Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
Biotecnologa
Profesora: Nria Saperas
BIOQUMICA. INTRODUCCIN A LA
BIOTECNOLOGA
Expresin y purificacin de una protena eucariota en la bacteria
Escherichia coli
Objetivos..............................................................................................................................4
2.
Conceptos bsicos................................................................................................................4
3.
Procedimiento experimental................................................................................................5
A. Comprobacin de la construccin de partida...................................................................5
B. Cromatografa de intercambio inico..............................................................................8
C. Precipitacin de las protenas de cada fraccin cromatogrfica......................................9
D. Anlisis electrofortico de cada fraccin cromatogrfica..............................................11
I.
4.
Discusin de Resultados....................................................................................................15
5.
Conclusiones......................................................................................................................17
6.
Cuestiones..........................................................................................................................18
7.
1.
2.
3.
4.
5.
Cuantificacin de protenas............................................................................................19
Bibliografa........................................................................................................................21
Introduccin
La biotecnologa es la aplicacin de organismos, sistemas o procesos biolgicos para las
industrias de fabricacin y/o servicios. El rea de aplicacin ms importante de la
biotecnologa, es la tecnologa del bioprocesamiento, particularmente la modificacin, el
cultivo de clulas y la purificacin de protenas. A partir de ellas, puede obtenerse materiales
de inters y relevancia para el ser humano.
El cultivo de clulas o microbiano, no es ms que un mtodo de multiplicacin de
microorganismos, tales como bacterias u hongos, a los que se les ha modificado
genticamente para que produzcan una sustancia de inters. En el caso de esta prctica de
laboratorio, se refiere a la modificacin de una bacteria para que produzca una protena
encontrada en las ranas. La modificacin de la bacteria para que exprese la protena de inters
se logra a travs de la introduccin de un plsmido que contiene el gen que la codifica. La
bacteria modificada es la Escherichia coli debido a su relativo bajo costo, alta densidad de
cultivo y su fcil manipulacin gentica. La protena que se expresar es la nucleoplasmina,
la cual es de gran importancia en el proceso de fecundacin y formacin del cigoto en
organismos que se reproducen de forma sexual. Interviene en la retirada de las protaminas
para que se d la incorporacin de histonas que se encarguen de empaquetar el ADN en el
nuevo organismo.
Este cultivo se debe preparar en un medio ptimo para favorecer el proceso deseado y el
producto de inters debe ser recuperado y purificado. Las tcnicas de recuperacin y
purificacin deben concentrarse en las caractersticas ms distintivas que tiene la protena de
inters y desarrollar un esquema de separacin en base a ello. La nucleoplasmina es una
protena de tamao grande, termoestable y de carcter muy acdico, ya que es rica en
aminocidos cidos.
Considerando todo lo mencionado anteriormente, en la presente prctica se expresar y
purificar una protena eucariota en la bacteria Escherichia coli. Como mtodo de
comprobacin de la construccin de partida se realizar una electroforesis en gel de agarosa.
La recuperacin y purificacin de la protena se lograr mediante un proceso qumico y un
proceso mecnico, refirindose a una lisis celular por la adicin de un detergente y a la
separacin mediante centrifugaciones a alta velocidad. Se utilizar la electroforesis como
tcnica de validacin.
2
1.
Objetivos
Conceptos bsicos
Precipitacin: Es una forma de separacin, para la cuantificacin e identificacin
qumica, basada en la solubilidad del slido que se encuentra disuelto en un solvente.
Sobrenadante: La parte superior clara de cualquier mezcla despus de ser
centrifugada.
Sedimentacin: Es la separacin por la accin de gravedad de las fases slida y
lquida de una suspensin diluida para obtener una suspensin concentrada y un
lquido claro.
Centrifugacin: Proceso mecnico que permite, por medio de un movimiento
acelerado de rotacin, provocar la sedimentacin de los componentes de una mezcla.
Condicin de Asepsia: Condiciones que evitan que los microorganismos ajenos a los cultivos
contaminen o que los grmenes que se encuentran en la muestra se propaguen en el rea de trabajo.
Las condiciones de asepsia se alcanzan trabajando en proximidad a la llama de un mechero o en
campanas de seguridad biolgicas, y en un ambiente limpio y ordenado.
I.
Nde I
Bam
HI
XhoI
0,5
0,5
0,5
0,5
-
0,5
-
Tampn de
digestin TR (10x)
(l)
1
1
1
Muestra
(l)
Agua
(l)
5
5
5
3
3
3,5
repartir las clulas sobre toda la superficie; mientras se tiene cuidado de no aplicar
fuerza excesiva y romper el vidrio. El asa de siembra debe estar asptica, por lo que
debe flamearse con alcohol siguiendo el siguiente procedimiento:
a. Sumergir la placa en un vaso precipitado que contenga alcohol.
b. Escurrir el exceso de lquido.
c. Pasar rpidamente por la llama para evitar que se ennegrezca.
d. Dejar extinguir la llama.
e. Enfriar el asa agitndola cerca de la llama para evitar la muerte de las bacterias
al plaquear.
La placa Petri contiene medio de cultivo LB y ampicilina gelificados con agar. Para
lograr este medio slido debi calentarse y disolver el agar a alta temperatura y
aadir antibitico a la mezcla antes de que gelifique. Las caractersticas de este
medio hacen que las bacterias plaqueadas tengan movilidad limitada y se queden en
la zona de la placa donde fueron colocadas.
El proceso de plaqueado se realiz en una placa diferente para cada muestra de los
grupos del laboratorio. Adicionalmente, se crearon dos grupos control compuestos
por clulas huspedes sensibles a la ampicilina, es decir, a las que no se les adicion
el ADN recombinante. Uno de los controles, denominado C1, se coloc en un medio
sin ampicilina y el otro, C2, se coloc en un medio con ampicilina. Ambos controles
sirven como referencia para la comprobacin de la eficacia de la transformacin de
nuestras clulas.
10) Incubar en la estufa a 37 C durante 1 hora. El procedimiento descrito en los pasos 9
y 10 se muestra en la Figura 10.
a. Pasar el asa por la llama hasta que se ponga completamente rojo el hilo de
platino.
b. Enfriar el asa agitndola cerca de la llama para evitar la muerte de las bacterias
al picar las colonias.
2) Incubar a 37 C y agitar a 250 rpm durante 4-6 horas. Este proceso de agitacin se
hace colocando los tubos de forma inclinada, no cerrados por completo, de manera que
se airee la muestra y se evite su contaminacin.
3) Reinocular la muestra sobre 25 ml de LB y ampicilina. El aumento progresivo de
volumen de cultivo logra que se reduzca la fase de ajuste de las bacterias y su
crecimiento empiece rpido y con mnimas perturbaciones.
4) Incubar a 37 C y agitar a 250 rpm durante toda la noche. Por cuestiones de tiempo de
uso del laboratorio, en el caso de las muestras trabajadas, la mitad de ellas fue
refrigerada durante dos das y luego fue incubada como se describe; mientras que la
otra mitad fue incubada durante dos das.
Segunda Parte
A Procesamiento del cultivo: Recuperacin y purificacin del producto
Una vez obtenido un cultivo de suficiente volumen de bacterias que habrn estado
expresndose ("fabricando") la protena de nuestro inters (nucleoplasmina en este
caso) tendremos que recuperar, enriquecer y purificar esta protena. Los diferentes
pasos se irn controlando mediante electroforesis en gel de poliacrilamida.
Importante: ahora no hay que trabajar en condiciones de asepsia pero s que conviene
trabajar siempre en fro (hielo) a menos que se especifique lo contrario. No se
requieren condiciones tan controladas de asepsia porque ya no se llevar a cabo
cultivo, sin embargo el fro es conveniente porque conserva mejor el material
biolgico.
1)
4)
5)
6)
7)
8)
9)
3)
4)
5)
6)
aproximadamente 4 %.
La presencia de dos zonas de diferente concentracin de poliacrilamida ocasionar una
diferencia en la movilidad de las protenas en cada una de ellas. En la zona de menor
concentracin o apilador, las protenas irn rpido hasta llegar a la interfaz, pasando a
la otra zona de forma simultnea. En la segunda zona, de mayor concentracin, se
separarn en base a su movilidad relativa.
Hervir las muestras a 100 C durante 6 min, ocasionando que se desnaturalicen las
protenas y se desplieguen, obteniendo monmeros desnaturalizados. Este proceso a
alta temperatura se realiza para asegurar que la nucleoplasmina se despliegue, ya que
por su alta estabilidad qumica, es posible que el SDS no logre hacerlo por completo.
Este despliegue incompleto ocasionara que la nucleoplasmina tuviese secciones
pentamricas y secciones desplegadas, y no avanzase correctamente en el gel.
Colocar el gel en el montaje de electroforesis y cargar las muestras. Esta electroforesis
se realiza de forma vertical y usa azul de bromofenol como colorante de migracin.
Adicionalmente, se desarrolla a 130 V y se deben cargar las muestras en el extremo
donde se conecte el electrodo negativo para la electroforesis. Como se coment
anteriormente, las muestras tendrn carga negativa por la adicin de SDS y migrarn
hacia el electrodo positivo.
Teir el gel con Azul de Coomassie para visualizar las bandas de protena. El gel
deber sufrir un proceso de destincin posterior para que las mismas sean observables.
Secar el gel entre dos papeles de celofn y observar las bandas ocasionadas por la
migracin de las protenas.
6. Cuestiones
Primera Parte
a) Comprobacin de la construccin de partida
1. De qu tamao se espera encontrar los fragmentos resultantes de la digestin? Haga
un esquema de electroforesis mostrando los resultados de la digestin.
En el proceso de electroforesis realizada se da una separacin de las bandas por
tamao de los fragmentos. Como muestra de referencia se usa un Marcador de Masa
Molecular (MMM), que es un marcador de kilobases. Es decir, aparecer una banda
cada 1000 pares de bases (pb). Especialmente notable ser la banda en 1 Kilobase, la
que tiene mayor intensidad y servir como gua para localizar a las otras bandas. Los
resultados esperados para la electroforesis de los fragmentos de la digestin son los
mostrados en la Figura xx.
Datos de partida
Plsmido:
Gen NP (Nucleoplasmina):
Longitud inicial = 3716 pb
Longitud Gen NP = 363 pb
Longitud diana [BamHI - Nde I] = 90
pb
Longitud diana [Xho I - BamHI] = 42
pb
Clculos
ADN recombinante:
ADN recombinante=Plsmidodiana [ BamHI Nde I ] +Gen NP=3716 pb90 pb+363 pb=
1 combinacin: Se espera la aparicin de dos fragmentos, la diana [BamHI - Nde
I] y el resto del plsmido.
1 fragmento=Gen NP=363 pb
2 fragmento= ADN RecombinanteGen NP=3989 pb363 pb=3626 pb
2 combinacin: Se espera la aparicin de dos fragmentos, siendo el primero la
diana [Xho I - BamHI] y el gen NP, y segundo el resto del plsmido.
1 fragmento=diana [ Xho I BamHI ] +Gen NP=42 pb+ 363 pb=405 pb
3. Por qu primero incubamos 1 hora con medio sin antibitico y en cambio al plaquear
lo hacemos sobre placas conteniendo el antibitico ampicilina?
c) Obtencin de suficiente volumen de cultivo en medio lquido
1. Por qu hay que trabajar en condiciones de asepsia en las partes b) y c)?
2. Por qu no se pica directamente la colonia sobre el volumen final deseado?
Segunda Parte
a) Procesamiento del cultivo: Recuperacin y purificacin del producto
1. Cul es la finalidad del SDS que utilizamos en esta electroforesis?
2. Por qu podemos utilizar el mismo colorante de migracin (azul de bromofenol) tanto
en el caso de la electroforesis de ADN como en la de protenas? Por qu no utilizar el
mismo colorante de migracin que vamos a utilizar en la electroforesis de protenas de
la prctica anterior (verde de metilo?
7. Bibliografa
Saperas, N. (2014). BIOTECNOLOGA: APUNTES (I). Barcelona: Servis Grafics
Copisteria Imatge, SL.
Negroni, M. (2004). MICROBIOLOGA. Buenos Aires: Editorial Panamericana.
Puerta y Uruena. (2003). PRCTICAS DE BIOLOGA MOLECULAR. Bogot:
Pontificia Universidad Javeriana.
Rodak, B. (2002). HEMATOLOGA. Mxico: Panamericana.
Brown, T. (2008). GENOMAS. Buenos Aires: Panamericana.
Garboza y Frontado. (2011). REVISTA DE LA SOCIEDAD VENEZOLANA DE
MICROBIOLOGA. Venezuela.
17