DETERMINACION DE SALMONELLA

1.- OBJETIVO
1.1.- Objetivo General
Determinar la existencia de salmonella en una muestra de quesillo
1.2.- Objetivos especficos
Reconocer una colonia tpica de salmonella
Conocer que medio es el adecuado para el crecimiento de salmonella
Realizar un pre enriquecimiento y enriquecimiento en agua peptonada y
tetrationato respectivamente, para recuperar la bacteria que se encuentra en la
muestra a analizar
Realizar la prueba de confirmacin con la serie bioqumica ( TSI, LIA, MIO, CS)

2.- INTRODUCCION
Esta infeccin est producida por una bacteria (la salmonella) que habita de forma natural
tanto en el intestino de las personas como de los animales. Por esta razn la
contaminacin fecal constituye un elemento clave en el contagio de los alimentos y del
agua. Otra importante fuente de contaminacin es la cruzada. La bacteria llega hasta los
hogares en alimentos como las aves de corral o los huevos y puede transmitirse por
contacto directo o indirecto a otros productos. Una vez en el alimento, y si las condiciones
son las adecuadas, la salmonella es capaz de multiplicarse de forma peligrosa y aumentar
su capacidad infecciosa. Las altas temperaturas facilitan el crecimiento y la reproduccin
de la bacteria.
Lo que no debemos hacer es facilitar su crecimiento y reproduccin, y una de las maneras
es no rompiendo las cadenas de fro y de calor de los alimentos". Los huevos crudos
(mayonesa, clara batida, sopas o leche con yema) o poco cocinados, las aves mal
cocidas y los alimentos cocinados que se mantienen a temperatura ambiente durante un
tiempo prolongado son los implicados de forma ms frecuente en la salmonelosis
Efectividad de procesos tecnolgicos aplicados a la distribucin de Salmonella

Irradiacin.

La efectividad de los diferentes procesos tecnolgicos como la irradiacin son efectivos

cuando se realizan tomando otros factores en consideracin como temperatura y sustrato;
A menor temperatura son menos efectivas las radiaciones ionizantes lo que se debe
considerar en productos congelados.

Efectividad de procesos tecnolgicos aplicados a la distribucin de Salmonella (2)

Gases

El oxido de etileno y formaldehdo en algunos productos como huevos se utilizan con

xito.

Preservantes y Desinfectantes

Algunos de los usados en industria de alimento impiden generalmente el desarrollo de

Salmonella.

3.- FUNDAMENTO TEORICO

La Salmonella
La salmonella es un gnero bacteriano formado por bacilos Gram negativos, anaerobios
facultativos, con flagelos pertricos que rodean al microorganismo y no desarrolla cpsula
ni espora. Son bacterias mviles que producen sulfuro de hidrgeno. No fermentan ni
lactosa sacarosa.
Es un agente zoontico de distribucin universal. Puede transmitirse por contacto directo
a travs de fomites, pero la va ms frecuente contaminacin cruzada durante la
manipulacin, en el procesador de alimentos, o por aguas contaminadas con aguas
residuales.
Crece con facilidad en la sangre formando colonias de 2 a 3 milmetros. En laboratorios
de microbiologa clnica puede aislarse en heces con medios selectivos para inhibir el
crecimiento de otras bacterias patgenas y de la flora intestinal.
Existen nicamente tres especies de Salmonella, la salmonella Typha, la cholera-suis, y la
enteritidis, teniendo esta ltima una gran variedad de serotipos

Fundamento de la Metodologa
Los mtodos para su deteccin en alimentos estn basados fundamentalmente en que
generalmente su presencia est en un menor nmero que el de la flora acompaante que
es muy diversa.

En el laboratorio, los mtodos convencionales para su recuperacin consideran todos

estos factores permitiendo recuperar Salmonella mediante procesos de:

- pre enriquecimiento
- enriquecimiento
- siembra en agares selectivos
- pruebas bioqumicas y
- serotipificacin

Fundamento de la Tcnica
Pre enriquecimiento
Depender del grado de injuria de las clulas, lo cual est relacionado con los procesos
tecnolgicos aplicados. (deshidratacin, congelacin, calor etc.) y en aquellos alimentos
en que se espera un bajo nmero.

El pre enriquecimiento es realizado en medios lquidos (agua peptonada, caldo nutritivo,

caldo Lactosado, etc) que son medios no inhibidores del resto de la flora acompaante.
Sin embargo es importante que en la eleccin del medio a utilizar se considere el grado
de injurias subletales derivadas del proceso tecnolgico.

En el caso del agua peptonada tamponada (ph 7.2) sta asegura la mantencin del pH
durante 24horas, lo que sumado al perodo de incubacin permite el incremento de
clulas que son sensibles a la disminucin del pH. A stos medios se les puede adicionar
sustancias que contrarresten las substancias inhibidoras que estn presentes en algunos
alimentos; as mismo se debe asegurar el pH que es un factor muy importante para el
crecimiento de Salmonella.

Enriquecimiento Selectivo
El enriquecimiento selectivo est destinado a inhibir la flora acompaante. Al estar
adicionados de substancias qumicas inhibidoras y sumado a los tiempos y temperatura
de incubacin ptimas permite su desarrollo por sobre otros microorganismos, lo que se
confirma en los medios selectivos elegidos o por otras pruebas de identificacin.
Normalmente el rango de T de incubacin va de 35C a 43C por perodos de 16 a 24 h.
Comnmente los caldos selectivos usados son selenito con cistina (SC), verde brillante,
tetrationato (TT), y el caldo cloruro de magnesio-verde malaquita de Rappaport-Vassiliadis
(RV).

Deteccin en Agares Selectivos

La deteccin en agares selectivos cuyos agentes principales de inhibicin son sales
biliares, Desoxicolato, verde brillante, bismuto de sulfito y antibiticos, la diferenciacin de
Salmonella de otros microorganismos es usualmente determinado por los cambios de
color del indicador que se detecta por cambio de pH y que corresponde a la fermentacin
de lactosa o sacarosa; asimismo la produccin de H2S o la descarboxilacin de lisina y de
la Ornitina.

En microbiologa alimentaria comnmente se utiliza agares como xilosa-lisina

Desoxicolato (XLD), bismuto sulfito, verde brillante con o sin sulfadiazina, Hecktoen,
MacConkey, Desoxicolato citrato y Salmonella-Shigella (SS). Se deberan estandarizar
para uso, dos de estos medios dada la complejidad y variedad de serotipos, los que
presentan diversidad en su fisiologa y a la variedad de flora acompaante presente en los
alimentos.

Identificacin
En los procedimientos de identificacin final es recomendable que los cultivos con
colonias poco aisladas o con variedad de flora realizar un re aislamiento en un agar
nutritivo y posteriormente sembrar en TSI y LIA adems de MIO.

Factores que afectan el crecimiento, muerte y/o sobrevivencia

Actividad de agua (aw)
La actividad de agua afecta el crecimiento de Salmonella siendo el lmite inferior de 0.94 y
puede sobrevivir por aos en alimentos con aw bajo (chocolate, pimienta, gelatina)
pH
El mnimo de pH es de 3.8. Cuando el pH excede el ptimo, el crecimiento disminuye.
La muerte ocurre cuando los lmites extremos son sobrepasados, influyendo la naturaleza
del cido orgnico.

4.- MATERIALES Y REACTIVOS

Reactivos
Agar Verde Bilis Brillante
Agar Xilosa Lisina Desoxicolato
Tetrationato
Triple Sugar Iron
Lysine Iron Agar
Motility Indol Ornitina
Citrato Simmons
Agua Peptona
Muestra
Quesillo

(VBB)
(XLD)
(TSI)
(LIA)
(MIO)
(CS)

Materiales de vidrio
3 Cajas Petrie
1 Matraz Enlermeyer 500Ml
5 Tubos de Ensayo
1 Mechero
3 Pipetas Volumtricas de 2mL
1 Gradilla
1 Asa de Volumen

Equipo de laboratorio y otros

1 Agitador Boster
1 Balanza Mecnica
1 Autoclave
1 Tijera

5.- PROCEDIMIENTO

Para realizar esta prctica se prosigui de la siguiente manera

Primeramente protegerse adecuadamente antes de comenzar la prctica es decir
colocndose barbijo, gorro y guantes, para posteriormente desinfectar el area de
trabajo
Tritura lo mas posibles la muestra de quesillo
PRIMERA PARTE PREENRIQUECIMIENTO
Pesar 25 gramos de quesillo y agregar a 225 mL. de agua peptonada, agitando
vigorosamente, dejar incubar por 24 horas a 37C
SEGUNDA PARTE ENRIQUECIMIENTO
Transcurridas las 24 horas agregar 2 ml de la solucin pre enriquecida al caldo
de Tetrationato (2 tubos de ensayo), 1 mL. a cada tubo respectivamente
preparado de la siguiente manera:
Solucin de yodo 2 mL./100mL solucin
Solucin verde brillante 1mL/100 mL. Solucin
Dejar incubar a 43 C por 24 horas
Trabajando siempre detrs del mechero
TERCERA PARTE - AISLAMIENTO
Se utiliza como medio de cultivo un agar selectivo como ser:
AGAR (XLD)
AGAR (VBB)
Esterilizar con ayuda de un mechero un asa volumtrica dejar enfriar e
introducirla el caldo de tetrationato descargar en las paredes y sembrar por
superficie en el agar XLD y VBB de la siguiente manera:
Dividir cada caja petry( Agar XLD y VBB) por la mitad siendo la primera
parte para el tubo N 1 ya enriquecido y la segunda parte para el tubo N
2 respectivamente
Dejar incubar por 24 horas a una temperatura de 37 C
CUARTA PARTE - CONFIRMACION
Transcurrida las 24 horas observar las colonias formadas en cada uno de los
hemisferios de la placa observando la existencia de
colonias tpicas o
sospechosas
Seleccionar una colonia sospechosa
Calentar el asa de aguja en el mechero, dejar enfriar y pinchar dicha colonia
Sembrar sin recargar en los siguientes medios:
TSI (picadura estra)
LIA (estra picadura)
Volver a quemar el asa ,enfriar, pinchar a la colonia y sembrar en los siguiente
medios restantes volviendo a cargar para cada uno de ellos
MIO (solo picadura)
CS (solo estra)

Placa

Antes del
Sembrado

Despus del Sembrado

6.- CALCULOS Y RESULTADOS

Agar Verde Bilis Dibujo del
Brillante
aspecto
inicial y
despus de
(VBB)
24 horas de
incubacin

Nombre del
medio

Dibujo del aspecto inicial y despus de 24

horas de incubacin

Agar Xilosa
Lisina
Desoxicolato
(XLD)

Nombre del
medio

Tripe
Sugar
Iron
(TSI)

Citrato
Simmons
(CS)

Motility
Indol
Ornitina

Lysin Iron
Agar
(LIA)

(MIO)

Reacciones Bioqumicas
Reacciones

Salmonella

Glucosa A
CO2
Lactosa
Sacarosa
H2S
Indol
Motibilidad
Lisina Dexc.
Lisina Ami.
Citrato

+
+
+
+
+
+
+

7.- OBSERVACIONES
MEDIOS DE PRE- ENRIQUECIMIENTO Y ENRIQUECIMIENTO
El caldo peptonado (Pre- enriquecimiento) presenta una tonalidad amarillo
tenue
El tetrationato (Enriquecimiento) tiene una tonalidad verde esmeralda
SERIE BIOQUIMICA

El medio TSI vira totalmente al color amarillo

El medio citrato Simmons vira a color azul
No existe la formacin de anillos rojos en la prueba de INDOL en el medio
MIO

AGARES
La morfologa de las colonias resultantes del agar XLD son convexas,
circulares y de una tonalidad amarilla blanquezino
Las colonias resultantes en el medio VBB con convexas y blanquecinas se
encuentran en menor proporcin que las existentes en el agar XLD

8.- CONCLUSIONES
Deacuerdo a las pruebas obtenidas de la serie bioqumica se puede asegurar que
el alimento analizada ( quesillo) se encuentra libre de la presencia de salmonella
No existe la formacin de colonias tpicas en ninguno de los agares utilizados
(XLD y VBB)
El cambio de color en el medio CS ( de verde a azul) nos indica que el MO
estudiado tiene la capacidad usar citrato como nica fuente de carbono y energa
La bacteria analizada presenta motilidad en el medio MIO pero esta da negativa a
la prueba de INDOL ya que no se formaron anillos rojos al agregar el reactivo de
KOVACS, dando negativo a la prueba de de Ornitina descarboxilasa
En el medio TSI se producen cidos, que se detectan por medio del indicador rojo
de fenol con el que cuenta este medio, el cual vira al color amarillo en medio cido.
De acuerdo a la prctica realizada se pueden detectar tres azucares lactosa en
la parte superior, en el medio sacarosa y en la base del tubo glucosa
El pre enriquecimiento se realiza con el fin de recuperar a la bacteria a estudiar
que puede estar daada o estresada por el proceso industrial al que ha sido
sometida
Se realiza un enriquecimiento selectivo para inhibir la flora acompaante del
alimento permitiendo as el desarrollo del microorganismo a estudiar
Deacuerdo con los resultados obtenidos de la serie bioqumica es posibles que el
microorganismo cultivado sea Enterobacter aereogenes

9.- BIBLIOGRAFIA

 Pascual Anderson, Microbiologa Alimentaria, Editorial Daz de Santos S.A. 2da

Edicin, Ao 1999. Madrid- Espaa
Wolin, M. TRATADO DE MICROBIOLOGA, 20ed, Editorial Interamericana, Mxico
(1973) p.p. 901
Brock. BIOLOGA DE LOS MICROORGANISMOS, 8 ed, Prentice-Hall, 1999