 30 segundos o 5 segn la
concentracin del reactivo (parte crtica de la coloracin).
Enjuagar con agua.
Tincin de contraste agregando safranina o fucsina bsica y esperar 1
minuto. Este tinte dejar de color rosado-rojizo las bacterias Gram
negativas.

Para observar al microscopio ptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite

de inmersin.
TINCIN DE GRAM.
Fue creada en 1884 por el mdico danes Hans Christian Gram, Esta tincin nos
permite separar a la mayora de las bacterias en dos grupos las gram positivas
que se tien de color violeta y las gram negativas que se tie de color rosa. La
diferencia en la tincin radica en las estructuras de la pared celular de las
bacterias.
FROTIS BACTERIANO.
Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriolgica hasta el rojo vivo
y esperar a que enfre un poco.
Tomar con el asa una gota de agua estril y agregarla en un portaobjetos.

Flamear nuevamente el asa y esperar a que enfre.

Tomar con el asa un poco de muestra bacteriana a partir de una colonia
aislada.
Despus agregar la muestra en la gota de agua que esta en el portaobjetos y
homogeneizar suavemente con movimientos circulares.
Esperar que seque al aire libre o poner durante uno o dos segundos con la
llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no
debe ser directo (slo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede
cambiar la morfologa celular de las bacterias a observar.
TINCIN.
1Agregar cristal violeta, solo el suficiente para que se cubra el extendido
bacteriano.
dejar actuar durante 60 segundos.
2Agregar el lugol, solo el suficiente, dejar actuar durante 60 segundos.
3Enjuagar con agua corriente.
4Agregar una o dos gotas de alcohol-acetona e inmediatamente enjuagar con
agua corriente.
5Agrgar Safranina, solo la suficiente, Dejar actuar durante 60 segundos.
6Enjuagar con agua corriente.
7Dejar secar a temperatura ambiente.
8Observar en un microscopio ptico con un objetivo 100X usando aceite de
inmersin.

FUNDAMENTO DE LA TINCIN DE GRAM.

**Los lavados con agua tienen el objetivo de arrastrar mecnicamente el
exceso de colorante y quitar el alcohol-acetona.
EXPLICACIN
**El colorante cristal violeta es de naturaleza bsica y por lo tanto tiene
afinidad por sustancias cargadas negativamente como la pared celular de
cualquier bacteria.por lo que bacterias Gram positivas y Gram negativas son
teidas de color violeta. El cristal violeta (colorante catinico) penetra en todas

las clulas bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas) a travs
de la pared bacteriana.
**Un mordiente es una sustancia que aumenta la fijacin de algn colorante
sobre una superficie determinada, en este caso el cristal violeta aumenta su
fijacin a la pared clular bacteriana usando de mordiente al lugol, (El lugol es
un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio) y
Sl (Siulterio), los cuales estn presente para solubilizar el yodo) en la pared
bacteriana el lugol forma un complejo con el cristal violeta insoluble en agua lo
que evita que se disuelva y se pierda el colorante durante el enjuague. Ya
sabemos que la pared de los Gram positivos son ricos en cidos teicoicos no
saturados estos muestran gran afinidad por los agentes oxidantes, todos los
mordientes por ejemplo el lugol son agentes oxidantes y su efecto en general
consiste en dar un caracter mas cidez de los cidos teicoicos lo que aumenta
la afinidad de estos por el colorante bsico cristal violeta.
**La mezcla de alcohol-acetona es un disolvente orgnico que decolora la
pared bacteriana disolviendo el complejo cristal violeta-lugol, esta decoloracin
no afecta a las bacterias Gram positivas, hay varias explicaciones al respecto,
les menciono las dos ms aceptadas.
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la
decoloracin, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los
organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos
s lo hacen.
-Una teora dice: El alcohol-acetona, deshidrata la pared rica en peptidoglicano
de los microorganismos grampositivos lo cual cierra los poros de la pared,
propiciando una barrera que no permite la salida del complejo cristal violetalugol. En la pared de las bacterias gramnegativas hay poco pptido glicano y
una gran cantidad de lpidos estos ltimos son disueltos por el alcohol-acetona,
lo que permite el escape del complejo cristal violeta-lugol.
-Otra teora dice: Las bacterias Gram positivas tienen una capa muy gruesa de
peptidoglicano con gran cantidad de enlaces entrecruzados de cidos teicoicos
los cuales son poco solubles en alcohol-acetona formando una especie de
barrera en la pared bacteriana que no permite la slida del complejo cristal
violeta-lugol por ende se retiene el cristal violeta-lugol en la pared en el
proceso de decoloracin.
**La safranina es un colorante catinico que tie las paredes bacterianas ya
que estas tienen compuestos cargados negativamente, por consiguiente las
bacterias Gram negativas se tien de color rosa, sin embargo las bacterias
Gram positivas no se tien debido a que su pared clular esta saturada del
colorante cristal violeta y esto no permite la entrada de la safranina.

Para poner de manifiesto las clulas Gram negativas se utiliza una coloracin
de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o
la fucsina. Despus de la coloracin de contraste las clulas Gram negativas
son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen violetas.
La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la tcnica. Sirve para
hacer una tincin de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram
negativas. Al trmino del protocolo, las Gram positivas se vern azul-violceas
y las Gram negativas, se vern rosas (si no se hizo la tincin de contraste) o
rojas (si se us, por ejemplo, safranina).
Las diferentes clases de bacterias reaccionan de modo distinto frente a la
tincin de Gram porque las diferencias estructurales en sus paredes
determinan la retencin o el escape de una combinacin de violeta de
genciana y de yodo, denominada complejo violeta-yodo (CV-I).
Entre otras diferencias las bacterias grampositivas tienen un peptidoglucano
(disacridos y aminocidos) en su pared celular ms grueso que las bacterias
gramnegativas. Adems, las bacterias gramnegativas contienen una capa de
lipopolisacrido (lpidos y polisacridos) como parte de su pared celular.
Cuando

se

los

aplica

tanto

clulas

grampositivas

como

clulas

gramnegativas el violeta de genciana y luego el yodo ingresa con facilidad en

las clulas, en cuyo interior se combinan para formar CV-I. Este complejo es
ms grande que la molcula de violeta de genciana que ingres en las clulas
y por su tamao, no puede ser eliminado por el agregado de alcohol de la capa
de peptidoglucano intacta de las clulas grampositivas. Estas retienen el color
del colorante violeta de genciana. En cambio en las clulas gramnegativas el
alcohol altera la capa externa del lipopolisacrido y el complejo CV-I se elimina
de la capa delgada de peptidoglucano. Como consecuencia, las clulas
gramnegativas son incoloras hasta que se agrega el colorante de contraste
safranina, despus de lo cual aparecen de color rosado.
En sntesis, las clulas grampositivas retienen el colorante y permanecen de
color violeta. Las clulas gramnegativas no retienen el colorante; son incoloras
hasta que se las tie con un colorante de contraste rojo.
TINCIN DE CIDO-ALCOHOL RESISTENCIA

Otra tincin diferencial importante es la tincin

de cido alcohol resistencia, que se fija de
modo firme solo a las bacterias que poseen
ceras en las paredes de sus clulas. Los
microbilogos

utilizan

esta

tincin

para

identificar todas las bacterias del gnero

Mycobacterium. Esta tincin se utiliza para
Bacterias
cidoidentificar
las cepas
del gnero Nocardia.
Fig. 7.-

En este procedimiento de tincin se aplica el colorante rojo carbolfucsina a un

extendido fijado y se caliente suavemente el portaobjetos durante varios
minutos. Luego se enfra el portaobjetos y se lo lava con agua. A continuacin
el extendido se trata con cido alcohol, un decolorante que elimina el color rojo
de las bacterias que no son cido alcohol resistentes. Los microorganismos
cido alcohol resistentes, retienen el color rojo porque la carbolfucsina es ms
soluble en los lpidos de la pared celular que en los cido alcohol resistentes,
en las bacterias que no son cido alcohol resistentes las paredes carecen de
componentes lipdicos y la carbolfucsina se elimina con facilidad durante la
decoloracin, lo que deja a las cdulas incoloras. Luego el extendido se colorea
con azul de metileno, que acta como colorante de contraste. Las bacterias
que no son cido alcohol resistente aparecen azules despus de la aplicacin
del colorante de contraste.

MEDIOS DE CULTIVO
AGAR CITRATO SIMMONS
Fuente de aminocidos:
Fuente de carbono: citrato de sodio
Fuente de nitrgeno: fosfato monoamnico, sales de amonio
Inhibidores: no tiene

Reguladores de pH: sales de fosfato (sistema buffer)

Enzimas: Magnesio (cofactor enzimtico)
Indicadores: Azul de bromotimol (que vira al color azul en medio alcalino)
Mantiene el balance osmtico: cloruro de sodio
Agente solidificante: Agar

AGAR PCA (Standard Methods Agar)

USO
Medio de cultivo recomendado para el recuento de bacterias aerbicas en
aguas, aguas residuales, productos lcteos y otros alimentos.
Tambin es recomendado como medio general para determinar poblaciones
microbianas.
FUNDAMENTO
La productividad de este medio, est basada en el alto contenido nutricional de
sus componentes, que permite el desarrollo de las bacterias presentes en la
muestra. Cuando se analiza leche y productos lcteos algunos autores
recomiendan suplementarla con leche descremada estril de uso bacteriolgico
en una proporcin de 1 g por litro. El agar es el agente solidificante.
Formula:

Extracto de levadura: Es utilizado en microbiologa en la preparacin de

una amplia variedad de medios de cultivo como excelente fuente de
nutrientes.

Triptena: La triptena y la peptona de soya aportan nutrientes ricos en

pptidos, aminocidos libres, bases pricas y pirimdicas, minerales y

vitaminas
Glucosa: fuente de energia
Agar: agente solidificante.

pH final : 7.0 0.2

AGAR PDA
Fuente de energa: glucosa, infusin de papa
Fuente de carbono: Dextrosa
Inhibidores: cido tartrico
Agente solidificante: Agar

CALDO VERDE BRILLA

Fuente de energa: peptona
Fuente de carbono: lactosa (hidrato de carbono fermentable)
Inhibidores: bilis de buey, verde brillante
Indicadores: no tiene

CALDO DE TRIPTONA
El agua triptona, por su base nutritiva, permite el desarrollo de diversas
especies bacterianas, y debido a su alto contenido de triptofano, es un buen
sustrato para la produccin de indol.
Prueba del Indol
Utilizar el reactivo de Kovacs o de Erlich: se considera un resultado positivo el
desarrollo de un color rojo.
La prueba del indol es una prueba bioqumica realizada en especies
bacterianas para determinar la habilidad del organismo de romper el indol del

aminocido triptfano. Esta divisin molecular es lograda por una serie de

enzimas intracelulares diferentes, un sistema que en conjunto se le llama con
frecuencia triptofanasa.
Se genera el indol por una desaminacin reductiva del triptfano via la
molcula intermediaria cido indolpirvico. Las triptofanasas catalizan la
reaccin de desaminacin, durante el cual se remueve el grupo amino (NH2) de
la molcula de triptfano. Los productos finales de la reaccin son el indol,
cido pirvico, amonaco (NH3) y energa. Como coenzima de la reaccin se
requiere al fosfato de piridoxal.
USO
Medio de cultivo no selectivo utilizado para efectuar recuentos bacterianos
mediante la tcnica de filtracin por membrana. Es ampliamente utilizado en el
anlisis de aguas y productos lcteos.

FUNDAMENTO
Su formulacin provee un alto contenido de nutrientes para el desarrollo
microbiano y no posee inhibidores de crecimiento.
FRMULA (en gramos por litro)

EXTRACTO DE CARNE
TRIPTENA
GLUCOSA

Inhibidores: no tiene

CALDO LACTOSADO
Lactosa: Hidrato de carbono fermentable
Fuente de carbono y nitrgeno: extracto de carne y la peptona

Inhibidores: no tiene
Indicadores: rojo de metilo

TCBS
Fuente de nutrientes: El extracto de levadura, la peptona de carne y la
triptena aportan nutrientes para el desarrollo bacteriano y la sacarosa.
Inhibidores: tiosulfato de sodio, citrato tri-sodio, bilis de buey
Indicadores: azul de timol y azul de bromotimol, del color azul al amarillo en
medio cido.
Cloruro de sodio: favorece crecimiento de microorganismos.